JP5017652B2 - 魚類生体内のグルコース濃度を測定する方法及びこれに使用するバイオセンサ - Google Patents
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Description
ところで、魚のストレスと血液中のグルコース濃度との間には密接な関係が有り、血中グルコース濃度が高いと魚が強いストレスを感じており、死亡率が高まる傾向にあるといわれている。
しかし、この方法は、魚類の動脈や心臓から採血しなければならず、魚への負担が大きく、場合によっては開腹が必要なので、検査の対象となる魚を殺すこともある。また、採取した血液を検体としているので、長時間連続的に検査を続けることは不可能であった。
しかし、通常のバイセンサは直径が0.5mm〜1.5mm程度あって、魚体に対する負担は依然として大きいばかりでなく、生きた魚類に長時間装着しておくのは困難であった。
バイオセンサを装着するには、注射針の外周に外筒を嵌合し、頭骨を通して生体魚類の眼球付近の粘膜内部に前記注射針及び外筒を刺し入れてから、前記注射針を抜き取って外筒のみを埋設し、次いで、外筒の内部に前記バイオセンサを挿入し、その後、該バイオセンサを頭骨に接着すると良い。
この場合、前記バイオセンサの測定値を送信手段により無線送信し、該送信手段からの信号を、生体魚類の近傍に配置された受信手段により受信し、該受信手段に接続された変換手段によって、前記バイオセンサの測定値を間質液中のグルコース濃度に変換しても良い。
或いは、先端部を除いた外周を絶縁体で被覆した短線状の作用極と、前記絶縁体の外周に塩化銀粉末を含有した銀ペーストを塗布して成る対極と、前記作用極の先端に装着され、前記作用極の直径よりも大きい径を有する球体と、前記作用極と対極を接続する回路に流れる電流を測定する測定部と、該測定部の測定値を無線送信する送信手段と、前記球体と絶縁体との間において、前記作用極の先端部外周に設けられた酵素固定部とを備える。
また、測定対象として血液を用いていないため、凝固した血液が付着して酵素(グルコースオキシダーゼ)が失活するのを抑制できる。
また、請求項4に係る発明によれば、バイオセンサと変換手段とを導線で接続する必要が無いので、バイオセンサを装着された魚は自由に動くことができ、バイオセンサを試着したままで長期間に亘って測定することが可能であると共に、ストレスによってグルコース濃度が変動する心配が無い。
また、従来のもののように、銀線表面の薄い銀・塩化銀処理が剥がれ、露出した銀線と銀・塩化銀の二つの金属が対極の役割を果たしてしまう心配が無く、長期間に亘って高い安定性が得られる。
また、先端に球体を設けてあるので、生体魚類の眼球粘膜に長期間刺し入れた状態でも刺激が少なくて済み、魚類に与える負担を軽減できる。
本発明のバイオセンサAは、頭骨を通して生体魚類の眼球付近に存在する粘膜内部の間質液中へ刺し入れるものであって、図1に示すように、短線状の作用極1と、作用極1の外周に被覆した絶縁体2と、絶縁体2の外周に設けられた銀線3と、作用極1の外周に塗布された銀・塩化銀層より成る対極5と、作用極1の先端に装着された球体6と、作用極1及び対極5に接続された定電圧装置7と、定電圧装置7に接続され、作用極1と対極5を接続する回路に流れる電流を測定する測定部8とを備える。
定電圧装置7と測定部8はポテンシオスタット17に組み込まれている。また、測定部8には、送信線16を介して、測定値をグルコース濃度へ変換する変換手段(コンピュータ)15が接続され、測定部8の測定値が送信線16によって変換手段15へ送信されるようになっている。
また、導線10をハンダ付けするために、絶縁体2の外周の末端寄りに、直径0.1mmの銀線3を10回程度巻きつけてある。
対極5である銀・塩化銀層は、微細な塩化銀粉末を0.2〜40重量%含有した銀ペーストを、銀線3を被覆するように、絶縁体2の外周に塗布して形成される。
そして、作用極1及び対極5には、ハンダ付けされた導線10を介して定電圧装置7が接続され、定電圧装置7から作用極1へ+0.650mVの定電圧を印加できるようになっている。
実際に測定を行う前に、バイオセンサAをグルコースオキシダーゼ溶液に浸漬し、酵素固定部11にグルコースオキシダーゼを固定する。酵素固定部11には表面張力が働いて確実にグルコースオキシダーゼが固定される。
作用極1には+0.650mVの定電圧が印加されているので、グルコースの酸化反応が起きていないときは、作用極1には+0.650mVの電位が常に維持されているが、過酸化水素が発生すると電子を受け取って電位が上昇し、作用極1と対極5を接続した回路に流れる電流が強まる。
また、バイオセンサAで測定した電流とグルコース濃度とは比例しているので、電流値に比例定数を乗することにより簡単にグルコース濃度に変換できる。
従って、測定部8が測定した電流を変換手段15へ送信すると、変換手段15は受信した測定値にこの比例定数を掛けてグルコース濃度へ変換する。
ティラピアを水から引き上げ、2-phenoxy ethanolで麻酔を施す。
次いで、図2に示すように、注射針12の外周にテフロン(登録商標)製の外筒13を嵌合したサーフローを用い、頭骨を通してティラピアの眼球B付近の粘膜C内部に注射針12及び外筒13を刺し入れてから、図3に示すように、注射針12を抜き取って外筒13のみを埋設する。
次いで、軟組織接合用接着剤(例えば、商品名:アロンアルファA,「三共株式会社」等のシアノアクリレート系接着剤)で、バイオセンサAを皮膚へ接着する。
そして、眼球付近にバイオセンサAが装着されたティラピアを2枚のセパレータの間に収納し、測定部8で電流を測定した。
ティラピアを水槽へ投入した後、電位が安定するまでしばらく待ってから、1.07時間後(a時点)に水槽から取り出し、眼球付近の間質液中のグルコース濃度を血糖計(アークレイ株式会社製 DIAmeter αGLUCOCARD)により測定した。
その後、ティラピアを水槽中に戻し、1.85時間後(b時点)及び3.44時間後(c時点)にそれぞれティラピアを取り出して、間質液中のグルコース濃度を血糖計で測定した。
バイオセンサAによる電流の測定値と血糖値を表1及び図4に示す。
電流とグルコース濃度とは比例するので、c時点における電流値を式で表すと、
22.46=S×G(t)+I0となる。
S=(15.11−4.37)/(272−194)=0.14
I0=4.37−(0.14×194)=−22.35984となる。
よって、
G(t)=(22.46−I0)/S={22.46−(−22.36)}/0.14=325mg/dLとなる。
c時点で血糖計により計測したグルコース濃度は317mg/dLなので、バイオセンサAで測定した電流から計算で求めたグルコース濃度はほぼ正しいことがわかった。
図5からは、間質液中のグルコース濃度は血中グルコース濃度よりやや低い傾向にあり、間質液中のグルコース濃度は血中グルコース濃度の変化に伴って一定の割合で変化し、両者には高い相関関係のあることがわかる。
従って、バイオセンサAの出力から間質液中のグルコース濃度を算出することで、血中グルコース濃度のモニタリングも可能である。
本発明のバイオセンサAに酵素を固定する前のバイオセンサ用電極、及び、従来のバイオセンサ用電極をpH6.5のPBSに浸漬し、0.650mVの定電圧を印加して、電流値の変化を1週間モニタリングした。このモニタリング結果を図6及び図7に示す。
図6及び図7からわかるように、従来のバイオセンサ用電極が時間経過と共に大きく電位のずれが生じたのに対し、本発明のバイオセンサ用の電極は、非常に良い安定性を示した。このような違いが生ずるのは、従来のバイオセンサ用電極では、極細の銀線の表面に銀・塩化銀を電気化学的にコーティングしたものを巻いて対極としてあるので、コーティングが非常に薄くて剥がれやすく、銀・塩化銀が剥がれると、内部の銀線と表層の塩化銀の二つの金属が対極の役割を果たしてしまうことになり、電位が非常に不安定になるためではないかと考えられる。
図8に示すように、バイオセンサAの測定部8に、その測定値を無線送信する送信手段9を接続し、測定対象である生体魚類の近傍に、送信手段9からの信号を受信する受信手段14を設置すると共に、受信手段14に測定した電流をグルコース濃度へ変換する変換手段15を接続してある。
定電圧装置7、測定部8及び送信手段9は無線ポテンシオスタット17’としてユニット化されており、その定電圧装置7をバイオセンサAの導線10に接続した。
また、FM波は淡水中で送信が可能なため、FM波を受信する受信手段14で受信することができる。
本実施例によれば、バイオセンサAと変換手段15とを送信線16で直接接続する必要が無いので、バイオセンサAを装着された魚は自由に動くことができ、バイオセンサAを試着したままで長期間に亘って測定することが可能であると共に、ストレスによってグルコース濃度が変動する心配が無い。
B 眼球
C 粘膜
1 作用極
2 絶縁体
3 銀線
5 対極
6 球体
7 定電圧装置
8 測定部
9 送信手段
10 導線
11 酵素固定部
12 注射針
13 外筒
14 受信手段
15 変換手段
16 送信線
17 ポテンシオスタット
17’ 無線ポテンシオスタット
Claims (6)
- 頭骨を通して魚類の眼球付近に存在する粘膜内部の間質液中へ刺し入れたバイオセンサにより魚類生体内のグルコース濃度を測定する方法。
- 注射針の外周に外筒を嵌合し、頭骨を通して生体魚類の眼球付近の粘膜内部に前記注射針及び外筒を刺し入れてから、前記注射針を抜き取って外筒のみを埋設し、次いで、外筒の内部に前記バイオセンサを挿入し、その後、該バイオセンサを頭骨に接着する請求項1に記載された魚類生体内のグルコース濃度を測定する方法。
- 前記バイオセンサの測定値を間質液中のグルコース濃度に変換する請求項1又は2に記載された魚類生体内のグルコース濃度を測定する方法。
- 前記バイオセンサの測定値を送信手段により無線送信し、該送信手段からの信号を、生体魚類の近傍に配置された受信手段により受信し、該受信手段に接続された変換手段によって、前記バイオセンサの測定値を間質液中のグルコース濃度に変換する請求項3に記載された魚類生体内のグルコース濃度を測定する方法。
- 請求項1〜3のいずれかに記載された魚類生体内のグルコース濃度を測定する方法に使用されるバイオセンサであって、先端部を除いた外周を絶縁体で被覆した短線状の作用極と、前記絶縁体の外周に塩化銀粉末を含有した銀ペーストを塗布して成る対極と、前記作用極の先端に装着され、前記作用極の直径よりも大きい径を有する球体と、前記作用極と対極を接続する回路に流れる電流を測定する測定部と、前記球体と絶縁体との間において、前記作用極の先端部外周に設けられた酵素固定部とを備えたバイオセンサ。
- 請求項4に記載された魚類生体内のグルコース濃度を測定する方法に使用されるバイオセンサであって、先端部を除いた外周を絶縁体で被覆した短線状の作用極と、前記絶縁体の外周に塩化銀粉末を含有した銀ペーストを塗布して成る対極と、前記作用極の先端に装着され、前記作用極の直径よりも大きい径を有する球体と、前記作用極と対極を接続する回路に流れる電流を測定する測定部と、該測定部の測定値を無線送信する送信手段と、前記球体と絶縁体との間において、前記作用極の先端部外周に設けられた酵素固定部とを備えたバイオセンサ。
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