JP5011961B2 - Cell electrophysiological sensor and manufacturing method thereof - Google Patents
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Description
本発明は、細胞の活動によって発生する物理化学的変化を観測するために用いられ、細胞内電位あるいは細胞外電位あるいは細胞膜通過電流等の細胞電気生理現象を測定するための細胞電気生理センサおよび製造方法に関する。 The present invention is used for observing a physicochemical change caused by cell activity, and a cell electrophysiological sensor and a manufacturing method for measuring a cell electrophysiological phenomenon such as an intracellular potential, an extracellular potential or a current passing through a cell membrane. Regarding the method.
電気生理学におけるパッチクランプ法は、細胞膜に存在するタンパク質の機能の一つであるイオンチャネル機能を測定する方法として知られており、このパッチクランプ法によってイオンチャネルの様々な機能が解明されてきた。そして、イオンチャネルの働きは細胞学において重要な関心ごとであり、これは薬剤の開発にも応用されている。 The patch clamp method in electrophysiology is known as a method for measuring an ion channel function, which is one of the functions of a protein present in a cell membrane, and various functions of the ion channel have been elucidated by this patch clamp method. And the action of ion channels is an important concern in cytology, which has been applied to drug development.
このパッチクランプ法は測定技術に微細なマイクロピペットを1個の細胞に高い精度で挿入するという極めて高い能力を必要としているため、熟練作業者が必要である。これは、1個の細胞にマイクロピペットを挿入するために、顕微鏡による観測下で一つの細胞に狙いを定め、マイクロマニュピレータ等の手段により高精度にマイクロピペットの先端を細胞の膜表面に接触させる必要がある。従って、このパッチクランプ法は高いスループットで測定を必要とする場合には適切な方法でない(例えば、非特許文献1参照)。
しかしながら、前記従来の構成では、顕微鏡下において一つの細胞に高精度にマイクロピペットを挿入することに困難が伴うことにある。特に、パッチクランプ法で測定する細胞は、基本的には細胞が顕微鏡下で固定されたガラスプレートなどの基板に接着されている必要があり、浮遊性細胞の場合は何らかの手段により細胞を固定した状態にしてからでないと、細胞の表面にマイクロピペットを移動させて高精度に配置することが困難である。 However, in the conventional configuration, it is difficult to insert a micropipette with high accuracy into one cell under a microscope. In particular, cells to be measured by the patch clamp method basically need to be adhered to a substrate such as a glass plate on which the cells are fixed under a microscope. In the case of suspension cells, the cells are fixed by some means. Otherwise, it is difficult to move the micropipette to the cell surface and place it with high accuracy.
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、顕微鏡下でマイクロピペットの位置制御をする必要が無く、浮遊性の細胞であっても高い確率で細胞を保持することができ、パッチクランプ法と同等の高精度な信号を検出することができる細胞電気生理センサおよびその製造方法を提供することを目的とするものである。 The present invention solves the above-mentioned conventional problems, and it is not necessary to control the position of a micropipette under a microscope, and even a floating cell can be held with high probability, and the patch clamp method It is an object of the present invention to provide a cell electrophysiological sensor capable of detecting a highly accurate signal equivalent to the above and a manufacturing method thereof.
本発明の細胞電気生理センサおよびその製造方法は、内部に空洞を有した筒部品と、この筒部品の空洞部内の一端または中間部に、薄板とこの薄板の周辺に前記薄板を保持する枠体からなるセンサチップとを備え、前記薄板の内部には少なくとも一つ以上の貫通孔が薄板の垂直方向に形成した構成とするものである。 The cell electrophysiological sensor and the method for producing the same according to the present invention include a cylindrical part having a hollow inside, a thin plate at one end or an intermediate part in the hollow part of the cylindrical part, and a frame body that holds the thin plate around the thin plate. And at least one through hole formed in the thin plate in the vertical direction of the thin plate.
本発明の細胞電気生理センサおよびその製造方法は、貫通孔が形成された薄板を持つセンサチップが、筒部品の内部に設置されているため、細胞を含む溶液および測定の際に要する溶液を、それぞれ、センサチップによって仕切られている筒部品の中空部に投入し、センサチップを挟み圧力差を発生させることで容易に細胞を薄板の貫通孔に密着させることができる。これによって、顕微鏡などを必要とすることなく、また高精度なマニュピレータ制御なども行う必要もなく、浮遊性の細胞であっても簡便な取り扱いのできる細胞電気生理センサおよびその製造方法を実現することができる。 The cell electrophysiological sensor of the present invention and the method for producing the same have a sensor chip having a thin plate with a through-hole formed therein, so that a solution containing cells and a solution required for measurement are obtained. The cells can be easily brought into close contact with the through-holes of the thin plate by putting them in the hollow parts of the cylindrical parts partitioned by the sensor chip and generating a pressure difference by sandwiching the sensor chip. This realizes a cell electrophysiological sensor that can be easily handled even in the case of floating cells without the need for a microscope or the like, nor with high-precision manipulator control, and a method for manufacturing the same. Can do.
(実施の形態1)
以下、本発明の実施の形態1における細胞電気生理センサおよびその製造方法について、図面を参照しながら説明する。
(Embodiment 1)
Hereinafter, the cell electrophysiological sensor and the manufacturing method thereof according to
図1は本発明の実施の形態1における細胞電気生理センサの断面図、図2は上面図、図3は拡大断面図である。
1 is a cross-sectional view of a cell electrophysiological sensor according to
図1〜図3において、1はガラスよりなる筒部品であり、この筒部品1の外径は図2に示したように円柱状で内部は中空構造をしている。この筒部品1の先端にはシリコンを主成分とする材料よりなるセンサチップ2が設置されており、このセンサチップ2は図3に示したように、シリコンを主成分とする材料よりなる薄板3とシリコンを主成分とする材料よりなる枠体4とから構成されており、薄板3には貫通孔5が少なくとも一つ設けられている。なお、このセンサチップ2は筒部品1の内壁部に隙間無く強固に固着している。これによって、センサチップ2は筒部品1の上部と下部を仕切るとともに、貫通孔5を通してのみ、上部と下部の空間が連通している。
1 to 3,
また、センサチップ2が固着される場所は筒部品1の端部のみでなく、図4に示したように中間部であってもよい。この場合は、後に使用方法でも説明するが、センサチップ2の上下に溶液を入れることが容易になるという利点を有している。
Further, the place where the
次に、別の細胞電気生理センサの例について図5〜図7を用いて説明する。図5は本実施の形態1における別の例の細胞電気生理センサの構成を説明するための断面図、図6は下面図、および図7は拡大断面図である。 Next, another example of the cell electrophysiological sensor will be described with reference to FIGS. FIG. 5 is a cross-sectional view for explaining the configuration of another example of the cell electrophysiological sensor according to the first embodiment, FIG. 6 is a bottom view, and FIG. 7 is an enlarged cross-sectional view.
図5および図7に示したように、筒部品1の内壁に断面と平行方向に凸形状の段差部7を設けておくことによって、筒部品1の空洞内にセンサチップ2を挿入する際に所定の位置に容易に設置できるので生産性が向上する。また、図6に示したように段差部7を筒部品1の内壁面の溶液の流れ方向に沿って連続して形成しておくことによって、気泡の発生を抑制することができるとともに気泡の除去を効率良く行うことができる。そして、この凸形状の段差部7を設ける手段としては筒部品1がガラス管などの場合には内壁面に同材料のガラスからなる棒材8をあらかじめ溶着したり、筒部品1が樹脂の場合には金型で段差部7を成型する等の方法などを用いることが可能である。
As shown in FIG. 5 and FIG. 7, when the
次に、本実施の形態1における細胞電気生理センサの製造方法について図面を用いて説明する。
Next, the manufacturing method of the cell electrophysiological sensor in this
まず始めに、図8に示したようにガラス管として供給される筒部品1と、シリコンを主成分としてなるセンサチップ2を所定の位置に挿入する。なお、筒部品1は所定の寸法を有するガラス管を加工することによって作製することが可能であり、センサチップ2はシリコン基板などを用いて半導体製造プロセスによる微細加工技術を用いることによって微細な形状のセンサチップ2を高精度に一括して大量に作製することができる。
First, as shown in FIG. 8, a
次に、筒部品1の内部にセンサチップ2を挿入した後、接着剤で固着させることでセンサチップ2は所定の位置に固着することができる。
Next, the
ここで、図9に示したようにより好ましくはセンサチップ2を挿入した後、筒部品1を外周部から熱源6によって加熱する方法を用いることが好ましい。特に、筒部品1を構成する材料がガラス管などの場合、筒部品1が600−700℃以上に加熱されると、ガラスは溶融を起こし、センサチップ2の主材料であるシリコンと強固に固着する。これによって、筒部品1とセンサチップ2は接着剤等の異種材料を使うことなく、強固に隙間なく直接接着することができることから、接着剤による汚れ等の発生を心配する必要のない封止性の高い細胞電気生理センサを作製することができる。
Here, as shown in FIG. 9, it is preferable to use a method in which the
なお、熱源6の種類としてはヒータ、赤外線、ガスバーナ等があるが特に限定するものでない。
In addition, as a kind of the
また、本実施の形態1では筒部品1の材料はガラスとしたが、特にアクリル、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリオレフィン、環状ポリオレフィンポリマー、および環状ポリオレフィンコポリマーのうち少なくともいずれか一つを主成分として含む熱可塑性樹脂を用いることも可能である。この材料を用いた場合において、ガラスの軟化温度より低い温度で熱可塑性樹脂を溶融させることができることから、製造工程において高温を使うことが好ましくない場合に有効である。
In the first embodiment, the material of the
例えば、実験ではTgが130℃の環状ポリオレフィンコポリマーを用いて、150−200℃で周囲を熱することでセンサチップ2と筒部品1を直接固着することができた。
For example, in the experiment, it was possible to directly fix the
なお、前記加熱工程によって、図9に示したように筒部品1の外形と内形は角部が丸められた形状としている。この外形の周辺部は丸くなることで、外観欠けが起こりにくくなり、また内形の角部を丸めた形状とすることによって、筒部品1の内形がセンサチップ2に近づいていくに従って小さくなることから、後で説明するようにセンサチップ2の下部に培養液あるいは薬液などの溶液を充填する際に気泡が残留することなく確実に充填できるという利点を有している。このセンサチップ2の下部の溶液に気泡が残留していると正確な測定ができないという課題を有しており、これを解決することができる。
Note that, by the heating step, as shown in FIG. 9, the outer shape and the inner shape of the
次に、センサチップ2を筒部品1の内部へ効率よく挿入するための製造方法について詳細に説明する。図10はセンサチップ2を筒部品1へ挿入する際に溶液23(例えば水)とともに挿入した様子を示している。このように溶液23は筒部品1内へ表面張力によって引き込まれ、同時にセンサチップ2を保持する。
Next, a manufacturing method for efficiently inserting the
その後、外部から加熱することによって筒部品1の溶融が起こり、図11に示したようにセンサチップ2が固着されるのである。このとき、溶液23としてはアルコール類などの親水性を有する液体を用いることによって同様の効果を発揮することができる。
Thereafter, the
次に、本実施の形態1における細胞電気生理センサを用いて、細胞の電気生理現象を測定する方法について図面を用いて説明する。図12〜図17は本実施の形態1における細胞電気生理センサを用いて細胞の電気生理現象を測定する測定方法を説明するための断面図である。また、図18〜図20は別の例による使用方法を説明するための断面図である。 Next, a method for measuring an electrophysiological phenomenon of a cell using the cell electrophysiological sensor according to the first embodiment will be described with reference to the drawings. 12 to 17 are cross-sectional views for explaining a measurement method for measuring a cell electrophysiological phenomenon using the cell electrophysiological sensor according to the first embodiment. Moreover, FIGS. 18-20 is sectional drawing for demonstrating the usage by another example.
まず始めに、図12に示したように筒部品1の下部に細胞の電気生理現象を測定するために用いる溶液の1種である細胞内液9を投入する。ここで細胞内液9とは被検体細胞19の内部を満たす溶液とほぼ同じ成分に調整された溶液であり、細胞の種類によって成分は変更されるがここでは詳細な説明は省略する。
First, as shown in FIG. 12, an
なお、本実施の形態1のように筒部品1の内部が中空であり、センサチップ2の下部より垂直方向に細胞内液9が貯留される領域を有することで、細胞内液9を投入する際に内部に気泡が残留してしまうことが少なくなる。さらに、筒部品1の内形は角部が丸められて結果として筒部品1の内壁がセンサチップ2の方向に向かって狭くなっていることから、より細胞内液9を投入する際に内部に気泡の残留を抑制することができる。ここで、図7に示したように筒部品1の内壁に、断面と垂直方向な面に段差部7を形成した構成とすることで、細胞内液9の投入時において、段差部7の周辺部で気泡の抜け道ができることから、気泡の流れをスムーズにし、気泡の残留を抑制することができる。
In addition, as in
次に、図13に示したように筒部品1の上部に細胞の電気生理現象の測定に用いる溶液の1種である細胞外液10を投入する。この細胞外液10は細胞内液9と同様に被検体細胞19の種類によって成分調整されるものであり、通常は被検体細胞19が生体内で活動するときの細胞外の溶液とほぼ同じ成分に調整される。その後、筒部品1の空洞部の上部、下部それぞれに測定電極11a,11bを挿入する。
Next, as shown in FIG. 13, an
次に、図14に示したように、測定電極11a,11b間に計測器17を接続すると、センサチップ2によって仕切られた細胞外液10と細胞内液9の間の電気的性質が測定される。これは貫通孔5を細胞内液9および細胞外液10によって満たされることで構成される電気的回路であり、その特性として例えば、電気抵抗、I−V特性等として観測され、通常、1MΩ程度の電気抵抗値を持つ。
Next, as shown in FIG. 14, when the measuring
なお、本実施の形態1のように筒部品1は円柱形状をしているので、図15に示したように市販のパッチクランプ用電極ホルダー12に挿入することが可能である。パッチクランプ用電極ホルダー12は筒部品1の挿入口13と吸引口14を備え、測定電極11bが電極端子15につながっており、筒部品1を挿入するとリングシール16によって筒部品1の下部が密閉され、吸引口14を通して下部の圧力を容易に変更することができる。
Since the
このようにパッチクランプ用のセットを大きく変えることなく、ガラスマイクロピペットに代えて本実施の形態1における細胞電気生理センサを用いることで、顕微鏡やマニュピレータ等で頻雑な作業を行うことなく細胞の電気生理測定を行うことができるようになる。 As described above, the cell electrophysiological sensor according to the first embodiment is used in place of the glass micropipette without greatly changing the set for the patch clamp, so that it is possible to perform cell operation without performing frequent operations with a microscope or a manipulator. Electrophysiological measurement can be performed.
なお、市販のパッチクランプ用電極ホルダー12を使わなくとも、図18に示したように筒部品1へのチューブ21を挿入することで、チューブ21の一方の端は容易に吸引手段・加圧手段に接続でき、測定電極11bも外部に取り出しができる。
Even if the commercially available patch
なお、図19に示したように本実施の形態1の別の方法として、センサチップ2が筒部品1の中間にあることで、センサチップ2の上部に細胞外液10をより投入しやすくなる。すなわち、細胞内液9の投入と同様、気泡が残留することなく容易に細胞外液10を充填することができる。
As shown in FIG. 19, as another method of the first embodiment, since the
さらに、図20に示したように本実施の形態1のさらに別の方法として、シリコン樹脂などからなるリング部品18を筒部品1の上部先端に挿入しておくことによって細胞外液10が蓄積される量を増量させることが可能であり、これによって測定電極11aをよりセットしやすくなると言う利点を有している。
Furthermore, as shown in FIG. 20, as another method of the first embodiment, the
次に、図16に示したように細胞外液10側に被検体細胞19を投入する。このとき、被検体細胞19は細胞外液10と同成分の溶液に所定の濃度で分散させたものとして供給することができる。これによって、浮遊性細胞であっても容易に測定部へ細胞を供給することができる。
Next, as shown in FIG. 16, the
その後、細胞内液9側から吸引すると、被検体細胞19は貫通孔5へ引きつけられて密着するようになる。このとき、被検体細胞19が貫通孔5に密着したかどうかは、計測器17によって電気抵抗を測定することで判別できる。
Thereafter, when sucked from the
通常、被検体細胞19が貫通孔5に到達したときには数MΩとなり、十分密着した場合には数十MΩから数GΩになる。このときの抵抗値はシール抵抗と呼ばれ、この抵抗値が高いほどノイズが少なくなるので、測定したい対象によって必要なシール抵抗値が得られるように吸引圧力を最適化すべきであるが、この工程はギガシール形成工程と呼ばれ、パッチクランプ法と全く同じである。
Usually, when the
次に、図17に示したように、さらに吸引圧力を高めることで、貫通孔5の被検体細胞19の微小な細胞膜部分に細胞膜穴20を形成する。
Next, as shown in FIG. 17, the
これによって、一つの被検体細胞19の全細胞膜の領域に埋め込まれたイオンチャネルを流れる電流を測定できるようになり、各種のイオンチャネルの電気的特性(例えば、I−V特性)、薬剤に対する反応特性、その他外的刺激に対する反応等を測定することができる。
As a result, the current flowing through the ion channel embedded in the entire cell membrane region of one
なお、細胞膜に微小な細胞膜穴20を形成する工程はホールセルと呼ばれ、パッチクランプ法で行うのと全く同じである。
The process of forming the minute
以上、述べてきたように本実施の形態1における細胞電気生理センサでは、貫通孔5が形成された薄板3を持つセンサチップ2が、筒部品1の内部に設置されているため、被検体細胞19を含む溶液および測定の際に要する溶液を、それぞれ、センサチップ2によって仕切られている筒部品1の中空部に投入し、センサチップ2を介して圧力差を発生させることで、容易に被検体細胞19を薄板3の貫通孔5に容易に密着させることができるようになる。
As described above, in the cell electrophysiological sensor according to the first embodiment, since the
これによって、たとえ浮遊性の細胞であっても顕微鏡などを必要とすることなく、また高精度なマニュピレータ制御なども行う必要のない、簡便な取り扱いのできる細胞電気生理センサおよびその製造方法を実現することができる。 This realizes a cell electrophysiological sensor that can be easily handled and a method for manufacturing the same, without requiring a microscope or the like, even if it is a floating cell, and does not require high-precision manipulator control. be able to.
以上のように本発明にかかる細胞電気生理センサおよびその製造方法は、細胞の電気生理現象の効率的な測定を可能にするので、高速で薬理判定を行う、薬品スクリーニング等の測定器に有用である。 As described above, the cell electrophysiological sensor and the method for producing the same according to the present invention enable efficient measurement of the electrophysiological phenomenon of cells, and thus are useful for measuring instruments such as drug screening that perform pharmacological determination at high speed. is there.
1 筒部品
2 センサチップ
3 薄板
4 枠体
5 貫通孔
6 熱源
7 段差部
8 棒材
9 細胞内液
10 細胞外液
11 測定電極
12 パッチクランプ用電極ホルダー
13 挿入口
14 吸引口
15 電極端子
16 リングシール
17 計測器
18 リング部品
19 被検体細胞
20 細胞膜穴
21 チューブ
23 溶液
DESCRIPTION OF
Claims (6)
前記センサチップは、少なくとも一つ以上の貫通孔が形成された薄板とこの薄板を保持する枠体とからなり、
前記筒部品の内形の角部を丸めた形状とし、
前記筒部品の内形はセンサチップに近付くに従い小さくなり、
前記筒部品が溶融することによって
前記センサチップと熱溶着し、
前記筒部品と前記センサチップとが直接接合している細胞電気生理センサ。 It consists of a cylindrical part with a cavity inside and a sensor chip provided at one end or middle part of the cavity of this cylindrical part,
The sensor chip is composed of a thin plate in which at least one through hole is formed and a frame body that holds the thin plate,
The inner part of the cylindrical part has a rounded corner,
The inner shape of the cylindrical part decreases as it approaches the sensor chip,
When the cylindrical part melts, the sensor chip is thermally welded,
A cell electrophysiological sensor in which the tubular part and the sensor chip are directly joined.
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