JP4969273B2

JP4969273B2 - 蛍光観察装置

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Publication number: JP4969273B2
Application number: JP2007060482A
Authority: JP
Inventors: 千賀中島
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2007-03-09
Filing date: 2007-03-09
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2027-03-09
Also published as: EP1967841A3; JP2008224311A; US20080219512A1; EP1967841B1; EP1967841A2

Description

本発明は、蛍光観察装置に関するものである。

従来、マウス等の実験小動物に励起光を照射して、癌組織等の病変部から発生する蛍光を観察する蛍光観察装置が知られている（例えば、特許文献１参照。）。蛍光観察は発光観察と比較して、比較的高い輝度の蛍光を観察するので、観察画像が鮮明となり、観察し易いという利点がある。

また、実験小動物に対して、病変部に作用させるための薬剤が投与され、同一の実験小動物における病変部の経時変化を観察したり、多数の実験小動物における薬効を確認したりする創薬スクリーニングが行われる。創薬スクリーニングにおいては、スクリーニング精度を向上するために、同一の実験小動物に対して時間間隔をあけて多数回にわたる観察を行ったり、多数の実験小動物に対して観察を行ったりする必要がある。

米国特許第５６５０１３５号明細書

しかしながら、時間間隔をあけた多数回の観察を行う場合に、観察装置に対して実験小動物を搭載し直す作業を繰り返す必要があり、その都度、実験小動物の位置決め作業を行わなければならないという不都合がある。すなわち、位置決め作業に時間を要する場合には、効率的にデータを取得することができないという問題がある。さらに、位置決め作業が正確に行われない場合には、得られた多数の蛍光画像における病変部の位置が変動し、多数の蛍光画像を表示画面中に配列して行う対比観察や、表示される蛍光画像を切り替えて行う対比観察において、病変部の変化の確認等が困難になるという不都合がある。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、実験小動物の位置決め作業を簡易化して、データの取得を効率的に行うことを可能とし、かつ、多数の画像の対比観察を容易にすることができる蛍光観察装置を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、実験小動物の明視野画像と蛍光画像とをそれらの相対位置を対応づけて複数対記憶する画像記憶部と、該画像記憶部に記憶された複数の蛍光画像を少なくとも一方向に配列して表示する表示部と、各明視野画像における実験小動物の輪郭形状を抽出する輪郭抽出部と、該輪郭抽出部により抽出された実験小動物の輪郭形状の重心位置および長手軸方向とその向きを算出し、前記重心位置が等間隔に配列され、かつ、該実験小動物の輪郭形状が同一方向に向かう表示位置情報と回転角度情報とを各前記明視野画像およびそれに対応する各前記蛍光画像に付与し、該表示位置情報および前記回転角度情報に基づいて各前記明視野画像に対応する各前記蛍光画像の表示位置を調節する画像位置調節部を備える蛍光観察装置を提供する。

本発明によれば、輪郭抽出部の作動により、各明視野画像における実験小動物の輪郭形状が抽出され、画像位置調節部の作動により、複数の明視野画像における実験小動物の輪郭形状の重心位置および長手軸方向とその向きが算出され、重心位置が等間隔に配列され、かつ、実験小動物の輪郭形状が同一方向に向かうように各明視野画像に対応する蛍光画像の表示位置が調節される。

これにより、時間間隔をあけて実験小動物の明視野画像および蛍光画像を取得する場合に、実験小動物の位置決め作業を大まかに行っても、実験小動物の重心位置が等間隔に配列され、かつ、その輪郭形状が同一方向に向かうように揃えた形態で複数の蛍光画像を表示することができ、これら蛍光画像間の対比観察を容易にすることができる。
すなわち、実験小動物の位置決め作業に費やす時間を短縮することができ、同一の実験小動物における病変部の経時変化を観察したり、多数の実験小動物における薬効を確認したりする創薬スクリーニング等の作業を効率的に行うことができる。

また、本発明は、実験小動物の明視野画像と蛍光画像とをそれらの相対位置を対応づけて複数対記憶する画像記憶部と、該画像記憶部に記憶された複数の蛍光画像を切り替えて表示する表示部と、各明視野画像における実験小動物の輪郭形状を抽出する輪郭抽出部と、該輪郭抽出部により抽出された実験小動物の輪郭形状の重心位置および長手軸方向とその向きを算出し、前記重心位置が一致し、かつ、該実験小動物の輪郭形状が同一方向に向かう表示位置情報と回転角度情報とを各前記明視野画像およびそれに対応する各前記蛍光画像に付与し、該表示位置情報および前記回転角度情報に基づいて各前記明視野画像に対応する各前記蛍光画像の表示位置を調節する画像位置調節部を備える蛍光観察装置を提供する。

本発明によれば、輪郭抽出部の作動により、各明視野画像における実験小動物の輪郭形状が抽出され、画像位置調節部の作動により、複数明視野において実験小動物の輪郭形状の重心位置が一致し、かつ、実験小動物の輪郭形状が同一方向に向かうように対応する蛍光画像の表示位置が調節される。そして、この状態で、表示部の作動により、複数の蛍光画像が切り替えて表示される。
これにより、順次切り替わる複数の蛍光画像において、実験小動物の輪郭形状が一致しているので、病変部の変化あるいは相違のみをクローズアップして対比観察することができる。

また、上記発明においては、実験小動物の明視野画像および蛍光画像を取得する観察光学系と、該観察光学系により取得された明視野画像と蛍光画像とをそれらの相対位置を対応づけて複数対記憶する画像記憶部とを備え、該画像記憶部に記憶された複数の蛍光画像を前記表示部に表示することとしてもよい。
また、上記発明においては、前記画像記憶部に記憶された蛍光画像を解析する画像解析部を備えることとしてもよい。

また、上記発明においては、前記観察光学系を収容して遮光するケースを備え、該ケースに、開閉可能な扉と、該扉の開閉を検出するセンサとが備えられ、該センサにより扉が閉鎖されたことが検出された場合に、前記観察光学系により明視野画像および蛍光画像の取得が行われることとしてもよい。
このようにすることで、ケースの扉を開いて、実験小動物を観察光学系に配置し、ケースの扉を閉めることにより、ケース内が遮光される。ケースの扉が閉鎖されたことがセンサにより検出されるので、これに応じて観察光学系により明視野画像および蛍光画像が取得される。ケースの扉が閉じられると、ケース内が遮光されるので、外光の影響を受けることなく、また、励起光を外部に漏洩させることなく、明視野画像および蛍光画像を取得することが可能となる。

本発明によれば、実験小動物の位置決め作業を簡易化して、データの取得を効率的に行うことを可能とし、かつ、多数の蛍光画像の対比観察を容易にすることができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る蛍光観察装置１について、図１〜図８を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る蛍光観察装置１は、図１に示されるように、観察装置本体２と、画像生成部３と、画像記憶部４と、表示部５と、これらを制御する制御部６とを備えている。
観察装置本体２は、実験小動物、例えば、マウスＡを搭載するステージ７と、観察光学系８と、該観察光学系８を収容して遮光するケース９とを備えている。

観察光学系８は、明視野観察用の可視光を出射する可視光源１０と、蛍光観察用の励起光を出射する励起光源１１と、これらを同一光路に合流させるミラー１２およびダイクロイックミラー１３と、可視光および励起光の合焦位置を調節する合焦位置調節光学系１４と、観察倍率を調節するズーム光学系１５と、可視光および励起光をステージ７上のマウスＡに照射する一方、マウスＡから戻る可視光の反射光および蛍光を集光する対物レンズ１６と、対物レンズ１６により集光された反射光および蛍光を励起光から分岐するダイクロイックミラー１７と、分岐された反射光および蛍光を撮影する撮像手段１８とを備えている。

前記ケース９には、ステージ７近傍に開閉可能な扉１９が設けられている。扉１９には、該扉１９が閉じられたことを検出するセンサ２０が設けられている。符号２１は、センサ２０により検出する検出片である。

画像生成部３は、可視光源１０から出射された可視光をマウスＡに照射することにより、マウスＡの表面から発せられる反射光を撮像手段１８により撮影して得られたマウスＡの輪郭形状を含む、図２（ａ）に示される反射光画像Ｇ_１と、励起光源１１から出射された励起光をマウスＡに照射することにより、マウスＡから発せられる蛍光を撮像手段１８により撮影して得られた、図２（ｂ）に示される病変部Ｂの蛍光画像Ｇ_２とを生成し、両者を対応づけるようになっている。

画像記憶部４は、画像生成部３において対応づけられた反射光画像Ｇ_１と蛍光画像Ｇ_２とを順次記憶していくようになっている。
制御部６は、ケース９のセンサ２０からの扉１９の閉鎖信号を受けて観察装置本体２を駆動するとともに、画像生成部３を起動して反射光画像Ｇ_１と蛍光画像Ｇ_２とを対応づけさせるようになっている。また、制御部６は、画像記憶部４に複数対の反射光画像Ｇ_１と蛍光画像Ｇ_２とが蓄積された後に、これら複数対の反射光画像Ｇ_１および蛍光画像Ｇ_２を読み出して以下の画像処理を行うようになっている。

まず、図３に示されるように、各反射光画像Ｇ_１を処理して、反射光画像Ｇ_１に含まれるマウスＡの輪郭形状を抽出する。輪郭形状の抽出は、２値化あるいは画素ずらし等の公知の方法により簡易に行うことができる。
次いで、抽出された輪郭形状の重心位置Ｃを求める。重心位置Ｃは、例えば、抽出された輪郭形状の面積を算出し、当該面積を１／２に分割する２本の分割線の交点を算出することにより容易に求めることができる。

次いで、図３に示されるように、各反射光画像Ｇ_１のマウスＡの輪郭形状の長手方向とマウスＡの向き（矢印Ｄ）を求める。長手方向は輪郭線が最も離れる画素を結ぶことにより簡易に求めることができる。また、マウスＡの向きＤは、目、ひげ、鼻、尻尾等の頭部と尾部とを区別するための特徴部分を抽出することにより簡易に求めることができる。

そして、制御部６は、求められた反射光画像Ｇ_１におけるマウスＡの輪郭形状の重心位置ＣとマウスＡの輪郭形状の長手方向とその向きＤとに基づいて、各反射光画像Ｇ_１に対し表示位置情報と回転角度情報とを付与する。すなわち、制御部６は、各反射光画像Ｇ_１について算出された重心位置Ｃが等間隔に縦横に配列され、かつ、マウスＡの輪郭形状の長手方向の向きＤが、全ての反射光画像Ｇ_１について一致するように、各反射光画像Ｇ_１に対し表示位置情報と回転角度情報とを付与する。

このようにして付与された表示位置情報と回転角度情報とを用いることによって、反射光画像Ｇ_１は、図４に示されるように、縦横線Ｋに沿って等間隔に配置されたポイントに、各重心位置Ｃを一致させ、かつ、全ての反射光画像Ｇ_１における矢印Ｄが同一方向に向くように配列することができる。

そして、制御部６は、このようにして反射光画像Ｇ_１に付与された表示位置情報と回転角度情報とを、該反射光画像Ｇ_１に対応づけて記憶されている蛍光画像Ｇ_２に対して付与するようになっている。本実施形態においては、制御部６は、表示部５の画面上において、１５枚の蛍光画像Ｇ_２を３行５列に配列して表示するようになっている。
これにより、蛍光画像Ｇ_２を、図５に示されるように配列表示することができるようになっている。このとき、各蛍光画像Ｇ_２に対応する反射光画像Ｇ_１は、図６に破線で示されるように、輪郭形状が正しく揃えられて配列されている。

このように構成された本実施形態に係る蛍光観察装置１の作用について、以下に説明する。
本実施形態に係る蛍光観察装置１を用いてマウスＡの蛍光観察を行うには、操作者は、蛍光薬剤を投与したマウスＡを睡眠させた状態で観察装置本体２のケース９内のステージ７上に固定し、ケース９の扉１９を閉じる。

ケース９の扉１９にはセンサ２０が設けられているので、扉１９が閉じられたことを示す信号がセンサ２０から制御部６に送られる。
制御部６においては、観察装置本体２および画像生成部３に起動信号が送られ、観察装置本体２により反射光画像Ｇ_１および蛍光画像Ｇ_２の取得が行われる。

すなわち、制御部６からの起動信号に応じて、観察装置本体２の可視光源１０から可視光が出射され、ステージ７上のマウスＡに照射される。マウスＡの表面における反射光は、対物レンズ１６により集光され、撮像手段１８により撮影される。撮影手段１８により取得されたマウスＡの輪郭形状を含む反射光画像Ｇ_１は、画像生成部３に送られて、一旦保持される。

次いで、励起光源１１から励起光が出射され、ステージ７上のマウスＡに照射される。マウスＡにおいては、癌等の病変部Ｂに特異的に集積している蛍光薬剤が励起されて蛍光が発生し、対物レンズ１６により集光され撮像手段１８により撮影される。撮影手段１８により取得された病変部Ｂの形に高輝度を有する蛍光画像Ｇ_２は、画像生成部３に送られて、保持されていた反射光画像Ｇ_１と対応づけられ、画像記憶部４に記憶される。

同一個体のマウスＡについて経時的な蛍光観察を行う場合には、ケース９の扉１９を開けて、マウスＡを取り出し、覚醒させて、平常通りの活動をさせた後、再度睡眠させて上記工程を繰り返すことにより、複数対の画像Ｇ_１，Ｇ_２をそれぞれ対応づけて画像記憶部４に蓄積するように記憶することができる。異なる個体のマウスＡについて、蛍光観察を行う場合には、ケース９の扉１９を開けて、マウスＡを取り出し、睡眠状態の別のマウスＡに入れ替えて、上記工程を繰り返す。

そして、例えば、１５対の画像Ｇ_１，Ｇ_２が画像記憶部４内に蓄積されたときには、制御部６は、反射光画像Ｇ_１に画像処理を施して、重心位置Ｃとマウスの向きＤとを算出し、図４に示されるように、重心位置Ｃが等間隔に配列され、かつ、マウスの向きＤが同一方向に向かうような表示位置情報と回転角度情報とを各反射光画像Ｇ_１に付与する。

そして、各反射光画像Ｇ_１に付与された表示位置情報と回転角度情報とを、該反射光画像Ｇ_１に対応する蛍光画像Ｇ_２を付与することにより、図６に示されるように全てのマウスＡを等間隔に、かつ同一方向に向けて配列した状態の蛍光画像Ｇ_２を図５に示されるように表示部５に表示することができる。

このように構成された本実施形態に係る蛍光観察装置１によれば、同一個体のマウスＡまたは異なる複数のマウスＡについて、時間間隔をあけて取得された蛍光画像Ｇ_２を正しく整列させた状態で表示部５に表示することができる。したがって、同一個体における病変部Ｂの形状の経時的な変化を観察する場合においては、変化の様子を容易に観察でき、微妙な変化も見逃すことなく観察することができるという利点がある。また、異なる複数の個体についての病変部Ｂの形状を対比観察することができ、個体の相違による病変部Ｂの相違を容易に発見することができる。

比較のために、上記画像処理を施すことなく、取得された複数の反射光画像Ｇ_１および蛍光画像Ｇ_２をそのまま配列して表示した場合を図７，図８にそれぞれ示す。この図８によれば、表示画面上において病変部Ｂの位置が上下に変動し、しかも、回転している蛍光画像Ｇ_３も存在するため、病変部Ｂの位置がマウスＡ内において変化しているのか、形状が変化しているのかについて、迅速かつ確実に判断することが困難である。

これに対して、本実施形態に係る蛍光観察装置１によれば、図４に示されるように、全てのマウスＡの輪郭形状を正しく整列させた状態で、図５に示されるように、対応する蛍光画像Ｇ_２を配列表示するので、マウスＡの輪郭形状内における病変部Ｂの位置が微妙な変化や、形状の微妙な変化を容易に発見することができるという利点がある。

さらに、本実施形態においては、上述したように、時間間隔をあけて行われる画像Ｇ_１，Ｇ_２の取得に際して、その都度、ステージ７上にマウスＡを固定する作業が行われるが、この固定作業においては、撮像手段１８の視野範囲内にマウスＡのほぼ全体が入るように大まかに位置決めするだけで済む。すなわち、生成された蛍光画像Ｇ_２を移動して、マウスＡが正しく整列されるように配列して表示するので、ステージ７上に正しく位置決めして固定する必要がない。

その結果、マウスＡの固定作業を簡易に行って、観察時間を短縮することができる。
特に、創薬スクリーニングを行う場合等、多数のマウスＡについて画像取得を行う必要がある場合には、マウスＡの入れ替えに要する時間を短縮してスピーディに多数の蛍光画像Ｇ_２を蓄積することができるという利点がある。

また、本実施形態においては、励起光源１１を含む観察光学系８をケース９内に収容し、扉１９の閉鎖を検出して励起光源１１から励起光を出射させることとしたので、励起光が外部に漏れる不都合を未然に防止することができるという利点がある。

なお、本実施形態においては、蛍光画像Ｇ_２のみを配列表示する場合について説明したが、これに代えて、対応づけて記憶されている蛍光画像Ｇ_２と反射光画像Ｇ_１とを重ね合わせて表示することにしてもよい。

また、本実施形態においては、実験小動物としてマウスＡを例示したが、これに限定されるものではなく、他の任意の実験小動物の蛍光観察に適用してもよい。
また、本実施形態においては、１５枚の蛍光画像Ｇ_２を配列する場合を例示したが、これに代えて、任意の枚数、任意の行数および列数の蛍光画像Ｇ_２を表示することにしてもよい。また、１列あるいは１行の蛍光画像Ｇ_２を表示することにしてもよい。
また、制御部６においては、取得された複数枚の蛍光画像Ｇ_２に基づいて、病変部Ｂの面積、平均輝度、最高輝度等を算出し、これらを用いて病変部Ｂの解析を行うこととしてもよい。

また、本実施形態においては、複数枚の蛍光画像Ｇ_２を配列して一度に表示する場合について説明したが、これに代えて、複数枚の蛍光画像Ｇ_２を１枚ずつ順次表示する場合に適用してもよい。
この場合には、制御部６において算出された重心位置ＣおよびマウスＡの向きＤを全ての画像において一致させるように表示すればよい。

このようにすることで、同一個体のマウスＡの経時変化をわかりやすく観察することができる。
また、異なる個体の複数のマウスＡを対比観察する場合には、病変部Ｂの大きさや位置の相違をより明確に観察することができ、微妙な相違も見逃すことなく観察することができるという利点がある。

また、本実施形態においては、同一倍率の反射光画像Ｇ_１と蛍光画像Ｇ_２とを対応づけて記憶し、反射光画像Ｇ_１に基づいて蛍光画像Ｇ_２の配列位置および向きを調節することとしたが、これに代えて、異なる倍率の反射光画像Ｇ_１と蛍光画像Ｇ_２とを対応づけて記憶することにしてもよい。この場合には、病変部Ｂが反射光画像Ｇ_１におけるマウスＡの輪郭形状の重心位置Ｃからオフセットしていることがあるので、蛍光画像Ｇ_２における表示位置情報としては、反射光画像Ｇ_１における並進移動量に蛍光画像Ｇ_２と反射光画像Ｇ_１との倍率比率を乗算した値を設定すればよい。

本発明の一実施形態に係る蛍光観察装置を示す全体構成図である。図１の蛍光観察装置により取得された（ａ）反射光画像および（ｂ）蛍光画像の一例を示す図である。図１の蛍光観察装置により取得された反射光画像において算出された重心位置およびマウスの向きを示す図である。図１の蛍光観察装置による複数の反射光画像を用いた表示位置の調節例を示す図である。図４の反射光画像による表示位置の調節量に基づいて蛍光画像の表示位置を調節した表示例を示す図である。図４の反射光画像（破線）と図５の蛍光画像とを重ね合わせて表示した例を示す図である。図１の蛍光観察装置により取得された複数の反射光画像を、画像処理を施すことなく表示した比較例を示す図である。図１の蛍光観察装置により取得された複数の蛍光画像を、画像処理を施すことなく表示した比較例を示す図である。

符号の説明

Ａマウス（実験小動物）
Ｃ重心位置
Ｄ長手軸方向
Ｇ_１反射光画像（明視野画像）
Ｇ_２蛍光画像
１蛍光観察装置
３画像生成部
４画像記憶部
５表示部
６制御部（輪郭抽出部、画像位置調節部、画像解析部）
８観察光学系
９ケース
１９扉
２０センサ

Claims

実験小動物の明視野画像と蛍光画像とをそれらの相対位置を対応づけて複数対記憶する画像記憶部と、
該画像記憶部に記憶された複数の蛍光画像を少なくとも一方向に配列して表示する表示部と、
各明視野画像における実験小動物の輪郭形状を抽出する輪郭抽出部と、
該輪郭抽出部により抽出された実験小動物の輪郭形状の重心位置および長手軸方向とその向きを算出し、前記重心位置が等間隔に配列され、かつ、該実験小動物の輪郭形状が同一方向に向かう表示位置情報と回転角度情報とを各前記明視野画像およびそれに対応する各前記蛍光画像に付与し、該表示位置情報および前記回転角度情報に基づいて各前記明視野画像に対応する各前記蛍光画像の表示位置を調節する画像位置調節部を備える蛍光観察装置。
実験小動物の明視野画像と蛍光画像とをそれらの相対位置を対応づけて複数対記憶する画像記憶部と、
該画像記憶部に記憶された複数の蛍光画像を切り替えて表示する表示部と、
各明視野画像における実験小動物の輪郭形状を抽出する輪郭抽出部と、
該輪郭抽出部により抽出された実験小動物の輪郭形状の重心位置および長手軸方向とその向きを算出し、前記重心位置が一致し、かつ、該実験小動物の輪郭形状が同一方向に向かう表示位置情報と回転角度情報とを各前記明視野画像およびそれに対応する各前記蛍光画像に付与し、該表示位置情報および前記回転角度情報に基づいて各前記明視野画像に対応する各前記蛍光画像の表示位置を調節する画像位置調節部を備える蛍光観察装置。
実験小動物の明視野画像および蛍光画像を取得する観察光学系と、
該観察光学系により取得された明視野画像と蛍光画像とをそれらの相対位置を対応づけて複数対記憶する画像記憶部とを備え、
該画像記憶部に記憶された複数の蛍光画像を前記表示部に表示する請求項１または請求項２に記載の蛍光観察装置。
前記画像記憶部に記憶された蛍光画像を解析する画像解析部を備える請求項３に記載の蛍光観察装置。
前記観察光学系を収容して遮光するケースを備え、
該ケースに、開閉可能な扉と、該扉の開閉を検出するセンサとが備えられ、
該センサにより扉が閉鎖されたことが検出された場合に、前記観察光学系により明視野画像および蛍光画像の取得が行われる請求項３または請求項４に記載の蛍光観察装置。