JP4965000B2 - 肝臓関連疾患治療薬 - Google Patents
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Description
なお、本願は、2009年8月28日出願の日本国特許出願第2009−198166号に対して優先権を主張するものであり、日本国特許出願第2009−198166号の全内容を本願に組み込むものである。
例えば、血友病は、肝臓にて発現する第VIII因子または第IX因子といった血液凝固因子をコードする遺伝子の変異に起因する遺伝疾患であり、その治療は欠損したこれらの因子を体外から補充することによって行われる。しかし、患者自身の免疫応答が循環抗凝固因子を誘発する場合があり、治療の妨げとなることがある。
(1)脂肪組織由来多系統前駆細胞を含む肝臓関連疾患治療薬;
(2)脂肪組織由来多系統前駆細胞が、
(a)脂肪組織由来細胞集団から赤血球を除去し、前脂肪組織由来多系統前駆細胞集団を形成し、
(b)得られた前脂肪組織由来多系統前駆細胞集団を培養し、
(c)培養した前脂肪組織由来多系統前駆細胞集団から脂肪組織由来多系統前駆細胞以外の細胞を除去する
ことで得られる細胞集団である、(1)記載の治療薬;
(3)経門脈的に投与される、(1)または(2)記載の治療薬;
(4)肝臓関連疾患が非炎症性である、(1)〜(3)のいずれか記載の治療薬;
(5)肝臓関連疾患が血液凝固障害、代謝性疾患および肝疾患から選択される、(1)〜(3)のいずれか記載の治療薬;
(6)肝臓関連疾患が血友病または家族性高コレステロール血症である、(4)または(5)記載の治療薬;
(7)脂肪組織由来多系統前駆細胞を対象に投与することを特徴とする肝臓関連疾患を治療する方法;および
(8)肝臓関連疾患治療に用いられる脂肪組織由来多系統前駆細胞。
また、本発明は、さらに別の態様において、肝臓関連疾患治療に用いられる脂肪組織由来多系統前駆細胞に関する。
1−1.脂肪組織の採取
脂肪組織の採取は、インフォームドコンセントを受けた対象5人(20〜60歳の男性4人および女性1人)から、国際公開第2008/153179号パンフレットに記載の方法に従って行った。
採取した脂肪組織を刻み、0.075%コラゲナーゼ(Sigma Aldrich社製)を含むハンクス緩衝溶液(HBSS;GIBCO Invitrogen社製)中、37℃で1時間消化した。消化産物をCell Strainer(BD Bioscience社製)でろ過し、800×gで10分間遠心分離した。次いで、Lymphoprep(d=1.077;Nycomed社製)を用いて比重法により赤血球を除去した。
得られた細胞を、10%ウシ胎児血清(FBS; Hyclone社製)を含むDMEM(GIBCO Invitrogen社製)培地に播種した。37℃で24時間培養し、付着細胞をPBSで洗浄後、0.2g/L EDTA溶液(ナカライテスク社製)で処理し、剥離された細胞集団を脂肪組織由来多系統前駆細胞(hADMPC)として得た。
(1)hADMPCの増殖
1−2で得たhADMPCを、ヒトフィブロネクチンコートディッシュ(BD BioCoat社製)に、10,000細胞/cm2の密度で播種し、60% DMEM−低グルコース、40%MCDB−201(Sigma Aldrich社製)、1×ITS(GIBCO Invitrogen社製)、1nM デキサメサゾン(Sigma Aldrich社製)、100μMアスコルビン酸−2−リン酸エステル、10ng/ml EGF(PreproTec社製)、および5%FBSからなる培地を用いて培養した。2〜3回継代したhADMPCは、直径25〜30μm程度の大きい扁平な細胞からなる単層構造を示した。本発明においては、hADMPCを5〜6回継代した細胞を移植に用いた。移植に用いたhADMPCについて、以下の発現特性解析を行った。
5〜6回継代したhADMPCについて、FACS解析によりABCG−2、SSEA−4、CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD105、CD117、CD133およびCD166の発現を調べた。本発明におけるhADMPCは、間葉系幹細胞または神経幹細胞で発現されるが、ES細胞にて発現されない表面マーカーであるCD29およびCD44(ヒアルロン酸受容体)、ならびにCD73、CD105(エンドグリン)、およびCD166を発現し、さらにSSEA−4を発現していた。一方、Mol Biol Cell 13, 4279-4295. (2002)に報告されている脂肪由来幹細胞(hADSC)は、造血系列のマーカーであるCD45、造血幹細胞マーカーであるABCG−2、CD34、およびCD133について陰性であった。以上の結果から、本発明におけるhADMPCは、hADSCとは異なる細胞集団であることを確認した。
5〜6回継代したhADMPCについて、RT−PCR解析により、islet−1、Nkx2.5およびGATA−4のmRNAの発現を調べた。hADMPCは、未分化マーカーであるislet−1、および肝前駆細胞マーカーであるGATA−4を発現し、さらにNkx2.5を発現していた。一方、hADSCは、islet−1、GATA−4およびNkx2.5のいずれも発現が見られなかった。
上記方法で得られたhADMPCについて、国際公開第2008/153180号パンフレットに記載の方法に従い、膵臓細胞(インスリン分泌細胞)、肝細胞、心筋芽細胞、脂肪細胞または骨組織へ分化誘導されることを確認し、多系統の組織の細胞に分化する能力を有することが確認された(データ示さず)。
2−1.hADMPCの移植
家族性高コレステロール血症のモデル動物である渡辺遺伝性高コレステロールウサギ(WHHLウサギ;北山ラベス社より入手)を50mg/kg量のペントバービタルで麻酔をかけ、胸部の端まで切開した。次いで、実施例1−3(1)で得たhADMPC 5×107細胞をHBSS 3mLに懸濁し、24ゲージのシリンジを用いて経門脈的に投与した(hADMPC移植群)。また、対照群として、前記方法においてhADMPC含有懸濁液の代わりにHBSSを投与したモデルを以下の解析に用いた。
本発明では、ウサギにヒトの細胞を移植するため、次の方法に従ってウサギに免疫抑制および抗ウィルス剤処置を施した。hADMPCを移植した日(day0)の前日(day−1)から犠牲死させるまでの間、シクロスポリンA(6mg/kg/day)およびラパマイシン(0.05mg/kg/day)を筋肉内投与した。メチルプレドニソロンをそれぞれ、3mg/kg/day(day1〜day7)、2mg/kg/day(day8〜14)、1mg/kg/day(day15〜21)、および0.5mg/kg/day(day22〜犠牲死させる日)の量で段階的に投与した。シクロフォスフォアミド(20mg/kg/day)は、day0、2、5および7に投与した。また、免疫抑制で易感染性となったウサギのウィルス感染を防ぐために、ガンシクロビル(2.5mg/kg/day i.m.)を投与した。対照群についても、上記と同様の免疫抑制処置を施した。
(1)脂質のプロファイリング
hADMPC移植群における血清中のコレステロールの量的・質的変化を解析した。
hADMPC移植群(n=7)、hADSC(Zuk etal.の方法による)を移植した群(n=3)および対照群(n=5)について、移植前後に非絶食時のウサギ血清を採取した。アッセイキット(和光純薬社製)を用いて、血清総コレステロールを移植後12週目まで測定した。
図1に示されるように、hADMPC移植群では、移植後3週間以内には血清総コレステロールが大幅に低下しており、測定期間全体として減少の傾向が維持されていた。hADMPC移植前のWHHLウサギの血清総コレステロールレベルは500−800mg/dLであるが、移植後3週目では、hADMPC移植群は約400mg/dLであり、約639mg/dLである対照群と比較して血清総コレステロールの有意な減少が見られた。
図2に示されるように、hADMPC投与後4週間で、LDLコレステロールのピークが明らかに減少し、HDLコレステロール画分が検出された。HDLレベルの上昇は、従来の治療法でLDLを低下させた後、またはLDL受容体cDNAをアデノウィルスベクターで導入した際に観察される現象であって、冠状動脈性心臓病のリスクを低減することが知られている。
移植後のhADMPCの生体内での肝細胞への分化を確認するために、hADMPC移植群の肝臓における成熟肝細胞マーカーのmRNAの発現レベルを解析した。
WHHLウサギにhADMPCを移植し、12週間後に犠牲死させ、肝臓を摘出した。肝臓のtotal RNAを単離し、ABI Prism 7900 Sequence Detection System(Applied Biosystems社製)にて定量的RT−PCRを行い、成熟肝細胞マーカーとしてヒトアルファ1アンチトリプシン(hAAT1)、ヒトアルブミン(hAlb)、ヒト第IX因子(hFactor9)、ヒトGATA4(hGATA4)、ヒト肝細胞核因子3β(HNF−3beta)、ヒトLDL受容体(hLDL−R)およびヒトグリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素(GAPDH)の発現を分析した。定量的RT−PCRにおいて、移植前のhADMPCをコントロールに用い、mRNAレベルをヒトGAPDHの発現で標準化した。各マーカーについて用いたTaqManプローブを以下の表1に示す。
移植後hADMPCの生体内における肝細胞への分化と機能発現を確認するために、hADMPC移植群の血清におけるヒトアルブミンタンパク質の存在を、イムノブロットおよびELISAにより慣用の方法に従って解析した。
ここで用いた抗ヒト特異的アルブミン抗体(goat polyclonal, bovine, mouse and pig ALB-adsorbed, affinity purified、Bethyl Laboratories社製)は、hADMPC移植前の血清のイムノブロットによって、ウサギ血清アルブミンを検出しないことを確認した。
ELISAの結果、移植後3週間でヒト血清アルブミンが検出され、その後の解析期間中発現が見られた。hADMPC移植群でヒトアルブミンの産生が確認されたことは、ADMPCに由来する、生存および機能する肝細胞が存在することを意味している。
hADMPCが適切な場所で肝細胞へ分化していることを確かめるために、hADMPC移植群の肝臓切片を組織化学的に解析した。
トレーサーとしてのDiO(3,3’−ジオクタデシルオキサカルボシアニンペルクロラート;Sigma Aldrich社製)を用いた。DiOで前処理したhADMPC(DiO−hADMPC)を、WHHLウサギに経門脈的に移植した。移植後1週目でウサギを犠牲死させ、作製した組織切片を蛍光顕微鏡下で観察した。DiO−hADMPCは、門脈周辺部位に局在し、移植後一週間で形態的に変化しながら、肝小葉中心部方向の肝実質へ移動した。
結果を図4および5にそれぞれ示す。蛍光顕微鏡下で観察したところ、ヒトアルブミンおよびLDL受容体陽性細胞が、肝実質の静脈周囲でホスト細胞と接触し、一体となって分散して存在していた。ヒトアルブミンが陽性である細胞の存在から、移植後のhADMPCから肝細胞へ分化したこと、およびこの細胞がLDL受容体陽性であることから、分化した肝細胞が機能していることを確認した。
hADMPC由来肝細胞によるLDLの取込みを生体外で確かめるため、hADMPC移植群の肝臓切片を組織化学的に解析した。
血中脂質が正常なドナーから、逐次超遠心し、生理食塩水−EDTAで透析し、0.2μmフィルターによりろ過滅菌してヒトLDL(密度 1.019〜1.063g/ml)を単離し、DiOでラベルしてDiO−LDLを作製した。WHHLウサギにhADMPCを経門脈的に移植し、12週間後に犠牲死させた。得られた肝臓の組織切片を作製し、組織切片を10μg/mL DiO−LDL含有無血清DMEM培地中で、37℃で24時間インキュベートした。洗浄後、10%ホルマリンで固定し、厚み5μmで切断してPermaFlour(日本ターナー社製)にマウントし、BioZeroレーザースキャニングマイクロスコープ(キーエンス社製)を用いて解析し、生体外におけるDiO−LDLの移植細胞による取り込みを測定した。
hADMPC移植群におけるLDLの代謝を確認するために、hADMPC移植群から採取した血清を分析した。
WHHLウサギ(8週齢、北山ラベス社より入手)を、ペントバルビタール(50mg/kg)を用いて麻酔した。腹膜を切開し、HBSS(20℃)に懸濁したhADMPC(高用量;3×107細胞/ウサギ、n=2、低用量;5×106細胞/ウサギ、n=2)または生理食塩水3mlを、18ゲージのシリンジを用いて経門脈的に投与した(それぞれ、hADMPC移植群(n=5)および対照群(n=2))。各ウサギに対して、実施例2−2と同様の免疫抑制を施し、8週間目にLDL代謝アッセイを行った。[I−125]ヒトLDL(Biomedical Technologies Inc.社製)をウシ血清アルブミン2mg/mlを含む生理食塩水に懸濁し、hADMPC移植群および対照群の耳静脈に投与した。投与から一定時間(それぞれ、5分、1時間、2時間、4時間、6時間および28時間)経過した後に、反対側の耳から血液を採取した。20%のトリクロロ酢酸(和光純薬社製)(血清;320μL、100%w/v TCA 80μL)を用いて、125Iラベルしたアポリポタンパク質Bを含むLDLを沈殿させ、得られた沈殿物をシンチレーションカウンター測定に供した。
Claims (6)
- 脂肪組織由来多系統前駆細胞を含む肝臓関連疾患治療薬。
- 脂肪組織由来多系統前駆細胞が、
(a)脂肪組織由来細胞集団から赤血球を除去し、前脂肪組織由来多系統前駆細胞集団を形成し、
(b)得られた前脂肪組織由来多系統前駆細胞集団を培養し、
(c)培養した前脂肪組織由来多系統前駆細胞集団から脂肪組織由来多系統前駆細胞以外の細胞を除去する
ことで得られる細胞集団である、請求項1記載の治療薬。 - 経門脈的に投与される、請求項1または2記載の治療薬。
- 肝臓関連疾患が非炎症性である、請求項1〜3のいずれか1項記載の治療薬。
- 肝臓関連疾患が血液凝固障害、代謝性疾患および肝疾患から選択される、請求項1〜3のいずれか1項記載の治療薬。
- 肝臓関連疾患が血友病または家族性高コレステロール血症である、請求項4または5記載の治療薬。
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