JP4958019B2 - ミトコンドリアdna可変領域塩基配列による水産魚介類の標識および識別のための方法 - Google Patents
ミトコンドリアdna可変領域塩基配列による水産魚介類の標識および識別のための方法 Download PDFInfo
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Description
養殖場において継代した雌親個体から採取された第1の試料のミトコンドリアDNA Dループの母系特異的塩基配列(第1の塩基配列)を決定し、
水産魚介類またはその加工品から採取された第2の試料のミトコンドリアDNA Dループの母系特異的塩基配列(第2の塩基配列)を決定し、
第1の塩基配列と第2の塩基配列とを比較し、前記水産魚介類またはその加工品が前記雌親個体の後代であることを同定することによって、前記水産魚介類またはその加工品の種苗または生産履歴を同定することを含む、前記方法に関する。
さらに、本発明は、水産魚介類またはその加工品が、食品である、前記方法に関する。
母系特異的配列の典型的な位置は、Dループのプロリン側末端の塩基を1番目の塩基として、約100〜600番目、好ましくは約150〜450番目の間の塩基配列中に存在する。例えばクロマグロにおいては母系特異的配列は約150〜350番目、マダイにおいては約250〜450番目の間の塩基配列中に存在する。
種特異的配列の典型的な位置は、母系特異的配列と部分的に重複する場合もある。例えばクロマグロにおいては種特異的配列は約150〜700番目、特に約150〜250番目および約600〜700番目に見出すことができる。
1.ミトコンドリアDNAの抽出・精製法
試薬の組成:
(1)P1溶液(再懸濁試薬:250ml、2〜8℃保存)
0.5M EDTA 5.0ml
1M Tris−HCl(pH 8.0) 12.5ml
滅菌水で250mlに増量し、オートクレーブ滅菌する。
(2)P2溶液(溶菌試薬:250ml、室温保存)
SDS 2.5g
NaOH 2.0g
滅菌水で250mlに増量する。
(3)P3溶液(除蛋白沈殿試薬:500ml、4〜8℃保存)
酢酸カリウム 147.3g
酢酸 60.0ml
滅菌水で500mlに増量し、pH 5.5に調整し、オートクレーブ滅菌する。
(1)水産魚介類の組織約0.2g(鱗の場合数枚)の試料を、サンプルチューブに移し、P1溶液を0.4ml添加し、ペスツル棒でサンプルを潰す。
(2)P2溶液を0.4ml添加し、ペスツル棒で軽く混合する。
(3)P3溶液を0.4ml添加し、チューブの底を指で弾いて攪拌する。
(4)室温で5分間、20,000×gで遠心分離し、上澄を別のチューブに移す。
(5)フェノール・クロロホルム溶液を0.4ml添加し、ボルテックスミキサーにかける。
(6)再び遠心分離を行ない、上澄を回収する。
(7)5、6の操作を繰り返す。
(8)得られた上澄の0.6倍容積のイソプロパノールを加える。
(9)20,000×gで30分間遠心分離し、上澄を捨て、70%エタノールで沈殿を洗浄する。
(10)再び遠心分離した後、上澄を捨て、65℃で5分間静置して乾燥させる。
(11)0.1MのTE 30μlに溶解させ、ミトコンドリアDNA溶液とする。
例えば以下の手順に従ってミトコンドリアのDNAのDループ塩基配列を増幅する:
(1)魚介類ミトコンドリアのDNAの塩基配列は、MitoFish(http://mitofish.ori.u-tokyo.ac.jp/)、GeneBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/)などの公開データベース(以下dbと略)から得られる、目的の種と同種、あるいは近縁種のmtDNAの塩基配列中、Dループの両側にあるプロリンtRNAおよびフェニルラニンtRNAの遺伝子配列からPCRプライマーを作製する。なお、dbに含まれていない新規の試料の場合は、近縁種のプライマーで代替えする(成功例:ブリ(実施例3を参照))か、あるいはミトコンドリアDNAのショットガンシークエンスなどにより配列を得る。
10×PCRバッファー:2μl、25mM MgCl2:2μl、2mM dNTPs:2μl、5U/μl Taqポリメラーゼ:0.1μl、16.7pmol/μlプライマー(フォワード):1μl、16.7pmol/μlプライマー(リバース):1μl、精製水:11.3μl。
(4)PCR反応液7.1μlを384ウェルPCRプレートに分注し、Exo SAP IT(USB Co.)を2.9μl添加する。
(5)37℃で15分間反応後、80℃で15分間熱変性する。
PCRでDNAを増幅した後、Exo SAP IT(USB Co.)などにより、PCR産物中のプライマーを消化および未反応dNTPを不活性化し、次いで、増幅に使用した2種のPCRプライマーの各々を用いて、それぞれの末端から、例えば以下の手順でシークエンスを行なう。
(2)シークエンス用カクテルをABI社マニュアルに従って以下の組成で作製する:
フォワード(またはリバース)プライマー:16.7pmol/μlを1μl、5×シークエンスバッファー:2μl、Bigdye:2μl。
(3)ヒートシールで密封し、熱変性96℃ 1分、伸長(96℃ 10秒、50℃ 5秒、60℃ 4分)×30サイクルの条件でサイクルシークエンス反応を行う。
(4)ヒートシールをはがし、125mMのEDTAを2.5μl、エタノールを25μl添加し、1時間、室温で静置する。
(5)4℃、3,273×gで30分間遠心分離する。
(6)PCRプレートを逆さまにしてエタノールを除去する。
(7)冷却した70%エタノールを35μl添加し、同条件で遠心分離する。
(8)エタノールを除去し、65℃に5分間置いて、乾燥させる。
(9)ホルムアミドを5μl添加し、熱変性する。
(10)ABI373型シークエンサーでシークエンスする。
以下に、「SEQUENCHER(登録商標)」を用いる場合の解析手順を示す。
(1)SEQUENCHER(登録商標)にシークエンスのデータをインポートする。
(2)末端のクオリティーの低い配列を除去する。
(3)データベース、または過去のシークエンスデータをシークエンチャーにインポートする。
(4)例えば以下の条件設定において、複数の配列のコンティグを作成し、相同性に基づいて、母系特異的配列、母系変異集中領域および同属異種特異的配列を決定する:
Assembly Algorithm :Dirty Dataをチェック
Optimize Gap placement :Use Re Aligner,Prefer 3’ Gap Placementをチェック
Minimum Match Percentage:80
Minimum Overlap :20。
方法:
1)「MitoFish」(http://mitofish.ori.u-tokyo.ac.jp)から、本まぐろ(太平洋クロマグロ:Thunnus orientalis)のミトコンドリアDNAの塩基配列(GeneBank登録番号AB185022:配列番号1、以下dbと記載)を検索し、プロリンtRNAとプェニルアラニンtRNAの塩基配列からDループ増幅のためのPCRプライマーを以下の通り作製した。
本まぐろのDループDNA増幅のためのPCR共通プライマー配列
フォワードプライマー(プロリン側):
5’-TACCCCTAACTCCCAAAGCTAGG-3’(配列番号2)
リバースプライマー(フェニルアラニン側):
5’-GCTTTCTAGGGCCCATCTTAAC-3’(配列番号3)
3)上記の方法でDループDNAを増幅した後に塩基配列決定を行ない、データベースの本まぐろ(db)のDループの塩基配列(配列番号1)と比較した。
多重整列化の結果を図1に示す(なお、各々のDループ塩基配列は、境港:配列番号20、福岡:配列番号21、養殖成魚:配列番号22、養殖稚魚1〜11:配列番号23〜33とする)。図中、下部の配列はデータベース(db)の太平洋クロマグロのミトコンドリアDループの塩基配列におけるnt(ヌクレオチド)1からnt865までであり、その下部の黒点は、該db太平洋クロマグロと比較した他のマグロとの間で塩基の相違があることを示す。上記プライマーを用いて決定した太平洋クロマグロ14個体のDループDNAは、dbと同じ865塩基であり、各塩基配列はギャップを加えることなく多重整列化することができた。天然および養殖の各成魚間において、個体間の配列の塩基相同性は高く、わずかに6〜22の異なった塩基相違点が太平洋クロマグロ(db)の前半nt175〜586間の29部位に存在していた(表1)。
母系特異的塩基配列、特に母系変異集中領域の塩基配列を増幅するPCR用プライマーを作製することにより、検体から簡易かつ迅速な方法により母系特異的シグナルを得、その母系性から検体の生産履歴を追跡することができる。以下に例を示す。
以下のプライマー対を作製し、天然および養殖の太平洋クロマグロ成魚3尾および稚魚11尾、ならびにミナミマグロおよびビンナガマグロ1尾ずつから抽出したミトコンドリアDNAを鋳型として、タッチダウンPCRにより増幅を行なった。
母系特異的PCRフォワードプライマー(図1、同一母系太平洋クロマグロnt.175〜200:母系特異的変異点7ヶ所):
5’-CTTTCAACATCTTACTTACATCACG-3’(配列番号4)
母系特異的PCRリバースプライマー(図1、同一母系太平洋クロマグロnt.273〜305:母系特異的変異点5カ所):
5’-TTCTTACTGCGTTTAAGTTTACCAG-3(配列番号5)
図2に、PCR増幅産物のアガロース電気泳動の結果を示す。母系が異なる天然太平洋クロマグロおよび養殖太平洋クロマグロからはシグナルは検出されなかったが、同一母系の養殖稚魚11尾から135塩基対の母系特異的DNAが増幅された。したがって、同一母系の養殖稚魚(種苗)が、母系特異的塩基配列によって遺伝子標識されており、該母系特異的塩基配列に特異的に設計されたプライマーを用いたPCRにより容易に検出し得ることを確認した。本明細書において示した系統または産地以外の種苗においても、同様に母系特異的なプライマーを設計し、検体のリアルタイムPCRを行なえば、シグナルの有無によって簡便かつ迅速に母系識別を行うことができる。
方法:
1)「MitoFish」からマダイ(Pagrus major)のミトコンドリアDNA塩基配列(GeneBank登録番号AP002949:配列番号6)を入手し、プロリンtRNAおよびフェニルアラニンtRNAの塩基配列から以下のPCRプライマーを設計して、マダイDループ増幅と塩基配列決定に使用した:
フォワードプライマー(クロマグロ(db)フェニルアラニンtRNA塩基配列から代用):
5’-GCTTTCTAGGGCCCATCTTAAC-3’(配列番号7)
リバースプライマーI(マダイdbプロリンtRNAから設計):
5’-TTTAACCCCCACCATTGGCTCCC-3’(配列番号8)
リバースプライマーII(マダイDループ内塩基配列より再設計):
5’-AGAGGGGGGTAACAATGAGATC-3’(配列番号9)
マダイのDループはいずれも約1054塩基対からなり、太平洋クロマグロ(db)Dループ(869塩基対)より189塩基対長い。4箇所にギャップを挿入することにより多重整列化が可能となった(図3)。特に養殖稚魚10尾間ではDループの配列は全て同一であった。同時に浮遊し採取された受精卵から生じる稚魚のミトコンドリアDループは同じ塩基配列を有することから、これらの稚魚が同一雌親に由来することが明らかとなり、また、同一の雌親に由来する受精卵や稚魚は、そのうちの1個体のミトコンドリアD−ループの塩基配列を決定することにより、全個体を同じ母系集団として容易に標識できることが示された。一方、産地の異なる各個体間では、約1054塩基対中、9〜24塩基の相違点が見られた(表2)。これらの変異のうち、マダイdbのDループnt.273〜311間に9カ所、nt370〜416間に9箇所が集中していたことから、この間を母系特異的領域とした。
方法:
実施例2において決定した母系特異的領域の塩基配列に基づいて以下のプライマーを設計し、天然および養殖のマダイ異母系成魚3尾および同一母系稚魚5尾から抽出したミトコンドリアDNAを鋳型として、タッチダウンPCRにより増幅を行なった:
マダイ母系特異的PCRフォワードプライマー(図3、マダイ稚魚nt.273〜308:母系特異的変異点8ヶ所):
5’-AGAAATAGCAAGTGTTCAAGTATTTATCCCCAAAAC-3’(配列番号10)
マダイ母系特異的PCRリバースプライマー(図3、マダイ稚魚nt.402〜375:母系特異的変異点5カ所):
5’-GTGTTGGTACTTGGTAGACATTTGTCG -3‘(配列番号11)
図4に、PCR増幅産物のアガロース電気泳動の結果を示す。母系が異なる天然および養殖成魚からはシグナルは検出されなかったが、同一母系の養殖稚魚5尾から129塩基対の母系特異的DNAが増幅された。したがって、同一母系の養殖稚魚(種苗)が、母系特異的塩基配列によって遺伝子標識されており、該母系特異的塩基配列に特異的に設計されたプライマーを用いたPCRにより容易に検出し得ることを確認した。
マダイ、ブリ、クロマグロは養殖魚売上げの90%を占め、いずれもスズキ目に属するがマダイはスズキ亜目タイ科,マグロはサバ亜目サバ科、ブリはスズキ亜目アジ科に属する。スズキ目はその他カツオ、マアジなど重要な回遊水産魚を数多く含む。これらの遺伝的類縁性を知るためにDループを比較した。ただし、ブリのミトコンドリアDNA塩基配列はデータベースに登録されていないため、クロマグロのtRNAプライマーで代用した。
鳥取、福岡で水揚げされた天然ブリのミトコンドリアDNAを鋳型として、実施例1において使用したクロマグロのDループ両端プライマー(配列番号2および3)を用いて、約900塩基対のDNAを増幅した。両端プライマーの各々を用いて両鎖シークエンスを行なったところ、フェニルアラニン側では一度で全長を読み取ることができなかったため、第一のプライマーにより得た部分配列から次のプライマーを設計し、全長の塩基配列を決定した。
ブリ逆方向プライマー: 5’-GGTTTAACGCGCAAAAGCCGAG-3’(配列番号12)
鳥取ブリ(配列番号13)と福岡ブリ(配列番号14)とのDループ塩基配列を整列化させるために、配列中1カ所にギャップを必要とした。699塩基中の690塩基配列が相同であり、相違塩基は8塩基であった。さらに試料を増やすことにより、ブリのミトコンドリアDNA Dループの塩基配列で品種(亜種)識別ができる。
なお、同じスズキ目間では、マダイ、マグロおよびブリの間では、随所に短い(最長33個)相同塩基はあるが、ギャップ挿入数が多く、多重整列化ができない状態であった。
MitoFishデータベースから入手した本まぐろ(太平洋クロマグロ:Thunnus orientalis)のミトコンドリアDNAの塩基配列(GeneBank登録番号AB185022:配列番号1)を標準材料として、以下の一般に市販されているマグロ属の種および亜種との間でDループの塩基配列の比較解析を行った:
ビンナガマグロ(Thunnus alalunga):ミトコンドリアDNA塩基配列(GeneBank登録番号AB101291:配列番号16)
メバチマグロ(インド洋産:Thunnus obesus:配列番号17)
キハダマグロ(宮城沖産:Thunnus albacares:配列番号18)
ミナミマグロ(オーストラリア産:Thunnus maccoyii:配列番号19)
上記マグロ6種のDループ塩基配列は869塩基前後であったが、1種あたり10部位前後のギャップを挿入することにより、多重整列化を行うことができた。ただし、ギャップ挿入は22部位あり、特に母系特異的配列前半のnt172〜232に9部位が集中していた。各品種間では869塩基中39〜77塩基の違いがあったが(表3)、その他の領域では相同性を保っていた。特に、nt173〜215にギャップ12部位を含む35部位とnt628〜672にギャップ3部位を含む20部位に相違塩基が集中していた(図5−1〜3)。いずれも部分的に太平洋クロマグロ母系特異的配列と重複するが、ギャップの位置および変異の数が前記母系特異的配列とは明確に異なるので、種識別領域(同属異種識別領域)として特定することができる。
方法:
図1および図3に示すように、マグロおよびマダイのDループ塩基配列を母系により識別することが可能となったが、母系は産卵場所や魚群,あるいは棲息海域で規定される可能性があるので、産地識別に利用できる可能性を調べた。棲息海域が広い回遊魚であるマグロのDループ塩基配列が産地によってどの程度異なるか、メバチマグロ、キハダマグロにおいて比較した。
下記の産地が異なる個体のDループ塩基配列の比較では、ギャップを加えることなしに配列を整列化できた。以下に、同種のマグロでの産地による塩基配列の変異数を示す(括弧内の数値=相違塩基部位数/比較塩基部位数):
メバチマグロ :パラオ/インド洋(18/569)
大西洋/パラオ(28/569)
大西洋/インド洋(35/569)
キハダマグロ :インド洋/宮城沖(12/756)
太平洋クロマグロ:(6〜22/869)
天然のマグロ集団と養殖稚魚との遺伝的相違を調べるために、築地市場に集積される天然のクロマグロと、近畿大学水産研究所から供与されたクロマグロ受精卵および稚魚のD−ループ塩基配列を、上記の方法により決定して比較した。
結果
漁場や水揚場の異なる535尾の太平洋クロマグロのうち、養殖稚魚と同じDループ配列を有する個体は存在しなかった(図6)。この結果から、本発明の方法を実際に用いて、例えば、漁獲された集団中の人工種苗を同定することができ、放流事業における加入量変動調査や、漁獲高に対する放流事業の貢献度を判定することや、育成・販売した種苗が他者により複製された場合に追跡を行うことなどが可能であることの裏付けがなされた。
同一母系の養殖クロマグロ稚魚11尾について、公知のマイクロサテライトマーカーTth208、Tth217、Tth4およびTth7-16(Clark et al., 2004, Mol. Ecol. Notes, 4:70-73)を用いてハプロタイプ分析を行った。少なくとも4パターンのハプロタイプが観察された(図7)ことから、少なくとも3個体の雄親と雌親(1個体)が産卵時に存在したことが示唆される。一方、天然のクロマグロについて同様の分析を行ったところ、分析を行った全個体間でマイクロサテライトパターンが異なり、同一のハプロタイプを示す個体は存在しなかった(データは示さず)。これらの結果から、遺伝的多様性が小さい養殖魚の場合は産卵時に存在する親魚の個体数が少ないので、受精卵全てのマイクロサテライトによるハプロタイプを決定することが可能であり、したがって、mtDNA Dループによる母系識別にマイクロサテライト分析による雄系識別を組み合わせることにより、より精度が高い系統標識が可能になることが示唆される。
Claims (6)
- 水産魚介類またはその加工品のミトコンドリアDNA Dループの塩基配列を決定することにより、該水産魚介類またはその加工品の種苗または生産履歴を同定する方法であって、
養殖場において継代した雌親個体から採取された第1の試料のミトコンドリアDNA Dループの母系特異的塩基配列(第1の塩基配列)を決定し、
水産魚介類またはその加工品から採取された第2の試料のミトコンドリアDNA Dループの母系特異的塩基配列(第2の塩基配列)を決定し、
第1の塩基配列と第2の塩基配列とを比較し、前記水産魚介類またはその加工品が前記雌親個体の後代であることを同定することによって、前記水産魚介類またはその加工品の種苗または生産履歴を同定することを含む、前記方法。 - マイクロサテライトにより核型を決定することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- ミトコンドリアDNA Dループの種特異的塩基配列が1から2以上のギャップの挿入により整列化できるか否かの判定をさらに含む、請求項1または2に記載の方法。
- ミトコンドリアDNAのDループ全長の塩基配列を、ミトコンドリアプロリンtRNA特異的プライマーおよびミトコンドリアフェニルアラニンtRNA特異的プライマーを用いて増幅し、両鎖シークエンシングにより決定することをさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 第1の塩基配列と第2の塩基配列との比較が、母系特異的塩基配列が完全に一致するか否かの比較である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 水産魚介類またはその加工品が、食品である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
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