JP4954615B2 - 走査型レーザ顕微鏡装置 - Google Patents

Description

本発明は、レーザ光で照明した試料像を観察するための走査型レーザ顕微鏡に関する。本発明は、特に、光源からのレーザ光のパワーを正確にモニタすることができる走査型レーザ顕微鏡に関する。

従来、互いに波長が異なる複数のレーザ光を発生する光源と、該光源からの複数のレーザ光を対物レンズを介して試料に照射する照明光学系と、複数のレーザ光の照射により試料から発する光を取得して試料像を得る観察光学系と、光源からの複数のレーザ光が試料に照射される前に当該複数のレーザ光の一部分を参照光として分割する分割装置と、該分割装置で分割された参照光のうち所定波長成分の光を選択する波長選択装置と、該波長選択装置で選択された所定波長成分の光の強度を検出する強度検出装置とを備えるレーザ顕微鏡が知られている（例えば、後記の特許文献１参照。）。

また、レーザ光を射出する光源と、レーザ光を標本上で走査する走査装置と、標本からの光を検出する光検出器と、光検出器からの信号を標本の画像信号に変換して出力する処理装置とを備え、光源から射出されるレーザ光の一部を参照光として検出する参照光検出器と、該参照光検出器からの信号をレーザ光が照明する標本上の位置に対応する補正データに変換して出力する補正データ処理装置と、処理装置が出力する標本の画像信号を補正データ処理装置が出力する補正データに基づいて補正する補正手段とを備えるレーザ顕微鏡も知られている（例えば、後記の特許文献２参照。）。
特開平１１−１７４３３２号公報 特開２００４−２１９５１３号公報

しかしながら、特許文献１に開示されたレーザ顕微鏡では、参照光側に複数のバンドパスフィルタを取り付けたタレット板を用いたり音響光学素子（ＡＯＴＦ）を用いたりして、波長選択して光量モニタしているが、ズーム等で観察する場合に、画素当たりのパワーが分からないという問題がある。

また、特許文献２に開示されたレーザ顕微鏡では、参照光を検出してレーザ光強度が変動してもその影響を受けない画像を得るようにしているが、蛍光検出信号を補正しているため、標本に照射されるレーザ光量が分からないという不都合がある。

本発明は、レーザ照射パワーを定量的に表示することができ、レーザ照射パワーの変動を抑制可能なレーザ顕微鏡を提供する。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の第１の態様は、レーザ光を射出する光源と、該光源から射出されたレーザ光を標本上で走査する走査装置と、前記標本からの光を検出する光検出器と、該光検出器からの信号を前記標本の画像信号に変換して出力する処理装置と、前記光源から射出されるレーザ光の一部を参照光として分離する分離ミラーと、該分離ミラーにより分離された前記参照光を参照光信号として検出する参照光検出器と、前記光源から射出されるレーザ光のパワーを制御するレーザ光制御部とを具備し、前記参照光検出器により検出された参照光信号に基づいて前記標本上の単位面積あたりの照射パワー値を算出する照射パワー算出部と、算出された前記標本上の単位面積あたりの照射パワー値を表示する表示部と、を備え、前記照射パワー算出部が、前記標本と前記参照光検出器との間の光学系の透過率特性データに基づいて、参照光信号を標本上の単位面積あたりの照射パワー値に換算し、該透過率特性データには、前記分離ミラーと前記標本との間の対物レンズを含む光学系の透過率が含まれる走査型レーザ顕微鏡である。

上記本発明の第１の態様においては、前記照射パワー算出部が、前記標本と前記参照光検出器との間の光学系の透過率特性データに基づいて、参照光信号を標本上の照射パワー値に換算することが好ましい。
また、上記本発明の第１の態様においては、前記照射パワー算出部が、前記標本と前記参照光検出器との間の光学系の透過率特性データに基づいて、前記参照光信号を標本上の照射パワー値に換算し、前記レーザ光制御部は、この照射パワー値に基づいて前記光源から射出されるレーザ光のパワーを補正することが好ましい。

さらに、上記本発明の第１の態様においては、前記照射パワー算出部が、前記参照光検出器の分光感度特性データおよび前記標本と前記参照光検出器との間の光学系の分光透過率特性データの少なくとも一方に基づいて、前記参照光信号を前記標本上の照射パワー値に換算することが好ましい。
また、上記本発明の第１の態様においては、前記照射パワー算出部が、参照光信号を前記標本上の単位面積当たりの照射パワー値に換算し、前記表示部は前記単位面積あたりの照射パワー値を表示することが好ましい（この構成を第１の構成とする）。
ここで、上記の単位面積は、標本の走査画像における１画素の大きさとされていてもよい。

また、上記本発明の第１の態様は、標本の位置に配置される照射光量検出器と、前記レーザ光制御部のパワー指令値または前記参照光検出器からの参照光信号と前記照射光量検出器によって測定される前記標本上の照射パワー測定値とを対応付けて記憶するデータ格納部とを備え、前記照射パワー算出部は、前記パワー指令値または前記参照光信号に対応する前記標本上の照射パワー測定値を前記データ格納部から読み出すことによって照射パワーを求める構成とされていてもよい。
この場合には、前記パワー算出部が、前記標本上の照射パワー値を前記標本上の単位面積あたりの照射パワー値に換算し、前記走査型レーザ顕微鏡はこの単位面積あたりの照射パワー値に基づいて、前記標本上の特定領域に対して所望の照射パワー値を達成可能なパワー指令値を特定するパワー指令特定部を備え、前記レーザ光制御部は、前記パワー指令特定部によって特定されたパワー指令値に基づいて光源を制御することが好ましい。
また、前記データ格納部が前記標本上の照射パワー値から換算された前記単位面積あたりの照射パワー値の情報を格納する構成とされていてもよい。

また、上記本発明の第１の構成において、前記照射パワー算出部が、ガウス密度分布に基づいて、参照光信号を前記標本上の単位面積当たりの照射パワー値に換算することとしてもよい。
また、上記本発明の第１の構成において、前記単位面積あたりの照射パワー値を、走査の１画素毎に更新して表示することとしてもよい。

また、上記本発明の第１の構成において、前記単位面積あたりの照射パワー値に基づいて、前記単位面積における照射パワーの時間的積算値を算出して表示することとしてもよい（この構成を第２の構成とする）。
また、上記本発明の第１の態様においては、前記表示部は、前記標本上の照射パワー値を、走査の１画素毎に更新して表示することとしてもよい。
また、上記本発明の第２の構成において、前記照射パワー算出部は、前記単位面積あたりの照射パワーを、一回のレーザ走査を行っている間で積算する構成とされていてもよい。
また、上記本発明の第１の態様において、前記照射パワー算出部は、前記標本上の照射パワーの時間的積算値を算出し、前記表示部はこの時間的積算値を表示する構成とされていてもよい。
この場合には、前記照射パワー算出部は、前記標本上の照射パワー値を、一回のレーザ走査を行っている間で積算する構成とすることが好ましい。
本発明の参考例としての発明の一態様は、レーザ光を射出する光源と、該光源から射出されたレーザ光を標本上で走査する走査装置と、前記標本からの光を検出する光検出器と、該光検出器からの信号を前記標本の画像信号に変換する処理装置と、前記光源から射出されるレーザ光の一部を参照光信号として検出する参照光検出器と、前記光源から射出されるレーザ光のパワーを制御するレーザ光制御部と、前記参照光検出器により検出された前記参照光信号に基づいて前記標本上の単位面積あたりの照射パワー値を算出する照射パワー算出部と、算出された前記標本上の単位面積あたりの照射パワー値を表示する表示部と、を備える走査型レーザ顕微鏡である。

本発明によれば、参照光検出器（レーザパワーモニタ）で検出される値を、途中の光学系の特性を考慮して対物レンズから出射されるレーザ光の照射パワー値に換算して表示するので、標本に対するレーザ照射光量を定量的に把握することができる。
また、ズーム等を行って観察する場合にも、画素あたりの照射パワーを把握することが可能になる。

以下、本発明の参考例としての発明の一参考実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡について、図面を参照して説明する。
図１は、本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡の概略構成を示している。
本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡は、レーザ光を出射する光源部１と、光源部１から出射されたレーザ光を照射光と参照光とに分岐する参照光分離ミラー２と、照射光を反射して標本に指向させるダイクロイックミラー３と、照射光をその光軸に直交するＸＹ２方向に走査する走査装置４と、走査された照射光を標本６に照射し、標本６から発せられる蛍光を集光する対物レンズ５と、該対物レンズ５により集光され、走査装置４およびダイクロイックミラー３を介した蛍光を絞るピンホール部材７と、該ピンホール部材７を通過した蛍光を検出する光検出器８とを備えている。

光検出器８にはシステム制御装置９（処理装置）が接続されている。システム制御装置９は、光検出器８において検出された標本６からの蛍光を処理して表示器１３に観察画像を表示させるようになっている。
また、本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡は、参照光分離ミラー２により分岐された参照光を検出する参照光検出器１０と、該参照光検出器１０により検出された参照光信号を標本６上での照射パワー値に換算し、光源部１へのパワー指令値を補正し、あるいは、システム制御装置９経由で表示器１３に表示させるレーザ光制御器１１とを備えている。すなわち、本実施形態では、レーザ光制御器１１は、光源部１の動作を制御して光源部１が発するレーザ光のパワーを制御する制御手段（後述するパワー指令を特定するパワー指令特定部）と、照射パワー値を算出する照射パワー算出部とを兼ねている（照射パワー算出部の機能はシステム制御装置９が有していてもよい）。

前記光源部１は、レーザ光制御器１１からの波長設定とパワー指令値に基づいて、設定された波長のレーザ光をパワー指令値に応じたパワーで出射するようになっている。
前記参照光分離ミラー２の透過率はｆ２（λ）、反射率は１−ｆ２（λ）である。
前記ダイクロイックミラー３の透過率はｆ３（λ）、反射率は１−ｆ３（λ）である。

前記走査装置４は、ミラーの傾斜角度を変化させ、標本６へ照射される照射光をＸＹ２方向に走査するようになっている。走査装置４のミラーの透過率はｆ４（λ）＝０、反射率は１−ｆ４（λ）＝１である。
対物レンズ５としては、標本６を詳細に観察できるように各種倍率の内で必要な倍率のものが光路上に配置されている。対物レンズ５の透過率はｆ５（λ）、反射率は１−ｆ５（λ）である。なお、f２（λ）、f３（λ）、f５（λ）はレーザ光の波長λの関数である分光透過率として扱っているが、これらの光学素子の波長特性を無視できる場合には定数として扱ってもよい。

標本６は、光路上の適切な位置に配置され、特定波長のレーザ光が照射されると、そのパワーに応じた明るさで、レーザ光とは異なる波長の蛍光が発せられる。
ピンホール部材７は、例えば、複数の異なる開口径のピンホールを適所に設けたプレートからなり、このプレートを電動で回転させることで、いずれかのピンホールを検出光の光路上に配置し、必要なコンフォーカル効果を得ることができるようになっている。

光検出器８は、ピンホール部材７を通過した蛍光のパワーを電流変換する光電子増倍管（ＰＭＴ）や電流電圧変換回路、Ａ／Ｄ変換回路等からなり、蛍光のパワーを検出するようになっている。

参照光検出器１０は、フォトダイオード等からなり、参照光分離ミラー２において反射された参照光を検出するようになっている。
システム制御装置９には操作器１２が接続されている。操作器１２は、走査装置４の走査範囲や走査速度等を設定したり、標本６に照射するレーザ光の波長やパワー指令を設定したり、蛍光観察の開始や終了等を操作するために使用される。表示器１３は、標本６の蛍光画像や、レーザ光制御器１１からの標本６上に換算されたレーザ光の照射パワー値等を表示するようになっている。

このように構成された本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡の作用について、以下に説明する。
本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡を用いて標本を観察するには、まず、操作器１２により、走査装置４の走査範囲や走査速度、光源部１から出射すべきレーザ光の波長やパワー指令値等を設定し、蛍光観察の開始操作を行う。設定されたレーザ光の波長とパワー指令値に基づいてレーザ光制御器１１が光源部１にパワー指令値を設定する信号を出力し、光源部１は設定された波長とパワー指令値に従うパワーのレーザ光Ｐ１を出力する。出力されたレーザ光Ｐ１は、参照光分離ミラー２に入射され、その一部が反射率１−ｆ２（λ）で反射して参照光検出器１０へ入射され、残りが透過率ｆ２（λ）で透過してダイクロイックミラー３へ入射させられる。

ダイクロイックミラー３に入射したレーザ光は反射率１−ｆ３（λ）で反射して、反射率１の走査装置４や透過率ｆ５（λ）の対物レンズ５を介して、標本６へ照射される。レーザ光が標本６に照射されると、標本においては、照射された波長とは異なる波長の蛍光が発せられる。蛍光は、対物レンズ５、走査装置４を介して、ダイクロイックミラー３へ入射され、ダイクロイックミラー３を透過率ｆ３（λ）で透過する。透過した蛍光は、ピンホール部材７を通過して光検出器８により検出され、蛍光のパワーに相当する検出信号がシステム制御装置９に送られる。

参照光分離ミラー２で反射した参照光は、参照光検出器１０へ入射してそのパワーを検出される。検出信号は、レーザ光制御器１１に検出量Ｐ１０として伝達される。レーザ光制御器１１は、予め分かっている参照光分離ミラー２の反射率１−ｆ２（λ）と透過率ｆ２（λ）、ダイクロイックミラー３の反射率１−ｆ３（λ）、走査装置４の反射率１、対物レンズ５の透過率ｆ５（λ）から、検出量Ｐ１０に対して下記の換算を行い、標本６上で照射されるレーザ光のパワーＰ６を計算する。なおλは使用するレーザの波長である。

Ｐ６＝ｆ５（λ）×（１−ｆ３（λ））×ｆ２（λ）／（１−ｆ２（λ））×Ｐ１０

換算された標本６上の照射パワー値Ｐ６は、システム制御装置９を介して表示器１３へ表示される。レーザ光制御器１１は、この照射パワー値Ｐ６を、蛍光観察開始前に操作器１２で設定されたレーザ光のパワー指令値と比較する。レーザ光制御器１１は、照射パワー値Ｐ６がパワー指令値より大きければ光源部１へ出力するパワー指令値を小さくし、パワー指令値より小さければ光源部１へ出力するパワー指令値を大きくする。これにより、照射パワー値Ｐ６がパワー指令値から変動しないように制御される。表示器１３への換算パワーの表示は、操作器１２からミリワット単位・ワット単位を切り換えたり、数値の桁数を変更したりすることが可能である。

上記のように、標本６へレーザ光のパワーが安定的に照射され表示された状態で、システム制御装置９へ伝達された蛍光のパワーに相当する信号は、走査装置４で走査した位置に応じて配列され、蛍光画像となる。生成された蛍光画像は、システム制御装置９を介して表示器１３へ表示される。

本実施形態では、透過率と反射率を加えると１となるように説明した。しかし、本発明がこれに限定されないことは言うまでもない。また、本実施形態では、透過率・反射率等は予め分かっているとして説明した。しかし、観察前に予備実験として、レーザを照射しながら参照光を収集し、換算式の計算の換わりに、パワー指令値または参照光信号と照射パワー測定値との対応関係を示すルックアップテーブルをメモリ（データ格納部）上に構成して、このルックアップテーブルを参照することにより、標本６上へ照射されるレーザ光のパワーへ換算しても構わない。この場合、途中の光学系の特性は、予備実験で得られる収集結果としてメモリ内の値へ反映される。更に、ピンホール部材７・光検出器８や図示しない蛍光を波長毎に分離するダイクロイックミラーは、検出したい蛍光の波長毎に複数あっても構わない。また、算出される数値の精度を向上させるために、参照光検出器１０の分光感度特性ｆ１０（λ）を考慮してもよい。この場合には、上述の式において参照光検出器１０の出力値Ｐ１０の部分を、ｆ１０（λ）×Ｐ１０に置き換える。

以上のように、本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡では、参照光検出器１０を用いて標本６へ照射されるレーザ光のパワーの一部を検出して、標本６上へ照射されるパワー値へ換算して、換算されたパワー値を表示したり、光源部１から出射されるレーザ光のパワーを補正することが可能になる。これにより、この走査型レーザ顕微鏡では、操作者が瞬時に照射パワーを認識したり、照射パワーを安定的に変動を少なく保つことができる。また、各部位での透過率・反射率は波長λを考慮した値を用いることにより、参照光検出器１０の分光感度特性データや標本６と参照光検出器１０との間の光学系の分光透過率特性データとのうちの少なくとも一方を基に標本６上に換算したパワーを得られることから、精度の良い換算パワーを得ることが可能である。
ここで、本実施形態において、レーザ光制御器１１は、上記のパワーＰ６の値を単位面積あたりの照射パワー値に換算し、この単位面積あたりの照射パワー値に基づいて各種の処理を行うようにしてもよい。

次に、本発明の第１の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡について、以下に説明する。
なお、本実施形態の説明において、上述した一参考実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。

本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡はシステム制御装置９における処理において一参考実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡と相違している。システム制御装置９においては、参照光検出器１０で得られた参照光を標本６上での照射パワーだけではなくパワー密度（すなわち、１画素あたりまたは所定の単位面積あたりの照射パワー、１画素を単位面積としてもよい）に換算して表示器１３で表示するように動作する。つまり、本実施形態では、システム制御装置９は、照射パワー算出部の機能を有している。

図２は、本発明の第２の実施の形態のシステム制御装置９でのパワー密度を表示するための動作フローを示す図である。
ステップａ１は、蛍光観察に用いる対物レンズ５を特定し、その対物レンズの開口数（ＮＡ値）から下記の計算式により標本６上でのレーザスポット径を算出する動作である。

φ［ｍｍ］＝Ｋａ／ＮＡ
ここで、φはレーザスポット径、Ｋａは定数である。

ステップａ２は、レーザ光のパワーがガウス分布であるときのレーザスポット径から下記の計算式により分散σを算出する動作である。

σ［ｍｍ］＝φ／６＝Ｋａ／６／ＮＡ

ステップａ３は、蛍光観察に用いる対物レンズ５の倍率と観察時のズーム値から、下記の計算式により標本６上での１画素の１辺の長さ（ｌｘ，ｌｙ）を算出する動作である。

ｌｘ［ｍｍ］＝ｌｙ［ｍｍ］＝Ｋｂ／ＯＢｘ／Ｚｏｏｍ
ここで、Ｋｂは定数、ＯＢｘは対物レンズの倍率、Ｚｏｏｍはズーム倍率である。なお、ズーム倍率は、走査の画角（走査装置４における走査ミラーの振動角度の大きさ）を変化させて観察視野の大小を調整する場合の倍率をあらわす。

ステップｂ１は、１画素の１辺ｌｘ＝ｌｙを基に、画素座標（Ｘ，Ｙ）を算出する動作である。
ステップｂ２は、レーザ光制御器１１経由で、参照光検出器１０により参照光のパワーＰ１０を検出する動作である。

ステップｂ３は、一参考実施形態と同様の換算方法で、参照光のパワーＰ１０を下記の計算式により標本６上での照射パワー値Ｐ６へ換算する動作である。

Ｐ６＝ｆ５（λ）×（１−ｆ３（λ））×ｆ２（λ）／（１−ｆ２（λ））×Ｐ１０

ステップｂ４は、平均μ＝０、分散σ＝Ｋａ／６／ＮＡとして、下記の計算式により画素座標（Ｘ，Ｙ）でのガウス強度分布すなわちパワー密度ＰＤ（Ｘ，Ｙ）を算出する動作である。ここで、ｆ（Ｘ）は画素座標Ｘにおけるガウス強度分布であり、ｆ（Ｙ）は画素座標Ｙにおけるガウス強度分布である。

ＰＤ（Ｘ，Ｙ）＝Ｐ６×ｆ（Ｘ）×ｆ（Ｙ）
＝Ｐ６×１／(√（２π）×σ）×ｅｘｐ｛−（Ｘ−μ）^２／（２×σ^２）｝×１／（√(２π）×σ）×ｅｘｐ｛−（Ｙ−μ）^２／（２×σ^２）｝
＝Ｐ６×１８／１．２２^２／π×ＮＡ^２×ｅｘｐ｛−１８／１．２２^２×ＮＡ^２×（Ｘ^２＋Ｙ^２）｝

ステップｂ５は、画素座標（Ｘ，Ｙ）に応じたパワー密度ＰＤ（Ｘ，Ｙ）を表示する動作である。ステップｂ６は１フレーム分の走査が終了したか否かを確認する動作である。ステップｂ７は、画素座標（Ｘ，Ｙ）毎に１フレーム分走査している時間のパワー密度ＰＤ（Ｘ，Ｙ）を時間積分し、各画素の総和を表示する動作であり、フレーム更新毎にこの表示は更新される。

なお、ステップａ１からａ３は蛍光観察開始前の設定時に行われる動作であり、ステップｂ１からｂ６は、蛍光観察開始後の走査中に１画素ずつ画素座標（Ｘ，Ｙ）がずれるたびに繰り返される動作である。また、ステップｂ７は１フレーム分の走査が終了するたびに繰り返される動作である。

このように構成された第１の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡において、まず、蛍光観察開始前に、システム制御装置９はステップａ１からａ３のように、使用する対物レンズ５のＮＡ値と使用する対物レンズ５の倍率ＯＢｘと観察時のズーム値Ｚｏｏｍのデータを収集する。このＮＡ値から、標本６上でのレーザ光のスポット径φ［ｍｍ］とレーザ光がガウス密度分布である場合の分散σ［ｍｍ］を算出し、倍率ＯＢｘとズーム値Ｚｏｏｍから標本６上での１画素の１辺ｌｘ［ｍｍ］＝ｌｙ［ｍｍ］を算出し、上記各情報を、システム制御装置９内の図示しないメモリへ格納しておく。

操作器１２により蛍光観察の開始操作が行われると、光源部１からレーザ光が出力されると共に、走査装置４により標本６上でレーザ光が走査される。この時、レーザ走査の中心である画素位置（Ｘ，Ｙ）にはガウス密度関数に則ったパワーのレーザ光が標本６上に照射されている。ステップｂ１により画素位置（Ｘ，Ｙ）を把握したシステム制御装置９は、ステップｂ２において、レーザ光制御器１１経由で参照光検出器１０により、参照光のパワーＰ１０を検出し、ステップｂ３において、一参考実施形態と同様の換算方法で、参照光のパワーＰ１０を標本６上での照射パワー値Ｐ６に換算する。

さらに、ステップｂ４において、図示しないメモリへ格納していた値を読み出して、平均μおよび分散σとして、画素座標（Ｘ，Ｙ）でのガウス強度分布すなわちパワー密度ＰＤ（Ｘ，Ｙ）を算出し、ステップｂ５において、画素座標（Ｘ，Ｙ）に応じたパワー密度ＰＤ（Ｘ，Ｙ）を表示器１３へ表示する。

さらに、ステップｂ６のように１フレーム分の走査を終了したか否かを確認する。走査が終了した場合にはステップｂ７のように画素座標（Ｘ，Ｙ）毎に１フレーム分走査している時間のパワー密度ＰＤ（Ｘ，Ｙ）を時間積分し、その時間積分した各画素のパワー密度ＰＤ（Ｘ，Ｙ）の総和を表示器１３に表示する。

走査装置４によりレーザ光は走査されており、画素座標（Ｘ，Ｙ）は次の画素へ移動しており、再度ステップｂ１からｂ７の動作を繰り返す。画素座標（Ｘ，Ｙ）が予め設定された１フレームサイズに到達したら、再度走査初期位置へ戻り、同様の動作を繰り返すか、もしくは蛍光観察を終了する。

以上のように、本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡によれば、対物レンズ５を切り換えたりズームを変更して観察しても、画素単位での標本６上に照射されるレーザ光の照射パワー値を表示できる。また、画素単位だけでなく様々な単位面積当たりのパワー密度として表示することが可能である。

さらに、画素毎に表示されるパワー密度が走査位置に応じて更新されるため、走査位置に応じたガウス密度分布の影響を受ける画素位置の経時変化を確認できる。また、複数の隣り合う画素を選択もしくは特定し、そのパワー密度を足し合わせて表示することで、観察時に着目している箇所の照射パワーを確認することも可能となる。さらに、時間積分した各画素のパワー密度の総和を表示するため、１フレームを走査した間に照射したレーザ光の換算照射パワー値をフレーム毎に更新された値で確認できる。

図３に、本発明の第１の実施形態において、観察される細胞の画像と照射するレーザ光のスポットの一例を示す。図３（ａ）、図３（ｅ）はズーム値Ｚｏｏｍが１の場合に観察された細胞の状態を示す画像の一例である。これらの図では、細胞は、Ｘ６画素目、Ｙ５画素目に位置している。図３（ｂ）はズーム値Ｚｏｏｍが１で照射されるレーザ光のスポット径が１画素相当である場合を示す図の一例である。図３（ｃ）はズーム値Ｚｏｏｍが１で照射されるレーザ光のスポット径が３画素相当である場合を示す図の一例である。図３（ｂ）、図３（ｃ）は、画角に対してレーザ走査がＸ６画素目・Ｙ５画素目になった状態を示す。図３（ｄ）はズーム値Ｚｏｏｍが１０の場合に観察された細胞の状態を示す画像の一例であり、図３（ａ）で観察された細胞を１０倍ズームで観察した画像である。

なお、ここでは説明を簡略化するために、観察するためにレーザを走査する領域を、Ｘ１０画素・Ｙ１０画素として説明するが、これに限定されないことは言うまでもない。
まず、図３（ｂ）に示すように、照射レーザのスポット径が１画素相当である場合について説明する。

図３（ａ）に示すように、ズームが１倍の場合に、細胞がおおよそ１画素のサイズに相当し、かつ、照射するレーザ光のスポット径φ［ｍｍ］は、図３（ｂ）に示されるように、約１画素のサイズに相当するようにシステムが設定されているものとする。このとき、レーザスポットの光量総量がＰ［ｍＷ］であったと仮定すると、Ｘ１画素目・Ｙ１画素目からＸ１０画素目・Ｙ１０画素目まで走査する間の内で、Ｘ６画素目・Ｙ５画素目にレーザを照射しているタイミングで、細胞に対してレーザスポットの光量総量である光量Ｐ［ｍＷ］が照射される。

この細胞をズーム１０倍で観察した場合、図３（ｄ）に示すように観察される。細胞は約１０×１０＝１００画素のサイズに相当する。レーザ光のスポット径、光量総量が前述と同様のφ［ｍｍ］、Ｐ［ｍＷ］であったと仮定すると、図のように１画素のほぼ１０倍の大きさのレーザスポットで標本６が走査される。レーザスポットがＸ１画素目・Ｙ１画素目からＸ１０画素目・Ｙ１０画素目まで走査する間に、その走査位置に応じて各画素におけるレーザ光の照射光量は変化する。１フレーム全体（すなわちＸ１画素目・Ｙ１画素目からＸ１０画素目・Ｙ１０画素目まで）を走査した場合に、各画素に照射されるレーザ光の光量は、図２のフローチャートの処理に従って算出される。１フレームの走査によって細胞に照射されるレーザ光量の合計を算出するには、画像上で細胞に含まれるすべての画素（図３（ｄ）の斜線部分）を指定し、指定された各画素の照射光量を合算すればよい。

次に、図３（ｃ）に示すように、照射レーザのスポット径が３画素相当である場合について説明する。
図３（ｅ）に示すように、ズーム１倍の場合に、細胞が約１画素のサイズに相当し、かつ、照射するレーザ光のスポット径が、約３画素のサイズに相当する（すなわちレーザスポット径＝３×φ［ｍｍ］）ようにシステムが設定されているものとする。このとき、レーザスポット全体での光量総量がＰ［ｍＷ］であったと仮定すると、Ｘ１画素目・Ｙ１画素目からＸ１０画素目・Ｙ１０画素目まで走査する間に、Ｘ５画素目・Ｙ４画素目からＸ７画素目・Ｙ４画素目までにレーザ光を照射しているタイミングで、レーザスポット径の下側部分が細胞へ照射される。また、Ｘ５画素目・Ｙ５画素目からＸ７画素目・Ｙ５画素目までにレーザを照射しているタイミングで、レーザスポット径の中央部分が細胞へ照射される（特に、Ｘ６画素目・Ｙ５画素目でレーザスポット径の中心付近が細胞へ照射される）。またＸ５画素目・Ｙ６画素目からＸ７画素目・Ｙ６画素目までにレーザを照射しているタイミングで、レーザスポットの上側部分が細胞へ照射される。これらの総和が細胞への照射光量Ｐ’［ｍＷ］となる。光量Ｐ’［ｍＷ］は、上述した図２のフローチャートの処理に従って算出される。

このように、ガウス分布に近似したレーザ光では、標本となる細胞のサイズに比較してレーザ光のスポット径が大きくなると、走査中での照射されるタイミング・領域（エリア)・光量が分布状態になるため、正確な光量の把握は困難になる。しかし、本実施形態のように、単位面積当たりのパワー密度を算出して表示することで、観察したい任意形状の標本への照射される光量が時間毎に把握や管理ができるようになる。これにより、標本となる細胞の褪色の進行の度合いを確認したり、褪色の時間を推定したりしながら、観察することが可能となる。また、対物レンズ倍率、ズーム倍率等の走査条件や観察している細胞のサイズによらず、照射されているパワー密度が単位面積毎に把握することができるようになる。

次に、本発明の第２の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡について、図４から図６を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡は、蛍光観察に先立って、光量調整プリスキャンを行う方式のもので、図４に蛍光観察前の光量調整プリスキャン時の構成、図５に蛍光観察時の構成を示す。
なお、本実施形態の説明において、図１に示した一参考実施形態および第１の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡と構成を共通とする箇所には同一符号を付しその説明を省略する。

図４および図５において、システム制御装置９には、指令パワースイープ発生器１６、換算パワー密度格納メモリ１７および指令パワー特定器１８が接続されている。指令パワースイープ発生器１６は、システム制御装置９からレーザ光制御器１１へのパワー指令値を、１フレーム走査が終わる度に、小さな値から大きな値もしくは大きな値から小さな値へと徐々に変更するようにスイープする。換算パワー密度格納メモリ１７は、後述する光量検出器１９による標本位置でのレーザ光量実測値を換算することで算出される、標本６上の各画素位置（Ｘ，Ｙ）での換算パワー密度を格納しておくメモリである。指令パワー特定器１８は、換算パワー密度格納メモリ１７を参照して、標本６上で各画素のパワー密度が所望の値となるようなパワー指令値を特定するようになっている。

光量調整プリスキャンを行う場合には、図４に示されるように、光量検出器１９が蛍光観察時の標本６の位置に配置され、対物レンズ５から出射されたレーザ光の光量が検出される。光量検出器１９によるレーザ光の検出光量Ｐ１９は、システム制御装置９に送られるようになっている。光量調整プリスキャンを行わない場合には、光量検出器１９は蛍光観察時の標本６の位置から退避させられ、標本６を配置可能とするスペースが空けられるようになっている。

このように構成された本発明の第２の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡を用いて蛍光観察を行う場合には、まず、図４に示されるように、蛍光観察開始前に、標本６が退避され、光量検出器１９が標本６の配置されることとなる位置に配置される。次いで、操作器１２により、光源部１からのレーザ光のパワー指令値Ｐｃｍｄおよびレーザ光を照射する標本上の領域等が設定され、光量調整プリスキャンの実行操作が行われる。

光量調整プリスキャンの実行操作が行われると、まず、指令パワースイープ発生器１６がスイープするパワー指令値のレンジの最小値を設定してレーザ光制御器１１に指令する。光源部１は、指令された最小のパワー指令値に相当するパワーのレーザ光を出射する。レーザ制御器１１は、参照光検出器１０で検出される参照光信号に基づいて、光源部１からの出力光量がパワー指令値に従うように光源部１を制御する。
この状態で走査装置４が走査を行う。
光量検出器１９で検出される標本位置でのレーザ光量Ｐ１９は、システム制御装置９へ送られる。システム制御装置９は、図６のフローチャートに基づいて、各画素座標におけるパワー密度ＰＤｃ（Ｘ，Ｙ）を、第１の実施形態と同じように算出し、表示器１３に表示する。ただし、図６では、ステップｃ１，ｃ２のように光量検出器１９の出力値Ｐ１９をそのまま標本上での照射パワーとして用いる。
また、算出された画素ごとのパワー密度値ＰＤｃ（Ｘ，Ｙ）は、換算パワー密度格納メモリ１７に転送されて格納される（ステップｃ３）。

１フレーム分の走査が終わると、次に指令パワースイープ発生器１６がパワー指令値を前回設定したパワー指令値より少し大きな値に設定し、同様の動作を繰り返す（ステップｃ４、ｃ５）。これら一連の動作を、スイープするパワー指令値のレンジの最大値が設定されるまで繰返す。最終的に、パワー指令値と画素座標とで相関付けられた換算パワー密度の値ＰＤｃ（Ｐｃｍｄ，Ｘ，Ｙ）が換算パワー密度格納メモリ１７に格納される。

パワー指令のレンジの最大値が設定されてから１フレーム分の走査が終了すると、光量検出器１９が退避させられ、標本６が光量検出器１９の配置されていた場所に配置される（図５の状態）。これにより、光量調整プリスキャンの実行を終了する。

その後、通常の蛍光観察を開始し、参照光によるパワー指令の表示や補正、画素毎のパワー密度の表示を行いながら、蛍光観察を行う。照射パワーや画素ごとのパワー密度の表示処理では、換算パワー密度格納メモリ１７を参照して、参照光検出器１０の出力Ｐ１０またはパワー指令値Ｐｃｍｄに対応する標本６上の照射パワー実測値Ｐ１９または画素ごとのパワー密度ＰＤｃ（Ｘ，Ｙ）を読み出して表示する。したがって、本実施形態では、標本６上の照射パワーの実測値に基づいて、標本観察中のレーザ照射光量を表示することができる。
標本６では細胞の他にスライドガラスやカバーガラスがあったり、対物レンズ５でも油浸対物レンズや水浸対物レンズを用いたりすることがある。この場合には、これら細胞と対物レンズ５との間の物質による屈折率等の値を予め入力しておき、光量検出器１９で得られる検出量を補正して、換算パワー密度格納メモリ１７へ格納することも可能である。なおこの補正は、一参考実施形態および第１の実施形態における照射光量の算出時に行うことも可能である。

以上説明したように、蛍光観察前に光量調整プリスキャンを行うことにより、標本６上での所望の照射パワーでレーザ光を出射でき、かつ、蛍光観察時に参照光の検出も行うので安定的にレーザ光を標本６へ照射できる。
また、指令パワー特定器１８は、換算パワー密度格納メモリ１７に格納された値を参照することにより、操作器１２により設定されたレーザ光のパワー指令値Ｐｃｍｄを標本６上で実現するのに最適なレーザ光制御器１１の出力を特定する。この特定されたレーザ光制御器１１の出力を用いて、レーザ出力を制御するようにしてもよい。
ここで、操作器１２により設定されたレーザ光の照射領域に含まれる画素座標（Ｘ，Ｙ）を抽出し、各画素のパワー密度の値ＰＤｃ（Ｘ，Ｙ）の総和を算出することにより、指定した領域に対する照射パワーの総計を得ることもできる。このパワー総計値を実現するのに最適なパワー指令値を特定し、これに基づいてレーザ出力を制御するようにしてもよい。
さらに、光量検出器１９としてＣＣＤ（Charge Coupled Devices）のような二次元アレイ素子を用いて、瞬時に全画素座標（Ｘ，Ｙ）のパワーやパワー密度を把握することも可能である。

また、標本６上に換算した画素毎のパワー密度を算出しているので、レーザ光を照射する領域を特定しても、所望の照射パワーでレーザ光を出射できる。さらに、参照光検出器１０からの検出値と、参照光検出器１０と標本６との間の光学系の透過率特性データとに基づいて、標本６上でのパワーに換算した値を算出するのではなく、実際のシステム上に参照光分離ミラー２、ダイクロイックミラー３、走査装置４および対物レンズ５が配置された状態で、光量検出器１９で直接検出するので、これにより、この走査型レーザ顕微鏡では、システム毎の個体差によらず、標本６上でのより正確な光量を把握することが可能になる。

その他に、蛍光観察時に、フレーム更新毎にパワーやパワー密度の表示を更新したり、記録を行うことも当然可能である。
また、各実施形態において図示して説明した機能ブロックの構成は、必ずしもハードウェアの構成と一致している必要はなく、たとえば複数の機能ブロックを一つのハードウェアの構成にまとめて実現することも可能である。
また、各実施例におけるレーザ光制御器１１は、光源部１に対して、出射するレーザ光の波長や強度を制御する機能と、参照光検出器１０からの参照光信号に基づいて標本上の照射パワーを算出する機能を備えるが、このうちの照射パワー算出機能を、レーザ光制御器１１とは別体のハードウェアで構成したり、システム制御装置９内でソフトウェア的に実現してもよい。
また、表示器において照射パワーは表示せずに照射パワー密度のみを表示してもよい。さらに、パワー密度の時間的積算値だけでなく、ビーム全体の照射パワーの積算値を算出して表示するようにしてもよい。積算値の算出を、例えば第2実施形態のように１フレーム毎におこなうことにより、１つの蛍光画像を取得するために照射したレーザ光の総光量を把握することができる。

本発明の一参考実施形態および第１の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡を模式的に示す全体構成図である。 図１の走査型レーザ顕微鏡のシステム制御装置において、パワー密度を表示するための動作フローを示す図である。 図１の走査型レーザ顕微鏡において、観察される細胞の画像と照射するレーザ光のスポットの一例を示す図である。 本発明の第２の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡のプリスキャン時の構成を模式的に示す全体構成図である。 図４の走査型レーザ顕微鏡の蛍光観察時の構成を模式的に示す全体構成図である。 図４の走査型レーザ顕微鏡のシステム制御装置において、標本上のレーザ照射パワーを測定するプリスキャン時の動作フローを示す図である。

符号の説明

１ 光源
２ 参照光分離ミラー（光学系）
３ ダイクロイックミラー（光学系）
４ 走査装置（光学系）
５ 対物レンズ（光学系）
６ 標本
８ 光検出器
９ システム制御装置（処理装置）
１０ 参照光検出器
１１ レーザ光制御器

Claims (14)

1. レーザ光を射出する光源と、
   該光源から射出されたレーザ光を標本上で走査する走査装置と、
   前記標本からの光を検出する光検出器と、
   該光検出器からの信号を前記標本の画像信号に変換する処理装置と、
   前記光源から射出されるレーザ光の一部を参照光として分離する分離ミラーと、
   該分離ミラーにより分離された前記参照光を参照光信号として検出する参照光検出器と、
   前記光源から射出されるレーザ光のパワーを制御するレーザ光制御部と、
   前記参照光検出器により検出された参照光信号に基づいて前記標本上の単位面積あたりの照射パワー値を算出する照射パワー算出部と、
   算出された前記標本上の単位面積あたりの照射パワー値を表示する表示部と、を備え、
   前記照射パワー算出部が、前記標本と前記参照光検出器との間の光学系の透過率特性データに基づいて、参照光信号を標本上の単位面積あたりの照射パワー値に換算し、
   該透過率特性データには、前記分離ミラーと前記標本との間の対物レンズを含む光学系の透過率が含まれる走査型レーザ顕微鏡。
2. 前記照射パワー算出部が、前記標本と前記参照光検出器との間の光学系の透過率特性データに基づいて、前記参照光信号を標本上の照射パワー値に換算し、
   前記レーザ光制御部は、この照射パワー値に基づいて前記光源から射出されるレーザ光のパワーを補正する請求項１に記載の走査型レーザ顕微鏡。
3. 前記照射パワー算出部が、前記参照光検出器の分光感度特性データおよび前記標本と前記参照光検出器との間の光学系の分光透過率特性データの少なくとも一方に基づいて、前記参照光信号を前記標本上の照射パワー値に換算する請求項１に記載の走査型レーザ顕微鏡。
4. 前記単位面積は前記標本の走査画像における１画素の大きさである、請求項１に記載の走査型レーザ顕微鏡。
5. 標本の位置に配置される照射光量検出器と、
   前記レーザ光制御部のパワー指令値または前記参照光検出器からの参照光信号と前記照射光量検出器によって測定される前記標本上の照射パワー測定値とを対応付けて記憶するデータ格納部とを備え、
   前記照射パワー算出部は、前記パワー指令値または前記参照光信号に対応する前記標本上の照射パワー測定値を前記データ格納部から読み出すことによって照射パワーを求める請求項１に記載の走査型レーザ顕微鏡。
6. 前記照射パワー算出部が、前記標本上の照射パワー値を前記標本上の単位面積あたりの照射パワー値に換算し、
   前記走査型レーザ顕微鏡はこの単位面積あたりの照射パワー値に基づいて、前記標本上の特定領域に対して所望の照射パワー値を達成可能なパワー指令値を特定するパワー指令特定部を備え、
   前記レーザ光制御部は、前記パワー指令特定部によって特定されたパワー指令値に基づいて前記光源を制御する請求項５に記載の走査型レーザ顕微鏡。
7. 前記データ格納部が前記標本上の照射パワー値から換算された前記単位面積あたりの照射パワー値の情報を格納する請求項５に記載の走査型レーザ顕微鏡。
8. 前記照射パワー算出部が、ガウス密度分布に基づいて、前記参照光信号を前記標本上の単位面積当たりの照射パワー値に換算する請求項１に記載の走査型レーザ顕微鏡。
9. 前記表示部は、前記単位面積あたりの照射パワー値を、走査の１画素毎に更新して表示する請求項１に記載の走査型レーザ顕微鏡。
10. 前記照射パワー算出部は、前記単位面積あたりの照射パワー値に基づいて、前記単位面積あたりの照射パワーの時間的積算値を算出し、
    前記表示部は前記照射パワーの時間的積算値を表示する請求項１に記載の走査型レーザ顕微鏡。
11. 前記表示部は、前記標本上の照射パワー値を、走査の１画素毎に更新して表示する請求項１に記載の走査型レーザ顕微鏡。
12. 前記照射パワー算出部は、前記単位面積あたりの照射パワーを、一回のレーザ走査を行っている間で積算する請求項１０に記載の走査型レーザ顕微鏡。
13. 前記照射パワー算出部は、前記標本上の照射パワーの時間的積算値を算出し、前記表示部はこの時間的積算値を表示する請求項１に記載の走査型レーザ顕微鏡。
14. 前記照射パワー算出部は、前記標本上の照射パワー値を、一回のレーザ走査を行っている間で積算する請求項１３に記載の走査型レーザ顕微鏡。

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