JP4953335B2 - 脂肪組織由来間葉系幹細胞を含有する、勃起不全又は尿意障害用の細胞製剤 - Google Patents
脂肪組織由来間葉系幹細胞を含有する、勃起不全又は尿意障害用の細胞製剤 Download PDFInfo
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Description
本発明は細胞製剤に関する。詳しくは、勃起不全又は尿意障害の改善に有効な細胞製剤に関する。本出願は、２００９年１０年１６日に出願された日本国特許出願第２００９−２３２０６８号に基づく優先権、及び２０１０年３年１２日に出願された日本国特許出願第２０１０−０５６５２２号に基づく優先権を主張するものであり、これらの特許出願の全内容は参照により援用される。
腹圧性尿失禁とは、膀胱から尿が漏れないように尿道を締める機能を有する尿道括約筋の機能障害により、腹圧時（運動、咳・くしゃみなど）に尿が尿意を伴わずに漏れる疾患をいう。腹圧性尿失禁は男女ともにみられる疾患で、女性における原因は、妊娠・出産、婦人科的手術、加齢による括約筋機能障害が多く、男性では前立腺肥大症や前立腺癌に対する手術による括約筋障害が原因となる。腹圧性尿失禁に対しては通常、理学療法（骨盤底筋訓練）が初期治療として行われるが、中等症以上の例には無効である。外科的治療としては、尿道スリング手術（経膣的手術で、尿道の下に人工テープをかけて、尿道を支える手術）が女性腹圧性尿失禁に対して広く行われ、良好な成績が得られているが、異物を体内に留置するという欠点があり、また男性における腹圧性尿失禁に対しては本邦で行い得る有効な外科的治療がないのが現状である。低侵襲的外科的治療として、傍尿道牛コラーゲン注入治療（経尿道的に内視鏡を挿入し、内視鏡下に尿道粘膜下にコラーゲンを注入する）が行われることがあるが、注入後数週間以内に吸収されるため1〜3ヶ月以内に再発することから治療持続効果がなく、また前立腺手術後の腹圧性尿失禁に対しては有効率自体が20％以下と不良である（非特許文献１）。さらに、コラーゲンは牛組織由来であるため、伝達性海綿状脳症発症の危険性が完全には否定できないという問題もある。
本疾患は、罹患率が非常に高く、生活の質を障害するものであること、また低侵襲で治療効果の高い治療法が現存しないことから、低侵襲で、有効性の高い治療法の開発が急務である。海外では、培養した自己骨格筋由来幹細胞を用いた尿道注入治療が腹圧性尿失禁の治療として、すでに臨床応用されているが（非特許文献２）、注入に用いる培養細胞の確保の困難性（培養方法、環境）、および安全性の問題から、新しい非侵襲的外科的治療法の開発および臨床導入が必要とされている。
脂肪組織由来間葉系幹細胞（Adipose-derived stem cells: ASC、Adipose-derived regeneration cells: ADRC、Adipose-derived mesenchymal stem cells: AT-MSC, AD-MSCなどと呼ばれる）を用いた腹圧性尿失禁治療は国内外において行われていない。ラットの尿道周囲にASCを注入し平滑筋に分化することが報告されているが（非特許文献３）、腹圧性尿失禁の改善を示す機能的データは示されていない。本発明者らの研究グループは先の特許出願において、腹圧性尿失禁ラットモデルを用いて培養ASCを傍尿道に注入することにより、尿道内圧の上昇と尿失禁の改善が得られることを報告した（特許文献１）。
Smith DN, Appell RA, Rackley RR, Winters JCCOLLAGEN INJECTION THERAPY FOR POST-PROSTATECTOMY INCONTINENCE J Urol. 1998 Aug;160(2):364-7.
Smaldone MC, Chancellor MB.Muscle derived stem cell therapy for stress urinary incontinence. World J Urol. 2008 Aug;26(4):327-32. Epub 2008 May 10.
Jack GS, Almeida FG, Zhang R, Alfonso ZC, Zuk PA, Rodriguez LV.Processed lipoaspirate cells for tissue engineering of the lower urinary tract: implications for the treatment of stress urinary incontinence and bladder reconstruction.J Urol. 2005 Nov;174(5):2041-5.
本発明は、脂肪組織由来間葉系幹細胞（ASC）の新たな医療用途を提供することを課題とする。
本発明者らは、細胞供給源としての皮下脂肪組織から採取される自己ASCを用いた腹圧性尿失禁に対する新しい治療、すなわち経尿道的内視鏡下ASC傍尿道注入治療を開発することを当初の目的として研究を進めた。まず、予備的実験として尿道周囲への細胞注入法を検討した。具体的には、脂肪組織と脂肪組織から分離したASCを混合して注入する際の両者の比率と尿道閉鎖効果（bulking効果）との関係を調べた。その結果、比率を１：１０（当実験系においてASCの比率が最大の場合）にしたときに最大の尿道閉塞効果を認め、ASCの混合比率を高めるとよいことが判明した。続いて、尿道括約筋障害による腹圧性尿失禁を有し且つ従来の治療で改善のみられない男性患者（前立腺癌に対する根治的前立腺摘除術、あるいは前立腺肥大症に対する経尿道的前立腺切除術の経験者）を対象とし、以下の手順でASCの治療効果を調べることにした。各患者について、下腹部腹壁あるいは臀部より脂肪吸引装置で脂肪組織250〜300gを採取し、脂肪組織由来間葉系幹細胞分離装置を用いて、必要量の脂肪組織由来間葉系幹細胞を含む濃厚細胞液を調製した。そして、濃厚細胞液の一部を尿道から挿入した内視鏡観察下に、尿道括約筋に注入した。次いで、採取した残りの濃厚細胞液と自己脂肪組織を混ぜて、括約筋部の尿道粘膜下に経尿道的に注入した（膨隆により膀胱頸部が閉鎖するまで注入を継続）。施術後、定期的に各種検査及びアンケートを行った。その結果、傍尿道周囲血流の上昇、一回排尿量の増加、及び尿失禁量の減少を患者の多数において認めた。即ち、ASC移植によって尿失禁の症状の改善が確認された。一方、驚くべきことに、施術１月後に１名の患者に尿意の出現を認めるとともに、施術３月後に至っては５名中４名の患者に尿意の出現を認めた。更に興味深い結果として、実に５名中４名の患者において勃起不全（ED）の改善を認めた。尿意の回復及び勃起不全の改善は尿失禁患者の生活の質を飛躍的に高めるものであり、以上の知見は臨床上、極めて重要な意味をもつ。
上記の通り、本発明者らの検討の結果、ASCの移植によって尿意が改善するとともに勃起不全が改善するという、当初予想すらし得ない知見がもたらされた。一方、移植後のASCの特性を評価すべく動物実験を行った結果、ASCが平滑筋細胞に分化していることが明らかとなった。また、尿道括約筋再増殖及び分化に関与し重要な役割を果たすとされているHGF（幹細胞増殖因子）をASCが産生する事実と、HGF濃度が再生初期のみ上昇し安全性が担保されることが確認された。更には、大動物（ブタ）を対象とした移植実験によってもASCを用いた治療の有効性及び安全性が示された。以下に示す本発明は以上の知見に基づく。
［１］脂肪組織由来間葉系幹細胞を含有し、勃起不全又は尿意障害用の細胞製剤。
［２］体脂肪を更に含有する、［１］に記載の細胞製剤。
［３］脂肪組織由来間葉系幹細胞を含有する第１構成要素と、生体から分離した体脂肪を含有する第２構成要素とからなるキットであることを特徴とする、［２］に記載の細胞製剤。
［４］脂肪組織由来間葉系幹細胞を含有し、その投与時に、生体から分離した体脂肪が併用投与されることを特徴とする、［２］に記載の細胞製剤。
［５］前記脂肪組織由来間葉系幹細胞が、細胞表面マーカーCD29及びCD44陽性である、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の細胞製剤。
［６］前記脂肪組織由来間葉系幹細胞が、
（１）脂肪組織から分離した細胞集団を800〜1500rpm、1〜10分間の条件下で遠心処理したときに沈降する沈降細胞集団に含まれる接着性細胞若しくはその継代細胞、
（２）前記沈降細胞集団を低血清条件下で培養したときに増殖した細胞、
（３）脂肪組織から分離した細胞集団を低血清条件下で培養したときに増殖した細胞、
（４）脂肪組織をプロテアーゼ処理した後、濾過処理に供し、次いで濾液を遠心処理することによって沈渣として回収される沈降細胞集団、又は
（５）脂肪組織をプロテアーゼ処理した後、濾過処理を経ることなく遠心処理することによって沈渣として回収される沈降細胞集団、
である、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の細胞製剤。
［７］前記低血清条件が、培養液中の血清濃度が5%(V/V)以下の条件である、［６］に記載の細胞製剤。
［８］前記脂肪組織がヒトの脂肪組織である、［１］〜［７］のいずれか一項に記載の細胞製剤。
［９］以下のステップを含む、勃起不全又は尿意障害用の細胞製剤の調製法：
（１）脂肪組織由来間葉系幹細胞及び体脂肪を用意するステップ；
（２）前記脂肪組織由来間葉系幹細胞と前記体脂肪を混合するステップ。
［１０］勃起不全又は尿意障害用の細胞製剤を製造するための、脂肪組織由来間葉系幹細胞の使用。
［１１］勃起不全又は尿意障害用の細胞製剤を製造するための、脂肪組織由来間葉系幹細胞及び体脂肪の使用。
［１２］勃起不全又は尿意障害の患者の外尿道括約筋及び／又は外尿道括約筋部の尿道粘膜下に、［８］に記載の細胞製剤を投与することを含む、勃起不全又は尿意障害の治療法。
［１３］勃起不全又は尿意障害の患者の外尿道括約筋及び／又は外尿道括約筋部の尿道粘膜下に、治療上有効量の脂肪組織由来間葉系幹細胞を投与することを含む、勃起不全又は尿意障害の治療法。
［１４］勃起不全又は尿意障害の患者の外尿道括約筋及び／又は外尿道括約筋部の尿道粘膜下に、治療上有効量の脂肪組織由来間葉系幹細胞及び体脂肪を投与することを含む、勃起不全又は尿意障害の治療法。
［１］脂肪組織由来間葉系幹細胞を含有し、勃起不全又は尿意障害用の細胞製剤。
［２］体脂肪を更に含有する、［１］に記載の細胞製剤。
［３］脂肪組織由来間葉系幹細胞を含有する第１構成要素と、生体から分離した体脂肪を含有する第２構成要素とからなるキットであることを特徴とする、［２］に記載の細胞製剤。
［４］脂肪組織由来間葉系幹細胞を含有し、その投与時に、生体から分離した体脂肪が併用投与されることを特徴とする、［２］に記載の細胞製剤。
［５］前記脂肪組織由来間葉系幹細胞が、細胞表面マーカーCD29及びCD44陽性である、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の細胞製剤。
［６］前記脂肪組織由来間葉系幹細胞が、
（１）脂肪組織から分離した細胞集団を800〜1500rpm、1〜10分間の条件下で遠心処理したときに沈降する沈降細胞集団に含まれる接着性細胞若しくはその継代細胞、
（２）前記沈降細胞集団を低血清条件下で培養したときに増殖した細胞、
（３）脂肪組織から分離した細胞集団を低血清条件下で培養したときに増殖した細胞、
（４）脂肪組織をプロテアーゼ処理した後、濾過処理に供し、次いで濾液を遠心処理することによって沈渣として回収される沈降細胞集団、又は
（５）脂肪組織をプロテアーゼ処理した後、濾過処理を経ることなく遠心処理することによって沈渣として回収される沈降細胞集団、
である、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の細胞製剤。
［７］前記低血清条件が、培養液中の血清濃度が5%(V/V)以下の条件である、［６］に記載の細胞製剤。
［８］前記脂肪組織がヒトの脂肪組織である、［１］〜［７］のいずれか一項に記載の細胞製剤。
［９］以下のステップを含む、勃起不全又は尿意障害用の細胞製剤の調製法：
（１）脂肪組織由来間葉系幹細胞及び体脂肪を用意するステップ；
（２）前記脂肪組織由来間葉系幹細胞と前記体脂肪を混合するステップ。
［１０］勃起不全又は尿意障害用の細胞製剤を製造するための、脂肪組織由来間葉系幹細胞の使用。
［１１］勃起不全又は尿意障害用の細胞製剤を製造するための、脂肪組織由来間葉系幹細胞及び体脂肪の使用。
［１２］勃起不全又は尿意障害の患者の外尿道括約筋及び／又は外尿道括約筋部の尿道粘膜下に、［８］に記載の細胞製剤を投与することを含む、勃起不全又は尿意障害の治療法。
［１３］勃起不全又は尿意障害の患者の外尿道括約筋及び／又は外尿道括約筋部の尿道粘膜下に、治療上有効量の脂肪組織由来間葉系幹細胞を投与することを含む、勃起不全又は尿意障害の治療法。
［１４］勃起不全又は尿意障害の患者の外尿道括約筋及び／又は外尿道括約筋部の尿道粘膜下に、治療上有効量の脂肪組織由来間葉系幹細胞及び体脂肪を投与することを含む、勃起不全又は尿意障害の治療法。
本発明は特定の疾患に適用される細胞製剤及びその用途に関する。本発明の細胞製剤は脂肪組織由来間葉系幹細胞（本明細書において「ASC」と略称することがある）を含有する。本発明において「脂肪組織由来間葉系幹細胞（ASC）」とは、脂肪組織に含まれる体性幹細胞のことをいうが、多分化能を維持している限りにおいて、当該体性幹細胞の培養（継代培養を含む）により得られる細胞も「脂肪組織由来間葉系幹細胞（ASC）」に該当するものとする。通常、ASCは、生体から分離された脂肪組織を出発材料とし、細胞集団（脂肪組織に由来する、ASC以外の細胞を含む）を構成する細胞として「単離された状態」に調製される。ここでの「単離された状態」とは、その本来の環境（即ち生体の一部を構成した状態）から取り出された状態、即ち人為的操作によって本来の存在状態と異なる状態で存在していることを意味する。尚、脂肪組織由来間葉系幹細胞はADRC（Adipose-derived regeneration cells）、AT-MSC（Adipose-derived mesenchymal stem cells）、AD-MSC（Adipose-derived mesenchymal stem cells）等とも呼ばれる。本明細書では以下の用語、即ち、脂肪組織由来間葉系幹細胞、ASC、ADRC、AT-MSC、AD-MSC、を相互に置換可能に使用する。
（ASCの調製法）
ASCは、脂肪基質からの幹細胞の分離、洗浄、濃縮、培養等の工程を経て調製される。ASCの調製法は特に限定されない。例えば公知の方法（Fraser JK et al. (2006), Fat tissue: an underappreciated source of stem cells for biotechnology. Trends in Biotechnology; Apr;24(4):150-4. Epub 2006 Feb 20. Review.; Zuk PA et al. (2002), Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular Biology of the Cell; Dec;13(12):4279-95.; Zuk PA et al. (2001), Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering; Apr;7(2):211-28.等が参考になる）に従ってASCを調製することができる。また、脂肪組織からASCを調製するための装置（例えば、Celution（登録商標）装置（サイトリ・セラピューティクス社、米国、サンディエゴ））も市販されており、当該装置を利用してASCを調製することにしてもよい。当該装置を利用すると、脂肪組織より、細胞表面マーカーCD29及びCD44陽性の細胞を分離できる。以下、ASCの調製法の具体例を示す。
ASCは、脂肪基質からの幹細胞の分離、洗浄、濃縮、培養等の工程を経て調製される。ASCの調製法は特に限定されない。例えば公知の方法（Fraser JK et al. (2006), Fat tissue: an underappreciated source of stem cells for biotechnology. Trends in Biotechnology; Apr;24(4):150-4. Epub 2006 Feb 20. Review.; Zuk PA et al. (2002), Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular Biology of the Cell; Dec;13(12):4279-95.; Zuk PA et al. (2001), Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering; Apr;7(2):211-28.等が参考になる）に従ってASCを調製することができる。また、脂肪組織からASCを調製するための装置（例えば、Celution（登録商標）装置（サイトリ・セラピューティクス社、米国、サンディエゴ））も市販されており、当該装置を利用してASCを調製することにしてもよい。当該装置を利用すると、脂肪組織より、細胞表面マーカーCD29及びCD44陽性の細胞を分離できる。以下、ASCの調製法の具体例を示す。
（１）脂肪組織からの細胞集団の調製
脂肪組織は動物から切除、吸引などの手段で採取される。ここでの用語「動物」はヒト、及びヒト以外の哺乳動物（ペット動物、家畜、実験動物を含む。具体的には例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、サル、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ等）を含む。免疫拒絶の問題を回避するため、本発明の細胞製剤を適用する対象（患者）と同一の個体から脂肪組織（自己脂肪組織）を採取することが好ましい。但し、同種の動物の脂肪組織（他家）又は異種動物の脂肪組織の使用を妨げるものではない。
脂肪組織は動物から切除、吸引などの手段で採取される。ここでの用語「動物」はヒト、及びヒト以外の哺乳動物（ペット動物、家畜、実験動物を含む。具体的には例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、サル、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ等）を含む。免疫拒絶の問題を回避するため、本発明の細胞製剤を適用する対象（患者）と同一の個体から脂肪組織（自己脂肪組織）を採取することが好ましい。但し、同種の動物の脂肪組織（他家）又は異種動物の脂肪組織の使用を妨げるものではない。
脂肪組織として皮下脂肪、内臓脂肪、筋肉内脂肪、筋肉間脂肪を例示できる。この中でも皮下脂肪は局所麻酔下で非常に簡単に採取できるため、採取の際の患者への負担が少なく、好ましい細胞源といえる。通常は一種類の脂肪組織を用いるが、二種類以上の脂肪組織を併用することも可能である。また、複数回に分けて採取した脂肪組織（同種の脂肪組織でなくてもよい）を混合し、以降の操作に使用してもよい。脂肪組織の採取量は、ドナーの種類や組織の種類、或いは必要とされるASCの量を考慮して定めることができ、例えば0.5〜500g程度である。ヒトをドナーとする場合にはドナーへの負担を考慮して一度に採取する量を約10〜20g以下にすることが好ましい。採取した脂肪組織は、必要に応じてそれに付着した血液成分の除去及び細片化を経た後、以下の酵素処理に供される。尚、脂肪組織を適当な緩衝液や培養液中で洗浄することによって血液成分を除去することができる。
酵素処理は、脂肪組織をコラゲナーゼ、トリプシン、ディスパーゼ等の酵素によって消化することにより行う。このような酵素処理は当業者に既知の手法及び条件により実施すればよい（例えば、R.I. Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 4th Edition, A John Wiley & Sones Inc., Publication参照）。好ましくは、後述の実施例に記載の手法及び条件によってここでの酵素処理を行う。以上の酵素処理によって得られた細胞集団は、多分化能幹細胞、内皮細胞、間質細胞、血球系細胞、及び／又はこれらの前駆細胞等を含む。細胞集団を構成する細胞の種類や比率などは、使用した脂肪組織の由来や種類に依存する。
（２）沈降細胞集団（SVF画分：stromal vascular fractions）の取得
細胞集団は続いて遠心処理に供される。遠心処理による沈渣を沈降細胞集団（本明細書では「SVF画分」ともいう）として回収する。遠心処理の条件は、細胞の種類や量によって異なるが、例えば1〜10分間、800〜1500rpmである。尚、遠心処理に先立ち、酵素処理後の細胞集団をろ過等に供し、その中に含まれる酵素未消化組織等を除去しておくことが好ましい。
細胞集団は続いて遠心処理に供される。遠心処理による沈渣を沈降細胞集団（本明細書では「SVF画分」ともいう）として回収する。遠心処理の条件は、細胞の種類や量によって異なるが、例えば1〜10分間、800〜1500rpmである。尚、遠心処理に先立ち、酵素処理後の細胞集団をろ過等に供し、その中に含まれる酵素未消化組織等を除去しておくことが好ましい。
ここで得られた「SVF画分」はASCを含む。従って、SVF画分を用いて本発明の細胞製剤を調製することができる。つまり、本発明の細胞製剤の一態様では、SVF画分が含有されることになる。尚、SVF画分を構成する細胞の種類や比率などは、使用した脂肪組織の由来や種類、酵素処理の条件などに依存する。また、SVF画分は、CD34陽性且つCD45陰性の細胞集団と、CD34陽性且つCD45陰性の細胞集団を含む点によって特徴付けられる（国際公開第２００６／００６６９２Ａ１号パンフレット）。
（３）接着性細胞（ASC）の選択培養及び細胞の回収
SVF画分にはASCの他、他の細胞成分（内皮細胞、間質細胞、血球系細胞、これらの前駆細胞等）が含まれる。そこで本発明の一態様では以下の選択培養を行い、SVF画分から不要な細胞成分を除去する。そして、その結果得られた細胞をASCとして本発明の細胞製剤に用いる。
SVF画分にはASCの他、他の細胞成分（内皮細胞、間質細胞、血球系細胞、これらの前駆細胞等）が含まれる。そこで本発明の一態様では以下の選択培養を行い、SVF画分から不要な細胞成分を除去する。そして、その結果得られた細胞をASCとして本発明の細胞製剤に用いる。
まず、SVF画分を適当な培地に懸濁した後、培養皿に播種し、一晩培養する。培地交換によって浮遊細胞（非接着性細胞）を除去する。その後、適宜培地交換（例えば３日に一度）をしながら培養を継続する。必要に応じて継代培養を行う。継代数は特に限定されない。尚、培養用の培地には、通常の動物細胞培養用の培地を使用することができる。例えば、Dulbecco's modified Eagle's Medium(DMEM)（日水製薬株式会社等）、α-MEM(大日本製薬株式会社等)、DMED:Ham's F12混合培地(1:1)(大日本製薬株式会社等)、Ham's F12 medium(大日本製薬株式会社等)、MCDB201培地(機能性ペプチド研究所)等を使用することができる。血清（ウシ胎仔血清、ヒト血清、羊血清など）又は血清代替物（Knockout serum replacement(KSR)など）を添加した培地を使用することにしてもよい。血清又は血清代替物の添加量は例えば5%(v/v)〜30%(v/v)の範囲内で設定可能である。
以上の操作によって接着性細胞が選択的に生存・増殖する。続いて、増殖した細胞を回収する。回収操作は常法に従えばよく、例えば酵素処理（トリプシンやディスパーゼ処理）後の細胞をセルスクレイパーやピペットなどで剥離することによって容易に回収することができる。また、市販の温度感受性培養皿などを用いてシート培養した場合は、酵素処理をせずにそのままシート状に細胞を回収することも可能である。このようにして回収した細胞（ASC）を用いることにより、ASCを高純度で含有する細胞製剤を調製することができる。
（４）低血清培養（低血清培地での選択的培養）及び細胞の回収
本発明の一態様では、上記（３）の操作の代わりに又は上記（３）の操作の後に以下の低血清培養を行う。そして、その結果得られた細胞をASCとして本発明の細胞製剤に用いる。
本発明の一態様では、上記（３）の操作の代わりに又は上記（３）の操作の後に以下の低血清培養を行う。そして、その結果得られた細胞をASCとして本発明の細胞製剤に用いる。
低血清培養では、SVF画分（（３）の後にこの工程を実施する場合には（３）で回収した細胞を用いる）を低血清条件下で培養し、目的の多分化能幹細胞（即ちASC）を選択的に増殖させる。低血清培養法では用いる血清が少量で済むことから、本発明の細胞製剤を投与する対象（患者）自身の血清を使用することが可能となる。即ち、自己血清を用いた培養が可能となる。自己血清を使用することによって、製造工程中から異種動物材料を排斥し、安全性が高く且つ高い治療効果を期待できる細胞製剤が提供される。ここでの「低血清条件下」とは5%以下の血清を培地中に含む条件である。好ましくは2%(V/V)以下の血清を含む培養液中で細胞培養する。更に好ましくは、2%(V/V)以下の血清と1〜100ng/mlの線維芽細胞増殖因子-2（bFGF）を含有する培養液中で細胞培養する。
血清はウシ胎仔血清に限られるものではなく、ヒト血清や羊血清等を用いることができる。好ましくはヒト血清、更に好ましくは本発明の細胞製剤を適用する対象の血清（即ち自己血清）を用いる。
培地は、使用の際に含有する血清量が低いことを条件として、通常の動物細胞培養用の培地を使用することができる。例えば、Dulbecco's modified Eagle's Medium(DMEM)（日水製薬株式会社等）、α-MEM(大日本製薬株式会社等)、DMED:Ham's F12混合培地(1:1)(大日本製薬株式会社等)、Ham's F12 medium(大日本製薬株式会社等)、MCDB201培地(機能性ペプチド研究所)等を使用することができる。
以上の方法で培養することによって、多分化能幹細胞（ASC）を選択的に増殖させることができる。また、上記の培養条件で増殖する多分化能幹細胞（ASC）は高い増殖活性を持つので、継代培養によって、本発明の細胞製剤に必要とされる数の細胞を容易に調製することができる。尚、SVF画分を低血清培養することによって選択的に増殖する細胞はCD13、CD90及びCD105陽性であり、CD31、CD34、CD45、CD106及びCD117陰性である（国際公開第２００６／００６６９２Ａ１号パンフレット）。
続いて、上記の低血清培養によって選択的に増殖した細胞を回収する。回収操作は上記（３）の場合と同様に行えばよい。回収した細胞（ASC）を用いることにより、ASCを高純度で含有する細胞製剤を調製することができる。
（５）製剤化
SVF画分の細胞、上記選択培養（３）の結果得られた細胞、又は上記低血清培養（４）の結果得られた細胞を生理食塩水や適当な緩衝液（例えばリン酸系緩衝液）等に懸濁することによって細胞製剤を得ることができる。治療上有効量の細胞が投与されるように、一回投与分の量として例えば1×106個〜1×1010個の細胞を含有させるとよい。細胞の含有量は、使用目的、対象疾患、適用対象（レシピエント）の性別、年齢、体重、患部の状態、細胞の状態などを考慮して適宜調整することができる。
SVF画分の細胞、上記選択培養（３）の結果得られた細胞、又は上記低血清培養（４）の結果得られた細胞を生理食塩水や適当な緩衝液（例えばリン酸系緩衝液）等に懸濁することによって細胞製剤を得ることができる。治療上有効量の細胞が投与されるように、一回投与分の量として例えば1×106個〜1×1010個の細胞を含有させるとよい。細胞の含有量は、使用目的、対象疾患、適用対象（レシピエント）の性別、年齢、体重、患部の状態、細胞の状態などを考慮して適宜調整することができる。
細胞の保護を目的としてジメチルスルフォキシド（DMSO）や血清アルブミン等を、細菌の混入を阻止することを目的として抗生物質等を、細胞の活性化、増殖又は分化誘導などを目的として各種の成分（ビタミン類、サイトカイン、成長因子、ステロイド等）を本発明の細胞製剤に含有させてもよい。サイトカインの例はインターロイキン（IL）、インターフェロン（IFN）、コロニー刺激因子（CSF）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）及びエリスロポエチン（EPO）、アクチビン、オンコスタチンM（OSM）である。尚、CSF、G-CSF、EPO等は成長因子でもある。一方、成長因子の例は肝細胞増殖因子（HGF）、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF、FGF2）、上皮成長因子（EGF）、血小板由来成長因子（PDGF）、インスリン様成長因子（IGF）、トランスフォーミング成長因子（TGF）、神経成長因子（NGF）及び脳由来神経栄養因子（BDNF）である。さらに、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）を本発明の細胞製剤に含有させてもよい。
以上の方法では、SVF画分を低血清培養して増殖した細胞を用いて細胞製剤が構成されるが、脂肪組織から得た細胞集団を直接（SVF画分を得るための遠心処理を介することなく）低血清培養することによって増殖した細胞をASCとして用いて細胞製剤を調製することにしてもよい。即ち本発明の一態様では、脂肪組織から得た細胞集団を低血清培養したときに増殖した細胞をASCとして用いる。また、選択的培養（上記（３）及び（４））によって得られる多分化能幹細胞ではなく、SVF画分（脂肪組織由来間葉系幹細胞を含有する）をそのまま用いて細胞製剤を構成することにしてもよい。この態様の細胞製剤は、（ａ）脂肪組織をプロテアーゼ処理した後、濾過処理に供し、次いで濾液を遠心処理することによって沈渣として回収される沈降細胞集団（SVF画分）、又は（ｂ）脂肪組織をプロテアーゼ処理した後、濾過処理を経ることなく遠心処理することによって沈渣として回収される沈降細胞集団（SVF画分）を含有することになる。尚、ここでの「そのまま用いて」とは、選択的培養を経ることなく細胞製剤の有効成分として用いること、を意味する。
（ASCと体脂肪との併用）
本発明の細胞製剤の一態様は、ASCに加えて体脂肪を含有する。即ち、この態様では、ASCと、生体から分離された体脂肪とを組み合わせて用いる。治療上有効量の脂肪が投与されるように、一回投与分の量として例えば10〜20gの体脂肪が用いられる。
本発明の細胞製剤の一態様は、ASCに加えて体脂肪を含有する。即ち、この態様では、ASCと、生体から分離された体脂肪とを組み合わせて用いる。治療上有効量の脂肪が投与されるように、一回投与分の量として例えば10〜20gの体脂肪が用いられる。
本明細書において「脂肪組織由来間葉系幹細胞と体脂肪を組み合わせて用いる」又は「脂肪組織由来間葉系幹細胞と体脂肪を組み合わせてなる」とは、脂肪組織由来間葉系幹細胞と体脂肪が併用されることを意味する。典型的には、ASCを含む細胞集団と体脂肪とを混合した配合剤として本発明の細胞製剤が提供されることになる。例えば、本発明の細胞を生理食塩水や適当な緩衝液（例えばリン酸系緩衝液）等に懸濁させて得た細胞懸濁液に体脂肪を混合すればよい。併用の態様は上記の例（即ち配合剤）に限定されず、例えば、ASCを含有する第１構成要素と、体脂肪を含有する第２構成要素とからなるキットの形態で本発明の細胞製剤を提供することもできる。この場合、対象に対して同時又は所定の時間的間隔を置いて両要素が投与されることになる。好ましくは、両要素を同時に投与することにする。ここでの「同時」は厳密な同時性を要求するものではない。従って、両要素を混合した後に対象へ投与する等、両要素の投与が時間差のない条件下で実施される場合は勿論のこと、片方の投与後、速やかに他方を投与する等、両要素の投与が実質的に時間差のない条件下で実施される場合もここでの「同時」の概念に含まれる。一方、片方の投与後、所定の時間差で他方を投与する場合は、併用の効果が良好に奏されるよう、時間差を可及的に短く設定することが好ましい。例えば、片方の投与後１５分以内、好ましくは１０分以内、更に好ましくは５分以内に他方を投与する。
ASCを含有する細胞製剤とし、その投与時に体脂肪が併用投与されるようにしてもよい。この場合の細胞製剤と体脂肪の投与のタイミングは、上記のキットの態様の場合と同様である。即ち、好ましくは同時に両者が投与されることになるが、所定の時間差で両者を投与することにしてもよい。また、上記の態様とは逆に、体脂肪を含有する細胞製剤とし、その投与時にASCが併用投与されるようにしてもよい。この場合の投与のタイミングは上記の態様の場合に準ずる。
体脂肪として、皮下脂肪、内臓脂肪、筋肉内脂肪、筋肉間脂肪を例示できる。この中でも皮下脂肪は局所麻酔下で非常に簡単に採取できるため特に好ましい。脂肪組織の調製法は、上記（１）の欄の説明に準ずる。
（適用疾患）
本発明の細胞製剤の治療又は予防対象の疾患は勃起不全又は尿意障害である。換言すれば、本発明の細胞製剤は勃起障害の予防又は治療、或いは尿意障害の予防又は治療に使用される。従って通常は、勃起障害の患者（又は潜在的患者）又は尿意障害の患者（又は潜在的患者）に対して本発明の細胞製剤が投与されることになる。但し、その効果を確認・検証することなどの実験ないし研究目的で本発明の細胞製剤を使用することもできる。
本発明の細胞製剤の治療又は予防対象の疾患は勃起不全又は尿意障害である。換言すれば、本発明の細胞製剤は勃起障害の予防又は治療、或いは尿意障害の予防又は治療に使用される。従って通常は、勃起障害の患者（又は潜在的患者）又は尿意障害の患者（又は潜在的患者）に対して本発明の細胞製剤が投与されることになる。但し、その効果を確認・検証することなどの実験ないし研究目的で本発明の細胞製剤を使用することもできる。
「勃起不全（Erectile Dysfunction; ED）」とは、男性の性機能障害の一種であり、「性交時に十分な勃起が得られないため、あるいは十分な勃起が維持できないため、満足な性交が行えない状態」をいう。勃起不全（以下、「ED」とも呼ぶ）は「勃起機能障害」や「勃起障害」ともよばれる。EDはその程度によって軽症、中等度、完全型に分類される。また、原因によって器質性（動脈硬化や神経の損傷などに起因）、心因性（精神的なストレスに起因）、混合型（器質性と心因性の両者の要素が組み合わさって生ずる）に分かれる。
「尿意障害」とは、必要なときに尿意が生じない又は生じたとしてもその程度が低い状態をいう。尿意障害は、尿失禁、尿閉等の原因となる。尿意障害は、尿路異常、前立腺肥大、神経因性膀胱等によって生ずる。また、前立腺全摘術等の後に尿意障害が生ずることや、糖尿病や脳血管障害の後遺症としての神経因性膀胱により尿意障害が生ずることもある。尿意障害の改善は生活の質（クオリティー・オブ・ライフ）の向上をもたらす。
（適用対象）
本発明の細胞製剤が投与される対象は典型的にはヒトである。但し、ヒト以外の哺乳動物（ペット動物、家畜、実験動物を含む。具体的には例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、サル、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ等）用に細胞製剤を構成することも可能である。繁殖用の犬や馬などでED様の症状が希に生ずることが確認されており、例えばこのような場合においても本発明の細胞製剤を利用することが可能である。
本発明の細胞製剤が投与される対象は典型的にはヒトである。但し、ヒト以外の哺乳動物（ペット動物、家畜、実験動物を含む。具体的には例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、サル、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ等）用に細胞製剤を構成することも可能である。繁殖用の犬や馬などでED様の症状が希に生ずることが確認されており、例えばこのような場合においても本発明の細胞製剤を利用することが可能である。
（投与方法）
本発明の細胞製剤は好ましくは患部への局所注入により投与される。注入部位は、典型的には、外尿道括約筋又は括約筋部の尿道粘膜下である。好ましくはこれら２箇所の両方に細胞製剤を注入するが、この場合には外尿道括約筋には脂肪組織を含有しない細胞製剤（即ち、必須成分としてASCのみを含有する細胞製剤）を適用し、括約筋部の尿道粘膜下には脂肪組織を含有する細胞製剤（即ち、必須成分としてASC及び脂肪組織を含有する細胞製剤）を適用するとよい。脂肪組織を含有する細胞製剤を使用する意図の一つは、脂肪組織による尿道閉鎖効果を発揮させることにある。従って、括約筋部の尿道粘膜下への注入の際には、尿道閉塞効果を良好に発揮させるため、膨隆により膀胱頸部が閉鎖するまで注入を継続するとよい。細胞製剤の投与量（総量）の例を示すと、外尿道括約筋への適用については例えば0.2ml〜2ml、好ましくは1.5ml〜2mlであり、総量括約筋部の尿道粘膜下への適用については例えば2ml〜20ml、好ましくは15ml〜20mlである(1:10比)。尚、外尿道括約筋への適用、及び括約筋部の尿道粘膜下への適用のいずれについても、２箇所以上に分けて注入するとよい。
本発明の細胞製剤は好ましくは患部への局所注入により投与される。注入部位は、典型的には、外尿道括約筋又は括約筋部の尿道粘膜下である。好ましくはこれら２箇所の両方に細胞製剤を注入するが、この場合には外尿道括約筋には脂肪組織を含有しない細胞製剤（即ち、必須成分としてASCのみを含有する細胞製剤）を適用し、括約筋部の尿道粘膜下には脂肪組織を含有する細胞製剤（即ち、必須成分としてASC及び脂肪組織を含有する細胞製剤）を適用するとよい。脂肪組織を含有する細胞製剤を使用する意図の一つは、脂肪組織による尿道閉鎖効果を発揮させることにある。従って、括約筋部の尿道粘膜下への注入の際には、尿道閉塞効果を良好に発揮させるため、膨隆により膀胱頸部が閉鎖するまで注入を継続するとよい。細胞製剤の投与量（総量）の例を示すと、外尿道括約筋への適用については例えば0.2ml〜2ml、好ましくは1.5ml〜2mlであり、総量括約筋部の尿道粘膜下への適用については例えば2ml〜20ml、好ましくは15ml〜20mlである(1:10比)。尚、外尿道括約筋への適用、及び括約筋部の尿道粘膜下への適用のいずれについても、２箇所以上に分けて注入するとよい。
投与スケジュールは、対象（患者）の性別、年齢、体重、病態などを考慮して作成すればよい。単回投与の他、連続的又は定期的に複数回投与することにしてもよい。複数回投与する際の投与間隔は特に限定されず、例えば１日〜１月である。また、投与回数も特に限定されない。投与回数の例は２回〜１０回である。
１．細胞注入法の検討
１−１．方法
（１）脂肪組織由来間葉系幹細胞（ASC）の分離
細胞外液を皮下に注入後、脂肪吸引チューブで皮下脂肪（ヒト）を細かく吸引した。次に、採取した脂肪組織300gの内、細胞分離用に260gを脂肪由来幹細胞分離装置（Celution（登録商標）装置）に注入した後、使用説明書に従って操作し、幹細胞を分離した。分離した幹細胞を装置からシリンジを使って採取した。一方、分離された幹細胞と混和するための脂肪組織（約20g）を洗浄した。尚、Celution（登録商標）装置にはディスポーザブルセットが装着され、症例ごとに脂肪組織を処理できる。脂肪由来幹細胞分離装置は脂肪基質から幹細胞を切り離す処理を行い、その際、幹細胞は分離された後に洗浄、濃縮される。このリアルタイム処理は、汚染物質に接触するリスクを最小限にするために閉鎖環境で行われ、１回の外科処置の時間内で完結する。
１−１．方法
（１）脂肪組織由来間葉系幹細胞（ASC）の分離
細胞外液を皮下に注入後、脂肪吸引チューブで皮下脂肪（ヒト）を細かく吸引した。次に、採取した脂肪組織300gの内、細胞分離用に260gを脂肪由来幹細胞分離装置（Celution（登録商標）装置）に注入した後、使用説明書に従って操作し、幹細胞を分離した。分離した幹細胞を装置からシリンジを使って採取した。一方、分離された幹細胞と混和するための脂肪組織（約20g）を洗浄した。尚、Celution（登録商標）装置にはディスポーザブルセットが装着され、症例ごとに脂肪組織を処理できる。脂肪由来幹細胞分離装置は脂肪基質から幹細胞を切り離す処理を行い、その際、幹細胞は分離された後に洗浄、濃縮される。このリアルタイム処理は、汚染物質に接触するリスクを最小限にするために閉鎖環境で行われ、１回の外科処置の時間内で完結する。
（２）ASCと脂肪組織の混合比率の検討
以下の試料（各2cc）を用意した後、各試料をヌードラット皮下に18G針で注入し、閉塞効果（bulking効果）を比較した。
試料a：分離した幹細胞とヒト脂肪組織を１：０（即ち脂肪組織のみ）で混合したもの
試料b：分離した幹細胞とヒト脂肪組織を１：１（即ち脂肪組織1gに対して脂肪組織1gから採取された幹細胞を使用）で混合したもの
試料c：分離した幹細胞とヒト脂肪組織を１：１０（即ち脂肪組織1gに対して脂肪組織10gから採取された幹細胞を使用）で混合したもの
以下の試料（各2cc）を用意した後、各試料をヌードラット皮下に18G針で注入し、閉塞効果（bulking効果）を比較した。
試料a：分離した幹細胞とヒト脂肪組織を１：０（即ち脂肪組織のみ）で混合したもの
試料b：分離した幹細胞とヒト脂肪組織を１：１（即ち脂肪組織1gに対して脂肪組織1gから採取された幹細胞を使用）で混合したもの
試料c：分離した幹細胞とヒト脂肪組織を１：１０（即ち脂肪組織1gに対して脂肪組織10gから採取された幹細胞を使用）で混合したもの
１−２．結果
臨床症例への適用を見据えて脂肪組織からASCを分離した。ASCは5mlの軽度赤血球の混ざった細胞成分の溶液として採取可能であった。試料ａ（ヒト脂肪組織のみ）では、瘤全体的容量の減少と血管新生が不十分なため虚血性の潰瘍を中央に認めた。尿道内腔に瘤を形成し閉塞効果を最も効果的に起こすための、脂肪組織とASCの比は１：１０であることが明らかとなった。
臨床症例への適用を見据えて脂肪組織からASCを分離した。ASCは5mlの軽度赤血球の混ざった細胞成分の溶液として採取可能であった。試料ａ（ヒト脂肪組織のみ）では、瘤全体的容量の減少と血管新生が不十分なため虚血性の潰瘍を中央に認めた。尿道内腔に瘤を形成し閉塞効果を最も効果的に起こすための、脂肪組織とASCの比は１：１０であることが明らかとなった。
２．調製したASCの特性評価
Celution（登録商標）装置を用いてヒト脂肪組織から調製した細胞の特性を評価した。まず、FACS分離直後のサンプルを塩化アンモニウム添加によって溶血後、間葉系幹細胞マーカーであるCD29及びCD44を測定した。その結果、CD29およびCD44が陽性であることが示された（図１）。
Celution（登録商標）装置を用いてヒト脂肪組織から調製した細胞の特性を評価した。まず、FACS分離直後のサンプルを塩化アンモニウム添加によって溶血後、間葉系幹細胞マーカーであるCD29及びCD44を測定した。その結果、CD29およびCD44が陽性であることが示された（図１）。
一方、Celution（登録商標）装置を用いて調製した細胞をインスリン、デキサメタゾン、インドメタシン及び3-isobutyl-1-methyl-xanthine(IBMX)を含有する脂肪分化培地で培養した。プライマリーな細胞は線維芽細胞様の形態を示し、4日目には70〜80％コンフルエントな状態となっていた。また脂肪分化誘導7日目には脂肪滴の形成が確認され、Oil-Redによって染色された（図２）。このように脂肪細胞への分化を確認した。
３．ASCの治療効果の検討
脂肪組織から採取されるASCの新規治療用途を見出すべく、以下の検討を行った。
３−１．方法
（１）患者（被験者）
名古屋大学医学部附属病院泌尿器科を受診されている腹圧性尿失禁の患者を被験者とした。患者は全て前立腺癌に対する根治的前立腺摘除術経験し、腹圧性尿失禁を術後１年以上持続した困難症例である。患者の年齢は７３歳〜８３歳（平均７５．６歳）であった。
脂肪組織から採取されるASCの新規治療用途を見出すべく、以下の検討を行った。
３−１．方法
（１）患者（被験者）
名古屋大学医学部附属病院泌尿器科を受診されている腹圧性尿失禁の患者を被験者とした。患者は全て前立腺癌に対する根治的前立腺摘除術経験し、腹圧性尿失禁を術後１年以上持続した困難症例である。患者の年齢は７３歳〜８３歳（平均７５．６歳）であった。
（２）皮下脂肪組織の採取
全身麻酔、あるいは局所および腰椎麻酔下に、患者腹部または臀部皮下脂肪組織に混合液[成分：生理食塩水1000ml+1%リドカイン（キシロカイン）2ml+0.1%アドレナリン（ボスミン）1.5ml+8.4%メイロン10ml]を適量注入し、十分膨満させた。通常形成外科領域で使用される専用シリンジで脂肪組織を含む懸濁液を陰圧吸引した。腰椎麻酔下で行う場合、患者にとってさらに疼痛が生じた際は、鎮痛のため静脈麻酔を追加した。
全身麻酔、あるいは局所および腰椎麻酔下に、患者腹部または臀部皮下脂肪組織に混合液[成分：生理食塩水1000ml+1%リドカイン（キシロカイン）2ml+0.1%アドレナリン（ボスミン）1.5ml+8.4%メイロン10ml]を適量注入し、十分膨満させた。通常形成外科領域で使用される専用シリンジで脂肪組織を含む懸濁液を陰圧吸引した。腰椎麻酔下で行う場合、患者にとってさらに疼痛が生じた際は、鎮痛のため静脈麻酔を追加した。
（３）皮下脂肪組織の処理（ASCの分離）
上記で得た脂肪組織約250〜300gから、ASC分離装置（Celution（登録商標）装置）を用いてASCを分離濃縮した（約1×106〜1×108個/5ml）。まず、滅菌済みのディスポーザブルセットへ採取した脂肪組織を注入し洗浄した。その後、脂肪組織の融解処理を行い、細胞を分離する酵素（CelaseTM）を加えて消化処理を行い、細胞懸濁液の遠心分離および酵素の洗浄を自動的に閉鎖回路内で行った。この採取、調整、移植は名古屋大学附属病院手術室内で行われた。その清潔度はクラス100-10000であり、全ての手技において清潔環境が保たれた。
上記で得た脂肪組織約250〜300gから、ASC分離装置（Celution（登録商標）装置）を用いてASCを分離濃縮した（約1×106〜1×108個/5ml）。まず、滅菌済みのディスポーザブルセットへ採取した脂肪組織を注入し洗浄した。その後、脂肪組織の融解処理を行い、細胞を分離する酵素（CelaseTM）を加えて消化処理を行い、細胞懸濁液の遠心分離および酵素の洗浄を自動的に閉鎖回路内で行った。この採取、調整、移植は名古屋大学附属病院手術室内で行われた。その清潔度はクラス100-10000であり、全ての手技において清潔環境が保たれた。
（４）傍尿道周囲へのASC移植
5mlに分離されたASC（約1×106〜1×108個）を用いて２種類の注入細胞溶液、即ち(a)ASC 0.5〜1.0 mlの細胞溶液及び(b)自己脂肪20gとASC 4.0-4.5 mlを混和した細胞溶液、を用意した。各患者に対して、全身麻酔、あるいは局所および腰椎麻酔下に、尿道より内視鏡を挿入し、上記２種類の注入細胞溶液を18Gの針注射器を用いて内視鏡下に注入した。すなわち、外尿道括約筋内へ(a)溶液0.5〜1.0 mlを左右各々2カ所、（b）溶液を膜様部尿道粘膜下(4,8,6時)に症例に応じて尿道閉塞効果（bulking効果）による尿道内腔の閉鎖が内視鏡的に確認できる程度に注入した（図３）。
5mlに分離されたASC（約1×106〜1×108個）を用いて２種類の注入細胞溶液、即ち(a)ASC 0.5〜1.0 mlの細胞溶液及び(b)自己脂肪20gとASC 4.0-4.5 mlを混和した細胞溶液、を用意した。各患者に対して、全身麻酔、あるいは局所および腰椎麻酔下に、尿道より内視鏡を挿入し、上記２種類の注入細胞溶液を18Gの針注射器を用いて内視鏡下に注入した。すなわち、外尿道括約筋内へ(a)溶液0.5〜1.0 mlを左右各々2カ所、（b）溶液を膜様部尿道粘膜下(4,8,6時)に症例に応じて尿道閉塞効果（bulking効果）による尿道内腔の閉鎖が内視鏡的に確認できる程度に注入した（図３）。
（５）検査と評価方法
治療効果とその持続期間を調べるために、治療前、治療後2週間、1ヶ月及び３ヶ月に所定の検査（傍尿道周囲血流量の測定、一回排尿量の測定、尿失禁の程度の検査、尿道機能検査、MRI検査、超音波検査など）を実施した。また、質問票（アンケート）により、尿失禁の状態や生活に及ぼす影響を調べた。更に、ICIQ-SF（尿失禁症状・QOLスコア：妥当性の検証された自己記入式質問票で、尿失禁頻度、尿失禁量、日常生活に対する影響をスコア化評価するもの）による評価（自覚的所見）と、他覚所見として24時間パッドテスト及び尿流動態検査（尿道内圧測定;最大尿道閉鎖圧、機能的尿道長）を実施した。24時間パッドテストでは、尿失禁があるたびにパッドの重さを計測し（乾いたパッドの重さを差し引く）、24時間の尿失禁量を定量的に測定した。4日間連続計測し、平均を1日の尿失禁量として算出した。
治療効果とその持続期間を調べるために、治療前、治療後2週間、1ヶ月及び３ヶ月に所定の検査（傍尿道周囲血流量の測定、一回排尿量の測定、尿失禁の程度の検査、尿道機能検査、MRI検査、超音波検査など）を実施した。また、質問票（アンケート）により、尿失禁の状態や生活に及ぼす影響を調べた。更に、ICIQ-SF（尿失禁症状・QOLスコア：妥当性の検証された自己記入式質問票で、尿失禁頻度、尿失禁量、日常生活に対する影響をスコア化評価するもの）による評価（自覚的所見）と、他覚所見として24時間パッドテスト及び尿流動態検査（尿道内圧測定;最大尿道閉鎖圧、機能的尿道長）を実施した。24時間パッドテストでは、尿失禁があるたびにパッドの重さを計測し（乾いたパッドの重さを差し引く）、24時間の尿失禁量を定量的に測定した。4日間連続計測し、平均を1日の尿失禁量として算出した。
３−２．結果
各検査の結果を図４〜１２に示す。ほとんどの患者について傍尿道周囲血流（傍尿道周囲／骨盤低筋群造影効果）の上昇が認められる（図４Ａ）。また、５名中４名の患者において１回排尿量の増加を認めた（図４Ｂ）。同様に、尿失禁量も５名中４名の患者で減少した（図４Ｃ）。24時間パッドテストによって術後の尿失禁量の推移を長期間に亘ってモニターした結果、優れた改善効果を認めた（図５、６）。また、ICIQ-SFによる評価では、尿失禁量、尿失禁頻度、QOLの著明な改善が得られた（図７）。尿道内圧測定では、最大尿道閉鎖圧の上昇（症例１：28cmH2Oから43cmH2O、症例２：21cmH2Oから36cmH2O）（図８左）、機能的尿道長の増加（症例１：14mmから32mm、症例２：17mmから27mm）（図８右）がみられ、尿道抵抗の改善が他覚的に確認された。造影超音波検査による、ADRC傍尿道注入部の血流評価においては、注入前に比べて注入翌日から血流の増加がみられ、注入後56日まで注入部の血流の経時的な増加がみられた（図９）。尿道粘膜下に注入された自己脂肪組織は注入後3ヶ月の時点においても、吸収による消失はみられず持続して注入部に存在した（図１０）。
各検査の結果を図４〜１２に示す。ほとんどの患者について傍尿道周囲血流（傍尿道周囲／骨盤低筋群造影効果）の上昇が認められる（図４Ａ）。また、５名中４名の患者において１回排尿量の増加を認めた（図４Ｂ）。同様に、尿失禁量も５名中４名の患者で減少した（図４Ｃ）。24時間パッドテストによって術後の尿失禁量の推移を長期間に亘ってモニターした結果、優れた改善効果を認めた（図５、６）。また、ICIQ-SFによる評価では、尿失禁量、尿失禁頻度、QOLの著明な改善が得られた（図７）。尿道内圧測定では、最大尿道閉鎖圧の上昇（症例１：28cmH2Oから43cmH2O、症例２：21cmH2Oから36cmH2O）（図８左）、機能的尿道長の増加（症例１：14mmから32mm、症例２：17mmから27mm）（図８右）がみられ、尿道抵抗の改善が他覚的に確認された。造影超音波検査による、ADRC傍尿道注入部の血流評価においては、注入前に比べて注入翌日から血流の増加がみられ、注入後56日まで注入部の血流の経時的な増加がみられた（図９）。尿道粘膜下に注入された自己脂肪組織は注入後3ヶ月の時点においても、吸収による消失はみられず持続して注入部に存在した（図１０）。
一方、驚くべきことに、施術１月後に１名の患者に尿意の出現を認めるとともに（図１１）、施術３月後に至っては５名中４名の患者に尿意の出現を認めた。また、勃起不全の指標（EHSスコアー）に関して更に興味深い結果が得られた。即ち、実に５名中４名の患者において勃起不全の改善が認められた（図１２）。
術前・術後の排尿状態の変化を調べた結果、全ての症例で排尿機能の障害を認めなかった（図１３）。
以上の通り、ASCの移植の結果、尿失禁の症状の改善に加え、尿意の回復（尿意障害の改善）及び勃起不全の改善を認めた。後二者の効果は当初予想すらし得ないものであり特筆に値する。尿意の回復及び勃起不全の改善は尿失禁患者の生活の質を飛躍的に高める。ASCによるこのような効果が見出されたことは臨床上、極めて重要な意味をもつ。特に、勃起不全の改善については、患者の年齢（７３歳〜８３歳）を考慮すると、極めて驚くべき効果といえる。
尚、今回施行した2症例（症例１、２）とも、尿失禁の改善が経時的に進み、特に尿失禁消失例では尿失禁改善が漸次改善し、24週（6ヶ月）で消失したこと、造影超音波検査により、経時的な注入部での著明な血流増加がみられたことから、尿道括約筋機能の改善は、単に脂肪組織注入によるbulking効果のみでなく、再生機序が強く関与しているものと考えられる。皮下脂肪組織の採取は、脂肪吸引という形成外科では標準的で低侵襲の方法により行うことができ、また脂肪組織からのASC採取は、分離装置を用いることにより、培養工程を必要とせず、短時間で安全に行うことができ、さらに一連の治療手技過程において、皮下脂肪採取、ASCの採取、採取したADRCsの経尿道的傍尿道注入を行うことができる。以上より、自己ASCの傍尿道注入治療は腹圧性尿失禁に対する新規非侵襲性外科的治療として、安全性が高く、有用な臨床再生療法であり、医学的意義が高いと考えられる。前立腺手術後の腹圧性尿失禁は、女性における腹圧性尿失禁に比べて非常に難治性であり、今回の2例で有効性が得られたことから考えると、女性腹圧性尿失禁に対しても有効であることが示唆される。
４．移植後のASCの特性評価
移植後のASCが平滑筋細胞へ分化したことを確認するため、ヌードラットの傍尿道周囲にASC（Greenラット皮下脂肪から調製したASC）を注入し、28日後に各種染色法で評価した。結果を図１４〜１７に示す。HE染色では尿道内腔に隆起する比較的分化した細胞塊を認めた（図１４、矢印）。また、HE染色された尿道内腔の隆起部位に一致してマッソン・トリクローム染色で赤く染まる筋組織を認めた（図１５、矢印）。一方、マッソン・トリクローム染色された筋組織部分の尿道内腔の隆起部位に一致してαSMA染色とカルポニンtype1染色で平滑筋組織が示される（図１６、１７）。以上の通り、傍尿道周囲ASC注入部位は尿道内腔に隆起する比較的分化した細胞塊として示された。その部位は筋組織として染色され、さらに平滑筋組織を反映する幼弱から成熟した平滑筋組織が染色されるαSMA染色と中等度成熟した平滑筋組織が染色されるカルポニンtype1染色で染色されたが、他方、成熟した平滑筋組織が染色されるMHC（ミオシン重鎖）で染色されなかったことから（データ示さず）、注入された細胞が平滑筋組織に分化し、まだ成熟している平滑筋にまでは至っていないことが推測された。
移植後のASCが平滑筋細胞へ分化したことを確認するため、ヌードラットの傍尿道周囲にASC（Greenラット皮下脂肪から調製したASC）を注入し、28日後に各種染色法で評価した。結果を図１４〜１７に示す。HE染色では尿道内腔に隆起する比較的分化した細胞塊を認めた（図１４、矢印）。また、HE染色された尿道内腔の隆起部位に一致してマッソン・トリクローム染色で赤く染まる筋組織を認めた（図１５、矢印）。一方、マッソン・トリクローム染色された筋組織部分の尿道内腔の隆起部位に一致してαSMA染色とカルポニンtype1染色で平滑筋組織が示される（図１６、１７）。以上の通り、傍尿道周囲ASC注入部位は尿道内腔に隆起する比較的分化した細胞塊として示された。その部位は筋組織として染色され、さらに平滑筋組織を反映する幼弱から成熟した平滑筋組織が染色されるαSMA染色と中等度成熟した平滑筋組織が染色されるカルポニンtype1染色で染色されたが、他方、成熟した平滑筋組織が染色されるMHC（ミオシン重鎖）で染色されなかったことから（データ示さず）、注入された細胞が平滑筋組織に分化し、まだ成熟している平滑筋にまでは至っていないことが推測された。
５．ASCのサイトカイン産生能の検討
ヒトSVFを採取し、継代培養した（ヒトASCの調製）。6代培養した後、10％FBSを含む培地に培地変換し、24時間後に培地を回収した。細胞数を計数するとともに、培地中のHGF濃度を測定した。その結果、細胞106個当たり約10ngのHGFを産生することを確認した（図１８）。
ヒトSVFを採取し、継代培養した（ヒトASCの調製）。6代培養した後、10％FBSを含む培地に培地変換し、24時間後に培地を回収した。細胞数を計数するとともに、培地中のHGF濃度を測定した。その結果、細胞106個当たり約10ngのHGFを産生することを確認した（図１８）。
次に、継代培養後の上記細胞（ヒトASC）3×106個を７週齢メスヌードラット尿道壁内に注入した。その後、３日目に屠殺し、注入部のHGF（肝細胞増殖因子）濃度を測定した。結果、注入した細胞から産生されたHGFの傍尿道周囲組織濃度は細胞注入後３日目でピークとなり（組織濃度は1mgあたり約300pg）、翌日４日目からは検出限界以下に低下した（図１９）。
一方、ラット脂肪組織から分離したSVFを培養し（20%FBS含有、成長因子非含有の培地を使用）、培養上清のVEGF濃度を測定した。その結果、正常酸素条件下及び低酸素条件下のいずれにおいても培養上清のVEGF濃度が上昇しており（図２０）、ASCがVEGFを産生することを確認した。
以上の通り、ASCがHGFを産生することを確認するとともに、ASC移植部におけるHGF濃度が移植後数日でピークを迎え、その後消失することを確認した。即ち、尿道括約筋再増殖及び分化に関与し重要な役割を果たすとされているHGFをASCが産生する事実と、HGF濃度が再生初期のみ上昇し安全性が担保されることが確認された。また、ASCがVEGFも産生することが確認された。
６．大動物を用いた前臨床研究
大動物としてブタを対象に、自己ASCを細胞分離装置で抽出し、傍尿道周囲に注入した。細胞注入28日後に各種染色法で有効性を評価した。また、安全性の検討も行った。
大動物としてブタを対象に、自己ASCを細胞分離装置で抽出し、傍尿道周囲に注入した。細胞注入28日後に各種染色法で有効性を評価した。また、安全性の検討も行った。
（１）自己ASCの傍尿道周囲注入手術
全身麻酔下に仰臥位をとる。臨床で行うのと同様の手技で皮下にボスミン含有生理食塩水(100ml)注入し18Gの皮下脂肪吸引管にて100g自己脂肪組織を吸引する。この組織からASC分離装置（Celution（登録商標）装置）によりASCを抽出した(5ml溶液)。同時に下腹部正中切開(A-1)にて骨盤腔内に入り膀胱頚部を剥離、露出する。膀胱頚部尿道から遠位に向かい約2cmの部位で傍尿周囲に細胞含有液を数回に分けて注入した。出血がないことを確認し、皮下（吸収糸；バイクリル3-0）皮膚（非吸収糸;絹糸1-0）で縫合し、手術を終了した。
全身麻酔下に仰臥位をとる。臨床で行うのと同様の手技で皮下にボスミン含有生理食塩水(100ml)注入し18Gの皮下脂肪吸引管にて100g自己脂肪組織を吸引する。この組織からASC分離装置（Celution（登録商標）装置）によりASCを抽出した(5ml溶液)。同時に下腹部正中切開(A-1)にて骨盤腔内に入り膀胱頚部を剥離、露出する。膀胱頚部尿道から遠位に向かい約2cmの部位で傍尿周囲に細胞含有液を数回に分けて注入した。出血がないことを確認し、皮下（吸収糸；バイクリル3-0）皮膚（非吸収糸;絹糸1-0）で縫合し、手術を終了した。
（２）傍尿道周囲注入部28日目の肉眼的及び顕微鏡的所見
注入部位に一致して尿道内腔に隆起する（図２１（１））パリセイドパターンの紡錘状細胞の構造を有することを認めた（図２１（２））。
注入部位に一致して尿道内腔に隆起する（図２１（１））パリセイドパターンの紡錘状細胞の構造を有することを認めた（図２１（２））。
（３）注入部の免疫染色所見（28日目）
HE染色では尿道内腔に隆起する分化した細胞塊を認める（図２２（１））。HE染色された尿道内腔の隆起部位に一致して矢印で示すごとくマッソン・トリクローム染色で赤く染まる筋組織を認める（図２２（２））。マッソン・トリクローム染色された筋組織成分の尿道内腔の隆起部位の外側から放射状にデスミンで染色される平滑筋または横紋筋様構造を認める（図２２（３））。また、その構造と一致して細胞増殖が亢進を反映するKi-67で染色される細胞構造を認める（図２２（４））。その部位は平滑筋組織が特異的に染色されるαSMA（図２２（５））、カルポニンtype1染色（図２２（６））及びMHC（ミオシン重鎖）（図２２（７））の３つの平滑筋抗体で染色された。また神経細胞を反映するS-100（図２２（８））とシナプトフィジン（図２２（９））の２つの抗体で染色された。
HE染色では尿道内腔に隆起する分化した細胞塊を認める（図２２（１））。HE染色された尿道内腔の隆起部位に一致して矢印で示すごとくマッソン・トリクローム染色で赤く染まる筋組織を認める（図２２（２））。マッソン・トリクローム染色された筋組織成分の尿道内腔の隆起部位の外側から放射状にデスミンで染色される平滑筋または横紋筋様構造を認める（図２２（３））。また、その構造と一致して細胞増殖が亢進を反映するKi-67で染色される細胞構造を認める（図２２（４））。その部位は平滑筋組織が特異的に染色されるαSMA（図２２（５））、カルポニンtype1染色（図２２（６））及びMHC（ミオシン重鎖）（図２２（７））の３つの平滑筋抗体で染色された。また神経細胞を反映するS-100（図２２（８））とシナプトフィジン（図２２（９））の２つの抗体で染色された。
以上の通り、傍尿道周囲ASC注入部位は尿道内腔に隆起する成熟した細胞塊として示された。その部位は筋組織として染色され、さらに平滑筋組織を反映する幼弱から成熟した平滑筋組織が染色されるαSMA染色と中等度成熟した平滑筋組織が染色されるカルポニンtype1染色、加えて成熟した平滑筋組織が染色されるMHCで染色され３つの抗体で平滑筋成分が染色された。さらに、その周辺と内部に神経細胞を反映するS-100とシナプトフィジンで染色され、平滑ばかりでなく機能をつかさどる神経をも増殖していることが推測された。小動物に比較すると細胞注入28日目においても大動物の尿道内腔に突出するこぶは平滑筋細胞で構成されていた。
（４）術後経過
手術後同日から自尿あり、完全尿閉の合併症がないことを確認した。その後も順調に自尿あり導尿処置の必要性はなかった。術後の全身状態も良好で体重の推移は28日間に33.9から48.9ｋｇで14.1kg増加していた（細胞注入後栄養状態；体重変化）。
手術後同日から自尿あり、完全尿閉の合併症がないことを確認した。その後も順調に自尿あり導尿処置の必要性はなかった。術後の全身状態も良好で体重の推移は28日間に33.9から48.9ｋｇで14.1kg増加していた（細胞注入後栄養状態；体重変化）。
（５）細胞注入後28日の血液所見、主な臓器のマクロ、ミクロ所見
血液検査の結果、貧血、低栄養状態なく、末梢血、生化学データに異常を認めなかった。一方、摘出した臓器の肉眼的所見は以下の通りであり、異常を認めなかった。
皮膚、筋肉；腫瘍・炎症・循環障害なし
脳：髄液の色調異常なく、脳表面、割面に腫瘍・炎症・循環障害なし
胸腔：肺；胸水・癒着・腫瘍・炎症なし、出血・うっ血無し
心臓；心のう液正常、心膜癒着なし、心外膜出血なし
腹腔：腹水・癒着なし、腫瘍・炎症・循環障害なし
消化管・肝胆膵・脾臓に腫瘍・炎症・循環障害なし
後腹膜臓器；腎、尿管、膀胱、前立腺、精嚢、陰茎については、細胞注入のために剥離した膀胱頚部、細胞注入を行った傍尿道を含めて注入針痕、癒着・腫瘍・炎症・循環障害の所見を認めず。
血液検査の結果、貧血、低栄養状態なく、末梢血、生化学データに異常を認めなかった。一方、摘出した臓器の肉眼的所見は以下の通りであり、異常を認めなかった。
皮膚、筋肉；腫瘍・炎症・循環障害なし
脳：髄液の色調異常なく、脳表面、割面に腫瘍・炎症・循環障害なし
胸腔：肺；胸水・癒着・腫瘍・炎症なし、出血・うっ血無し
心臓；心のう液正常、心膜癒着なし、心外膜出血なし
腹腔：腹水・癒着なし、腫瘍・炎症・循環障害なし
消化管・肝胆膵・脾臓に腫瘍・炎症・循環障害なし
後腹膜臓器；腎、尿管、膀胱、前立腺、精嚢、陰茎については、細胞注入のために剥離した膀胱頚部、細胞注入を行った傍尿道を含めて注入針痕、癒着・腫瘍・炎症・循環障害の所見を認めず。
また、HE染色にて上記臓器の顕微鏡的検討を行ったが、腫瘍、炎症、循環障害を示唆する所見はなかった。
（６）まとめ
大動物を対象に自己ASCの傍尿道周囲注入手術を臨床研究と同じ方法、実際治療施行にあたる術者で行なった。手術の合併症である完全尿閉はなく、細胞治療が全身に及ぼす影響として全臓器と注入局所において、この臨床再生の目的以外の脂肪、骨、腫瘍の分化の所見や炎症、循環障害の所見は認めなかった。さらに、血液検査においても特に異常を認めなかった。また、注入部に形成されたこぶは、28日後も存在し、bulking massとしての有効性が確認された。さらに、注入部こぶの免疫染色により、平滑筋への分化が示された。以上より、ブタにおいてもASCの傍尿道注入の安全性と有効性が示された。
大動物を対象に自己ASCの傍尿道周囲注入手術を臨床研究と同じ方法、実際治療施行にあたる術者で行なった。手術の合併症である完全尿閉はなく、細胞治療が全身に及ぼす影響として全臓器と注入局所において、この臨床再生の目的以外の脂肪、骨、腫瘍の分化の所見や炎症、循環障害の所見は認めなかった。さらに、血液検査においても特に異常を認めなかった。また、注入部に形成されたこぶは、28日後も存在し、bulking massとしての有効性が確認された。さらに、注入部こぶの免疫染色により、平滑筋への分化が示された。以上より、ブタにおいてもASCの傍尿道注入の安全性と有効性が示された。
７．尿失禁動物モデルを用いた検討
ヒトにおける前立腺摘除後の難治性腹圧性尿失禁症状を再現する動物モデルとして知られるECMモデルラット（電気メス前立腺部尿道周囲剥離腹圧性尿失禁ラット；Chermansky C. J. et al. Neurourology and Urodynamics 23: 166-171 (2004)）を用い、ASCの傍尿道周囲注入術による治療効果を調べた。まず、既報の方法に準じ雄ウイスターラット（250〜300g）の前立腺部尿道周囲の剥離した後、予め調製しておいたASC（同系ラットの皮下脂肪からWO/2008/018450（PCT/JP2007/065431）に記載の方法の方法で調製）を注入した（ASC治療群）。対照として、ASCの代わりに溶媒（DMEM培地）を注入した（ECMモデル群）。術後２週及び４週にASC治療群、ECMモデル群及び偽手術群（sham群）を比較評価した。
ヒトにおける前立腺摘除後の難治性腹圧性尿失禁症状を再現する動物モデルとして知られるECMモデルラット（電気メス前立腺部尿道周囲剥離腹圧性尿失禁ラット；Chermansky C. J. et al. Neurourology and Urodynamics 23: 166-171 (2004)）を用い、ASCの傍尿道周囲注入術による治療効果を調べた。まず、既報の方法に準じ雄ウイスターラット（250〜300g）の前立腺部尿道周囲の剥離した後、予め調製しておいたASC（同系ラットの皮下脂肪からWO/2008/018450（PCT/JP2007/065431）に記載の方法の方法で調製）を注入した（ASC治療群）。対照として、ASCの代わりに溶媒（DMEM培地）を注入した（ECMモデル群）。術後２週及び４週にASC治療群、ECMモデル群及び偽手術群（sham群）を比較評価した。
評価結果を図２３に示す。ASC治療群ではECMモデル群に比較して尿漏出圧が有意に高い。また、経時的な尿漏出圧の上昇も認める。このように、前立腺癌術後の難治性腹圧性尿失禁症例の脂肪組織由来幹細胞尿道周囲注入による尿失禁の改善効果が、条件を一定にした基礎実験でも確認された。
本発明の細胞製剤は勃起不全の改善又は尿意の回復（尿意障害の回復）のために使用される。本発明の細胞製剤の適用対象（患者）として、腹圧性尿失禁の患者、前立腺術後の尿意障害の患者、畜尿障害の患者、勃起不全の患者などが想定される。
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
Claims (14)
- 脂肪組織由来間葉系幹細胞を含有し、尿意障害用の細胞製剤。
- 体脂肪を更に含有する、請求項１に記載の細胞製剤。
- 脂肪組織由来間葉系幹細胞を含有する第１構成要素と、生体から分離した体脂肪を含有する第２構成要素とからなるキットであることを特徴とする、請求項２に記載の細胞製剤。
- 脂肪組織由来間葉系幹細胞を含有し、その投与時に、生体から分離した体脂肪が併用投与されることを特徴とする、請求項２に記載の細胞製剤。
- 前記脂肪組織由来間葉系幹細胞が、細胞表面マーカーCD29及びCD44陽性である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞製剤。
- 前記脂肪組織由来間葉系幹細胞が、
（１）脂肪組織から分離した細胞集団を800〜1500rpm、1〜10分間の条件下で遠心処理したときに沈降する沈降細胞集団に含まれる接着性細胞若しくはその継代細胞、
（２）前記沈降細胞集団を低血清条件下で培養したときに増殖した細胞、
（３）脂肪組織から分離した細胞集団を低血清条件下で培養したときに増殖した細胞、
（４）脂肪組織をプロテアーゼ処理した後、濾過処理に供し、次いで濾液を遠心処理することによって沈渣として回収される沈降細胞集団、又は
（５）脂肪組織をプロテアーゼ処理した後、濾過処理を経ることなく遠心処理することによって沈渣として回収される沈降細胞集団、
である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞製剤。 - 前記低血清条件が、培養液中の血清濃度が5%(V/V)以下の条件である、請求項６に記載の細胞製剤。
- 前記脂肪組織がヒトの脂肪組織である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の細胞製剤。
- 患者の外尿道括約筋及び／又は外尿道括約筋部の尿道粘膜下に投与されることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の細胞製剤。
- 腹圧性尿失禁の患者に投与されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の細胞製剤。
- 前立腺摘除術後の患者に投与されることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の細胞製剤。
- 以下のステップを含む、尿意障害用の細胞製剤の調製法：
（１）脂肪組織由来間葉系幹細胞及び体脂肪を用意するステップ；
（２）前記脂肪組織由来間葉系幹細胞と前記体脂肪を混合するステップ。 - 尿意障害用の細胞製剤を製造するための、脂肪組織由来間葉系幹細胞の使用。
- 尿意障害用の細胞製剤を製造するための、脂肪組織由来間葉系幹細胞及び体脂肪の使用。
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