JP4949557B2 - Peptide acylation method and novel acylating agent - Google Patents
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Description
【０００１】
本発明の分野
本発明はペプチド又はタンパク質への1つ以上のアシル基の導入方法に関する。より特に、本発明は天然のGLP−1又はそのアナログに含まれるリジン残基のεアミノ基の改良したアシル化方法に関する。さらには、本発明は前記方法においてアシル化剤として有効な化合物に関する。
【０００２】
本発明の背景
ペプチドは医療の現場で広く用いられ、そしてそれらを組換えDNA技術によって製造できるので、それらの重要性がこれからも増大すると予想される。天然のペプチド又はそれらのアナログが治療に使用される場合、それらが高いクリアランスを持つことが広く見うけられる。治療薬の高いクリアランスは、繰返されてきた投与が必要となったとき以降にも長期間にわたるそれらの高い血中濃度の維持することが望まれる場合に不便である。高いクリアランスをもつ天然型のペプチドの例は：ACTH、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、アンギオテンシン、カルシトニン、エキセンジン、エキセンジン−3、エキセンジン−4、インシュリン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド−1、グルカゴン様ペプチド−2、インシュリン様成長因子−1、インシュリン様成長因子−2、ガストリック・インヒビトリー・ペプチド、成長ホルモン放出因子、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド、セクレチン、エンテロガストリン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ソマトメジン、副甲状腺ホルモン、トロンボポエチン、エリスロポエチン、視床下部ホルモン放出因子、プロラクチン、甲状腺刺激ホルモン、エンドルフィン、エンケファリン、バソプレッシン、オキシトシン、オピオイド及びそれらのアナログ、スーパーオキサイド・ディスムターゼ、インターフェロン、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニン・デアミナーゼ、アデノシン・デアミナーゼ、並びにリボヌクレアーゼである。
【０００３】
天然ペプチド又はそのアナログへの親油性アシル基の導入は、天然ペプチド（又は改変されていないアナログ）に関連する延長された作用特性をもつアシル化されたペプチドを導く。この現象は、当該出願者の先の出願、GLP-1及びアナログのアシル化を開示するWO98/08871、GLP-2及びアナログのアシル化を開示するWO98/08872、並びにエキセンジン及びアナログのアシル化を開示するWO99/43708において完全に記載されそして論証されている。さらには親油性基に隣接する負電荷をもちうる基、例えばカルボン酸基の包含が有利でありうることが提唱されている。
【０００４】
欧州特許出願第92107035.5号（Kuraray社）はタンパク質への長鎖カルボン酸の調製のための長鎖ジカルボン酸の反応性モノエステルを記載する。
【０００５】
モノ−又はジペプチド・スペーサーを介したGLP-1への親油性アシル基の導入は特に興味深く、そしてWO98/08871中に提唱されそして例示されている。アスパラギン酸及びグルタミン酸が好適なリンカーとして挙げられた。しかしながら、このようなモノ−又はジペプチド・スペーサーは、補足的なカルボン酸基を含むため、保護及びその後の脱保護ステップが必要であると考えられた。脱保護は、前記ペプチド（GLP-1）の崩壊を一定の度合いで導く酸性条件下でおこなわれた。よって、それらの変異体の調製のための代替の方法が望ましい。
【０００６】
よって、α−アミノ−α,ω−ジカルボン酸スペーサーを介したペプチドへの親油性残基の導入のための代替方法の提供が本発明の目的である。前記方法は改変されたペプチドの調製を容易にするであろう。電荷をもちうるカルボン酸基は、親油性残基の近くに導入され、このとき上記親油性残基に対して直接作用することはない。
【０００７】
本発明の詳細
本発明はN-アシル化されたペプチド（N-アシル化されたタンパク質）を得るためのペプチド（又はタンパク質）の1つ以上のアミノ基のアシル化方法であって、以下のステップ：
（a）少なくとも遊離アミノ基をもつペプチド（又はタンパク質）を以下の一般式（Ｉ）：
【０００８】
【化３】
｛式中、
nは0〜8であり；
R1はCOOR4であり；
R2は親油性部分であり、例えばC3-39−アルキル、C3-39−アルケニル、C3-39−アルカジエニル、及びステロイド性残基から選ばれ；
R3は、R3がそれに付着されているところのカルボキシル基と一緒になって、反応性エステル又は反応性N−ヒドロキシ・イミド・エステルを表し；そして
R4は水素、C1-12−アルキル、及びベンジルから選ばれる。｝により表されるアシル化剤と、塩基性条件下、非プロトン極性溶媒と水の混合物中で反応させ；及び
（b）R4が水素でない場合、塩基性条件下、上記のアシル化したペプチド・エステル基（COOR4）をケン化する；
を含む前記方法を提供する。
【００１０】
塩基性条件下における前記アシル化されたペプチド・エステル（ここではR4はアルキル基又はベンジル基）のケン化は、上記ペプチド及び上記スペーサーのさまざまなα−アミノ酸断片のごくわずかなラセミ化又は無ラセミ化において可能である。本出願には副産物、例えば分解産物の純度及び抑制に関連するあらかじめ用いた酸性的加水分解に関して確かな利点が発見された。
【００１１】
塩基性条件下における遊離酸（ここではR4は水素）としてのアシル化剤を用いたアシル化もまた発見された。前記アシル化は、本質的に副産物なしにそして脱保護のステップによらず、望ましい産物であるアシル化されたペプチドを直接的に誘導する。
【００１２】
本発明は前述の方法においてアシル化剤として有効な新規化合物もまた提供し、上記の新規化合物は以下の一般式（Ｉ）：
【００１３】
【化４】
｛式中、
nは0〜8であり；
R1はCOOHであり;
R2は親油性部分であり、例えばC3-39−アルキル、C3-39−アルケニル、C3-39−アルカジエニル、及びステロイド性残基から選ばれ；そして
R3は、R3がそれに付着されているところのカルボキシル基と一緒になって反応性エステル又は反応性N−ヒドロキシ・イミド・エステルを表す。｝により表される。
【００１５】
本発明の詳細な説明
ペプチド及びタンパク質
本発明がインビボにおけるクリアランス速度を低下させるためのいくつかのペプチド（又はタンパク質）への親油性アシル基の導入にとって有効であることは一般的に理解される。前記ペプチド及びタンパク質の例はACTH、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、アンギオテンシン、カルシトニン、エキセンジン及びそのアナログ、インシュリン及びそのアナログ、グルカゴン及びそのアナログ、グルカゴン様ペプチド−1及びそのアナログ、グルカゴン様ペプチド−2及びそのアナログ、インシュリン様成長因子−1、インシュリン様成長因子−2、ガストリック・インヒビトリー・ペプチド、成長ホルモン放出因子、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド、セクレチン、エンテロガストリン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ソマトメジン、副甲状腺ホルモン、トロンボポエチン、エリスロポエチン、視床下部ホルモン放出因子、プロラクチン、甲状腺刺激ホルモン、エンドルフィン、エンケファリン、バソプレッシン、オキシトシン、オピオイド及びそれらのアナログ、スーパーオキサイド・ディスムターゼ、インターフェロン、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニン・デアミナーゼ、アデノシン・デアミナーゼ、並びにリボヌクレアーゼである。
【００１６】
前記ペプチド（又はタンパク質）は少なくとも1つの遊離アミノ基、ここで上記アミノ基はN−末端アミノ基又は側鎖のアミノ基をもつであろうことは理解されるであろう。特に興味深いものはリジン及びオルニチンアミノ酸残基のアミノ基である。前記方法は特にリジン残基のε−アミノ基のN−アセチル化に関する。着目の前記ペプチド又はタンパク質が、本発明に従いN−アシル化されうる2つ以上のペンダント・アミノ基をもちうることもまた理解されるであろう。
【００１７】
本発明がGLP-1及びそのアナログの改変にとって特に好適であることは必然的に理解される。本発明に従いN−アシル化されうるGLP-1及びアナログの例は、GLP-1及び切断型アナログ、例えば
【００１８】
【化５】
である。
【００２０】
それらのGLP-1アナログ及び切断型アナログのそれぞれは本発明の他の態様を構成する。
【００２１】
本発明はGLP-2及びそのアナログの改変にとっても特に好適であることは必然的に理解される。本発明に従いN−アシル化されうるGLP-2及びアナログの例は、GLP-2アナログ及び切断型アナログ、例えばLys20GLP−2（1−33）； Lys20Arg30GLP−2（1−33）； Arg30Lys34GLP−2（1−34）； Arg30Lys35GLP−2（1−35）； Arg30,35Lys20GLP−2（1−35）； 及びArg35GLP−2（1−35）である。それらのGLP-2アナログ及び切断型アナログのそれぞれは本発明の他の態様を構成する。
【００２２】
本発明はエキセンジン（exendin）及びそのアナログの改変にとっても特に好適であることは必然的に理解される。本発明に従いN−アシル化されうるエキセンジン及びアナログの例は、エキセンジン・アナログ及び切断型アナログ、例えばエキセンジン−3及びエキセンジン−4である。それらのエキセンジン・アナログ及び切断型アナログのそれぞれは本発明の他の態様を構成する。
【００２３】
本発明のさらなる態様において前記N−アシル化はリジン残基のε−アミノ基において起こる。
【００２４】
GLP-1及びそのアナログの作用はWO98/08871に全て記載されている。
【００２５】
GLP-2及びそのアナログの作用はWO98/08872に全て記載されている。
【００２６】
エキセンジン及びそのアナログの作用はWO99/43708に全て記載されている。
【００２７】
アシル化剤
本発明の方法において、少なくとも1つの遊離アミノ基をもつペプチド（又はタンパク質）は一般式（Ｉ）のアシル化剤と反応する。
【００２８】
【化６】
一般式（Ｉ）中の整数nは好ましくは0〜8、特に0〜6であり、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などに相当する。好ましくはnは0〜4、例えば0〜2、0（アスパラギン酸）又は1（グルタミン酸）である。それらの整数及び範囲のそれぞれは本発明の他の態様を構成する。
【００３０】
式（Ｉ）中のR1は遊離の酸性基（COOH）又はエステル基（COOR4）を表す。R1がエステル基である場合において、R4は塩基性条件下で加水分解によって（アルコールに相当するものとして）遊離されうる基から選ばれる。前記の基の例はC1-12−アルキル、例えばメチル、エチル、prop−1−イル、prop−2−イル、but−1−イル、but−2−イル、2−メチル−prop−1−イル、2−メチル−prop−2−イル（tert−butyl）、hex−1−イルなど、及びベンジルである。それらの基のそれぞれは本発明の他の態様を構成する。
【００３１】
式（Ｉ）中のR2は前記ペプチド又はタンパク質中に取り込まれている親油性の部分を表す。前記の親油性の部分はC3-39−アルキル、C3-39−アルケニル、C3-39−アルカジエニル、及びステロイド性残基から典型的に選ばれる。C3-39−アルキルの具体的な例はヘプチル、ノニル、ウンデカニル、トリデカニル、ペンタデカニル、ヘプタデカニル、及びノナデカニルである。それらの親油性の部分のそれぞれは本発明の他の態様を構成する。
【００３２】
前記の親油性置換基又は部分は、約0.1mg/水100ml〜約250mg/水100mlの範囲、好ましくは約0.3mg/水100ml〜約75mg/水100mlの範囲における20℃の水に対してもっている溶解度によって特徴づけられる。例えば、オクタン酸（C8）は20℃の水に対して68mg/100mlの溶解度をもち、デカン酸（C10）は20℃の水に対して15mg/100mlの溶解度をもち、そしてオクタデカン酸（C18）は20℃の水に対して0.3mg/100mlの溶解度をもつ。それらの親油性置換基の範囲のそれぞれは本発明の他の態様を構成する。
【００３３】
前記用語「C3-39−アルキル（C3-39−alkyl）」、「C3-39−アルケニル（C3-39−alkenyl）」、及び「C3-39−アルカジエニル（C3-39−alkadienyl）」は直鎖及び分岐鎖、好ましくは直鎖、飽和、モノ−不飽和、ジ−不飽和、3〜39炭素原子の炭化水素ラジカルのそれぞれを包含することを意図している。C3-39−アルキルの具体的な例はヘプチル、ノニル、ウンデカニル、トリデカニル、ペンタデカニル、ヘプタデカニル、及びノナデカニルである。
【００３４】
本明細書において使用した場合、前記用語「ステロイド性残基（steroidal residues）」は、ステロイド性カルボン酸から得られるR2が付着されるところのカルボニル基をともなう親油性基を意味することを意図する、例えばトリ−、テトラ−、及びペンタサイクリック、完全飽和又は部分的不飽和C16-36−炭化水素である。前記の基R2−C（＝O）−の例は、リトコロイル（lithocholoy）、デオキシコロイル（deoxycholoyl）、及びコロイル（choloyl）である。
【００３５】
前記親油性基の中で先に挙げた、C7-25−アルキル、C7-25−アルケニル、C7-25−アルカジエニル、及びステロイド性残基は特に関連がある。特に興味深い例はヘプチル、ノニル、ウンデカニル、トリデカニル、ペンタデカニル、ヘプタデカニル、ノナデカニル、リトコロイル、デオキシコロイル、及びコロイルである。それらの親油性基のそれぞれは本発明の他の態様を構成する。
【００３６】
式（Ｉ）中のR3は、R3がそれに付着されているところのカルボキシル基と一緒になって反応性エステル又は反応性N−ヒドロキシ・イミド・エステルを表す。それらのエステルのそれぞれは本発明の他の態様を構成する。反応性エステル又は反応性N−ヒドロキシ・イミド・エステルは、アミノ、チオ、及びヒドロキシ基のアシル化に用いられる反応基として有機化学の分野（特にペプチド化学）にて周知である。本発明の文脈中の用語「反応性エステル又は反応性N−ヒドロキシ・イミド・エステル」は、カルボン酸基の形態にアミン、好ましくは一級アミンのアシル化に好適な官能性をもたせたエステルを意味することを意図する。よって、一級アミンのアシル化の選択性はヒドロキシ及びチオ基のアシル化までおよぶことが好まれることは理解されるであろう。反応性N−ヒドロキシ・イミド・エステルは特に好まれる。
【００３７】
反応性エステルの例は1−ヒドロキシベンゾトリアゾール・エステル及び誘導体である。カルボン酸の前記活性化されたエステル形成のための高い効果をもつ多くの試薬、例えば2−（1H−ベンゾトリアゾール−1イル）−1,1,3,3,−テトラメチルロニウム・テトラフルオロボレートが知られている。前記反応性エステルは塩基、例えば有機塩基であるトリアルキルアミンが存在することによりその場で典型的に形成される。
【００３８】
N−ヒドロキシ・イミド・エステルの前記イミド部の例は、欧州特許出願第92107035.5号の13ページ3行目から17ページ10行目までに明確に記載されているものである（これを本明細書に援用する）。それらの中で特に興味深いイミド部の例は、サクシンイミド（succinimide）、フタルイミド（phthalimide）などである。それらのイミド部のそれぞれは本発明の他の態様を構成する。
【００３９】
前記式（Ｉ）の反応性N−ヒドロキシ・イミド・エステルは、対応する酸（すなわちN-アシル化されたα−カルボキシ保護された二酸（N-acylated α-carboxy protected diacid）（R4は水素ではない））と等モル量（例えば0.95〜1.05モル、好ましくは1.0モル）の対応するイミドのN−ヒドロキシ−イミドの縮合によって調製されうる。（前記N−アシル化されたα−カルボキシ保護された二酸は一方で対応する親油性の部分のα−カルボキシ保護された、α−アミノジアシド、及びベンゾトリアゾール・エステルから典型的には調製される。このベンゾトリアゾール・エステルは、例えばWO98/02460（実施例1〜3）に記載のDCC共役によって塩素酸とベンゾトリアゾールから又は遊離酸とベンゾトリアゾールから調製される。）前記縮合は塩基性条件下、例えば共役剤、例えばカルボジイミド共役剤（例えばジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC））の存在において典型的におこなわれる。この場合、前記共役剤は好ましくは酸に対して等モル量添加される。前記反応は極性非プロトン溶媒、例えば無水テトラヒドロフラン（THF）、無水ジメチルホルムアミド（DMF）、無水アセトン、無水ジクロロメタン、無水ジオキサン、無水ジメチルアセトアミド又は無水N−メチル−2−ピロリドン（NMP）中にて典型的にはおこなわれる。前記反応は0〜50℃、例えば5〜30℃、例えば室温の範囲の温度にて、1〜96時間、例えば4〜36時間の期間において典型的にはおこなわれる。試薬と条件の1つの実行可能な組合せは以下の：前記N−ヒドロキシ−イミド（サクシンイミド又はフタルイミド）と着目の前記酸をおよそ1：1のモル比において無水THF又は無水DMF（又はそれらの混合物）中に溶解し、そして等モル量のDCCを上記溶液に添加する。N−ヒドロキシ−イミドと酸の間の反応完了の後、上記産物を従来法、例えばろ過（DCCを共役剤として使用した場合には沈澱させたジシクロヘキシルウレア（DCU）のろ過）、結晶化、再結晶化、クロマトグラフィーなどにより分離及び精製する。1つの実行可能な精製経路はろ過、減圧下における溶媒の蒸発、前記産物の再溶解、例えばアセトンに再溶解しろ過、非極性溶媒の添加によって結晶化、例えばヘキサンに再溶解し、場合によっては再結晶化及び／又は洗浄により沈澱させた使用した共役剤の除去を含む。前記産物は前記式（Ｉ）のアシル化剤として本発明の方法に直ちに使用されうる。
【００４０】
前記式（Ｉ）のアシル化剤が遊離αカルボン酸（R4＝水素）として使用される場合には、R4が選択的に除かれる基であるところの上記式（Ｉ）の化合物はR4が水素であるところの対応する化合物に転化する。前記カルボン酸保護基は接触水素化によって除かれうるベンジル基又は選択的に除かれうるアリル基でありうる。ベンジル保護基は非プロトン極性溶媒中の接触水素化によって、例えばアセトン中で室温にて炭素上パラジウムと水素によって除かれうる。前記反応は激しい撹拌のもとで水素ガス雰囲気の閉ざされた容器（典型的には0.1〜10atm）中でも起こりうる。前記反応はパラジウム触媒の品質に依存して0.5〜12時間で典型的には完了する。従来法を応用する。
【００４１】
R4が水素であるところの前記式（Ｉ）の化合物は新規物質として、そしてそれによってそれらの化合物が本発明の特殊な側面から成ることが理解される。よって、本発明は以下の一般式（Ｉ）：
【００４２】
【化７】
｛式中、
nは0〜8であり；
R1はCOOHであり;
R2は親油性の部分であり、好ましくはC3-39−アルキル、C3-39−アルケニル、C3-39−アルカジエニル、及びステロイド性残基から選ばれ；そして
R3は、R3がそれに付着されているところのカルボキシル基と一緒になって、反応性エステル又は反応性N−ヒドロキシ・イミド・エステルを表す。｝により表される新規化合物をも提供する。
【００４４】
反応条件
前記式（Ｉ）のアシル化剤と前記ペプチド又はタンパク質の間の反応は、非プロトン極性溶媒と水の混合物において塩基性条件下でおこなわれる。
【００４５】
前記式（Ｉ）のアシル化剤は前記ペプチド又はタンパク質のアミノ基の数に関連してわずかな過剰量にて典型的には使用される。前記割合は典型的には前記ペプチドのアミノ基数の値を考慮して1：1〜1：20と余分のアシル化剤、好ましくは1：1.2〜1：5である。
【００４６】
前記ペプチドが十分なN−アシル化であるか又は一部だけのN−アシル化であるかは使用したアシル化剤の量と前記反応条件に依存しうることは理解されるであろう。前記N−アシル化が実質的に化学量論的であることは好ましい。
【００４７】
典型的には、非プロトン極性溶媒は無水テトラヒドロフラン（THF）、無水ジメチルホルムアミド（DMF）、アセトン、ジクロロメタン、ジメチルスルホキシド（DMSO）、ジオキサン、ジメチルアセトアミド又はN−メチル−2−ピロリドン及びそれらの混合物から選ばれ、中でもジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、及びN−メチル−2−ピロリドンが好まれ、そしてN−メチル−2−ピロリドンが特に好まれる。前記非プロトン極性溶媒と水（例えばN−メチル−2−ピロリドンと水）の割合は典型的には1：10〜10：1、とりわけ1：5〜5：1、特に1：1〜3：1である。
【００４８】
前記温度は典型的には-10〜50℃の範囲、好ましくは0〜25℃の範囲に維持される。
【００４９】
前記反応の円滑な進行のために前記溶媒混合物のpH値が7〜14の範囲、例えば9〜13、好ましくは9.5〜12.5であることが重要である。収量及び純度に関する結果は、前記溶媒混合物のpH値が10〜12の範囲である場合に一般的に至適である。望ましいpH値はアルカリ金属の水酸化物、例えば水酸化ナトリウム及び水酸化カリウム、並びに／又は有機塩基、例えばトリアルキルアミン（トリエチルアミン、N,N−ジイソプロピルエチルアミンなど）の添加によって得られる。
【００５０】
典型的な例として、ステップ（a）の反応は前記タンパク質と前記式（Ｉ）のアシル化剤の1：1〜1：5のモル比における使用によりおこなわれる。前記ペプチドは典型的には−10〜30℃、例えば0〜25℃、そしてpHをアルカリ金属水酸化物（例えば水酸化ナトリウム又は水酸化カリウム）を用いて望ましいレベルに調整した水に事前に溶解されている。前記pH値は酸、例えば酢酸及び塩基、例えばトリアルキルアミンを用いてさらに調整されうるが、前記温度は好ましくは先の範囲内である。前記非プロトン極性溶媒（又は溶媒混合物）はその後に添加される。前記反応は、水と酸、例えばpH6.5〜9.0までの酢酸の添加前、0.2〜4時間、例えば0.2〜1時間で典型的に得られる縮合（HPLCによって観察される）を典型的には進行させる。前記産物は典型的にはHPLC又は等電点のpHにより沈澱させること又は精製の前に加水分解させること（ステップ（b））によって分離され、そして精製される。
【００５１】
R4が水素である前記式（Ｉ）のアシル化剤を使用した場合、N−アシル化されたペプチド又は親油性の部分及び遊離カルボン酸基をもつタンパク質が直接的に得られる。よって、R4が水素である変異体は本発明の方法の好ましい態様を表す。
【００５２】
あるいは、すなわち前記R4がC1-12−アルキル又はベンジルである場合、前記N−アシル化されたペプチド・エステル（又はタンパク質・エステル）は、N−アシル化されたペプチド又はN−アシル化されたタンパク質を得るために塩基性条件下にてケン化される。ケン化は典型的にはアルカリ金属水酸化物、例えばナトリウム又は水酸化カリウムの0.01〜4.0M溶液中にておこなわれる。前記溶液のpHは典型的には10〜14である。前記反応は典型的には0.1〜12時間、好ましくは0.5〜4時間、0〜40℃、例えばおよそ室温にて進行させる。反応後、前記産物は、例えば等電点のpHでの沈澱及び／又は予備的なHPLCによって精製される。よって、R4がC1-12−アルキル又はベンジルである変異体は本発明の方法の他の好ましい態様を表す。
【００５３】
本発明は以下の側面にも関する：
側面1．N-アシル化ペプチドを得るためのペプチド又はタンパク質のアミノ基のアシル化方法であって、以下のステップ：
（a）少なくとも1つの遊離アミノ基をもつペプチドを以下の一般式（Ｉ）：
【００５４】
【化８】
｛式中、
nは0〜8であり；
R1はCOOR4であり；
R2は親油性部分であり；
R3は、R3がそれに付着されているところのカルボキシル基と一緒になって、反応性エステル又は反応性N−ヒドロキシ・イミド・エステルを表し；そして
R4は水素、C1-12−アルキル、及びベンジルから選ばれる。｝により表されるアシル化剤と、塩基性条件下、非プロトン極性溶媒と水の混合物中で反応させ；及び
（b）R4が水素でない場合、塩基性条件下、上記のアシル化されたペプチド・エステル基（COOR4）をケン化する；
を含む前記方法。
【００５６】
側面2．R4が水素である、側面1に記載の方法。
【００５７】
側面3．R4がC1-8−アルキル及びベンジルから選ばれる、側面1に記載の方法。
【００５８】
側面4．前記R3は、R3がそれに付着されているところのカルボキシル基と一緒になって、反応性N−ヒドロキシ・イミド・エステルを表す、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
【００５９】
側面5．前記非プロトン極性溶媒と水の混合物が1：5〜5：1までのN−メチル−2−ピロリドンと水の混合物である、側面1〜4のいずれかに記載の方法。
【００６０】
側面6．ステップ（a）における前記反応混合物のpHが9〜13の範囲内である、側面1〜5のいずれかに記載の方法。
【００６１】
側面7．ステップ（a）における前記反応混合物の温度が0〜50℃の範囲内である、側面1〜6のいずれかに記載の方法。
【００６２】
側面8．前記アシル化したペプチド・エステルが10〜14の範囲内のpH値においてケン化される、側面3〜7のいずれかに記載の方法。
【００６３】
側面9．R2がC3-39−アルキル、C3-39−アルケニル、C3-39−アルカジエニル、及びステロイド性残基から選ばれる、側面1〜8のいずれかに記載の方法。
【００６４】
側面10．以下の式（Ｉ）：
【００６５】
【化９】
｛式中、
nは0〜8であり；
R1はCOOHであり;
R2は親油性部分であり；そして
R3は、R3がそれに付着されているところのカルボキシル基と一緒になって、反応性エステル又は反応性N−ヒドロキシ・イミド・エステルを表す。｝により表される化合物。
【００６７】
側面11．nは0又は1そしてR3は、R3がそれに付着されているところのカルボキシル基と一緒になって反応性エステル又は反応性N−ヒドロキシ・イミド・エステルを表す、側面10に記載の化合物。
【００６８】
側面12．R2がC3-39−アルキル、C3-39−アルケニル、C3-39−アルカジエニル、及びステロイド性残基から選ばれる、側面10又は11に記載の化合物。
【００６９】
実施例
出発物質の調製
実施例1
N−ヘキサデカノイルグルタミン酸α−ベンジル・エステルの調製
グルタミン酸α−ベンジル・エステル（4.75g、20.0mmol）をN−メチル−2−ピロリドン（100ml）に20〜25℃にて溶解した。トリエチルアミン（2.53g、25.0mmol）と同時に1−ヘキサデカノイルベンゾトリアゾール（7.15g、20.0mmol）を加えた。前記反応混合物を20〜25℃にて22時間撹拌した。前記生成物溶液に対し0.2M塩酸（250ml）を加えた。前記生成物懸濁液を0℃にて3時間冷却した。前記産物をろ過により分離し、水（50ml×4）により洗浄し、そして40℃の減圧下において恒量まで乾燥した。
【００７０】
収量：9.15g（96％）の白色物質、90.0℃（ピーク値）における融解を示差熱分析器（DSC）によって測定した。
【００７１】
実施例2
N−ヘキサデカノイルグルタミン酸α−メチル・エステルの調製
実施例1の記載と類似した反応条件下において8.06g（50.0mmol）のグルタミン酸α−メチル・エステルを使用して、N−ヘキサデカノイルグルタミン酸α−メチル・エステルを調製した。
【００７２】
収量：17.70g（88％）の白色物質、95.4℃（ピーク値）における融解をDSCによって測定した。
【００７３】
実施例3
N−ヘキサデカノイルグルタミン酸α−ベンジル・エステルγ−N−ヒドロキシサクシンイミド・エステルの調製
N−ヘキサデカノイルグルタミン酸α−ベンジル・エステル（23.78g、50.0mmol）をテトラヒドロフラン（200ml）に20〜25℃にて溶解した。N−ヒドロキシサクシンイミド（5.75g、50.0mmol）と同時にジシクロヘキシルカルボジイミド（10.32g、50.0mmol）を加えた。前記反応混合物を20〜25℃にて20時間撹拌した。前記生成物懸濁液をろ過し、そして前記ろ液を減圧下の乾燥により蒸発させた。前記結晶性の残渣を40℃にてアセトン（100ml）に溶解し、そしてろ過によって不純物を除いた。ろ液に対しn−ヘプタン（300ml）を加えた。前記生成物懸濁液を20〜25℃にて4時間撹拌し、その後0℃にて1/2時間冷却した。前記産物をろ過により分離し、n−ヘプタン（50ml×3）により洗浄し、そして40℃の減圧下において恒量まで乾燥した。
【００７４】
収量：23.75g（83％）の白色物質、98.6℃（ピーク値）における融解をDSCによって測定した。
【００７５】
実施例4
N−ヘキサデカノイルグルタミン酸α−メチル・エステルγ−N−ヒドロキシサクシンイミド・エステルの調製
実施例3の記載と類似した反応条件下において8.00g（20mmol）のN−ヘキサデカノイルグルタミン酸α−メチル・エステルを使用して、N−ヘキサデカノイルグルタミン酸α−メチル・エステルγ−N−ヒドロキシサクシンイミド・エステルを調製した。
【００７６】
収量：6.45g（65％）の白色物質、106.0℃（ピーク値）における融解をDSCによって測定した。
【００７７】
実施例5
N−ヘキサデカノイルグルタミン酸γ−N−ヒドロキシサクシンイミド・エステルの調製
N−ヘキサデカノイルグルタミン酸α−ベンジル・エステルγ−N−ヒドロキシサクシンイミド・エステル（5.73g、10.0mmol）をアセトン（100ml）に20〜25℃にて溶解した。10％パラジウム含有カーボン・ペースト（乾燥物として約0.25g）を加えた。前記懸濁液を水素の消費がなくなるまで水素雰囲気下で撹拌した（水素290ml、45分間）。前記触媒をろ過によって除き、そして前記ろ液を20〜25℃にて減圧下の乾燥により蒸発させた。前記残渣を20〜25℃にてアセトン（25ml）に溶解し、そしてろ過によって不純物を除いた。ろ液に対しn−ヘプタン（200ml）を加えた。前記生成物懸濁液を20〜25℃にて1時間撹拌した。前記産物をろ過により分離し、n−ヘプタン（50ml×2）により洗浄し、そして40℃の減圧下において恒量まで乾燥した。
【００７８】
収量：4.20g（87％）の白色物質、100.8℃（ピーク値）における融解をDSCによって測定した。
【００７９】
アシル化されたGLP-1アナログの調製
実施例6
Arg34Lys26-[N-ε-（γ-Glu（N-ヘキサデカノイル））]-GLP-17-37の調製
Arg34-GLP-17-37（等電点沈澱させたペプチドの凍結物質5.0g、約0.15mmol）を水（25ml）に0〜5℃にて溶解した。前記溶液のpHを1.0M水酸化ナトリウム（2.25ml）の添加により12.5に調整した。2分後、N−メチル−2−ピロリドン（50ml）と1.0M酢酸（1.25ml）を温度を15℃に保ちながら加えた。トリエチルアミン（0.2ml）そして同時にN−ヘキサデカノイルグルタミン酸γ−N−ヒドロキシサクシンイミド・エステル（97.0mg、0.20mmol）を加えた。30分後15℃の水（50ml）を加え、そしてpHを1.0M酢酸（1.70ml）の添加により8.0に調整した。
【００８０】
収量：分析用RP-HPLCにより前記反応混合物がArg34Lys26-[N-ε-（γ-Glu（N-ヘキサデカノイル））]-GLP-17-37を（エリアにおいて）77％含有することを示した。
【００８１】
前記産物の最終精製はカラム・クロマトグラフィーによっておこなった。
【００８２】
実施例7
Arg34Lys26-[N-ε-（γ-Glu-OMe（N-ヘキサデカノイル））]-GLP-17-37の調製
実施例6の記載と類似した反応条件下においてN−ヘキサデカノイルグルタミン酸α−メチル・エステルγ−N−ヒドロキシサクシンイミド・エステルを使用してArg34-LP-17-37をアシル化した。
【００８３】
収量：分析用RP-HPLCにより前記反応混合物がArg34Lys26-[N-ε-（γ-Glu-OMe（N-ヘキサデカノイル））]-GLP-17-37を（エリアにおいて）64％含有することを示した。前記産物は1M酢酸を用いて前記反応混合物のpHを6.0に調整することによって沈澱として分離できた。あるいは前記反応混合物は次の実施例8に記載のとおり直ちに使用できる。
【００８４】
実施例8
Arg34Lys26-[N-ε-（γ-Glu（N-ヘキサデカノイル））]-GLP-17-37の調製
実施例7において得られた産物を含む反応混合物を、1M水酸化ナトリウムを用いてpHを12〜13に調整することによって塩基性加水分解に供した。反応混合物の温度を8〜18℃に維持した。2時間後前記反応を完了し、そして前記反応混合物のpHを1M酢酸の添加により7.45に調整した。
【００８５】
収量：分析用RP-HPLCにより前記反応混合物がArg34Lys26-[N-ε-（γ-Glu（N-ヘキサデカノイル））]-GLP-17-37を（エリアにおいて）65％含有することを示した。
【００８６】
前記産物の最終精製はカラム・クロマトグラフィーによっておこなった。
【００８７】
実施例9
以下の：
Arg26,34,Lys36-[N-ε-（γ-Glu（N-ヘキサデカノイル））]-GLP-17-36、
Arg26,Lys34-[N-ε-（γ-Glu（N-ヘキサデカノイル））]-GLP-17-37、及び
Gly8,Arg26,34,Glu37,Lys38-[N-ε-（γ-Glu（N-ヘキサデカノイル））]-GLP-17-38
の化合物は調製される実施例6の化合物に対するアナログであり、前記産物の最終精製はカラム・クロマトグラフィーによっておこなわれる。[0001]
Field of the invention
The present invention relates to a method for introducing one or more acyl groups into a peptide or protein. More particularly, the present invention relates to an improved acylation method for the ε-amino group of lysine residues contained in natural GLP-1 or analogs thereof. Furthermore, the present invention relates to a compound effective as an acylating agent in the above method.
[0002]
Background of the invention
Since peptides are widely used in the medical field and they can be produced by recombinant DNA technology, their importance is expected to continue to increase. When natural peptides or their analogs are used for therapy, it is widely seen that they have high clearance. The high clearance of therapeutic agents is inconvenient if it is desired to maintain their high blood concentration over an extended period of time even after repeated administration is required. Examples of naturally occurring peptides with high clearance are: ACTH, corticotropin releasing factor, angiotensin, calcitonin, exendin, exendin-3, exendin-4, insulin, glucagon, glucagon-like peptide-1, glucagon-like peptide-2 , Insulin-like growth factor-1, insulin-like growth factor-2, gastric inhibitory peptide, growth hormone releasing factor, pituitary adenylate cyclase activating peptide, secretin, enterogastrin, somatostatin, somatotropin, somatomedin, parathyroid gland Hormone, thrombopoietin, erythropoietin, hypothalamic hormone releasing factor, prolactin, thyroid stimulating hormone, endorphin, enkephalin, vasopressin, oxytocin, opioid and it These analogs, superoxide dismutase, interferon, asparaginase, arginase, arginine deaminase, adenosine deaminase, and ribonuclease.
[0003]
Introduction of a lipophilic acyl group into a natural peptide or analog thereof leads to an acylated peptide with prolonged action characteristics associated with the natural peptide (or an unmodified analog). This phenomenon is the result of the applicant's earlier application, WO98 / 08871, which discloses acylation of GLP-1 and analogs, WO98 / 08872, which discloses acylation of GLP-2 and analogs, and exendin and analog acylation. Fully described and demonstrated in the disclosed WO99 / 43708. Furthermore, it has been proposed that the inclusion of groups which may have a negative charge adjacent to the lipophilic group, for example carboxylic acid groups, may be advantageous.
[0004]
European patent application 92107035.5 (Kuraray) describes reactive monoesters of long-chain dicarboxylic acids for the preparation of long-chain carboxylic acids into proteins.
[0005]
The introduction of lipophilic acyl groups into GLP-1 via mono- or dipeptide spacers is of particular interest and is proposed and exemplified in WO98 / 08871. Aspartic acid and glutamic acid have been mentioned as suitable linkers. However, since such mono- or dipeptide spacers contain additional carboxylic acid groups, it was thought that protection and subsequent deprotection steps were necessary. Deprotection was performed under acidic conditions that led to a certain degree of degradation of the peptide (GLP-1). Thus, alternative methods for the preparation of these variants are desirable.
[0006]
Accordingly, it is an object of the present invention to provide an alternative method for the introduction of lipophilic residues into peptides via an α-amino-α, ω-dicarboxylic acid spacer. Said method will facilitate the preparation of modified peptides. Carboxylic acid groups which can be charged are introduced in the vicinity of the lipophilic residue and do not act directly on the lipophilic residue.
[0007]
Details of the present invention
The present invention is a method for acylating one or more amino groups of a peptide (or protein) to obtain an N-acylated peptide (N-acylated protein) comprising the following steps:
(A) A peptide (or protein) having at least a free amino group is represented by the following general formula (I):
[0008]
[Chemical Formula 3]
{Where,
n is 0-8;
R1Is COORFourIs;
R2Is a lipophilic part, for example C3-39-Alkyl, C3-39-Alkenyl, C3-39-Selected from alkadienyl and steroidal residues;
RThreeRThreeTogether with the carboxyl group to which it is attached represents a reactive ester or a reactive N-hydroxy imide ester; and
RFourIs hydrogen, C1-12-Selected from alkyl and benzyl. Are reacted in a mixture of an aprotic polar solvent and water under basic conditions; and
(B) RFourWhen is not hydrogen, the above-mentioned acylated peptide ester group (COORFour) Saponification;
A method comprising the steps of:
[0010]
The acylated peptide ester (here RFourSaponification of the alkyl group or benzyl group) is possible with very little or no racemization of the various α-amino acid fragments of the peptide and the spacer. Certain advantages have been discovered in this application with respect to previously used acidic hydrolysis related to the purity and inhibition of by-products such as degradation products.
[0011]
Free acid under basic conditions (here RFourAcylation with an acylating agent as hydrogen) has also been discovered. Said acylation directly leads to the desired product, the acylated peptide, essentially without side products and without a deprotection step.
[0012]
The present invention also provides a novel compound effective as an acylating agent in the above-mentioned method, wherein the novel compound is represented by the following general formula (I):
[0013]
[Formula 4]
{Where,
n is 0-8;
R1Is COOH;
R2Is a lipophilic part, for example C3-39-Alkyl, C3-39-Alkenyl, C3-39-Selected from alkadienyl and steroidal residues; and
RThreeRThreeTogether with the carboxyl group to which it is attached represents a reactive ester or a reactive N-hydroxy imide ester. }.
[0015]
Detailed Description of the Invention
Peptides and proteins
It is generally understood that the present invention is effective for the introduction of lipophilic acyl groups into some peptides (or proteins) to reduce the clearance rate in vivo. Examples of said peptides and proteins are ACTH, corticotropin releasing factor, angiotensin, calcitonin, exendin and its analogs, insulin and its analogs, glucagon and its analogs, glucagon-like peptide-1 and its analogs, glucagon-like peptide-2 and Its analog, insulin-like growth factor-1, insulin-like growth factor-2, gastric inhibitory peptide, growth hormone releasing factor, pituitary adenylate cyclase activating peptide, secretin, enterogastrin, somatostatin, somatotropin, somatomedin, Parathyroid hormone, thrombopoietin, erythropoietin, hypothalamic hormone releasing factor, prolactin, thyroid stimulating hormone, endorphin, enkephalin, vasopressin Oxytocin, opioids and analogues thereof, superoxide dismutase, interferon, asparaginase, arginase, arginine deaminase, adenosine deaminase, and ribonuclease.
[0016]
It will be appreciated that the peptide (or protein) will have at least one free amino group, wherein the amino group will have an N-terminal amino group or a side chain amino group. Of particular interest are the amino groups of lysine and ornithine amino acid residues. Said method relates in particular to N-acetylation of the ε-amino group of lysine residues. It will also be understood that the peptide or protein of interest may have more than one pendant amino group that can be N-acylated in accordance with the present invention.
[0017]
It will be appreciated that the present invention is particularly suitable for modification of GLP-1 and its analogs. Examples of GLP-1 and analogs that can be N-acylated according to the present invention include GLP-1 and truncated analogs such as
[0018]
[Chemical formula 5]
It is.
[0020]
Each of these GLP-1 analogs and truncated analogs constitutes another aspect of the present invention.
[0021]
It will be appreciated that the present invention is also particularly suitable for modification of GLP-2 and its analogs. Examples of GLP-2 and analogs that can be N-acylated according to the present invention include GLP-2 analogs and truncated analogs such as Lys.20GLP-2 (1-33); Lys20Arg30GLP-2 (1-33); Arg30Lys34GLP-2 (1-34); Arg30Lys35GLP-2 (1-35); Arg30,35Lys20GLP-2 (1-35); and Arg35GLP-2 (1-35). Each of these GLP-2 analogs and truncated analogs constitutes another aspect of the present invention.
[0022]
It will be appreciated that the present invention is also particularly suitable for modification of exendins and their analogs. Examples of exendins and analogs that can be N-acylated according to the present invention are exendin analogs and truncated analogs such as exendin-3 and exendin-4. Each of these exendin analogs and truncated analogs constitutes another aspect of the present invention.
[0023]
In a further embodiment of the invention said N-acylation occurs at the ε-amino group of the lysine residue.
[0024]
The actions of GLP-1 and its analogs are all described in WO98 / 08871.
[0025]
The actions of GLP-2 and its analogs are all described in WO98 / 08872.
[0026]
The actions of exendin and its analogs are all described in WO99 / 43708.
[0027]
Acylating agent
In the method of the present invention, a peptide (or protein) having at least one free amino group is reacted with an acylating agent of general formula (I).
[0028]
[Chemical 6]
The integer n in the general formula (I) is preferably 0 to 8, particularly 0 to 6, and corresponds to, for example, aspartic acid or glutamic acid. Preferably n is 0-4, such as 0-2, 0 (aspartic acid) or 1 (glutamic acid). Each of these integers and ranges constitutes another aspect of the invention.
[0030]
R in formula (I)1Is a free acidic group (COOH) or ester group (COOR)Four). R1R is an ester group, RFourIs selected from groups which can be liberated by hydrolysis (as corresponding to alcohols) under basic conditions. Examples of such groups are C1-12-Alkyl, for example methyl, ethyl, prop-1-yl, prop-2-yl, but-1-yl, but-2-yl, 2-methyl-prop-1-yl, 2-methyl-prop-2- Tert-butyl, hex-1-yl, and the like, and benzyl. Each of these groups constitutes another aspect of the invention.
[0031]
R in formula (I)2Represents a lipophilic moiety incorporated in the peptide or protein. The lipophilic part is C3-39-Alkyl, C3-39-Alkenyl, C3-39-Typically selected from alkadienyl and steroidal residues. C3-39Specific examples of -alkyl are heptyl, nonyl, undecanyl, tridecanyl, pentadecanyl, heptadecanyl, and nonadecanyl. Each of these lipophilic portions constitutes another aspect of the invention.
[0032]
Said lipophilic substituent or moiety is for water at 20 ° C. in the range of about 0.1 mg / 100 ml of water to about 250 mg / 100 ml of water, preferably about 0.3 mg / 100 ml of water to about 75 mg / 100 ml of water. It is characterized by the solubility. For example, octanoic acid (C8) has a solubility of 68 mg / 100 ml in water at 20 ° C., decanoic acid (C10) has a solubility of 15 mg / 100 ml in water at 20 ° C., and octadecanoic acid (C18) Has a solubility of 0.3 mg / 100 ml in water at 20 ° C. Each of these lipophilic substituent ranges constitutes another aspect of the invention.
[0033]
The term “C”3-39-Alkyl (C3-39-Alkyl) "," C3-39-Alkenyl (C3-39-Alkenyl) ", and" C3-39-Alkadienyl (C3-39-Alkadienyl) "is intended to include straight and branched chains, preferably straight chain, saturated, mono-unsaturated, di-unsaturated, each of hydrocarbon radicals of 3 to 39 carbon atoms. C3-39Specific examples of -alkyl are heptyl, nonyl, undecanyl, tridecanyl, pentadecanyl, heptadecanyl, and nonadecanyl.
[0034]
As used herein, the term “steroidal residues” refers to R derived from steroidal carboxylic acids.2Is intended to mean a lipophilic group with a carbonyl group to which is attached, for example, tri-, tetra-, and pentacyclic, fully saturated or partially unsaturated C16-36-Hydrocarbon. Said group R2Examples of -C (= O)-are lithocholoy, deoxycholoyl, and coroyl.
[0035]
Among the lipophilic groups mentioned above, C7-25-Alkyl, C7-25-Alkenyl, C7-25-Alkadienyl and steroidal residues are particularly relevant. Particularly interesting examples are heptyl, nonyl, undecanyl, tridecanyl, pentadecanyl, heptadecanyl, nonadecanyl, lithocoyl, deoxycoroyl, and coroyl. Each of these lipophilic groups constitutes another aspect of the invention.
[0036]
R in formula (I)ThreeRThreeTogether with the carboxyl group to which it is attached represents a reactive ester or a reactive N-hydroxy imide ester. Each of these esters constitutes another aspect of the invention. Reactive esters or reactive N-hydroxy imide esters are well known in the field of organic chemistry (especially peptide chemistry) as reactive groups used for acylation of amino, thio, and hydroxy groups. The term “reactive ester or reactive N-hydroxyimide ester” in the context of the present invention means an ester having a functionality suitable for acylation of an amine, preferably a primary amine, in the form of a carboxylic acid group. Intended to be. Thus, it will be appreciated that the selectivity of acylation of primary amines preferably extends to the acylation of hydroxy and thio groups. Reactive N-hydroxy imide esters are particularly preferred.
[0037]
Examples of reactive esters are 1-hydroxybenzotriazole esters and derivatives. Many highly effective reagents for the formation of said activated esters of carboxylic acids, for example 2- (1H-benzotriazol-1yl) -1,1,3,3-tetramethylronium tetrafluoro Borate is known. The reactive ester is typically formed in situ by the presence of a base, for example a trialkylamine, which is an organic base.
[0038]
Examples of the imide part of the N-hydroxy imide ester are those clearly described in European Patent Application No. 92107035.5 from page 13, line 3 to page 17, line 10 (this specification ). Among them, examples of particularly interesting imide parts are succinimide, phthalimide and the like. Each of these imide moieties constitutes another aspect of the present invention.
[0039]
The reactive N-hydroxy imide ester of formula (I) is a corresponding acid (ie, N-acylated α-carboxy protected diacid (RFourIs not hydrogen)) and an equimolar amount (eg, 0.95 to 1.05 moles, preferably 1.0 mole) of the corresponding imide by N-hydroxy-imide condensation. (The N-acylated α-carboxy protected diacid is typically prepared from the corresponding lipophilic moiety of the α-carboxy protected α-aminodiaside, and a benzotriazole ester. This benzotriazole ester is prepared, for example, from chloric acid and benzotriazole or from free acid and benzotriazole by DCC conjugation as described in WO 98/02460 (Examples 1 to 3). For example, in the presence of a conjugate, such as a carbodiimide conjugate (eg, dicyclohexylcarbodiimide (DCC)). In this case, the conjugate is preferably added in an equimolar amount with respect to the acid. The reaction is typical in polar aprotic solvents such as anhydrous tetrahydrofuran (THF), anhydrous dimethylformamide (DMF), anhydrous acetone, anhydrous dichloromethane, anhydrous dioxane, anhydrous dimethylacetamide or anhydrous N-methyl-2-pyrrolidone (NMP). Is done. The reaction is typically carried out at a temperature in the range of 0-50 ° C., for example 5-30 ° C., for example room temperature, for a period of 1-96 hours, for example 4-36 hours. One possible combination of reagents and conditions is the following: N-hydroxy-imide (succinimide or phthalimide) and the acid of interest in an approximate 1: 1 molar ratio of anhydrous THF or anhydrous DMF (or mixtures thereof) Dissolve in and add an equimolar amount of DCC to the solution. After completion of the reaction between N-hydroxy-imide and acid, the product is purified by conventional methods such as filtration (filtering of precipitated dicyclohexylurea (DCU) if DCC is used as a conjugating agent), crystallization, recrystallization. Separation and purification by crystallization, chromatography, etc. One feasible purification route is filtration, evaporation of the solvent under reduced pressure, redissolution of the product, e.g. redissolved in acetone, filtration, crystallization by addition of a non-polar solvent, e.g. redissolved in hexane, and in some cases Removal of used conjugating agents precipitated by recrystallization and / or washing. Said product can be used immediately in the process of the invention as said acylating agent of formula (I).
[0040]
The acylating agent of formula (I) is a free α carboxylic acid (RFour= Hydrogen when used as R)FourWherein the compound of formula (I) is a group that is selectively removed is RFourIs converted to the corresponding compound where is hydrogen. The carboxylic acid protecting group can be a benzyl group that can be removed by catalytic hydrogenation or an allyl group that can be selectively removed. Benzyl protecting groups can be removed by catalytic hydrogenation in an aprotic polar solvent, for example palladium on carbon and hydrogen at room temperature in acetone. The reaction can also take place in a closed vessel (typically 0.1-10 atm) of hydrogen gas atmosphere under vigorous stirring. The reaction is typically complete in 0.5 to 12 hours depending on the quality of the palladium catalyst. Apply conventional methods.
[0041]
RFourIt will be appreciated that the compounds of the above formula (I) in which is hydrogen are novel substances and thereby they constitute a special aspect of the present invention. Thus, the present invention provides the following general formula (I):
[0042]
[Chemical 7]
{Where,
n is 0-8;
R1Is COOH;
R2Is a lipophilic part, preferably C3-39-Alkyl, C3-39-Alkenyl, C3-39-Selected from alkadienyl and steroidal residues; and
RThreeRThreeTogether with the carboxyl group to which it is attached represents a reactive ester or a reactive N-hydroxy imide ester. } Is also provided.
[0044]
Reaction conditions
The reaction between the acylating agent of formula (I) and the peptide or protein is carried out under basic conditions in a mixture of aprotic polar solvent and water.
[0045]
The acylating agent of formula (I) is typically used in a slight excess relative to the number of amino groups in the peptide or protein. The ratio is typically 1: 1 to 1:20 and an extra acylating agent, preferably 1: 1.2 to 1: 5, taking into account the value of the number of amino groups in the peptide.
[0046]
It will be appreciated that whether the peptide is fully N-acylated or only partially N-acylated can depend on the amount of acylating agent used and the reaction conditions. It is preferred that the N-acylation is substantially stoichiometric.
[0047]
Typically, the aprotic polar solvent is from anhydrous tetrahydrofuran (THF), anhydrous dimethylformamide (DMF), acetone, dichloromethane, dimethyl sulfoxide (DMSO), dioxane, dimethylacetamide or N-methyl-2-pyrrolidone and mixtures thereof. Among them, dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, dimethylacetamide, and N-methyl-2-pyrrolidone are preferred, and N-methyl-2-pyrrolidone is particularly preferred. The ratio of said aprotic polar solvent to water (eg N-methyl-2-pyrrolidone and water) is typically 1:10 to 10: 1, in particular 1: 5 to 5: 1, in particular 1: 1 to 3: 1.
[0048]
The temperature is typically maintained in the range of -10 to 50 ° C, preferably in the range of 0 to 25 ° C.
[0049]
In order for the reaction to proceed smoothly, it is important that the pH value of the solvent mixture is in the range of 7 to 14, for example 9 to 13, preferably 9.5 to 12.5. Results regarding yield and purity are generally optimal when the pH value of the solvent mixture is in the range of 10-12. The desired pH value is obtained by the addition of alkali metal hydroxides such as sodium hydroxide and potassium hydroxide, and / or organic bases such as trialkylamines (triethylamine, N, N-diisopropylethylamine, etc.).
[0050]
As a typical example, the reaction of step (a) is carried out by use of the protein and the acylating agent of formula (I) in a molar ratio of 1: 1 to 1: 5. The peptide is typically pre-dissolved in water at -10-30 ° C, eg 0-25 ° C, and the pH adjusted to the desired level using an alkali metal hydroxide (eg sodium hydroxide or potassium hydroxide) Has been. The pH value can be further adjusted using acids such as acetic acid and bases such as trialkylamine, but the temperature is preferably within the above range. The aprotic polar solvent (or solvent mixture) is then added. The reaction typically involves condensation (observed by HPLC) typically obtained in 0.2 to 4 hours, for example 0.2 to 1 hour, prior to addition of water and acid, for example acetic acid to pH 6.5-9.0. Make it progress. The products are typically separated and purified by precipitation by HPLC or isoelectric point pH or by hydrolysis prior to purification (step (b)).
[0051]
RFourWhen the acylating agent of the above formula (I) is used, N-acylated peptide or protein having a lipophilic moiety and a free carboxylic acid group is obtained directly. Therefore, RFourA variant in which is hydrogen represents a preferred embodiment of the method of the invention.
[0052]
Alternatively, i.e. said RFourIs C1-12When it is alkyl or benzyl, the N-acylated peptide ester (or protein ester) is subjected to basic conditions to obtain an N-acylated peptide or N-acylated protein. Is saponified. Saponification is typically carried out in a 0.01-4.0 M solution of an alkali metal hydroxide such as sodium or potassium hydroxide. The pH of the solution is typically 10-14. The reaction is typically allowed to proceed for 0.1-12 hours, preferably 0.5-4 hours, at 0-40 ° C., for example at about room temperature. After the reaction, the product is purified by, for example, precipitation at isoelectric point pH and / or preliminary HPLC. Therefore, RFourIs C1-12Variants that are -alkyl or benzyl represent another preferred embodiment of the method of the invention.
[0053]
The invention also relates to the following aspects:
Side 1. A method for acylating an amino group of a peptide or protein to obtain an N-acylated peptide comprising the following steps:
(A) A peptide having at least one free amino group is represented by the following general formula (I):
[0054]
[Chemical 8]
{Where,
n is 0-8;
R1Is COORFourIs;
R2Is a lipophilic part;
RThreeRThreeTogether with the carboxyl group to which it is attached represents a reactive ester or a reactive N-hydroxy imide ester; and
RFourIs hydrogen, C1-12-Selected from alkyl and benzyl. Are reacted in a mixture of an aprotic polar solvent and water under basic conditions; and
(B) RFourWhen is not hydrogen, the above acylated peptide ester group (COORFour) Saponification;
Including said method.
[0056]
Side 2. RFourThe method of aspect 1, wherein is hydrogen.
[0057]
Side 3. RFourIs C1-8The method according to aspect 1, selected from alkyl and benzyl.
[0058]
Side 4. RThreeRThree4. A process according to any one of claims 1 to 3, wherein together with the carboxyl group to which it is attached represents a reactive N-hydroxy imide ester.
[0059]
Side 5. 5. The method according to any one of aspects 1 to 4, wherein the mixture of the aprotic polar solvent and water is a mixture of N: methyl-2-pyrrolidone and water up to 1: 5 to 5: 1.
[0060]
Side 6 The method according to any one of aspects 1 to 5, wherein the pH of the reaction mixture in step (a) is in the range of 9 to 13.
[0061]
Side 7. The method according to any one of aspects 1 to 6, wherein the temperature of the reaction mixture in step (a) is in the range of 0 to 50 ° C.
[0062]
Side 8 8. The method according to any of aspects 3 to 7, wherein the acylated peptide ester is saponified at a pH value in the range of 10-14.
[0063]
Side 9. R2Is C3-39-Alkyl, C3-39-Alkenyl, C3-39A method according to any one of aspects 1 to 8, selected from alkadienyl and steroidal residues.
[0064]
Side 10. The following formula (I):
[0065]
[Chemical 9]
{Where,
n is 0-8;
R1Is COOH;
R2Is a lipophilic part; and
RThreeRThreeTogether with the carboxyl group to which it is attached represents a reactive ester or a reactive N-hydroxy imide ester. } The compound represented by these.
[0067]
Side 11. n is 0 or 1 and RThreeRThree11. A compound according to aspect 10, wherein together with the carboxyl group to which it is attached represents a reactive ester or a reactive N-hydroxy imide ester.
[0068]
Side 12. R2Is C3-39-Alkyl, C3-39-Alkenyl, C3-39A compound according to aspect 10 or 11, selected from alkadienyl and steroidal residues.
[0069]
Example
Preparation of starting material
Example 1
Preparation of N-hexadecanoyl glutamic acid α-benzyl ester
Glutamic acid α-benzyl ester (4.75 g, 20.0 mmol) was dissolved in N-methyl-2-pyrrolidone (100 ml) at 20-25 ° C. 1-Hexadecanoylbenzotriazole (7.15 g, 20.0 mmol) was added simultaneously with triethylamine (2.53 g, 25.0 mmol). The reaction mixture was stirred at 20-25 ° C. for 22 hours. 0.2M hydrochloric acid (250 ml) was added to the product solution. The product suspension was cooled at 0 ° C. for 3 hours. The product was separated by filtration, washed with water (50 ml × 4) and dried to constant weight under reduced pressure at 40 ° C.
[0070]
Yield: 9.15 g (96%) of white material, melting at 90.0 ° C. (peak value) was measured by a differential thermal analyzer (DSC).
[0071]
Example 2
Preparation of N-hexadecanoyl glutamic acid α-methyl ester
N-hexadecanoyl glutamic acid α-methyl ester was prepared using 8.06 g (50.0 mmol) of glutamic acid α-methyl ester under reaction conditions similar to those described in Example 1.
[0072]
Yield: 17.70 g (88%) of white material, melting at 95.4 ° C. (peak value) was measured by DSC.
[0073]
Example 3
Preparation of N-hexadecanoyl glutamic acid α-benzyl ester γ-N-hydroxysuccinimide ester
N-hexadecanoyl glutamic acid α-benzyl ester (23.78 g, 50.0 mmol) was dissolved in tetrahydrofuran (200 ml) at 20-25 ° C. N-hydroxysuccinimide (5.75 g, 50.0 mmol) was added simultaneously with dicyclohexylcarbodiimide (10.32 g, 50.0 mmol). The reaction mixture was stirred at 20-25 ° C. for 20 hours. The product suspension was filtered and the filtrate was evaporated by drying under reduced pressure. The crystalline residue was dissolved in acetone (100 ml) at 40 ° C. and impurities were removed by filtration. N-Heptane (300 ml) was added to the filtrate. The product suspension was stirred at 20-25 ° C. for 4 hours and then cooled at 0 ° C. for 1/2 hour. The product was separated by filtration, washed with n-heptane (50 ml x 3) and dried to constant weight under reduced pressure at 40 ° C.
[0074]
Yield: 23.75 g (83%) of white material, melting at 98.6 ° C. (peak value) was measured by DSC.
[0075]
Example 4
Preparation of N-hexadecanoyl glutamic acid α-methyl ester γ-N-hydroxysuccinimide ester
N-hexadecanoyl glutamic acid α-methyl ester γ-N-hydroxy was used using 8.00 g (20 mmol) of N-hexadecanoyl glutamic acid α-methyl ester under reaction conditions similar to those described in Example 3. A succinimide ester was prepared.
[0076]
Yield: 6.45 g (65%) of white material, melting at 106.0 ° C. (peak value) was measured by DSC.
[0077]
Example 5
Preparation of N-hexadecanoyl glutamic acid γ-N-hydroxysuccinimide ester
N-hexadecanoyl glutamic acid α-benzyl ester γ-N-hydroxysuccinimide ester (5.73 g, 10.0 mmol) was dissolved in acetone (100 ml) at 20-25 ° C. Carbon paste containing 10% palladium (about 0.25 g as a dry product) was added. The suspension was stirred under a hydrogen atmosphere until no more hydrogen was consumed (290 ml of hydrogen, 45 minutes). The catalyst was removed by filtration and the filtrate was evaporated by drying under reduced pressure at 20-25 ° C. The residue was dissolved in acetone (25 ml) at 20-25 ° C. and impurities were removed by filtration. N-Heptane (200 ml) was added to the filtrate. The product suspension was stirred at 20-25 ° C. for 1 hour. The product was separated by filtration, washed with n-heptane (50 ml × 2) and dried to constant weight under reduced pressure at 40 ° C.
[0078]
Yield: 4.20 g (87%) of white material, melting at 100.8 ° C. (peak value) was measured by DSC.
[0079]
Preparation of acylated GLP-1 analogues
Example 6
Arg34Lys26-[N-ε- (γ-Glu (N-hexadecanoyl))]-GLP-17-37Preparation of
Arg34-GLP-17-37(Isoelectric point precipitated peptide frozen material 5.0 g, about 0.15 mmol) was dissolved in water (25 ml) at 0-5 ° C. The pH of the solution was adjusted to 12.5 by adding 1.0M sodium hydroxide (2.25 ml). Two minutes later, N-methyl-2-pyrrolidone (50 ml) and 1.0M acetic acid (1.25 ml) were added while keeping the temperature at 15 ° C. Triethylamine (0.2 ml) and N-hexadecanoyl glutamic acid γ-N-hydroxysuccinimide ester (97.0 mg, 0.20 mmol) were added simultaneously. After 30 minutes, 15 ° C. water (50 ml) was added and the pH was adjusted to 8.0 by addition of 1.0 M acetic acid (1.70 ml).
[0080]
Yield: Arg was analyzed by RP-HPLC for analysis.34Lys26-[N-ε- (γ-Glu (N-hexadecanoyl))]-GLP-17-37Of 77% (in the area).
[0081]
Final purification of the product was performed by column chromatography.
[0082]
Example 7
Arg34Lys26-[N-ε- (γ-Glu-OMe (N-hexadecanoyl))]-GLP-17-37Preparation of
Arg using N-hexadecanoyl glutamic acid α-methyl ester γ-N-hydroxysuccinimide ester under reaction conditions similar to those described in Example 634-LP-17-37Was acylated.
[0083]
Yield: Arg was analyzed by RP-HPLC for analysis.34Lys26-[N-ε- (γ-Glu-OMe (N-hexadecanoyl))]-GLP-17-37Of 64% (in the area). The product could be isolated as a precipitate by adjusting the pH of the reaction mixture to 6.0 using 1M acetic acid. Alternatively, the reaction mixture can be used immediately as described in Example 8 below.
[0084]
Example 8
Arg34Lys26-[N-ε- (γ-Glu (N-hexadecanoyl))]-GLP-17-37Preparation of
The reaction mixture containing the product obtained in Example 7 was subjected to basic hydrolysis by adjusting the pH to 12-13 with 1M sodium hydroxide. The temperature of the reaction mixture was maintained at 8-18 ° C. After 2 hours, the reaction was complete and the pH of the reaction mixture was adjusted to 7.45 by addition of 1M acetic acid.
[0085]
Yield: Arg was analyzed by RP-HPLC for analysis.34Lys26-[N-ε- (γ-Glu (N-hexadecanoyl))]-GLP-17-37Of 65% (in the area).
[0086]
Final purification of the product was performed by column chromatography.
[0087]
Example 9
below:
Arg26,34, Lys36-[N-ε- (γ-Glu (N-hexadecanoyl))]-GLP-17-36,
Arg26, Lys34-[N-ε- (γ-Glu (N-hexadecanoyl))]-GLP-17-37,as well as
Gly8, Arg26,34, Glu37, Lys38-[N-ε- (γ-Glu (N-hexadecanoyl))]-GLP-17-38
Is an analog to the compound of Example 6 prepared, and final purification of the product is performed by column chromatography.
Claims (29)
（ａ）リジン残基の少なくとも１つの遊離ε−アミノ基をもつペプチド又はタンパク質を以下の一般式（Ｉ）：
ｎは０〜８であり；
Ｒ1はＣＯＯＲ4であり；
Ｒ2は、０．１ｍｇ／水１００ｍｌ〜２５０ｍｇ／水１００ｍｌの範囲における２０℃の水に対する溶解度を有することによって特徴づけられる親油性部分であり；
Ｒ3は、Ｒ3がそれに付着されているところのカルボニル基と一緒になって、カルボン酸基の形態に官能性をもたせたエステルであり、アミノ基のアシル化に用いられる、反応性エステル又は反応性Ｎ−ヒドロキシ・イミド・エステルを表し；そして
Ｒ4は水素、Ｃ1-12−アルキル、及びベンジルから選ばれる。｝
により表されるアシル化剤と、塩基性条件下、非プロトン極性溶媒と水の混合物中で反応させ；及び
（ｂ）Ｒ4が水素でない場合、塩基性条件下、上記のアシル化されたペプチド・エステル基（ＣＯＯＲ4）をケン化する；
を含む前記方法。A method for acylating an amino group of a peptide or protein to obtain an N-acylated ε-amino group of a lysine residue of the peptide or protein comprising the following steps:
(A) A peptide or protein having at least one free ε-amino group of a lysine residue is represented by the following general formula (I):
n is 0-8;
R 1 is COOR 4 ;
R 2 is a lipophilic moiety characterized by having a solubility in water of 20 ° C. in the range of 0.1 mg / 100 ml water to 250 mg / 100 ml water;
R 3 is an ester functionalized in the form of a carboxylic acid group, together with a carbonyl group to which R 3 is attached, and is a reactive ester or amino ester used for acylation of an amino group Represents a reactive N-hydroxy imide ester; and R 4 is selected from hydrogen, C 1-12 -alkyl, and benzyl. }
Reacting in a mixture of an aprotic polar solvent with water under basic conditions; and (b) when R 4 is not hydrogen, the above acylated peptide under basic conditions Saponifying the ester group (COOR 4 );
Including said method.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP99610019.4 | 1999-03-17 | ||
| EP99610019 | 1999-03-17 | ||
| PCT/DK2000/000117 WO2000055119A1 (en) | 1999-03-17 | 2000-03-16 | Method for acylating peptides and novel acylating agents |
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| JPS57114556A (en) * | 1980-10-27 | 1982-07-16 | Fujisawa Pharmaceut Co Ltd | Novel peptide compound and its preparation |
| JPS59148745A (en) * | 1983-02-08 | 1984-08-25 | Fujisawa Pharmaceut Co Ltd | Novel acylglutamyl lysine derivative |
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
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