JP4945869B2 - 免疫賦活剤 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、免疫賦活剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
加齢やストレス等により、免疫力が低下することがある。免疫システムは、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞やマクロファージ等様々な免疫細胞が関与し、それぞれ独立に、或いは密接に関係を持ち複雑に構成されている。
【０００３】
低下した免疫を賦活化するため、様々な化合物が研究されいる。また、滋養強壮作用を有する生薬を用いて免疫賦活作用の研究が行われている。
【０００４】
しかしながら、免疫賦活作用を有する薬剤は、数少なく、また薬効においても必ずしも満足できるものは少ない。従って、新たな免疫賦活剤の開発が望まれている。
【０００５】
下記式で表される化合物は、冬虫夏草、ヒトデ、海綿動物や海藻類に含有されていることが知られている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、優れた効果を有する免疫賦活剤を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、かかる課題を解決するために鋭意研究した結果、冬虫夏草や海綿動物や海藻類に含まれる特定の化合物が上記目的を達成できることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
本発明は、式
【０００９】
【化２】
【００１０】
（式中、Ｒ1は、酸素原子又は式 =NCH2COOH で表される基を示し、Ｒ2は、式 -CH(CH2OH)CH2CH2CONH2 で表される基、式 -CH(CH2OH)CH2CH2COOH で表される基、式 -CH2CH2SO3H で表される基又は式 -COOH で表される基を示す。）で表される化合物を有効成分とする免疫賦活剤である。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の化合物は、冬虫夏草、ヒトデ、海綿動物や海藻類に含有される化合物として公知であるが、免疫賦活作用については全く知られていなかった。
本発明にかかる化合物を免疫賦活剤として使用するために、経口投与製剤に調整する。経口投与製剤としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、チュアブル錠、シロップ剤、ドリンク剤などであり、慣用的な方法で製造される。
【００１２】
固形剤として調整するの場合には、必要に応じて、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤等を使用する。液剤として調整する場合には、必要に応じて、界面活性剤、溶解補助剤、緩衝剤等を使用する。
また、他に保存剤、香料、色素、甘味剤、嬌味剤、清涼化剤等を使用することができる。
【００１３】
【実施例】
以下に、本発明を実施例及び試験例を示し、詳細に説明する。
【００１４】
実施例１：
冬虫夏草の粉末0.5gに水20mLを加え、10分間超音波を照射し、更に10分間振とうし、抽出エキスを得た。抽出エキスからイオン交感樹脂カラム等を用いて、当該免疫賦活物質画分を得、液体クロマトグラフ装置（紫外吸光光度計：波長290-360nm、カラム：TSKgel ODS-80T、カラム温度：50℃付近の一定温度、移動相：10mMリン酸二水素カリウムｐH5.5）を用い、下記成分（化合物１及び化合物２）を得た。
【００１５】
化合物１（一般名；マイコスポリン）：
上記式（１）中、Ｒ1が酸素原子であり、Ｒ2が式 -CH(CH2OH)CH2CH2CONH2 である化合物。
化合物２（一般名；マイコスポリン−２）：
上記式（１）中、Ｒ1が酸素原子であり、Ｒ2が式 -CH(CH2OH)CH2CH2COOH である化合物。
【００１６】
実施例２；
下記文献１-３を参考にし、乾燥したヒトデや海藻類の粉末0.5gに水20mLを加え、10分間超音波を照射し、更に10分間振とうし、抽出エキスを得た。抽出エキスからイオン交感樹脂カラム等を用いて、当該免疫賦活物質画分を得、液体クロマトグラフ装置（紫外吸光光度計：波長290-360nm、カラム：TSKgel ODS-80T、カラム温度：50℃付近の一定温度、移動相：10mMリン酸二水素カリウムｐH5.5）を用い、下記成分（化合物３及び化合物４）の特定を行った。
【００１７】
文献１： Comp. Biochem. Physiol. 112B(1), 105-114, 1995.
文献２： J Chromatography 250, 113-118, 1982.
文献３： Physiol., C: Pharmacol., Endocrinol. 115C(3), 281-286, 1997.
【００１８】
化合物３（一般名；マイコスポリン−タウリン）：
上記式（１）中、Ｒ1が酸素原子であり、Ｒ2が式 -CH2CH2SO3H である化合物。 化合物４（一般名；マイコスポリン−２−グリシン）：
上記式（１）中、Ｒ1が =NCH2COOH であり、Ｒ2が式 -COOH である化合物。
【００１９】
実施例３
製造方法：
各成分及び分量を秤量し均一に混合した後、得られた混合粉末を直打法により打錠し、トローチ剤４錠を得た。
【００２０】
実施例４
製造方法：
各成分及び分量を秤量し均一に混合した後、精製水に溶解し液剤を得た。
【００２１】
試験例１
１．試験方法
試験当日まで通常飼育したマウス20 匹を５匹ずつ４群に群分けし，うち２群については水投与群（水10mL/kg）、他の２群についてはそれぞれ化合物２投与群（50mg/kg、250mg/kg）を一日１回、７日間連投した。水投与群１群と化合物２投与群２群について、マウスの活動期である夜間に拘束ストレスを負荷した。負荷時間は 18:30〜翌 8:30（14 時間）とし、拘束はステンレス製の金網機具を用いて行った。残りの水投与群１群は同時間帯を絶食・絶水し、コントロール群とした。拘束ストレス負荷終了後、３時間後に剖検を行った。
【００２２】
２．使用動物
C3B6F1雄性マウス10週齢（日本エスエルシー）を用いた。マウスはすべて試験直前まで飼育用床敷きケージに10 匹飼いし，室温22±1℃で照明時間（7:00〜19:00）が12 時間サイクルで設定された動物室で飼育した。剖検日の各群の平均体重はコントロール群；25.7±0.6g(ｎ＝５)、ストレス負荷群で水投与群（水10mL/kg)；25.5±0.6g（ｎ＝５）、化合物２低投与群（50mg/kg）；25.9±0.6g(ｎ＝５)、化合物２高投与群(250mg/kg)；26.1±0.7g(ｎ＝５)のマウスを使用した。
【００２３】
３．材料及び方法
１）材料
以下の操作にて脾臓リンパ球細胞の浮遊液、洗浄液及び希釈液として用いる培養液は、標的細胞の培養に用いた培地で、10 非働化FCS及び100U/mL ペニシリンＧ、100μg/mL ストレプトマイシン（PENICILLIN STREPTOMYCINE, LIFE TECHNOLOGY社）、200mg/mL カナマイシン（SIGMA社）、0.3g/L グルタミン（日水製薬社）及び４μL/L ２−メルカプトエタノール（SIGMA社）を添加したRPMI-1640-培地（日水製薬社）を用いた。
Phorbol 12-Myristate 13 Acetate（PMA）及び ionomycin は Sigma 社製、RPMI-1640 培地は日水製薬製、フローサイトメトリー用試薬 CD3 FITC、 NK 1.1 PE は Pharmingen 社製、FACS Flow はBECTON DICKINSON 社製、マウス IFN-γ ELIZA system は Amersham 社製を用いた。
【００２４】
２）脾臓リンパ球の調製
マウスにペントバルビタールナトリウム（ネンブタール注射液、ABBOTT社）を腹腔内に投与し(50mg/kg）、体重を計測した後、麻酔下で脾臓を摘出し、重量を計測した。
【００２５】
得られた脾臓は計測後、滅菌シャーレにとりスライドグラス(MATSUNAMI GLASS社）２枚を用いて、スリのある部分で脾臓をかるくすりつぶし脾臓細胞を浮遊させた。非固着性シリコンガーゼ（富士システムズ社）を用いて、脾臓細胞浮遊液を濾過し、リンパ球細胞以外の細胞を除去した。
【００２６】
赤血球の混入は免疫活性の測定に影響するため、脾臓細胞浮遊液中に混在する赤血球はGey'Solutionを用いて溶血させ赤血球を除去し、RPMI 培地 10 mLを用いて洗浄した（２回）。得られた脾臓細胞浮遊液の細胞濃度をコールターカウンター（CoulterMultisizerII,Coulter社）にて計測し、γIFN産生能の測定に使用した。
【００２７】
３）IFN-γ産生能の測定
PMA 及び ionomycin で刺激した際の脾臓リンパ球の IFN-γ産生量を指標に評価した。上記３−２）で得た脾臓リンパ球分散液を培地で希釈して３×106cell/mL とし、これに PMA 11μg/mL 溶液 50μL 及び ionomycin 50μg/mL 溶液40μL を添加した．CO2 ５、37℃で 20時間インキュベートし、500×gで５分間遠心した上清について Amersham 社の手順書に倣い ELISA システムにより IFN-γ量を測定した。
【００２８】
４．結果
図１に拘束ストレスによるマウス脾臓リンパ球のγーIFN産生能低下に及ぼす化合物２投与の効果について示した。縦軸は脾臓リンパ球のγ-IFN産生量(ng／３×106個)を示す。
【００２９】
ストレス負荷により、コントロール群はγIFN産生能が低下したが、化合物２投与群は用量依存的にγIFN産生能の低下を抑制した。化合物２はストレスにより低下しやすい免疫力にストレス抵抗性を付与し、ストレス後、早期に免疫力を回復させる効果があることを示された。
【００３０】
したがって、本発明の組成物は、免疫賦活剤として有用であることが示された。
【００３１】
【発明の効果】
本発明の免疫賦活剤は、加齢やストレス等により、免疫力が低下した際、効果的に免疫力を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】拘束ストレスによるマウス脾臓リンパ球のγーIFN産生能低下に及ぼす化合物２投与の効果を示す図面
【発明の属する技術分野】
本発明は、免疫賦活剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
加齢やストレス等により、免疫力が低下することがある。免疫システムは、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞やマクロファージ等様々な免疫細胞が関与し、それぞれ独立に、或いは密接に関係を持ち複雑に構成されている。
【０００３】
低下した免疫を賦活化するため、様々な化合物が研究されいる。また、滋養強壮作用を有する生薬を用いて免疫賦活作用の研究が行われている。
【０００４】
しかしながら、免疫賦活作用を有する薬剤は、数少なく、また薬効においても必ずしも満足できるものは少ない。従って、新たな免疫賦活剤の開発が望まれている。
【０００５】
下記式で表される化合物は、冬虫夏草、ヒトデ、海綿動物や海藻類に含有されていることが知られている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、優れた効果を有する免疫賦活剤を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、かかる課題を解決するために鋭意研究した結果、冬虫夏草や海綿動物や海藻類に含まれる特定の化合物が上記目的を達成できることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
本発明は、式
【０００９】
【化２】
（式中、Ｒ1は、酸素原子又は式 =NCH2COOH で表される基を示し、Ｒ2は、式 -CH(CH2OH)CH2CH2CONH2 で表される基、式 -CH(CH2OH)CH2CH2COOH で表される基、式 -CH2CH2SO3H で表される基又は式 -COOH で表される基を示す。）で表される化合物を有効成分とする免疫賦活剤である。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の化合物は、冬虫夏草、ヒトデ、海綿動物や海藻類に含有される化合物として公知であるが、免疫賦活作用については全く知られていなかった。
本発明にかかる化合物を免疫賦活剤として使用するために、経口投与製剤に調整する。経口投与製剤としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、チュアブル錠、シロップ剤、ドリンク剤などであり、慣用的な方法で製造される。
【００１２】
固形剤として調整するの場合には、必要に応じて、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤等を使用する。液剤として調整する場合には、必要に応じて、界面活性剤、溶解補助剤、緩衝剤等を使用する。
また、他に保存剤、香料、色素、甘味剤、嬌味剤、清涼化剤等を使用することができる。
【００１３】
【実施例】
以下に、本発明を実施例及び試験例を示し、詳細に説明する。
【００１４】
実施例１：
冬虫夏草の粉末0.5gに水20mLを加え、10分間超音波を照射し、更に10分間振とうし、抽出エキスを得た。抽出エキスからイオン交感樹脂カラム等を用いて、当該免疫賦活物質画分を得、液体クロマトグラフ装置（紫外吸光光度計：波長290-360nm、カラム：TSKgel ODS-80T、カラム温度：50℃付近の一定温度、移動相：10mMリン酸二水素カリウムｐH5.5）を用い、下記成分（化合物１及び化合物２）を得た。
【００１５】
化合物１（一般名；マイコスポリン）：
上記式（１）中、Ｒ1が酸素原子であり、Ｒ2が式 -CH(CH2OH)CH2CH2CONH2 である化合物。
化合物２（一般名；マイコスポリン−２）：
上記式（１）中、Ｒ1が酸素原子であり、Ｒ2が式 -CH(CH2OH)CH2CH2COOH である化合物。
【００１６】
実施例２；
下記文献１-３を参考にし、乾燥したヒトデや海藻類の粉末0.5gに水20mLを加え、10分間超音波を照射し、更に10分間振とうし、抽出エキスを得た。抽出エキスからイオン交感樹脂カラム等を用いて、当該免疫賦活物質画分を得、液体クロマトグラフ装置（紫外吸光光度計：波長290-360nm、カラム：TSKgel ODS-80T、カラム温度：50℃付近の一定温度、移動相：10mMリン酸二水素カリウムｐH5.5）を用い、下記成分（化合物３及び化合物４）の特定を行った。
【００１７】
文献１： Comp. Biochem. Physiol. 112B(1), 105-114, 1995.
文献２： J Chromatography 250, 113-118, 1982.
文献３： Physiol., C: Pharmacol., Endocrinol. 115C(3), 281-286, 1997.
【００１８】
化合物３（一般名；マイコスポリン−タウリン）：
上記式（１）中、Ｒ1が酸素原子であり、Ｒ2が式 -CH2CH2SO3H である化合物。 化合物４（一般名；マイコスポリン−２−グリシン）：
上記式（１）中、Ｒ1が =NCH2COOH であり、Ｒ2が式 -COOH である化合物。
【００１９】
実施例３
各成分及び分量を秤量し均一に混合した後、得られた混合粉末を直打法により打錠し、トローチ剤４錠を得た。
【００２０】
実施例４
各成分及び分量を秤量し均一に混合した後、精製水に溶解し液剤を得た。
【００２１】
試験例１
１．試験方法
試験当日まで通常飼育したマウス20 匹を５匹ずつ４群に群分けし，うち２群については水投与群（水10mL/kg）、他の２群についてはそれぞれ化合物２投与群（50mg/kg、250mg/kg）を一日１回、７日間連投した。水投与群１群と化合物２投与群２群について、マウスの活動期である夜間に拘束ストレスを負荷した。負荷時間は 18:30〜翌 8:30（14 時間）とし、拘束はステンレス製の金網機具を用いて行った。残りの水投与群１群は同時間帯を絶食・絶水し、コントロール群とした。拘束ストレス負荷終了後、３時間後に剖検を行った。
【００２２】
２．使用動物
C3B6F1雄性マウス10週齢（日本エスエルシー）を用いた。マウスはすべて試験直前まで飼育用床敷きケージに10 匹飼いし，室温22±1℃で照明時間（7:00〜19:00）が12 時間サイクルで設定された動物室で飼育した。剖検日の各群の平均体重はコントロール群；25.7±0.6g(ｎ＝５)、ストレス負荷群で水投与群（水10mL/kg)；25.5±0.6g（ｎ＝５）、化合物２低投与群（50mg/kg）；25.9±0.6g(ｎ＝５)、化合物２高投与群(250mg/kg)；26.1±0.7g(ｎ＝５)のマウスを使用した。
【００２３】
３．材料及び方法
１）材料
以下の操作にて脾臓リンパ球細胞の浮遊液、洗浄液及び希釈液として用いる培養液は、標的細胞の培養に用いた培地で、10 非働化FCS及び100U/mL ペニシリンＧ、100μg/mL ストレプトマイシン（PENICILLIN STREPTOMYCINE, LIFE TECHNOLOGY社）、200mg/mL カナマイシン（SIGMA社）、0.3g/L グルタミン（日水製薬社）及び４μL/L ２−メルカプトエタノール（SIGMA社）を添加したRPMI-1640-培地（日水製薬社）を用いた。
Phorbol 12-Myristate 13 Acetate（PMA）及び ionomycin は Sigma 社製、RPMI-1640 培地は日水製薬製、フローサイトメトリー用試薬 CD3 FITC、 NK 1.1 PE は Pharmingen 社製、FACS Flow はBECTON DICKINSON 社製、マウス IFN-γ ELIZA system は Amersham 社製を用いた。
【００２４】
２）脾臓リンパ球の調製
マウスにペントバルビタールナトリウム（ネンブタール注射液、ABBOTT社）を腹腔内に投与し(50mg/kg）、体重を計測した後、麻酔下で脾臓を摘出し、重量を計測した。
【００２５】
得られた脾臓は計測後、滅菌シャーレにとりスライドグラス(MATSUNAMI GLASS社）２枚を用いて、スリのある部分で脾臓をかるくすりつぶし脾臓細胞を浮遊させた。非固着性シリコンガーゼ（富士システムズ社）を用いて、脾臓細胞浮遊液を濾過し、リンパ球細胞以外の細胞を除去した。
【００２６】
赤血球の混入は免疫活性の測定に影響するため、脾臓細胞浮遊液中に混在する赤血球はGey'Solutionを用いて溶血させ赤血球を除去し、RPMI 培地 10 mLを用いて洗浄した（２回）。得られた脾臓細胞浮遊液の細胞濃度をコールターカウンター（CoulterMultisizerII,Coulter社）にて計測し、γIFN産生能の測定に使用した。
【００２７】
３）IFN-γ産生能の測定
PMA 及び ionomycin で刺激した際の脾臓リンパ球の IFN-γ産生量を指標に評価した。上記３−２）で得た脾臓リンパ球分散液を培地で希釈して３×106cell/mL とし、これに PMA 11μg/mL 溶液 50μL 及び ionomycin 50μg/mL 溶液40μL を添加した．CO2 ５、37℃で 20時間インキュベートし、500×gで５分間遠心した上清について Amersham 社の手順書に倣い ELISA システムにより IFN-γ量を測定した。
【００２８】
４．結果
図１に拘束ストレスによるマウス脾臓リンパ球のγーIFN産生能低下に及ぼす化合物２投与の効果について示した。縦軸は脾臓リンパ球のγ-IFN産生量(ng／３×106個)を示す。
【００２９】
ストレス負荷により、コントロール群はγIFN産生能が低下したが、化合物２投与群は用量依存的にγIFN産生能の低下を抑制した。化合物２はストレスにより低下しやすい免疫力にストレス抵抗性を付与し、ストレス後、早期に免疫力を回復させる効果があることを示された。
【００３０】
したがって、本発明の組成物は、免疫賦活剤として有用であることが示された。
【００３１】
【発明の効果】
本発明の免疫賦活剤は、加齢やストレス等により、免疫力が低下した際、効果的に免疫力を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】拘束ストレスによるマウス脾臓リンパ球のγーIFN産生能低下に及ぼす化合物２投与の効果を示す図面
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| Publication Number | Publication Date |
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2001
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