JP4942014B2 - O-linked sugar amino acids - Google Patents
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Description
本発明は種々のO−結合型糖アミノ酸の合成のための出発化合物として有用な糖アミノ酸、及びそれを用いるO−結合型糖アミノ酸の製造方法に関する。 The present invention relates to a sugar amino acid useful as a starting compound for the synthesis of various O-linked sugar amino acids, and a method for producing an O-linked sugar amino acid using the same.
近年のゲノム研究の発展により、核酸とタンパク質に関する研究は急速に発展した。タンパク質が実際に機能するためには正しくフォールディングし、特定の部位へ輸送される必要があるが、これに糖鎖が深く関わっていることが近年報告され、その詳細な機構の解明が期待されている。さらに、特定の部位に配置されたタンパク質が様々な相互作用を利用して機能する場面においても、多くの場合、糖鎖との相互作用は避けて通ることのできない重要な情報伝達経路である。 Recent advances in genome research have led to rapid development of nucleic acid and protein research. In order for proteins to actually function, they need to be correctly folded and transported to specific sites, but it has recently been reported that sugar chains are deeply involved in this, and the detailed mechanism is expected to be elucidated. Yes. Furthermore, even in a situation where a protein arranged at a specific site functions using various interactions, in many cases, an interaction with a sugar chain is an important information transmission pathway that cannot be avoided.
このようにポストゲノム分野において糖鎖はきわめて重要な役割を果たしているにもかかわらず、その詳細な機能の解明はあまり進んでいない。その主な理由として糖鎖はタンパク質などとの複合体として機能していることが多く、さらに特定のタンパク質に特定の糖鎖が修飾されるわけではなく、加齢、病変などに伴いその糖鎖構造は多様に変化することがあげられる。また、特定のタンパク質上の糖鎖構造の変化を測定する技術に関してもまだ有力なものは開発されていない。 Thus, although the sugar chain plays a very important role in the post-genomic field, elucidation of its detailed function has not progressed much. The main reason is that sugar chains often function as a complex with proteins, etc., and specific sugar chains are not modified to specific proteins. The structure can be variously changed. In addition, a powerful technique for measuring the change in sugar chain structure on a specific protein has not been developed yet.
糖鎖の機能をより詳細に解明するには、まず、構造が明確で純粋な(均一な)複合糖質サンプルを容易にしかも迅速に合成できなければならない。 In order to elucidate the function of glycans in more detail, it is first necessary to be able to synthesize easily and rapidly a pure (homogeneous) complex carbohydrate sample with a well-defined structure.
しかしながら、現在のところ標準糖鎖として入手可能な糖タンパク質関連糖鎖はほぼN−結合型糖アミノ酸のものに限られており(例えば、特開2001−115616号公報、特開平11−255807号公報)、O−結合型糖アミノ酸の標準サンプルは入手は非常に困難である。一部のO−結合型糖アミノ酸について報告されているが、その簡便な合成法についは知られていない。 However, currently, glycoprotein-related sugar chains available as standard sugar chains are almost limited to those of N-linked sugar amino acids (for example, JP-A Nos. 2001-115616 and 11-255807). ), Standard samples of O-linked sugar amino acids are very difficult to obtain. Although some O-linked sugar amino acids have been reported, no simple synthesis method is known.
多様な糖鎖を有する種々のO−結合型糖アミノ酸の簡便な製造方法及びそのための原料化合物、並びに新規なO−結合型糖アミノ酸を提供することを目的とする。 An object is to provide a simple method for producing various O-linked sugar amino acids having various sugar chains, a raw material compound therefor, and a novel O-linked sugar amino acid.
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、特定の糖アミノ酸を出発化合物として用い、これに糖転移酵素を作用させることにより、前記課題を解決できることを見出し、本発明を完成させるに至った。 As a result of intensive investigations to solve the above problems, the present inventors have found that the above problems can be solved by using a specific sugar amino acid as a starting compound and allowing a glycosyltransferase to act on the compound. It came to complete.
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
(1)下記式(I):
Rは、
That is, the present invention includes the following inventions.
(1) The following formula (I):
R is
X、Yは、それぞれ独立して、水素、単糖残基又はオリゴ糖残基であり;
Z1は、水素、アミノ基の保護基又は標識基であり;
Z2は、ヒドロキシル基、カルボキシル基の保護基、活性化基又は標識基である。]
で表される化合物。
但し、X及びYが同時に水素となることはなく、また下記化合物を除く:
X and Y are each independently hydrogen, a monosaccharide residue or an oligosaccharide residue;
Z 1 is hydrogen, an amino-protecting group or a labeling group;
Z 2 is a hydroxyl group, a protecting group for a carboxyl group, an activating group or a labeling group. ]
A compound represented by
However, X and Y do not simultaneously become hydrogen and exclude the following compounds:
(2)Rは、
X及びYは、それぞれ独立して、水素、
(2) R is
X and Y are each independently hydrogen,
Zは、ヒドロキシル基、
Z is a hydroxyl group,
R3、R6及びR6’は、互いに独立して、水素、又は
R 3 , R 6 and R 6 ′ are independently of each other hydrogen, or
R3’及びR3”は、互いに独立して、水素又は、
R 3 ′ and R 3 ″ are independently of each other hydrogen or
nは1〜20までの整数である;
の前記(1)記載の化合物。
n is an integer from 1 to 20;
The compound according to (1) above.
(3)下記式:
(4)下記式:
(5)前記(1)記載の式(I)の化合物を出発原料として用いるO−結合型糖アミノ酸の製造方法。
(6)糖供与体の存在下で、前記(1)記載の式(I)の化合物に糖転移酵素を作用させて、式(I)の化合物の糖鎖を伸長することを特徴とするO−結合型糖アミノ酸の製造方法。
(5) A method for producing an O-linked sugar amino acid using the compound of formula (I) described in (1) as a starting material.
(6) O-ring characterized by extending a sugar chain of the compound of the formula (I) by allowing a glycosyltransferase to act on the compound of the formula (I) described in the above (1) in the presence of a sugar donor. -Production method of conjugated sugar amino acid.
本発明の方法によれば、特定のコア構造を有する糖アミノ酸を出発化合物として、これに糖転移酵素を作用させることにより、糖鎖が均一なO−結合型糖アミノ酸を容易に得ることができる。また、本発明の新規なO−結合型糖アミノ酸は、糖鎖分析用の標準サンプルとして、又はタンパク質との相互作用解析用サンプル等として有用である。さらには、本発明のO−結合型糖アミノ酸は、これ自体を原料とし、糖転移酵素を作用させることにより糖鎖を伸長させることもできる。 According to the method of the present invention, a sugar amino acid having a specific core structure is used as a starting compound, and a glycosyltransferase is allowed to act thereon, whereby an O-linked sugar amino acid having a uniform sugar chain can be easily obtained. . In addition, the novel O-linked sugar amino acid of the present invention is useful as a standard sample for sugar chain analysis, a sample for analysis of interaction with proteins, or the like. Furthermore, the O-linked sugar amino acid of the present invention can be used as a raw material, and the sugar chain can be extended by the action of glycosyltransferase.
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明の化合物は、下記式(I):
Rは、
The present invention is described in detail below.
The compound of the present invention has the following formula (I):
R is
上記X及びYとしては、互いに独立して、水素、糖残基又は2〜30糖の糖鎖が挙げられる。前記糖残基又は2〜30糖の糖鎖としては、単糖及びオリゴ糖(2〜30糖、好ましくは2〜15糖、さらに好ましくは2〜10糖)のいずれでもよく、また、各構成糖はペントース、ヘキソース及びヘプトース等のいずれであってもよい。3糖以上のオリゴ糖鎖である場合には直鎖状糖鎖及び分岐状糖鎖のいずれでもよい。前記糖残基又は糖鎖は、その水酸基の1つ以上が硫酸基、リン酸基、メチル基及び/又はアセチル基により置換されていてもよい。前記糖残基又は糖鎖の糖鎖構造は天然型および非天然型のいずれでもよい。 As said X and Y, hydrogen, a sugar residue, or a sugar chain of 2-30 sugars is mentioned mutually independently. The sugar residue or sugar chain of 2 to 30 sugars may be any of monosaccharides and oligosaccharides (2 to 30 sugars, preferably 2 to 15 sugars, more preferably 2 to 10 sugars). The sugar may be any of pentose, hexose, heptose and the like. In the case of an oligosaccharide chain having 3 or more sugars, either a linear sugar chain or a branched sugar chain may be used. In the sugar residue or sugar chain, one or more of the hydroxyl groups may be substituted with a sulfate group, a phosphate group, a methyl group and / or an acetyl group. The sugar residue or sugar chain structure of the sugar chain may be either a natural type or a non-natural type.
前記糖残基又は糖鎖の具体例としては、例えば、N−アセチルグルコサミン、N−アセチルガラクトサミン、キシロース、マンノース、ガラクトース、グルコース、フコース、N−アセチルノイラミン酸、N−グリコイルノイラミン酸、N−アセチルラクトサミン、リボース、ラクトース、マルトース等の単糖類、並びにこれらの構成糖単位を含み直鎖状又は分岐状に結合したオリゴ糖が挙げられる。 Specific examples of the sugar residue or sugar chain include, for example, N-acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, xylose, mannose, galactose, glucose, fucose, N-acetylneuraminic acid, N-glycolneuraminic acid, Examples thereof include monosaccharides such as N-acetyllactosamine, ribose, lactose and maltose, and oligosaccharides containing these constituent sugar units and bound in a linear or branched manner.
Z1は水素、アミノ基の保護基、又は標識基である。アミノ基の保護基としては例えば、9−フルオレニルオキシカルボニル基(Fmoc基)、ベンジルオキシカルボニル基、第3ブチルオキシカルボニル基等が挙げられ、特にFmoc基が好ましい。また、標識基としては発色団、蛍光基又は放射性同位体が挙げられる。 Z 1 is hydrogen, an amino-protecting group, or a labeling group. Examples of the amino-protecting group include 9-fluorenyloxycarbonyl group (Fmoc group), benzyloxycarbonyl group, tertiary butyloxycarbonyl group and the like, and Fmoc group is particularly preferable. Examples of the labeling group include a chromophore, a fluorescent group, and a radioisotope.
Z2はヒドロキシル基、カルボキシル基の保護基、標識基、又はカルボキシル基の活性化基である。通常は遊離酸(即ち、Z2はヒドロキシル基)の状態で使用されるが、必要に応じて発色団、蛍光基、放射性同位体等の標識基を導入してもよく、ペプチド合成を行う場合には、保護基により保護したり、活性化してもよい。カルボキシル基の活性化基とは、カルボキシル基のカルボニル炭素の反応性を高める目的で導入される官能基である。カルボキシル基の保護基及び活性化基R2としては、例えば、−OR(エステル:−COORとして)、Pfp(ペンタフルオロフェニル基)、フッ素基、S−アルキル基及びS−アリール基(チオエステル:−COSRとして)等が挙げられる。ここで、前記Rは低級アルキル又はアリール基である。 Z 2 is a hydroxyl group, a protecting group for a carboxyl group, a labeling group, or an activating group for a carboxyl group. Usually used as a free acid (ie, Z 2 is a hydroxyl group), but if necessary, labeling groups such as chromophores, fluorescent groups, and radioisotopes may be introduced. May be protected by a protecting group or activated. The activating group of the carboxyl group is a functional group introduced for the purpose of increasing the reactivity of the carbonyl carbon of the carboxyl group. The protecting group of the carboxyl group and activating group R 2, for example, -OR (ester as -COOR), Pfp (pentafluorophenyl group), a fluorine group, S- alkyl and S- aryl groups (thioester: - As COSR). Here, R is a lower alkyl or aryl group.
本明細書で言う発色団とはUV−VIS(可視)領域の電磁波(200〜800nmが好ましい)を吸収する官能基であり、蛍光基とはUV−VIS領域の電磁波を吸収することによりVIS領域の電磁波(300〜900nmが好ましい)を発する官能基を指す。そのような発色団及び蛍光基の具体例としては、例えば、フルオレセイン基、ダンシル基、AMCA基、DIDS基、ピリジルアミノ基、ローダミン基、テトラメチルローダミン基、クマリン基、7−メトキシクマリン基、ピレン基、NBD基等が挙げられる。 The chromophore referred to in this specification is a functional group that absorbs electromagnetic waves in the UV-VIS (visible) region (200 to 800 nm is preferable), and the fluorescent group is a VIS region that absorbs electromagnetic waves in the UV-VIS region. The functional group which emits electromagnetic waves (300 to 900 nm is preferable). Specific examples of such chromophores and fluorescent groups include, for example, fluorescein group, dansyl group, AMCA group, DIDS group, pyridylamino group, rhodamine group, tetramethylrhodamine group, coumarin group, 7-methoxycoumarin group, and pyrene group. , NBD group and the like.
但し、本発明の化合物は、式(I)においてX及びYが同時に水素となることはなく、また下記化合物は除外される: However, in the compounds of the present invention, X and Y in formula (I) are not simultaneously hydrogen, and the following compounds are excluded:
好ましくは、Rは
好ましくは、X、Yは、それぞれ独立して、水素、
好ましくは、前記Zは、水素、
好ましくは、前記R3、R6及びR6’は、互いに独立して、水素又は、
好ましくは、前記R3'及びR3”は、互いに独立して、水素又は、
好ましくは、前記nは1〜20までの整数である。
本発明のO−結合型糖アミノ酸は糖転移酵素を用いて製造することができる。出発化合物としては、特に限定されるものではないが、以下のコア構造を有する糖アミノ酸:
Preferably, n is an integer from 1 to 20.
The O-linked sugar amino acid of the present invention can be produced using a glycosyltransferase. The starting compound is not particularly limited, but is a sugar amino acid having the following core structure:
Core2と呼ばれる分岐型3糖を有する上記糖アミノ酸化合物1から出発して、糖転移酵素を用いて、例えば、以下のようなスキームにより多様なO−結合型糖アミノ酸を製造することができる。 Starting from the above sugar amino acid compound 1 having a branched trisaccharide called Core2, various O-linked sugar amino acids can be produced by using a glycosyltransferase according to the following scheme, for example.
以下に、上記化合物1を出発化合物とする本発明のO−結合型糖アミノ酸の製造方法について例を示して説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、生成したO−結合型糖アミノ酸の分離精製及び分析感度の点から、そのアミノ基部位は非極性の置換基であるFmoc基が望ましい。 Hereinafter, the method for producing an O-linked sugar amino acid of the present invention using Compound 1 as a starting compound will be described with reference to examples, but the present invention is not limited thereto. In view of separation and purification of the produced O-linked sugar amino acid and analytical sensitivity, the amino group site is preferably a Fmoc group which is a nonpolar substituent.
糖転移酵素としては、例えば、グルコース転移酵素(GlcT)、ガラクトース転移酵素(GalT)、N-アセチルグルコサミン転移酵素(GlcNAcTまたはGnT)、N-アセチルガラクトサミン転移酵素(GalNAcT)、グルクロン酸転移酵素(GlcAT)、マンノース転移酵素(ManT)、フコース転移酵素(FucT)、シアル酸転移酵素(SiaT)、キシロース転移酵素(XylT)、ガラクツロン酸転移酵素(GalAT)等が挙げられ、より具体的には、β−1,4−GlcT、α−1,2−GlcT、α−1,3−GlcT、α−1,4−GlcT、β−1,2−GlcNAcT、β−1,3−GlcNAcT、β−1,4−GlcNAcT、β−1,6−GlcNAcT、β−1,3−GalNAcT、β−1,4−GalNAcT、β−1,6−GalNAcT、α−1,2−GalNAcT、α−1,3−GalNAcT、α−1,4−GalNAcT、α−1,6−GalNAcT、β−1,4−GalT、β−1,3−GalT、α−1,4−GalT、α−1,3−GalT、α−1,2−ManT、α−1,3−ManT、α−1,6−ManT、α−2,3(O)−SiaT、α−2,3(N)−SiaT、α−2,3−SiaT、α−2,6(N)−SiaT、α−2,6−SiaT、α−2,3/8−SiaT、α−2,8−SiaT、α−2,8/9−SiaT、α−1,2−FucTI、α−1,2−FucTII、α−1,3/4−FucTIII、α−1,3/4−FucTIII、α−1,3−FucTIV、α−1,3−FucTV、α−1,3−FucTVI、α−1,3−FucTVII、α−1,6−FucTVIII、α−1,3−FucTIX、α−1,4−GalAT、α−1,3−XylT、β−1,2−XylT等が挙げられる。 Examples of the glycosyltransferase include glucose transferase (GlcT), galactose transferase (GalT), N-acetylglucosamine transferase (GlcNAcT or GnT), N-acetylgalactosamine transferase (GalNAcT), glucuronic acid transferase (GlcAT). ), Mannose transferase (ManT), fucose transferase (FucT), sialic acid transferase (SiaT), xylose transferase (XylT), galacturonic acid transferase (GalAT) and the like, more specifically, β -1,4-GlcT, α-1,2-GlcT, α-1,3-GlcT, α-1,4-GlcT, β-1,2-GlcNAcT, β-1,3-GlcNAcT, β-1 , 4-GlcNAcT, β-1,6-GlcNAcT, β-1,3-GalNAcT, β-1,4- alNAcT, β-1,6-GalNAcT, α-1,2-GalNAcT, α-1,3-GalNAcT, α-1,4-GalNAcT, α-1,6-GalNAcT, β-1,4-GalT, β-1,3-GalT, α-1,4-GalT, α-1,3-GalT, α-1,2-ManT, α-1,3-ManT, α-1,6-ManT, α- 2,3 (O) -SiaT, α-2,3 (N) -SiaT, α-2,3-SiaT, α-2,6 (N) -SiaT, α-2,6-SiaT, α-2 , 3 / 8-SiaT, α-2,8-SiaT, α-2,8 / 9-SiaT, α-1,2-FucTI, α-1,2-FucTII, α-1,3 / 4-FucTIII , Α-1,3 / 4-FucTIII, α-1,3-FucTIV, α-1,3-FucTV, α-1,3-FucTVI α-1,3-FucTVII, α-1,6-FucTVIII, α-1,3-FucTIX, α-1,4-GalAT, α-1,3-XylT, β-1,2-XylT, etc. It is done.
本発明に用いる糖鎖供与体としては、糖転移酵素の基質となり得るものであれば特に限定されるものではなく、例えば、UDP−Glc、UDP−Gal、UDP−GlcNAc、UDP−GalNAc、UDP−GlcA、UDP−GalA、UDP−Xyl、GDP−Glc、GDP−Man、GDP−Fuc、CMP−NeuAc、及びこれらのナトリウム塩等が挙げられる。また、酵素的あるいは化学的に修飾された糖鎖、あるいは化学合成された糖鎖も用いることができる。 The sugar chain donor used in the present invention is not particularly limited as long as it can serve as a glycosyltransferase substrate. For example, UDP-Glc, UDP-Gal, UDP-GlcNAc, UDP-GalNAc, UDP- Examples include GlcA, UDP-GalA, UDP-Xyl, GDP-Glc, GDP-Man, GDP-Fuc, CMP-NeuAc, and sodium salts thereof. In addition, enzymatically or chemically modified sugar chains or chemically synthesized sugar chains can also be used.
本発明の反応は、基質の糖供与体、糖受容体である糖アミノ酸及び糖転移酵素を緩衝溶液中で混合することにより行われる。通常、糖供与体の濃度を1mM以上、好ましくは10〜100mM、糖アミノ酸の濃度を0.1mg/ml以上、好ましくは1.0〜20mg/mlになるように加える。酵素量は、好ましくは0.1〜500mU、さらに好ましくは5〜200mU程度の量で用いる。緩衝液としては、pH5〜10程度、濃度10〜200mM、好ましくは20〜100mMの適当な緩衝液(例えば、HEPES、MES緩衝液)が用いられる。また、必要に応じて金属塩を追加してもよい。添加できる金属塩としてはMg、Mn、Ca、Co、Zn、Cu等があり、通常塩化物等の形で添加することができる。 The reaction of the present invention is carried out by mixing a sugar donor as a substrate, a sugar amino acid as a sugar acceptor, and a glycosyltransferase in a buffer solution. Usually, the sugar donor concentration is 1 mM or more, preferably 10 to 100 mM, and the sugar amino acid concentration is 0.1 mg / ml or more, preferably 1.0 to 20 mg / ml. The amount of the enzyme is preferably 0.1 to 500 mU, more preferably about 5 to 200 mU. As the buffer solution, a suitable buffer solution (for example, HEPES, MES buffer solution) having a pH of about 5 to 10 and a concentration of 10 to 200 mM, preferably 20 to 100 mM is used. Moreover, you may add a metal salt as needed. Examples of metal salts that can be added include Mg, Mn, Ca, Co, Zn, Cu, and the like, which can be usually added in the form of chlorides.
反応温度は通常、酵素の至適温度、例えば、10〜50℃程度、好ましくは20〜40℃で行われ、反応時間は1〜48時間、好ましくは1〜24時間程度である。 The reaction temperature is usually an optimum enzyme temperature, for example, about 10 to 50 ° C., preferably 20 to 40 ° C., and the reaction time is 1 to 48 hours, preferably about 1 to 24 hours.
生成したO−結合型糖アミノ酸は公知の手段に従って反応終了液から容易に分離精製することができる。例えば、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー、イオン交換樹脂カラムクロマトグラフィー、レクチンカラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)等により反応終了液から反応生成物のO−結合型糖アミノ酸を分離し、更に必要に応じて濃縮、脱塩、凍結乾燥等を行えばよい。
さらに糖鎖を伸長する場合には、上記の操作を繰り返し行えばよい。
The produced O-linked sugar amino acid can be easily separated and purified from the reaction completion solution according to known means. For example, the O-linked sugar amino acid of the reaction product is separated from the reaction completion solution by gel filtration column chromatography, ion exchange resin column chromatography, lectin column chromatography, high performance liquid chromatography (HPLC), etc. Accordingly, concentration, desalting, lyophilization and the like may be performed.
Further, when the sugar chain is extended, the above operation may be repeated.
このように作用させる糖転移酵素の種類、順番を変えることにより、さまざまな構造のO−結合型糖アミノ酸を調製することができる。 O-linked sugar amino acids having various structures can be prepared by changing the type and order of glycosyltransferases to act in this way.
上記の方法により、例えば、以下のようなO−結合型糖アミノ酸を製造できる:
このような化合物の具体例としては、以下の化合物:
By the above method, for example, the following O-linked sugar amino acids can be produced:
Specific examples of such compounds include the following compounds:
また、本発明の化合物のアミノ酸残基(即ち、トレオニン又はセリン)に他のアミノ酸を結合してペプチドを形成してもよい。 Moreover, you may form a peptide by couple | bonding another amino acid with the amino acid residue (namely, threonine or serine) of the compound of this invention.
ペプチド鎖を形成するには公知のペプチド合成反応を利用して行うことができる。例えば、公知の縮合剤(例えば、ジフェニルホスホリルアジド(DPPA)、ジエチルホスホリルシアニデート、アジドトリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩等の有機リン化合物、N−エトキシカルボニル−2−エトキシ−1,2−ジハイドロキノリン(EEDQ)、1−イソブチル−2−イソブチル−1,2−ジヒドロキシキノリン等のキノリン系ペプチド縮合剤、2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HBTU)、DCC等のカルボジイミド類等)を用いて、本発明の化合物のトレオニン又はセリン残基のアミノ基又はカルボキシル基に、順次アミノ酸を結合していくことによりペプチド鎖を伸長することができる。また、マイクロ波を照射しながら行ってもよい。本明細書で言う「マイクロ波」とは波長約0.3〜30cm程度の電磁波(1〜100GHzに相当する)のことをいう。マイクロ波の波長としては、好ましくは2300〜2600MHzであるが、さらに好ましくは2350〜2550MHz、特に好ましくは2400〜2500MHzである。 A peptide chain can be formed using a known peptide synthesis reaction. For example, known condensing agents (for example, organic phosphorus compounds such as diphenylphosphoryl azide (DPPA), diethylphosphoryl cyanidate, azidotris (dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate, N-ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1, Quinoline peptide condensing agents such as 2-dihydroquinoline (EEDQ) and 1-isobutyl-2-isobutyl-1,2-dihydroxyquinoline, 2- (1H-benzotriazol-1-yl) -1,1,3, 3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU), carbodiimides such as DCC, etc.), and sequentially binding amino acids to the amino group or carboxyl group of the threonine or serine residue of the compound of the present invention. Can elongate the peptide chain. Moreover, you may carry out, irradiating a microwave. As used herein, “microwave” refers to an electromagnetic wave (corresponding to 1 to 100 GHz) having a wavelength of about 0.3 to 30 cm. The wavelength of the microwave is preferably 2300 to 2600 MHz, more preferably 2350 to 2550 MHz, and particularly preferably 2400 to 2500 MHz.
このペプチド合成は固相反応により行ってもよく、例えば、固相担体に本発明の化合物のN末端アミノ基又はC末端カルボキシル基を結合して(例えば、C末端のカルボキシル基をクロロトリチル樹脂、クロルメチル樹脂、オキシメチル樹脂、p−アルコキシベンジルアルコール樹脂等の担体に結合する)、通常の固相合成反応と同様にして行うことができる。 This peptide synthesis may be carried out by solid phase reaction, for example, by binding the N-terminal amino group or C-terminal carboxyl group of the compound of the present invention to a solid phase carrier (for example, the C-terminal carboxyl group is chlorotrityl resin, It binds to a carrier such as chloromethyl resin, oxymethyl resin, or p-alkoxybenzyl alcohol resin), and can be carried out in the same manner as in a normal solid phase synthesis reaction.
以下に本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は、これらに限定されるものではない。 The present invention will be described more specifically with reference to the following examples. However, the present invention is not limited to these examples.
HPLCによる生成物の分析
以下に示される条件で分析を行った。また、生成物の分取も同条件で行った。
カラム:Inertsil ODS−3(GLサイエンス製、内径4.6mm、長さ250mm)
移動相:A:0.1%トリフロロ酢酸、B:アセトニトリル(0.1%トリフロロ酢酸)
0→5min A:B=85:15
5→35min A:B=85:15→45:55
35→35.1min A:B=45:55→10:90
35.1→45min A:B=10:90
流速:1ml/min
カラム温度:40℃
検出:UV254nm
参考例 コア(Core)2トレオニン誘導体の調製
下記の合成スキームにしたがってコア2トレオニン誘導体(化合物8)を調製した。
Analysis of the product by HPLC The analysis was performed under the following conditions. The product was also collected under the same conditions.
Column: Inertsil ODS-3 (GL Science, inner diameter 4.6 mm, length 250 mm)
Mobile phase: A: 0.1% trifluoroacetic acid, B: acetonitrile (0.1% trifluoroacetic acid)
0 → 5min A: B = 85: 15
5 → 35 min A: B = 85: 15 → 45: 55
35 → 35.1 min A: B = 45: 55 → 10: 90
35.1 → 45 min A: B = 10: 90
Flow rate: 1 ml / min
Column temperature: 40 ° C
Detection: UV254nm
Reference Example Preparation of Core 2 Threonine Derivative A core 2 threonine derivative (Compound 8) was prepared according to the following synthesis scheme.
化合物(1)の合成
3,4,6−トリ−O−アセチル−D−ガラクタール(68.9g)を乾燥アセトニトリル(1000ml)に溶かし、−20℃に冷却した。−20℃まで冷えたらセリウムアンモニウムナイトレート(216g)及びアジ化ナトリウム(13.0g)を加え、−20℃で激しく攪拌した。1時間後、さらにセリウムアンモニウムナイトレート(200g)及びアジ化ナトリウム(11.7g)を加え、−20℃で攪拌した。6時間後、反応液にエーテルと水とを加え、分液操作により有機層を集め、水層からエーテルで2回抽出操作を行った。有機層を集め、硫酸マグネシウム乾燥した後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲル(200g)を充填したショートカラムに加え、ヘキサン−酢酸エチル(1:1)で溶出した。得られた粗生成物画分を集め、濃縮し、その残渣をアセトン−水(1:1)混合液(1000ml)に溶かし、これに炭酸カルシウム(25g)を加え、室温で3日間攪拌した。反応懸濁液からカルシウム塩を濾別したのち、濾液を半量になるまで濃縮し、酢酸エチルを用いて3回抽出した。有機層を乾燥、濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー[トルエン−酢酸エチル(2:1)]により精製し、化合物(1)(43g、52%)を得た。化合物(1):Rf0.3[ヘキサン−酢酸エチル(1:1)]。
Synthesis of Compound (1) 3,4,6-Tri-O-acetyl-D-galactal (68.9 g) was dissolved in dry acetonitrile (1000 ml) and cooled to −20 ° C. When cooled to -20 ° C, cerium ammonium nitrate (216 g) and sodium azide (13.0 g) were added, and the mixture was vigorously stirred at -20 ° C. After 1 hour, cerium ammonium nitrate (200 g) and sodium azide (11.7 g) were further added, and the mixture was stirred at -20 ° C. After 6 hours, ether and water were added to the reaction solution, the organic layer was collected by liquid separation operation, and extraction operation was performed twice from the aqueous layer with ether. The organic layer was collected, dried over magnesium sulfate, and concentrated under reduced pressure. The residue was added to a short column packed with silica gel (200 g) and eluted with hexane-ethyl acetate (1: 1). The obtained crude product fractions were collected and concentrated, and the residue was dissolved in an acetone-water (1: 1) mixture (1000 ml), calcium carbonate (25 g) was added thereto, and the mixture was stirred at room temperature for 3 days. After the calcium salt was filtered off from the reaction suspension, the filtrate was concentrated to half volume and extracted three times with ethyl acetate. The organic layer was dried and concentrated, and the residue was purified by silica gel column chromatography [toluene-ethyl acetate (2: 1)] to obtain compound (1) (43 g, 52%). Compound (1): Rf 0.3 [hexane-ethyl acetate (1: 1)].
化合物(2)の合成
化合物(1)(4.05g)とトリクロロアセトニトリル(2.45ml)とのジクロロメタン(40ml)溶液に無水炭酸カリウム(1.69g)を加え、室温で7時間激しく攪拌した。炭酸カリウムをセライトろ過により濾別した後、濾液を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー[トルエン−酢酸エチル−トリエチルアミン(150:50:1)]により精製し、化合物(2)(4.6g、79%)を得た。化合物(2):Rf0.4[トルエン−酢酸エチル−トリエチルアミン(150:50:1)]。
Synthesis of Compound (2) To a solution of compound (1) (4.05 g) and trichloroacetonitrile (2.45 ml) in dichloromethane (40 ml) was added anhydrous potassium carbonate (1.69 g), and the mixture was vigorously stirred at room temperature for 7 hours. After potassium carbonate was filtered off by Celite filtration, the filtrate was concentrated, and the residue was purified by silica gel column chromatography [toluene-ethyl acetate-triethylamine (150: 50: 1)] to obtain compound (2) (4.6 g, 79%). Compound (2): Rf 0.4 [toluene-ethyl acetate-triethylamine (150: 50: 1)].
化合物(3)の合成
化合物(2)(25.0g)とN−α−Fmoc−L−トレオニン−t−ブチルエステル(11.4g)をジクロロメタン−エーテル(1:1)の乾燥混合液(200ml)に溶かし、−30℃に冷却した後、TMSOTf(516μl)を滴下した。反応液を−30℃で30分間攪拌した後、トリエチルアミン(400μl)で中和し、クロロホルムで希釈した後、0.1M 塩酸で洗浄、硫酸マグネシウム乾燥、濃縮を順次行った。残渣を減圧乾燥した後、乾燥メタノールに溶かし、これに、pH8〜9の範囲に保つように注意しながら0.5M ナトリウムメトキシドメタノール溶液を滴下した。TLCで目的物(Rf0.5;酢酸エチル)の蓄積を確認した後、反応液に酢酸(2.0ml)を加え、減圧濃縮した。次に、残渣をクロロホルムに溶かし、飽和炭酸水素ナトリウム水、水で順次洗浄した後、有機層を硫酸マグネシウム乾燥、濃縮し、減圧乾燥した。続いて、残渣を乾燥アセトニトリルに溶かし、ベンズアルデヒドジメチルアセタール(8.5ml)とCSA(200mg)を加え、室温で3時間攪拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水を加え、この懸濁液からクロロホルムで3回抽出した。抽出液を硫酸マグネシウム乾燥、濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー[ヘキサン−酢酸エチル(3:2)]により精製し、化合物(3)(7.2g、38%)を得た。化合物(3):Rf0.6[ヘキサン−酢酸エチル(1:1)]。
Synthesis of Compound (3) Compound (2) (25.0 g) and N-α-Fmoc-L-threonine-t-butyl ester (11.4 g) were mixed in a dichloromethane-ether (1: 1) dry mixture (200 ml) ) And cooled to −30 ° C., TMSOTf (516 μl) was added dropwise. The reaction solution was stirred at −30 ° C. for 30 minutes, neutralized with triethylamine (400 μl), diluted with chloroform, washed with 0.1 M hydrochloric acid, dried over magnesium sulfate, and concentrated. The residue was dried under reduced pressure, dissolved in dry methanol, and 0.5M sodium methoxide methanol solution was added dropwise thereto while taking care to keep the pH in the range of 8-9. After confirming the accumulation of the desired product (Rf0.5; ethyl acetate) by TLC, acetic acid (2.0 ml) was added to the reaction solution, followed by concentration under reduced pressure. Next, the residue was dissolved in chloroform and washed successively with saturated aqueous sodium hydrogen carbonate and water, and then the organic layer was dried over magnesium sulfate, concentrated and dried under reduced pressure. Subsequently, the residue was dissolved in dry acetonitrile, benzaldehyde dimethyl acetal (8.5 ml) and CSA (200 mg) were added, and the mixture was stirred at room temperature for 3 hours. Saturated aqueous sodium hydrogen carbonate was added to the reaction mixture, and the suspension was extracted 3 times with chloroform. The extract was dried over magnesium sulfate and concentrated, and the residue was purified by silica gel column chromatography [hexane-ethyl acetate (3: 2)] to obtain compound (3) (7.2 g, 38%). Compound (3): Rf 0.6 [hexane-ethyl acetate (1: 1)].
化合物(4)の合成
化合物(3)(200mg)、2,3,4,6−テトラ−O−アセチル−α−D−ガラクトーストリクロロアセトイミデート(200mg)のジクロロメタン(4ml)溶液を0℃に冷却し、TMSOTf(11μl)を滴下した。0℃で時間攪拌した後、反応液にトリエチルアミン(8μl)を加え、反応液に0.1M塩酸を加えた。有機層の分液及び水層のクロロホルム抽出を行った後、有機層を合わせ、硫酸マグネシウム乾燥し、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー[ヘキサン−酢酸エチル(1:1)]により精製し、化合物(4)(249mg、84%)を得た。化合物(4):Rf0.4[ヘキサン−酢酸エチル(1:1)]。
Synthesis of Compound (4) Compound (3) (200 mg), 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-α-D-galactose trichloroacetimidate (200 mg) in dichloromethane (4 ml) was brought to 0 ° C. After cooling, TMSOTf (11 μl) was added dropwise. After stirring at 0 ° C. for a time, triethylamine (8 μl) was added to the reaction solution, and 0.1 M hydrochloric acid was added to the reaction solution. After separation of the organic layer and chloroform extraction of the aqueous layer, the organic layers were combined, dried over magnesium sulfate, and concentrated. The residue was purified by silica gel column chromatography [hexane-ethyl acetate (1: 1)] to obtain Compound (4) (249 mg, 84%). Compound (4): Rf 0.4 [hexane-ethyl acetate (1: 1)].
化合物(5)の合成
化合物(4)(224mg)を80%酢酸水に溶かし、80℃で2時間攪拌した。反応液の濃縮、トルエン共沸を行い、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー[ヘキサン−酢酸エチル(1:3)]により精製し、化合物(5)(176mg、86%)を得た。化合物(5):Rf0.2[ヘキサン−酢酸エチル(1:3)]。
Synthesis of Compound (5) Compound (4) (224 mg) was dissolved in 80% aqueous acetic acid and stirred at 80 ° C. for 2 hours. The reaction solution was concentrated and azeotroped with toluene, and the residue was purified by silica gel column chromatography [hexane-ethyl acetate (1: 3)] to obtain compound (5) (176 mg, 86%). Compound (5): Rf0.2 [hexane-ethyl acetate (1: 3)].
化合物(6)の合成
化合物(5)(1.71g)と3,4,6−トリ−O−アセチル−N−(2,2,2−トリクロロエチルオキシカルボニル)−D−グルコサミントリクロロイミデート(2.28g)の乾燥ジクロロメタン(50ml)溶液を−40℃に冷却し、TMSOTf(48μl)を滴下した。10分後、反応液にトリエチルアミン(38μl)を加え、反応液に0.1M塩酸を加えた。有機層の分液及び水層のクロロホルム抽出を行った後、有機層を合わせ、硫酸マグネシウム乾燥し、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー[ヘキサン−酢酸エチル(1:2)]により精製し、化合物(6)(3.15g、92%)を得た。化合物(6):Rf0.6[ヘキサン−酢酸エチル(1:3)]。
Synthesis of Compound (6) Compound (5) (1.71 g) and 3,4,6-tri-O-acetyl-N- (2,2,2-trichloroethyloxycarbonyl) -D-glucosamine trichloroimidate ( 2.28 g) of dry dichloromethane (50 ml) was cooled to −40 ° C. and TMSOTf (48 μl) was added dropwise. After 10 minutes, triethylamine (38 μl) was added to the reaction solution, and 0.1 M hydrochloric acid was added to the reaction solution. After separation of the organic layer and chloroform extraction of the aqueous layer, the organic layers were combined, dried over magnesium sulfate, and concentrated. The residue was purified by silica gel column chromatography [hexane-ethyl acetate (1: 2)] to obtain Compound (6) (3.15 g, 92%). Compound (6): Rf 0.6 [hexane-ethyl acetate (1: 3)].
化合物(7)の合成
化合物(6)(3.5g)及び酢酸(8.0ml)の酢酸エチル溶液(60ml)に亜鉛粉末(19g)を加え、激しく攪拌した。30分後、反応液に無水酢酸(8.0ml)を加え、さらに30分間攪拌した。未反応の亜鉛末をセライトろ過により濾別した後、濾液を0.1M塩酸及び水で順次洗浄し、硫酸マグネシウム乾燥、濃縮した。残渣にシリカゲルカラムクロマトグラフィー[アセトン−ヘキサン(2:1)]を行い(7)の粗生成物(3.0g、94%)を得た。さらにクロロホルム−ヘキサンより3回再結晶することにより化合物(7)の精製物(1.9g、60%)を得た。化合物(7):Rf0.3[アセトン−ヘキサン(2:1)]。
Synthesis of Compound (7) Zinc powder (19 g) was added to an ethyl acetate solution (60 ml) of compound (6) (3.5 g) and acetic acid (8.0 ml), and vigorously stirred. After 30 minutes, acetic anhydride (8.0 ml) was added to the reaction solution, and the mixture was further stirred for 30 minutes. Unreacted zinc powder was filtered off through Celite filtration, and the filtrate was washed successively with 0.1M hydrochloric acid and water, dried over magnesium sulfate, and concentrated. The residue was subjected to silica gel column chromatography [acetone-hexane (2: 1)] to obtain a crude product of (7) (3.0 g, 94%). Further, recrystallization from chloroform-hexane three times gave a purified product (1.9 g, 60%) of compound (7). Compound (7): Rf0.3 [acetone-hexane (2: 1)].
化合物(8)の合成
化合物(7)(1.8g)を95%TFAに溶かし、室温で1時間攪拌した。反応液をトルエンで希釈した後濃縮し、さらにトルエン共沸を2回行い、化合物(8)(1.7g、100%)を得た。化合物(8):Rf0.5[クロロホルム−メタノール(4:1)]。化合物8の水酸基を保護するアセチル基を定法により脱保護して、以下の実施例で使用する化合物1を得た。
Synthesis of Compound (8) Compound (7) (1.8 g) was dissolved in 95% TFA and stirred at room temperature for 1 hour. The reaction mixture was diluted with toluene and concentrated, and toluene azeotropy was further performed twice to obtain compound (8) (1.7 g, 100%). Compound (8): Rf0.5 [chloroform-methanol (4: 1)]. The acetyl group protecting the hydroxyl group of Compound 8 was deprotected by a conventional method to obtain Compound 1 used in the following Examples.
実施例1 化合物2の合成Example 1 Synthesis of Compound 2
β1,4−GalT(東洋紡製)を100mU/ml、UDP−Galを25mM、MnCl2を10mM、BSAを0.1%含む50mMHEPES緩衝液(pH7.0)1mlに化合物1を4.6mg加え、25℃で24時間反応させた。反応後、95℃で3分間加熱し、反応を停止した。反応液1μlを蒸留水で50倍希釈し、HPLCで分析したところ、原料である化合物1に相当するピークは消失しており、生成物に由来する新たなピークが確認された。反応液より、HPLCを用いて生成物に由来するピークを分取することにより、生成物を分離精製した。生成物画分を凍結乾燥することにより生成物4.3mgを得た。
得られた生成物を、2,5−ジヒドロ安息香酸をマトリックスとする、MALDI−TOF−MSで分析したところ、1094.3[M+Na]+(理論値[M+Na]+=1094.4)にピークが検出され、化合物2であることが確認された。
4.6 mg of Compound 1 was added to 1 ml of 50 mM HEPES buffer (pH 7.0) containing 100 mM U / ml of β1,4-GalT (Toyobo), 25 mM of UDP-Gal, 10 mM of MnCl 2 and 0.1% of BSA, The reaction was performed at 25 ° C. for 24 hours. After the reaction, the reaction was stopped by heating at 95 ° C. for 3 minutes. When 1 μl of the reaction solution was diluted 50-fold with distilled water and analyzed by HPLC, the peak corresponding to the raw material compound 1 disappeared, and a new peak derived from the product was confirmed. The product was separated and purified from the reaction solution by separating a peak derived from the product using HPLC. The product fraction was lyophilized to give 4.3 mg of product.
The obtained product was analyzed by MALDI-TOF-MS using 2,5-dihydrobenzoic acid as a matrix, and peaked at 1094.3 [M + Na] + (theoretical value [M + Na] + = 1094.4). Was detected and confirmed to be compound 2.
実施例2 化合物3及び6の合成Example 2 Synthesis of Compounds 3 and 6
Glycobiology, 9, 1061-1071(1999)に従って調製したNeisseria menigitidis MC58株(ATCC BAA-335D)由来のβ1,3-GlcNAcTを30mU/ml、UDP−GlcNAcを5mM、MgCl2を10mM、MnCl2を10mM、BSAを0.01%含む100mMグリシン緩衝液(pH10.0)2mlに実施例1で得られた化合物2を2.2mg加え、20℃で24時間反応させた。反応後、95℃で3分間加熱し、反応を停止した。反応液5μlを蒸留水で10倍希釈し、HPLCで分析したところ、原料である化合物2に相当するピークは消失しており、生成物に由来する新たなピークが確認された。反応液より、HPLCを用いて生成物に由来するピークを分取することにより、生成物を分離精製した。生成物画分を凍結乾燥することにより生成物2.0mgを得た。
得られた生成物を、2,5−ジヒドロ安息香酸をマトリックスとする、MALDI−TOF−MSで分析したところ、1296.3[M+Na]+(理論値[M+Na]+=1097.5)にピークが検出され、化合物3であることが確認された。
なお、同様に48時間反応した後、熱処理したサンプルをHPLCで分析したところ、化合物3に対応するピークの他に新たなピークの出現が確認された。HPLCを用いて当該ピークを分取し、凍結乾燥後、得られた生成物を 2,5−ジヒドロ安息香酸をマトリックスとする、MALDI−TOF−MSで分析したところ、化合物6(理論値[M+Na]+=1500.5)に対応するにピーク 1499.5[M+Na]+を確認した。
Β1,3-GlcNAcT derived from Neisseria menigitidis MC58 strain (ATCC BAA-335D) prepared according to Glycobiology, 9, 1061-1071 (1999), 30 mU / ml, UDP-GlcNAc 5 mM, MgCl 2 10 mM, MnCl 2 10 mM Then, 2.2 mg of the compound 2 obtained in Example 1 was added to 2 ml of 100 mM glycine buffer (pH 10.0) containing 0.01% BSA, and reacted at 20 ° C. for 24 hours. After the reaction, the reaction was stopped by heating at 95 ° C. for 3 minutes. When 5 μl of the reaction solution was diluted 10 times with distilled water and analyzed by HPLC, the peak corresponding to the raw material compound 2 disappeared, and a new peak derived from the product was confirmed. The product was separated and purified from the reaction solution by separating a peak derived from the product using HPLC. The product fraction was lyophilized to give 2.0 mg of product.
The obtained product was analyzed by MALDI-TOF-MS using 2,5-dihydrobenzoic acid as a matrix, and peaked at 1296.3 [M + Na] + (theoretical value [M + Na] + = 1097.5). Was detected and confirmed to be compound 3.
In addition, after reacting similarly for 48 hours, when the heat-processed sample was analyzed by HPLC, appearance of a new peak other than the peak corresponding to the compound 3 was confirmed. The peak was fractionated using HPLC, and after freeze-drying, the obtained product was analyzed by MALDI-TOF-MS using 2,5-dihydrobenzoic acid as a matrix. Compound 6 (theoretical value [M + Na ] + = 1500.5) corresponding to peak 1499.5 [M + Na] + was confirmed.
実施例3 化合物4の合成Example 3 Synthesis of Compound 4
Neisseria meningitidis MC58株由来β1,3−GlcNAcTを30mU/ml、UDP−GlcNAcを5mM、MgCl2を10mM、MnCl2を10mM、BSAを0.1mg/ml含む50mMグリシン緩衝液(pH10.0)1mlに化合物1を1.0mg加え、20℃で24時間反応させた。反応後、95℃で3分間加熱し、反応を停止した。反応液1μlを蒸留水で10倍希釈し、HPLCで分析したところ、原料である化合物1に相当するピークの他に、生成物に由来する新たなピークの出現を確認した。反応液より、HPLCを用いて生成物に由来するピークを分取することにより、生成物を分離精製した。生成物画分を凍結乾燥し、これを2,5−ジヒドロ安息香酸をマトリックスとする、MALDI−TOF−MSで分析したところ、化合物4(理論値[M+Na]+=1135.4)に対応するにピーク 1135.4[M+Na]+を確認した。 Neisseria meningitidis MC58 strain-derived β1,3-GlcNAcT at 30 mU / ml, UDP-GlcNAc at 5 mM, MgCl 2 at 10 mM, MnCl 2 at 10 mM and BSA at 0.1 mg / ml in 1 ml of 50 mM glycine buffer (pH 10.0) 1.0 mg of compound 1 was added and reacted at 20 ° C. for 24 hours. After the reaction, the reaction was stopped by heating at 95 ° C. for 3 minutes. When 1 μl of the reaction solution was diluted 10-fold with distilled water and analyzed by HPLC, the appearance of a new peak derived from the product was confirmed in addition to the peak corresponding to compound 1 as the raw material. The product was separated and purified from the reaction solution by separating a peak derived from the product using HPLC. The product fraction was freeze-dried and analyzed by MALDI-TOF-MS using 2,5-dihydrobenzoic acid as a matrix, which corresponds to compound 4 (theoretical value [M + Na] + = 1135.4). The peak 1135.4 [M + Na] + was confirmed in FIG.
実施例4 化合物5の合成Example 4 Synthesis of Compound 5
α2,3(O)−SiaT(カルビオケム社製)を169mU/ml、CMP−NeuAcを25mM、MgCl2を10mM、トリトンCF−54を0.1%、BSAを0.1%含む50mMHEPES緩衝液(pH7.0)1mlに化合物1を4.6mg加え、25℃で24時間反応させた。反応後、実施例1と同様の方法で反応の停止及びHPLC分析を行った。その結果、原料である化合物1に相当するピークは消失しており、生成物に由来する新たなピークが確認された。反応液より、HPLCを用いて生成物に由来するピークを分取することにより、生成物を分離精製した。生成物画分を凍結乾燥することにより生成物4.8mgを得た。
得られた生成物を、実施例1と同様の方法でMALDI−TOF−MS分析したところ、1223.2[M+Na]+(理論値[M+Na]+=1223.4)にピークが検出され、化合物5であることが確認された。
50 mM HEPES buffer containing 169 mU / ml α2,3 (O) -SiaT (Calbiochem), 25 mM CMP-NeuAc, 10 mM MgCl 2 , 0.1% Triton CF-54 and 0.1% BSA ( 4.6 mg of Compound 1 was added to 1 ml of pH 7.0) and reacted at 25 ° C. for 24 hours. After the reaction, the reaction was stopped and HPLC analysis was performed in the same manner as in Example 1. As a result, the peak corresponding to the raw material compound 1 disappeared, and a new peak derived from the product was confirmed. The product was separated and purified from the reaction solution by separating a peak derived from the product using HPLC. The product fraction was lyophilized to give 4.8 mg of product.
The obtained product was analyzed by MALDI-TOF-MS in the same manner as in Example 1. As a result, a peak was detected at 1223.2 [M + Na] + (theoretical value [M + Na] + = 1223.4). 5 was confirmed.
実施例5 化合物7の合成Example 5 Synthesis of Compound 7
α2,3(N)−SiaT(カルビオケム社製)を20mU/ml、CMP−NeuAcを25mM、MgCl2を10mM、トリトンCF−54を0.1%、BSAを0.1%含む50mMMES緩衝液(pH6.5)1mlに実施例1で得た化合物2を5.4mg加え、25℃で2時間反応させた。反応後、実施例1と同様の方法で反応の停止及びHPLC分析を行った。その結果、原料である化合物2に相当するピークは消失しており、生成物に由来する新たなピークが確認された。反応液より、HPLCを用いて生成物に由来するピークを分取することにより、生成物を分離精製した。生成物画分を凍結乾燥することにより生成物5.4mgを得た。
得られた生成物を、実施例1と同様の方法でMALDI−TOF−MS分析したところ、1386.3[M+Na]+(理論値[M+Na]+=1385.5)にピークが検出され、化合物7であることが確認された。
50 mM MES buffer containing 20 mU / ml α2,3 (N) -SiaT (Calbiochem), 25 mM CMP-NeuAc, 10 mM MgCl 2 , 0.1% Triton CF-54, 0.1% BSA ( pH 6.5) 5.4 mg of the compound 2 obtained in Example 1 was added to 1 ml and reacted at 25 ° C. for 2 hours. After the reaction, the reaction was stopped and HPLC analysis was performed in the same manner as in Example 1. As a result, the peak corresponding to the raw material compound 2 disappeared, and a new peak derived from the product was confirmed. The product was separated and purified from the reaction solution by separating a peak derived from the product using HPLC. The product fraction was lyophilized to give 5.4 mg of product.
The obtained product was analyzed by MALDI-TOF-MS in the same manner as in Example 1. As a result, a peak was detected at 1386.3 [M + Na] + (theoretical value [M + Na] + = 1385.5). 7 was confirmed.
実施例6 化合物8の合成Example 6 Synthesis of Compound 8
化合物1に代えて実施例1で得た化合物2を5.4mg用いる以外は実施例4と同様の方法で反応を行った。反応後、実施例1と同様の方法で反応の停止及びHPLC分析を行った。その結果、原料である化合物2に相当するピークは消失しており、生成物に由来する新たなピーク(但し、実施例5の生成物とは異なる保持時間)が確認された。反応液より、HPLCを用いて生成物に由来するピークを分取することにより、生成物を分離精製した。生成物画分を凍結乾燥することにより生成物5.5mgを得た。
得られた生成物を、実施例1と同様の方法でMALDI−TOF−MS分析したところ、1385.4[M+Na]+(理論値[M+Na]+=1385.5)にピークが検出され、化合物8であることが確認された。
The reaction was conducted in the same manner as in Example 4 except that 5.4 mg of compound 2 obtained in Example 1 was used instead of compound 1. After the reaction, the reaction was stopped and HPLC analysis was performed in the same manner as in Example 1. As a result, the peak corresponding to the compound 2 as the raw material disappeared, and a new peak derived from the product (however, a different retention time from the product of Example 5) was confirmed. The product was separated and purified from the reaction solution by separating a peak derived from the product using HPLC. The product fraction was lyophilized to give 5.5 mg of product.
The obtained product was analyzed by MALDI-TOF-MS in the same manner as in Example 1. As a result, a peak was detected at 1385.4 [M + Na] + (theoretical value [M + Na] + = 1385.5). 8 was confirmed.
実施例7 化合物9の合成Example 7 Synthesis of Compound 9
化合物2に代えて実施例6で得た化合物8を6.8mg用いる以外は実施例5と同様の方法で反応を行った。反応後、実施例1と同様の方法で反応の停止及びHPLC分析を行った。その結果、原料である化合物8に相当するピークは消失しており、生成物に由来する新たなピークが確認された。反応液より、HPLCを用いて生成物に由来するピークを分取することにより、生成物を分離精製した。生成物画分を凍結乾燥することにより生成物6.6mgを得た。
得られた生成物を、実施例1と同様の方法でMALDI−TOF−MS分析したところ、1677.2[M+Na]+(理論値[M+Na]+=1676.6)にピークが検出され、化合物9であることが確認された。
The reaction was conducted in the same manner as in Example 5 except that 6.8 mg of compound 8 obtained in Example 6 was used instead of compound 2. After the reaction, the reaction was stopped and HPLC analysis was performed in the same manner as in Example 1. As a result, the peak corresponding to the raw material compound 8 disappeared, and a new peak derived from the product was confirmed. The product was separated and purified from the reaction solution by separating a peak derived from the product using HPLC. The product fraction was lyophilized to give 6.6 mg of product.
The obtained product was analyzed by MALDI-TOF-MS in the same manner as in Example 1. As a result, a peak was detected at 1677.2 [M + Na] + (theoretical value [M + Na] + = 1676.6). 9 was confirmed.
実施例8 化合物9の合成Example 8 Synthesis of Compound 9
化合物2に代えて実施例5で得た化合物7を6.8mg用いる以外は実施例6と同様の方法で反応を行った。反応後、実施例1と同様の方法で反応の停止及びHPLC分析を行った。その結果、原料である化合物7に相当するピークは消失しており、生成物に由来する新たなピーク(実施例7の生成物と同じ保持時間)が確認された。反応液より、HPLCを用いて生成物に由来するピークを分取することにより、生成物を分離精製した。生成物画分を凍結乾燥することにより生成物6.5mgを得た。
得られた生成物を、実施例1と同様の方法でMALDI−TOF−MS分析したところ、1676.9[M+Na]+(理論値[M+Na]+=1676.6)にピークが検出され、化合物9であることが確認された。
The reaction was conducted in the same manner as in Example 6 except that 6.8 mg of compound 7 obtained in Example 5 was used instead of compound 2. After the reaction, the reaction was stopped and HPLC analysis was performed in the same manner as in Example 1. As a result, the peak corresponding to compound 7 as the raw material disappeared, and a new peak derived from the product (the same retention time as the product of Example 7) was confirmed. The product was separated and purified from the reaction solution by separating a peak derived from the product using HPLC. The product fraction was lyophilized to give 6.5 mg of product.
The obtained product was analyzed by MALDI-TOF-MS in the same manner as in Example 1. As a result, a peak was detected at 1676.9 [M + Na] + (theoretical value [M + Na] + = 1676.6). 9 was confirmed.
実施例9 化合物10の合成Example 9 Synthesis of Compound 10
α1,3−FucTV(カルビオケム社製)を50mU/ml、GDP−Fucを25mM、MnCl2を20mM、トリトンCF−54を0.1%、BSAを0.1%含む50mMHEPES緩衝液(pH7.5)1mlに実施例7で得た化合物9を8.3mg加え、25℃で24時間反応させた。反応後、実施例1と同様の方法で反応の停止及びHPLC分析を行った。その結果、原料である化合物9に相当するピークは消失しており、生成物に由来する新たなピークが確認された。反応液より、HPLCを用いて生成物に由来するピークを分取することにより、生成物を分離精製した。生成物画分を凍結乾燥することにより生成物7.2mgを得た。
得られた生成物を、実施例1と同様の方法でMALDI−TOF−MS分析したところ、1824.0[M+Na]+(理論値[M+Na]+=1824.6)にピークが検出され、化合物10であることが確認された。
50 mM HEPES buffer (pH 7.5) containing 50 mU / ml α1,3-FucTV (Calbiochem), 25 mM GDP-Fuc, 20 mM MnCl 2 , 0.1% Triton CF-54, 0.1% BSA ) 8.3 mg of compound 9 obtained in Example 7 was added to 1 ml and reacted at 25 ° C. for 24 hours. After the reaction, the reaction was stopped and HPLC analysis was performed in the same manner as in Example 1. As a result, the peak corresponding to compound 9 as a raw material disappeared, and a new peak derived from the product was confirmed. The product was separated and purified from the reaction solution by separating a peak derived from the product using HPLC. The product fraction was lyophilized to give 7.2 mg of product.
The obtained product was analyzed by MALDI-TOF-MS in the same manner as in Example 1. As a result, a peak was detected at 1824.0 [M + Na] + (theoretical value [M + Na] + = 1824.6). 10 was confirmed.
実施例10 化合物11の合成Example 10 Synthesis of Compound 11
化合物9に代えて実施例5で得た化合物7を6.8mg用いる以外は実施例7と同様の方法で反応を行った。反応後、実施例1と同様の方法で反応の停止及びHPLC分析を行った。その結果、原料である化合物7に相当するピークは消失しており、生成物に由来する新たなピークが確認された。反応液より、HPLCを用いて生成物に由来するピークを分取することにより、生成物を分離精製した。生成物画分を凍結乾燥することにより生成物6.0mgを得た。
得られた生成物を、実施例1と同様の方法でMALDI−TOF−MS分析したところ、1533.1[M+Na]+(理論値[M+Na]+=1533.5)にピークが検出され、化合物11であることが確認された。
The reaction was conducted in the same manner as in Example 7 except that 6.8 mg of compound 7 obtained in Example 5 was used instead of compound 9. After the reaction, the reaction was stopped and HPLC analysis was performed in the same manner as in Example 1. As a result, the peak corresponding to the raw material compound 7 disappeared, and a new peak derived from the product was confirmed. The product was separated and purified from the reaction solution by separating a peak derived from the product using HPLC. The product fraction was lyophilized to give 6.0 mg of product.
The obtained product was analyzed by MALDI-TOF-MS in the same manner as in Example 1. As a result, a peak was detected at 1533.1 [M + Na] + (theoretical value [M + Na] + = 1533.5). 11 was confirmed.
実施例11 化合物12の合成Example 11 Synthesis of Compound 12
化合物9に代えて実施例6で得た化合物8を6.8mg用いる以外は実施例9と同様の方法で反応を行った。反応後、実施例1と同様の方法で反応の停止及びHPLC分析を行った。その結果、原料である化合物8に相当するピークは消失しており、生成物に由来する新たなピーク(但し、実施例10の生成物とは異なる保持時間)が確認された。反応液より、HPLCを用いて生成物に由来するピークを分取することにより、生成物を分離精製した。生成物画分を凍結乾燥することにより生成物5.9mgを得た。
得られた生成物を、実施例1と同様の方法でMALDI−TOF−MS分析したところ、1532.8[M+Na]+(理論値[M+Na]+=1533.5)にピークが検出され、化合物12であることが確認された。
The reaction was conducted in the same manner as in Example 9 except that 6.8 mg of compound 8 obtained in Example 6 was used instead of compound 9. After the reaction, the reaction was stopped and HPLC analysis was performed in the same manner as in Example 1. As a result, the peak corresponding to the raw material compound 8 disappeared, and a new peak derived from the product (however, a different retention time from the product of Example 10) was confirmed. The product was separated and purified from the reaction solution by separating a peak derived from the product using HPLC. The product fraction was lyophilized to give 5.9 mg of product.
The obtained product was analyzed by MALDI-TOF-MS in the same manner as in Example 1. As a result, a peak was detected at 1532.8 [M + Na] + (theoretical value [M + Na] + = 1533.5). 12 was confirmed.
実施例12 化合物13の合成Example 12 Synthesis of Compound 13
β1,4−GalT(東洋紡製)を100mU/ml、UDP−Galを5mM、MnCl2を10mM、BSAを0.1mg/ml含む50mMHEPPES緩衝液(pH7.0)1.5mlに化合物3を1.9mg加え、25℃、24時間反応させた。反応後、95℃で3分間加熱し、反応液5μlを10倍希釈し、HPLCで分析したところ、原料である化合物3に相当するピークは消失しており、生成物に由来する新たなピークが確認された。反応液より、HPLCを用いて生成物に由来するピークを分取することにより、生成物を分離精製した。生成物画分を凍結乾燥することにより生成物1.8mgを得た。
得られた生成物を、2,5−ジヒドロ安息香酸をマトリックスとする、MALDI−TOF−MSで分析したところ、1446.5[M+Na]+(理論値[M+Na]+=1445.5)にピークが検出され、化合物13であることが確認された。
1. Compound 3 in 1.5 ml of 50 mM HEPES buffer (pH 7.0) containing 100 mU / ml of β1,4-GalT (manufactured by Toyobo), 5 mM of UDP-Gal, 10 mM of MnCl 2 and 0.1 mg / ml of BSA. 9 mg was added and reacted at 25 ° C. for 24 hours. After the reaction, it was heated at 95 ° C. for 3 minutes, 5 μl of the reaction solution was diluted 10 times, and analyzed by HPLC. As a result, the peak corresponding to the compound 3 as a raw material disappeared, and a new peak derived from the product was found. confirmed. The product was separated and purified from the reaction solution by separating a peak derived from the product using HPLC. The product fraction was lyophilized to give 1.8 mg of product.
The obtained product was analyzed by MALDI-TOF-MS using 2,5-dihydrobenzoic acid as a matrix, and peaked at 1446.5 [M + Na] + (theoretical value [M + Na] + = 1445.5). Was detected and confirmed to be Compound 13.
実施例13 化合物14の合成Example 13 Synthesis of Compound 14
Neisseria meningitidis MC58株由来β1,3−GlcNAcTを30mU/ml、UDP−GlcNAcを5mM、MgCl2を10mM、MnCl2を10mM、BSAを0.1mg/ml含む50mMグリシン緩衝液(pH10.0)1mlに化合物13を1.6mg加え、20℃で24時間反応させた。反応後、95℃で3分間加熱し、反応を停止した。反応液2μlを蒸留水で10倍希釈し、HPLCで分析したところ、原料である化合物13に相当するピークはほぼ消失しており、生成物に由来する新たなピークが確認された。反応液より、HPLCを用いて生成物に由来するピークを分取することにより、生成物を分離精製した。生成物画分を凍結乾燥することにより生成物1.5mgを得た。
得られた生成物を、2,5−ジヒドロ安息香酸をマトリックスとする、MALDI−TOF−MSで分析したところ、1648.2[M+Na]+(理論値[M+Na]+=1648.6)にピークが検出され、化合物14であることが確認された。
Neisseria meningitidis MC58 strain-derived β1,3-GlcNAcT at 30 mU / ml, UDP-GlcNAc at 5 mM, MgCl 2 at 10 mM, MnCl 2 at 10 mM and BSA at 0.1 mg / ml in 1 ml of 50 mM glycine buffer (pH 10.0) 1.6 mg of compound 13 was added and reacted at 20 ° C. for 24 hours. After the reaction, the reaction was stopped by heating at 95 ° C. for 3 minutes. When 2 μl of the reaction solution was diluted 10-fold with distilled water and analyzed by HPLC, the peak corresponding to the compound 13 as the raw material almost disappeared, and a new peak derived from the product was confirmed. The product was separated and purified from the reaction solution by separating a peak derived from the product using HPLC. The product fraction was lyophilized to give 1.5 mg of product.
The obtained product was analyzed by MALDI-TOF-MS using 2,5-dihydrobenzoic acid as a matrix, and peaked at 1648.2 [M + Na] + (theoretical value [M + Na] + = 1648.6). Was detected and confirmed to be Compound 14.
実施例14 化合物15の合成Example 14 Synthesis of Compound 15
β1,4−GalT(東洋紡製)を100mU/ml、UDP−Galを5mM、MnCl2を10mM、BSAを0.1mg/ml含む50mMHEPPES緩衝液(pH7.0)0.8mlに化合物14を1.3mg加え、25℃、24時間反応させた。反応後、95℃で3分間加熱し、反応液2μlを10倍希釈し、HPLCで分析したところ、原料である化合物14に相当するピークは消失しており、生成物に由来する新たなピークが確認された。反応液より、HPLCを用いて生成物に由来するピークを分取することにより、生成物を分離精製した。生成物画分を凍結乾燥することにより生成物1.3mgを得た。
得られた生成物を、2,5−ジヒドロ安息香酸をマトリックスとする、MALDI−TOF−MSで分析したところ、1810.6[M+Na]+(理論値[M+Na]+=1810.6)にピークが検出され、化合物15であることが確認された。
Compound 14 was added to 0.8 ml of 50 mM HEPES buffer (pH 7.0) containing 100 mU / ml of β1,4-GalT (manufactured by Toyobo), 5 mM of UDP-Gal, 10 mM of MnCl 2 and 0.1 mg / ml of BSA. 3 mg was added and reacted at 25 ° C. for 24 hours. After the reaction, the mixture was heated at 95 ° C. for 3 minutes, and 2 μl of the reaction solution was diluted 10-fold and analyzed by HPLC. As a result, the peak corresponding to the raw material compound 14 disappeared, and a new peak derived from the product was found. confirmed. The product was separated and purified from the reaction solution by separating a peak derived from the product using HPLC. The product fraction was lyophilized to give 1.3 mg of product.
The obtained product was analyzed by MALDI-TOF-MS using 2,5-dihydrobenzoic acid as a matrix, and peaked at 1810.6 [M + Na] + (theoretical value [M + Na] + = 1810.6). Was detected and confirmed to be Compound 15.
実施例15 化合物16の合成Example 15 Synthesis of Compound 16
Neisseria meningitidis MC58株由来β1,3−GlcNAcTを30mU/ml、UDP−GlcNAcを5mM、MgCl2を10mM、MnCl2を10mM、BSAを0.1mg/ml含む50mMグリシン緩衝液(pH10.0)0.8mlに化合物15を1.1mg加え、20℃で24時間反応させた。反応後、95℃で3分間加熱し、反応を停止した。反応液2μlを蒸留水で10倍希釈し、HPLCで分析したところ、原料である化合物15に相当するピークと共に、生成物に由来する新たなピークが確認された。反応液より、HPLCを用いて生成物に由来するピークを分取することにより、生成物を分離精製した。生成物画分を凍結乾燥することにより生成物0.4mgを得た。
得られた生成物を、2,5−ジヒドロ安息香酸をマトリックスとする、MALDI−TOF−MSで分析したところ、2013.9[M+Na]+(理論値[M+Na]+=2013.7)にピークが検出され、化合物16であることが確認された。
50 mM glycine buffer (pH 10.0) containing β1,3-GlcNAcT derived from Neisseria meningitidis strain MC58 at 30 mU / ml, UDP-GlcNAc at 5 mM, MgCl 2 at 10 mM, MnCl 2 at 10 mM, and BSA at 0.1 mg / ml. To 8 ml, 1.1 mg of compound 15 was added and reacted at 20 ° C. for 24 hours. After the reaction, the reaction was stopped by heating at 95 ° C. for 3 minutes. When 2 μl of the reaction solution was diluted 10-fold with distilled water and analyzed by HPLC, a new peak derived from the product was confirmed along with a peak corresponding to the compound 15 as a raw material. The product was separated and purified from the reaction solution by separating a peak derived from the product using HPLC. The product fraction was lyophilized to give 0.4 mg of product.
The obtained product was analyzed by MALDI-TOF-MS using 2,5-dihydrobenzoic acid as a matrix, and peaked at 20133.9 [M + Na] + (theoretical value [M + Na] + = 20133.7). Was detected and confirmed to be Compound 16.
実施例16 化合物17の合成Example 16 Synthesis of Compound 17
β1,4−GalT(東洋紡製)を100mU/ml、UDP−Galを5mM、MnCl2を10mM、BSAを0.1mg/ml含む50mMHEPPES緩衝液(pH7.0)0.3mlに化合物16を0.3mg加え、25℃、24時間反応させた。反応後、95℃で3分間加熱し、反応液2μlを10倍希釈し、HPLCで分析したところ、原料である化合物16に相当するピークは消失しており、生成物に由来する新たなピークが確認された。反応液より、HPLCを用いて生成物に由来するピークを分取することにより、生成物を分離精製した。生成物画分を凍結乾燥することにより生成物0.3mgを得た。
得られた生成物を、2,5−ジヒドロ安息香酸をマトリックスとする、MALDI−TOF−MSで分析したところ、2175.8[M+Na]+(理論値[M+Na]+=2175.8)にピークが検出され、化合物17であることが確認された。
Compound 16 was added to 0.3 ml of 50 mM HEPES buffer (pH 7.0) containing 100 mU / ml of β1,4-GalT (manufactured by Toyobo), 5 mM of UDP-Gal, 10 mM of MnCl 2 and 0.1 mg / ml of BSA. 3 mg was added and reacted at 25 ° C. for 24 hours. After the reaction, the mixture was heated at 95 ° C. for 3 minutes, and 2 μl of the reaction solution was diluted 10-fold and analyzed by HPLC. As a result, the peak corresponding to the compound 16 as a raw material disappeared, and a new peak derived from the product was found. confirmed. The product was separated and purified from the reaction solution by separating a peak derived from the product using HPLC. The product fraction was lyophilized to give 0.3 mg of product.
The obtained product was analyzed by MALDI-TOF-MS using 2,5-dihydrobenzoic acid as a matrix, and peaked at 2175.8 [M + Na] + (theoretical value [M + Na] + = 2175.8). Was detected and confirmed to be Compound 17.
実施例17 化合物18の合成Example 17 Synthesis of Compound 18
β1,4−GalT(東洋紡製)を100mU/ml、UDP−Galを5mM、MnCl2を10mM、BSAを0.1mg/ml含む50mMHEPPES緩衝液(pH7.0)1.0mlに化合物6を1.3mg加え、25℃、24時間反応させた。反応後、95℃で3分間加熱し、反応液2μlを10倍希釈し、HPLCで分析したところ、原料である化合物6に相当するピークは消失しており、生成物に由来する新たなピークが確認された。反応液より、HPLCを用いて生成物に由来するピークを分取することにより、生成物を分離精製した。生成物画分を凍結乾燥することにより生成物1.5mgを得た。
得られた生成物を、2,5−ジヒドロ安息香酸をマトリックスとする、MALDI−TOF−MSで分析したところ、1810.5[M+Na]+(理論値[M+Na]+=1810.6)にピークが検出され、化合物18であることが確認された。
Compound 1 was added to 1.0 ml of 50 mM HEPES buffer (pH 7.0) containing 100 mU / ml of β1,4-GalT (manufactured by Toyobo), 5 mM of UDP-Gal, 10 mM of MnCl 2 and 0.1 mg / ml of BSA. 3 mg was added and reacted at 25 ° C. for 24 hours. After the reaction, the mixture was heated at 95 ° C. for 3 minutes, and 2 μl of the reaction solution was diluted 10-fold and analyzed by HPLC. As a result, the peak corresponding to compound 6 as a raw material disappeared, and a new peak derived from the product was found. confirmed. The product was separated and purified from the reaction solution by separating a peak derived from the product using HPLC. The product fraction was lyophilized to give 1.5 mg of product.
The obtained product was analyzed by MALDI-TOF-MS using 2,5-dihydrobenzoic acid as a matrix, and peaked at 1810.5 [M + Na] + (theoretical value [M + Na] + = 1810.6). Was detected and confirmed to be Compound 18.
実施例18 化合物19の合成Example 18 Synthesis of Compound 19
Neisseria meningitidis MC58株由来β1,3−GlcNAcTを30mU/ml、UDP−GlcNAcを5mM、MgCl2を10mM、MnCl2を10mM、BSAを0.1mg/ml含む50mMグリシン緩衝液(pH10.0)0.8mlに化合物18を1.3mg加え、20℃で24時間反応させた。反応後、95℃で3分間加熱し、反応を停止した。反応液2μlを蒸留水で10倍希釈し、HPLCで分析したところ、原料である化合物18に相当するピークは消失しており、生成物に由来する新たなピークが確認された。反応液より、HPLCを用いて生成物に由来するピークを分取することにより、生成物を分離精製した。生成物画分を凍結乾燥することにより生成物1.4mgを得た。
得られた生成物を、2,5−ジヒドロ安息香酸をマトリックスとする、MALDI−TOF−MSで分析したところ、2216.9[M+Na]+(理論値[M+Na]+=2216.8)にピークが検出され、化合物19であることが確認された。
50 mM glycine buffer (pH 10.0) containing β1,3-GlcNAcT derived from Neisseria meningitidis strain MC58 at 30 mU / ml, UDP-GlcNAc at 5 mM, MgCl 2 at 10 mM, MnCl 2 at 10 mM, and BSA at 0.1 mg / ml. To 8 ml, 1.3 mg of compound 18 was added and reacted at 20 ° C. for 24 hours. After the reaction, the reaction was stopped by heating at 95 ° C. for 3 minutes. When 2 μl of the reaction solution was diluted 10 times with distilled water and analyzed by HPLC, the peak corresponding to the compound 18 as a raw material disappeared, and a new peak derived from the product was confirmed. The product was separated and purified from the reaction solution by separating a peak derived from the product using HPLC. The product fraction was lyophilized to give 1.4 mg of product.
The obtained product was analyzed by MALDI-TOF-MS using 2,5-dihydrobenzoic acid as a matrix, and peaked at 2216.9 [M + Na] + (theoretical value [M + Na] + = 2216.8). Was detected and confirmed to be Compound 19.
実施例19 化合物20の合成Example 19 Synthesis of Compound 20
β1,4−GalT(東洋紡製)を100mU/ml、UDP−Galを5mM、MnCl2を10mM、BSAを0.1mg/ml含む50mMHEPPES緩衝液(pH7.0)0.8mlに化合物19を1.0mg加え、25℃、24時間反応させた。反応後、95℃で3分間加熱し、反応液2μlを10倍希釈し、HPLCで分析したところ、原料である化合物19に相当するピークは消失しており、生成物に由来する新たなピークが確認された。反応液より、HPLCを用いて生成物に由来するピークを分取することにより、生成物を分離精製した。生成物画分を凍結乾燥することにより生成物1.1mgを得た。
得られた生成物を、2,5−ジヒドロ安息香酸をマトリックスとする、MALDI−TOF−MSで分析したところ、2540.9[M+Na]+(理論値[M+Na]+=2540.9)にピークが検出され、化合物20であることが確認された。
1. Compound 19 in 100 ml of β1,4-GalT (Toyobo), 5 mM of UDP-Gal, 10 mM of MnCl 2 and 0.1 mg / ml of BSA in 0.8 ml of 50 mM HEPPES buffer (pH 7.0) 0 mg was added and reacted at 25 ° C. for 24 hours. After the reaction, the mixture was heated at 95 ° C. for 3 minutes, and 2 μl of the reaction solution was diluted 10 times and analyzed by HPLC. As a result, the peak corresponding to the compound 19 as a raw material disappeared, and a new peak derived from the product was found. confirmed. The product was separated and purified from the reaction solution by separating a peak derived from the product using HPLC. The product fraction was lyophilized to give 1.1 mg of product.
The obtained product was analyzed by MALDI-TOF-MS using 2,5-dihydrobenzoic acid as a matrix, and peaked at 2540.9 [M + Na] + (theoretical value [M + Na] + = 2540.9). Was detected and confirmed to be Compound 20.
本発明のO−結合型糖アミノ酸は糖アミノ酸の糖部分の水酸基が遊離であり、糖ペプチド合成用原料に限らず、それ自体で天然糖鎖の標準サンプルとしても有用である。また、タンパク質との相互作用解析用サンプルとしても使用することができる。 The O-linked sugar amino acid of the present invention has a free hydroxyl group in the sugar moiety of the sugar amino acid, and is useful not only as a raw material for synthesizing glycopeptides but also as a standard sample of natural sugar chains. It can also be used as a sample for analyzing interaction with proteins.
さらに本発明の糖アミノ酸から出発して多様なO−結合型糖アミノ酸を製造することができ、O−結合型糖アミノ酸ライブラリー合成を可能となり、糖タンパク質の機能解析や構造解析が飛躍的に進行するものと期待される。 Furthermore, starting from the sugar amino acids of the present invention, various O-linked sugar amino acids can be produced, O-linked sugar amino acid libraries can be synthesized, and functional analysis and structural analysis of glycoproteins can be dramatically improved. Expected to progress.
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