JP4925756B2 - タンパク質認識構造体、タンパク質認識基板、及びこれらの製造方法 - Google Patents
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Description
従来技術のように、タンパク質を溶液に溶かして分子インプリントを行う方法では、分子インプリントがタンパク質のいろいろな部位で行われることになり、インプリントポリマー(タンパク質認識構造体)の結合部位は不均一となる。このため、認識力の弱い部位から強い部位までさまざまな官能基部位が存在することになり、認識特異性が低くなる。
また、インプリント溶液に多量に水が含まれていると、水が機能性モノマーと特異的官能基部位との相補的結合を阻害するため、インプリント溶液の含水分量を1質量%以下とする。
ここで、インプリントの含水分量は、有機溶媒や重合性分子に含まれる水分量の総和を意味し、有機溶媒と水とが分離しているものは有機溶媒に含めない。
実施の形態1を図面に基づいて説明する。図1は実施の形態1のタンパク質認識構造体の作製手順を示す図である。
このようにして、図1(b)に示すようにタンパク質アモルファス固体2が得られる。
また、N,N,N’,N’−テトラメチルエチレンジアミンなどの重合促進剤を加えても良い。
重合時間に制限はないが、目視により溶液がゲル化していれば重合完了と判断できる。一般的には0.5〜48時間で重合が完了する。
実施の形態2を図面に基づいて説明する。実施の形態2では鋳型としてタンパク質アモルファス固体を用いて薄膜状のタンパク質認識構造体を作製する。図2は実施の形態2のタンパク質認識構造体の作製手順を示す図である。
最後に、ポリマー薄膜15が形成された基板14に、実施の形態1と同様に鋳型であるタンパク質に溶解性を示す溶液を接触させて、鋳型であるタンパク質を取り除く。これにより、図2(d)のようにポリマー薄膜の表面に標的分子であるタンパク質がインプリントされたタンパク質認識構造体を作製することができる。
実施の形態3を図面に基づいて説明する。実施の形態3はタンパク質アモルファス固体を鋳型として用いてタンパク質認識構造体の微粒子を作製し、この微粒子を基板上に配置してタンパク質認識基板を作製する。
実施例1ではタンパク質アモルファス固体を鋳型として薄膜状のタンパク質認識構造体を作製した。
鋳型のタンパク質としてリゾチームを用いた。
10mM HEPES緩衝液(pH7.4)3mlにリゾチームを120mg溶かした。この溶液に沈殿剤として硫酸アンモニウムを1.4g加えて溶かした。この溶液を10mlバイアル瓶に入れ、密封し、25℃で静置した。1日静置後にタンパク質アモルファス固体の形成が確認された。
機能性モノマーとしてのアクリル酸7μlと、架橋剤としてエチレングリコールジメタクリレート188μlと、重合開始剤として2,2’−アゾビスイソブチロニトリル3.2mgと、をクロロホルム6mlに溶かし、プレポリマー溶液(インプリント溶液)とした。
タンパク質認識構造体を載置する基板として、ガラス基板に金膜がコートされているSPR用のセンサーチップ(ビアコア社製)を用いた。センサーチップとポリマーとが化学的に結合できるように、次のようにしてセンサーチップ表面をビニル基で修飾した。具体的には、センサーチップをN,N’-ビス(アクリロイル)シスタミン10mgを溶かしたメタノール溶液8mlに30分間浸漬し、センサーチップ表面の金膜と、N,N’-ビス(アクリロイル)シスタミンのチオール基との間で共有結合させた。
アモルファス固体を含む溶液から上澄みを除き、上記プレポリマー溶液でタンパク質アモルファス固体を3回洗浄した。その後、タンパク質アモルファス固体をスライドガラスの上に置き、プレポリマー溶液100μlを滴下した。その上に、ビニル基修飾センサーチップを乗せ、4℃で紫外線照射を2時間行い、重合させた。
重合反応後、センサーチップを剥がし、クロロホルム、メタノール、1M塩化ナトリウム溶液、純水の順に洗浄を行い、未反応モノマーおよび鋳型であるタンパク質アモルファス固体を除去した。
このようにして作製したタンパク質認識構造体の薄膜を用いて、リゾチーム、チトクロムc、リボヌクレアーゼA、ミオグロビン、ラクトアルブミン、トリプシンに対する結合実験を行った。結合実験は、SPR(ビアコア社製)を用いて行った。
2 タンパク質アモルファス固体
3 プレポリマー溶液
11 基板
12 タンパク質アモルファス固体
13 プレポリマー溶液
14 基板
15 ポリマー
20 基板
21 微粒子A
22 微粒子B
23 スポットA
24 スポットB
25 タンパク質Aを認識する部位
26 タンパク質Bを認識する部位
Claims (8)
- タンパク質アモルファス固体の外表面形状及びタンパク質アモルファス固体の外表面に配位された特異的官能基部位が分子インプリントされたタンパク質認識構造体。
- タンパク質アモルファス固体の外表面形状及びタンパク質アモルファス固体の外表面に配位された特異的官能基部位が分子インプリントされたタンパク質認識構造体が、基板上にアレイ配置されているタンパク質認識基板。
- タンパク質アモルファス固体の外表面に、タンパク質アモルファス固体の外表面に配位された特異的官能基部位と相補的に結合する機能性モノマーを有する前記重合性分子を溶解させたインプリント溶液を接触させ、この状態で前記重合性分子を重合させる重合ステップと、
前記重合ステップの後、重合されたインプリントポリマーから前記タンパク質アモルファス固体を除去する除去ステップと、
を備え、
前記重合性分子を溶解させる溶媒が、有機溶媒であり、
前記インプリント溶液に含まれる水分量が、1質量%以下である、
ことを特徴とするタンパク質認識構造体の製造方法。 - 前記有機溶媒の比誘電率が、25℃条件において水よりも小さいことを特徴とする請求項3記載のタンパク質認識構造体の製造方法。
- 前記タンパク質アモルファス固体が水溶性タンパク質のアモルファス固体であることを特徴とする請求項3記載のタンパク質認識構造体の製造方法。
- タンパク質アモルファス固体の外表面に、タンパク質アモルファス固体の外表面に配位された特異的官能基部位と相補的に結合する機能性モノマーを有する前記重合性分子を溶解させたインプリント溶液を接触させ、この状態で前記重合性分子を重合させる重合ステップと、
前記重合ステップの後、重合されたインプリントポリマーから前記タンパク質アモルファス固体を除去する除去ステップと、
前記除去ステップの後、作製されたタンパク質認識構造体を基板上にアレイ配置する配置ステップと、
を備え、
前記重合性分子を溶解させる溶媒が、有機溶媒であり、
前記インプリント溶液に含まれる水分量が、1質量%以下である、
ことを特徴とするタンパク質認識基板の製造方法。 - 前記重合ステップが、直径1000nm以下のポリマーにインプリントするステップであることを特徴とする請求項6記載のタンパク質認識基板の製造方法。
- 前記配置ステップは、異なる種類のタンパク質アモルファス固体を鋳型としたタンパク質認識構造体を、それぞれ異なるアレイに配置するステップであることを特徴とする請求項6記載のタンパク質認識基板の製造方法。
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