JP4925262B2 - シグナル伝達系活性化剤 - Google Patents

Description

本発明はインテグリンβ１シグナル伝達系活性化剤に関する。

障害を起こした中枢神経系の再生は困難であるが、動物実験では胎児組織、特に神経幹細胞の移植が有用であることが報告されている。しかし、治療に十分な神経幹細胞を得るには多数の中絶胎児の献体を必要とする上に、胎児の使用に倫理面での問題があるため、現実的な臨床応用は難しい。

そこで、胎児から直接単離した神経幹細胞に代わる移植材料の候補として、体外で培養し、増殖させた神経幹細胞が注目されている。神経幹細胞は自己複製能と多分化能を有する未分化な細胞であり、体外で培養することにより無尽蔵に増殖するため、十分なドナー細胞の供給が可能である。

神経幹細胞や神経前駆細胞における、細胞維持（maintenance）、細胞生存（survival）、細胞増殖（proliferation）、細胞分化（differentiation）には、インテグリンβ１が重要な役割を果たしている（例えば、非特許文献１〜１１参照）。そこで、インテグリンβ１シグナル伝達系を調節することにより、神経幹細胞や神経前駆細胞の細胞維持、細胞生存、細胞増殖、あるいは細胞分化を調節できるようになると考えられる。
Campos L.S. "Beta1 integrins and neural stem cells: making sense of the extracellular environment." Bioessays vol.27 No.7 p.698-707, 2005. Jacques T.S. et al. "Neural precursor cell chain migration and division are regulated through different beta1 integrins." Development vol.125 No.16 p.3167-3177, 1998. Gimond C. et al. "Defects in adhesion and migration, but not in proliferation and differentiation, of embryonic stem cells upon replacement of integrin subunit beta1A by beta1D." Differentiation. Vol.66 No.2-3 p.93-105, 2000. Prestoz L. et al. "Association between integrin-dependent migration capacity of neural stem cells in vitro and anatomical repair following transplantation." Mol. Cell Neurosci. Vol.18 No.5 p.473-484, 2001. Murase S. and Horwitz A.F. "Deleted in colorectal carcinoma and differentially expressed integrins mediate the directional migration of neural precursors in the rostral migratory stream." J. Neurosci. Vol.22 No.9 p.3568-3579, 2002. Yoshida N, et al. "Decrease in expression of alpha 5 beta 1 integrin during neuronal differentiation of cortical progenitor cells." Exp. Cell Res. Vol.287 No.2 p.262-271, 2003. Campos L.S. et al. "Beta1 integrins activate a MAPK signalling pathway in neural stem cells that contributes to their maintenance." Development. Vol.131 No.14 p.3433-3444, 2004. Yanagisawa M. et al. "Roles of lipid rafts in integrin-dependent adhesion and gp130 signalling pathway in mouse embryonic neural precursor cells." Genes Cells. Vol.9 No.9 p.801-809, 2004. Tate M.C. et al. "Specific beta1 integrins mediate adhesion, migration, and differentiation of neural progenitors derived from the embryonic striatum." Mol. Cell Neurosci. Vol.27 No.1 p.22-31, 2004. Andressen C. et al. "The contribution of beta1 integrins to neuronal migration and differentiation depends on extracellular matrix molecules." Eur. J. Cell Biol. Vol.84 No.12 p.973-982, 2005. Campos L.S. et al. "Notch, EGFR and beta 1 integrin pathways are coordinated in neural stem cells." J. Biol. Chem. accepted manuscript version (2005 Dec 6).

そこで、本発明は、神経幹細胞または神経前駆細胞における、インテグリンβ１シグナル伝達系の活性化剤、及びインテグリンβ１シグナル伝達系を介して神経幹細胞または神経前駆細胞の維持、生存、または分化を調節する調節剤を提供することを目的としてなされた。

発明者らは、ガレクチン−１が神経幹細胞の増殖に関わる因子の一つであることをすでに明らかにしている。そこで、ガレクチン−１の受容体の同定を試み、鋭意努力の結果、ガレクチン−１の受容体がインテグリンβ１であることを明らかにし、本発明の完成に至った。

本発明にかかる活性化剤は、神経幹細胞または神経前駆細胞において、インテグリンシグナル伝達系を活性化する活性化剤であって、ガレクチン−１を含有することを特徴とする。また、本発明にかかる活性化方法は、培養条件下の神経幹細胞または神経前駆細胞において、インテグリンβ１シグナル伝達系を活性化する活性化方法であって、前記細胞にガレクチン−１を投与することを特徴とする。

さらに、本発明にかかる調節剤は、神経幹細胞または神経前駆細胞の維持、生存または分化を調節する調節剤であって、ガレクチン−１を含有することを特徴。また、本発明にかかる調節方法は、培養条件下の神経幹細胞または神経前駆細胞の維持、生存または分化を調節する調節方法であって、前記細胞にガレクチン−１を投与することを特徴とする。

本発明によって、神経幹細胞または神経前駆細胞における、インテグリンシグナル伝達系の活性化剤、及びインテグリンβ１シグナル伝達系を介して神経幹細胞または神経前駆細胞の維持、生存、または分化を調節する調節剤を提供することが可能となった。

インテグリンはαサブユニットとβサブユニットのヘテロダイマーからなる受容体タンパク質である。中でも、インテグリンβ１は、発生過程において、特に重要な役割を果たすことが示されてきた。

＝＝神経幹細胞または神経前駆細胞の維持を調節する調節剤＝＝
発生過程にある大脳皮質においては、ＶＺ（ventral zone）領域の神経幹細胞は、まず等分裂した後に神経幹細胞と神経前記細胞に不等分裂をし、神経幹細胞の維持に働く。インテグリンβ１と相互作用する細胞内タンパク質であるＩＬＫ（integrin-linked kinase）は転写抑制因子Snail/Slugの発現を亢進することにより、Ｅカドヘリンとβカテニンの転写の発現を抑制することが知られているが、Ｅカドヘリンとβカテニンを高発現しているＶＺ領域の細胞が移動できるようになるのは、このメカニズムを利用していることが考えられる（Campos L.S., Bioessays 27, 698-707, 2005）。一方、ＦＧＦ２の存在下でβカテニンを過剰発現させると、神経前駆細胞を増殖させ続けること、またＦＧＦ２の非存在下でβカテニンを過剰発現させると、神経前駆細胞を神経分化の方向に向かわせることが知られているが、神経前駆細胞にＦＧＦを投与すると、インテグリンβ１の発現が亢進することから、βカテニンの効果にＦＧＦ２が関与するのは、部分的に、細胞間、あるいは細胞−ＥＣＭ間の微小環境によると考えられる。これらの結果から、ＶＺにおいてタンパク質相互作用のネットワークが機能し、インテグリンβ１シグナル伝達系は他のシグナル伝達系とのクロストークを通じて、神経幹細胞を維持するか、それとも分化したり移動したりするか、の選択を行なうと考えられている（Campos L.S., Bioessays 27, 698-707, 2005）。

従って、ガレクチン−１によってインテグリンβ１を活性化することにより、神経幹細胞または神経前駆細胞の状態を維持することが可能となり、ガレクチン−１は、神経幹細胞または神経前駆細胞の維持を調節する調節剤として有効である。

＝＝神経幹細胞または神経前駆細胞の生存を調節する調節剤＝＝
ＶＺ領域の神経幹細胞の等分裂と不等分裂は、特定の分子を不等配分することにより、細胞の生存を調節することにより調節しうる。発生過程では、基底膜がＰＣＤ（programmed cell death）を調節していることが知られており、基底膜の近くや他の生存因子（例えば、増殖因子）が存在している環境にある細胞だけが生存できるため、適当なマトリックスとの接触を失った細胞では、細胞死が引き起こされる。実際、インテグリンシグナル伝達系がなくなると、ＰＣＤが誘導されたり（Zhang Z., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 6161-6165, 1995; Gilmore A.P. et al., J. Cell Biol. 149, 431-446, 2000; Gary D.S. et al., J. Neurochem 84, 878-890, 2003）、インテグリンβ１の構造変化がアポトーシスを引き起こしたりする（Prince J.M. et al., Dev. Dyn. 223, 497-516, 2002）。また、フリーのインテグリンは、カスパーゼ−８を膜に誘導して活性化し、インテグリンの結合はインテグリン−カスパーゼの相互作用を阻害し、細胞の生存を促進する（Stupack D.G. et al., J. Cell Biol. 155, 459-470, 2004）。さらに、α３β１インテグリンが、ＭＡＰＫシグナル伝達系を活性化することにより、細胞の生存を促進することが知られている（Manohar A. et al., J. Cell Sci. 117, 4043-4054, 2004）。これらの結果から、in vivoでも、神経幹細胞または神経前駆細胞の生存は、インテグリンβ１を高発現しているＶＺにおいて、インテグリンβ１によって維持されていると考えられている（Campos L.S., Bioessays 27, 698-707, 2005）。

従って、ガレクチン−１によってインテグリンβ１を活性化することにより、神経幹細胞または神経前駆細胞の生存を維持することが可能となり、ガレクチン−１は、神経幹細胞または神経前駆細胞の生存を調節する調節剤として有効である。

＝＝神経幹細胞または神経前駆細胞の分化を調節する調節剤＝＝
最近、神経前駆細胞においてインテグリンβ１の発現レベルを下げると、ネスチン陽性細胞が減少することが明らかになった（Leone D. et al. J. Cell Sci. 118, 2005）。ネスチンは、神経幹細胞あるいは神経前駆細胞の未分化状態のマーカーであり、この実験結果は、インテグリンβ１が神経幹細胞及び神経前駆細胞の未分化状態の維持に必要であることを示す。

従って、ガレクチン−１によってインテグリンβ１を活性化することにより、神経幹細胞または神経前駆細胞の未分化状態を維持することが可能となり、ガレクチン−１は、神経幹細胞または神経前駆細胞の分化を調節する調節剤として有効である。

＜実施例１＞インテグリンβ１はガレクチン−１の受容体を構成する
神経幹細胞に対するガレクチン−１の結合に糖が関与しているかどうかを調べるため、ビオチン化Ｃ２Ｓガレクチン−１（C2S-GAL-1-bio）（産総研より提供）を用いて、ラクトースの存在下で組織染色を行った。このC2S-GAL-1は、ガレクチン−１の２番目のシステインをセリンに置換した変異体（Hirabayashi & Kasai, J Biol Chem 266, 23648-23653 1991）で、正常な炭化水素結合能を有することが既に示されている（Purkrabkova et al. Biol Cell 95, 535-545, 2003）。

まず、生後５６日から１０５日目のマウスの脳を取り出し、４％ホルムアルデヒド溶液で潅流固定した後、４℃で一晩、同溶液で後固定し、５０μｍのビブラトーム切片を作成した。

この切片を、２０ｍＭラクトース存在下で、０．５％Triron X-100及び１％BSAを含有するＰＢＳに溶解させた１μｇ／ｍＬ C2S-GAL-1-bio溶液中で、４℃で一晩インキュベートし、ＡＢＣキット（Vectastain社）とＴＳＡ（PerkinElmer社）を用いて蛍光染色したところ、ラクトースを含まないコントロールと比べて、シグナルが有意に弱くなった(図１Ａ）。このことは、神経幹細胞に対するガレクチン−１の結合がラクトースによって阻害されることを示す。

このラクトースによる結合阻害のメカニズムを探り、ガレクチン−１の結合因子を同定するため、C2S-GAL-1アフィニティカラムを用いて、ＳＶＺの抽出物からガレクチン−１結合因子を単離した。まず、組換えC2S-GAL-1をＮＨＳ活性化セファロースカラム（Amersham社）に固定し、容積２ｍｌのカラムに入れ、２ｍＭ ＥＤＴＡ及び４ｍＭの２−メルカプトエタノールを含むＰＢＳ（ＭＥ−ＰＢＳ）で平衡化した。一方、５匹の成体マウスから、脳を摘出後、眼下用メスを用いて実体顕微鏡下で、ＳＶＺの組織を切り出した。得られたＳＶＺ組織をソニケイターで破砕後、２０ｍＭ ラクトース（Wako社）を含むＭＥ−ＰＢＳでピペッティングし、遠心分離して上清を除去するという洗浄工程を３回行い、最後に、１％ Triton X-100を含むＭＥ−ＰＢＳで溶液状にし、ＭＥ−ＰＢＳで平衡化したカラムに注入した。１００ｍＭ α−メチルマンノピラノシド（Sigma社）を含むＭＥ−ＰＢＳでカラムを洗浄し、非特異的に結合した分子を洗い流した後、２０ｍＭ ラクトースまたは１００ｍＭ マンノース（Wako社）を含むＭＥ−ＰＢＳで溶出を試みた。溶出液中にインテグリンβ１が存在するかどうか調べるため、ウエスタン・ブロッティングを行い、１次抗体として抗インテグリン抗体（ＢＤ社マウス anti-integrin β1 IgG monoclonal、１００倍希釈）を、２次抗体としてＨＲＰ標識抗マウスIgG（Jackson社、５００倍希釈）を用いて、インテグリンβ１を検出したところ、ラクトースを含むＭＥ−ＰＢＳで、インテグリンβ１が溶出されたが、マンノースを含むＭＥ−ＰＢＳでは、インテグリンβ１は溶出されないことが明らかになった(図１Ｂ）。ラクトースはガレクチン−１が受容体に結合するのを阻害することと考え合わせると、少なくともインテグリンβ１は、神経幹細胞上のガレクチン−１の受容体であると考えられた。

そこで、上記マウス脳のビブラトーム切片に対し、C2S-Gal-1と抗インテグリン抗体（Pharmingen社、１０倍希釈）で二重染色をした。C2S-Gal-1の検出には、ＡＢＣキット（Vectastain社）及びＴＳＡ（PerkinElmer社）を用い、インテグリンの検出には、二次抗体として、抗マウスＩｇＧ抗体（Jackson社、５００倍希釈）を用いた。図１Ｃに示すように、インテグリンβ１を発現している細胞は、C2S-Gal-1に対する親和性を有していた。このことは、ガレクチン−１の受容体はインテグリンβ１であることを支持する。

＜実施例２＞抗インテグリンβ１抗体は、ガレクチン−１とインテグリンβ１の相互作用を阻害する
ＳＶＺにおいては、ＳＶＺアストロサイトの一部は神経幹細胞として機能し、中間分化段階のＴＡ細胞（transit amplifying cells）を経て、さらに細胞増殖の後、ＮＢ（神経芽細胞）へと分化することが知られている。この神経幹細胞は、比較的ゆっくり増殖することが知られているため、長期的にBrdUを取り込ませることにより、神経幹細胞を同定することができる。

一方、ガレクチン−１をマウス脳に投与すると、ＳＶＺにおける神経幹細胞の増殖が促進する（国際公開WO2005/026343公報）。そこで、ガレクチン−１とインテグリンβ１の相互作用の阻害が、神経幹細胞の増殖にどのような影響があるか調べた。

まず、組換えガレクチン−１（R&D Systems社）（２または１４μｇ）、抗ガレクチン中和抗体（キリンより供与、ウサギＩｇＧ、３０μｇ／ｍｌ）ガレクチンを認識しないコントロール抗体（キリンより供与、ウサギＩｇＧ、３０μｇ／ｍｌ）、抗インテグリンβ１抗体（ＢＤ社、ハムスターＩｇＭ、１０μｇ／ｍｌ）、インテグリンβ１を認識しないコントロール抗体（ＢＤ社、ハムスターＩｇＭ、１０μｇ／ｍｌ）を１ｍｇ／ｍｌのマウス血清アルブミン（Sigma社）を含む０．９％食塩水に溶解し、脳定位手術によってbregmaから後ろ０．２ｍｍ、外側０．８ｍｍ、深さ２．０ｍｍの位置にカニューレを挿入し、osmotic pumpを用いて、０．５μｌ／ｈの速度でガレクチン溶液を側脳室に７日間連続投与した（図２Ａ）。

これらの場合に、神経幹細胞の増殖がどうなるか、長期的にBrdUを取り込ませることにより、増殖細胞を可視化した。まず、ガレクチン−１(図２Ｂ，Ｃ）７日間の連続投与、またはガレクチン−１と抗インテグリンβ１抗体（図３Ａ，Ｂ）の７日間の連続投与の間、１ｍｇ／ｍｌのBrdUを含む水を、飲み水として与えた(図２Ａ）。投与の最後の日から１７日後と３７日後に(図２Ｂ，Ｃ）、または１７日後に（図３Ａ，Ｂ）マウスを解剖し、脳を取り出し、上述のようにＳＶＺの領域でビブラトーム切片を作成した。１次抗体として、ラット抗BrdUモノクローナル抗体（Abcam社rat monoclonal antibody[BU 1/75(ICR)]、１００倍希釈）、２次抗体として、ビオチン標識抗ラットＩｇＧ抗体（Jackson社、１００倍希釈）を用い、コンフォーカルレーザー顕微鏡（LSM-510, Zeiss）で観察した（図２Ｂ及び図３Ａ）。また、シグナルを定量化するために、ＳＶＺ領域で（bregma +0〜+1）７μｍごとに１μｍの断面を取り、BrdU陽性の核の数を数え、グラフに表した（図２Ｃ、図３Ｂ）。

図２Ｂ，Ｃに示すように、ガレクチン−１を投与したマウスでは、１７日後及び３７日後の両方において、無処理のコントロール・マウスより、ＳＶＺにおいて、有意にゆっくりと増殖する細胞の数が増えていた（１７日目 ｐ＝０．０１；３７日目 ｐ＜０．００１）。この結果より、ガレクチン−１の脳内への投与は、神経幹細胞の数を増やすことが示された。

また、図３Ａ，Ｂに示すように、抗インテグリンβ１抗体を投与したマウスでは、無処理のコントロール・マウスより、ＳＶＺにおいて、有意にゆっくりと増殖する細胞の数が減っていた（ｐ＜０．０５）。この結果より、抗インテグリンβ１抗体の脳内への投与は、神経幹細胞の数を減らすことが示された。

しかも、ガレクチン−１を投与しても、抗インテグリンβ１抗体を投与すると、ガレクチン−１の効果は生じず、有意にゆっくりと増殖する細胞の数が減っていた（ｐ＜０．０５）。この結果より、抗インテグリン抗体による神経幹細胞数の減少は、抗インテグリβ１抗体が、ガレクチン−１とインテグリンβ１の相互作用を阻害することによることが示された。

＜結論＞
これらの結果から、神経幹細胞または神経前駆細胞において、インテグリンβ１はガレクチン−１の受容体であり、ガレクチン−１がインテグリンβ１に結合することにより、インテグリンシグナル伝達系を活性化することが明らかになった。

インテグリンβ１がガレクチン−１の受容体であることを証明する実験例を示した図である。（Ａ）in vivoで、神経幹細胞に対するガレクチン−１の結合がラクトースによって阻害されることを示す実験例である。（Ｂ）C2S-GAL-1アフィニティカラムにインテグリンβ１が結合し、溶出されることを示す実験例である。（Ｃ）インテグリンβ１を発現している細胞は、ガレクチン−１に対する親和性を有することを示す実験例である。 実施例において、ガレクチン−１を脳に投与した場合、同時にBrdUを取り込ませた結果を示す図である。（Ａ）実施例における、BrdU及びガレクチン−１の投与方法を示す。（Ｂ）増殖細胞をin situで可視化した結果を示す。（Ｃ）BrdU陽性核の数を数えた結果を示す。 実施例において、ガレクチン−１と抗インテグリン抗体を脳に投与した場合、同時にBrdUを取り込ませた結果を示す図である。（Ａ）増殖細胞をin situで可視化した結果を示す。（Ｃ）BrdU陽性核の数を数えた結果を示す。

Claims (4)

1. 神経幹細胞または神経前駆細胞におけるインテグリンβ１を検出するための検出剤であって、
   ガレクチン−１を含有することを特徴とする検出剤。
2. 前記ガレクチン−１が、Ｃ２Ｓガレクチン−１であることを特徴とする請求項１に記載の検出剤。
3. 神経幹細胞または神経前駆細胞におけるインテグリンβ１（ヒト個体内のインテグリンβ１を除く）を検出するための検出方法であって、
   ガレクチン−１を前記インテグリンβ１に結合させる工程と、
   前記インテグリンβ１に結合した前記ガレクチン−１を検出する工程と、
   を含む検出方法。
4. 前記ガレクチン−１が、Ｃ２Ｓガレクチン−１であることを特徴とする請求項３に記載の検出方法。