JP4997432B2 - 神経幹細胞の増殖抑制剤 - Google Patents

Description

本発明は神経幹細胞の増殖抑制剤及び増殖抑制方法に関する。

中枢神経の損傷に、神経幹細胞を移植するという試みがなされてきた(例えば、非特許文献１〜３参照）。例えば、細胞キャリア（例えば、非特許文献４参照）のような人工的基質の有無を問わず、損傷した脳への注入（例えば、非特許文献５および６参照）や脊髄への注入（例えば、非特許文献７参照）など、局所に直接投与することも試みられてきた。

一方、遺伝子治療薬（例えば、非特許文献８参照）や神経栄養因子（例えば、非特許文献９参照）、そしてnitecaponeなどの薬剤の場合には、脳脊髄液（CSF）を介して投与がおこなわれてきた。このことを利用して、神経幹細胞も脳脊髄液に注入する試みがなされ、ラットの第四脳室内の脳脊髄液に神経幹細胞を注入すると、細胞自らが損傷部を認識し、損傷部に入り込んで修復に関与することが示された（例えば、非特許文献１０参照）。
Van-der-Kooy and Weiss, Science 287:1439-1441 (2000) Fuchsand Segre, Cell 100:143-55 (2000) Seaberg and van-der-Kooy J Neurosci. 22:1784-1793 (2002) Wu et al., Neurosci Lett. 312:173-176 (2001) Gage et al., Proc Natl Acad Sci U S A 92:11879-11883 (1995) Fricker et al., J Neurosci. 19:5990-6005 (1999) Akiyama et al., Exp Neurol. 167:27-39 (2001) Bajocchi et al., Nat Genet. 3:229-234 (1993) Araujo and Hilt Neuroscience 81:1099-110 (1997) Bai et al. J Neurosci Methods 124:181-187 (2003)

しかし、移植した神経幹細胞の増殖が１年以上も止まらないことが明らかになり、臨床応用のためには、神経幹細胞の増殖を止める方法の開発が必要とされている。

そこで、本発明は、神経幹細胞の増殖を抑制する方法および神経幹細胞の増殖抑制剤、並びにその利用方法を提供することを目的としてなされた。

発明者らは、ガレクチン−１が神経幹細胞の増殖に関わる因子の一つであることをすでに明らかにしている。そこで、ガレクチン−１の受容体の同定を行ってきた。

参考例に示すように、ガレクチン−１の神経幹細胞に対する接着は、ラクトースによって阻害された(図１Ａ）。また、ガレクチン−１を結合させたカラムに、側室脳下層（subventricular zone）に存在するＳＶＺ細胞の抽出物を結合させ、ラクトースで流出させると、インテグリンβ１が流出する(図１Ｂ）ことから、ガレクチン−１の受容体は、ＳＶＺ細胞が発現しているインテグリンβ１であることが明らかになった。実際、ＳＶＺ上で、ガレクチン−１とインテグリンβ１の発現部位が重なる(図１Ｃ）ことは、ガレクチン−１の受容体はインテグリンβ１であることを支持する。

このように、発明者らは、鋭意努力の結果、ガレクチン−１の受容体がインテグリンβ１であることを明らかにした。そこで、抗インテグリンβ１抗体を脳内に投与し、ガレクチン−１がインテグリンβ１に伝達するシグナルを阻害したところ、ＳＶＺ神経細胞の増殖が抑制されることが明らかとなり、本発明の完成に至った。

本発明にかかる神経幹細胞の増殖抑制剤は、ガレクチン−１とインテグリンβ１との結合を阻害する結合阻害組成物を含有する。また、本発明にかかる神経幹細胞の増殖抑制方法は、ガレクチン−１とインテグリンβ１との結合を阻害することを特徴とする。

本発明にかかる神経損傷治療剤は、神経幹細胞及び上記増殖抑制剤を含有する。この神経損傷治療剤は、脳脊髄液に投与されることが好ましい。また、本発明にかかる神経損傷治療方法は、神経幹細胞及び上記増殖抑制剤を投与することを特徴とし、特に、脳脊髄液に投与することが好ましい。

本発明にかかる抗神経腫瘍剤は、ガレクチン−１とインテグリンβ１との結合を阻害する結合阻害組成物を含有する。また、本発明にかかる抗神経腫瘍方法は、ガレクチン−１とインテグリンβ１との結合を阻害することを特徴とする。

ここで、結合阻害組成物とは、抗ガレクチン−１抗体または抗インテグリンβ１抗体であることが好ましい。

本発明によって、神経幹細胞の増殖を抑制する方法および神経幹細胞の増殖抑制剤を提供すること、並びにその利用方法を提供することが可能となった。

＝＝結合阻害組成物＝＝
参考実験に示すように、ガレクチン−１が神経幹細胞の増殖を促進する際、インテグリンβ１を受容体とし、神経幹細胞にシグナルを伝達する。そこで、ガレクチン−１に対する結合阻害活性を有する抗インテグリンβ１抗体などの、ガレクチン−１とインテグリンβ１との結合を阻害する結合阻害組成物を投与することにより、ガレクチン−１から神経幹細胞への増殖シグナルが遮断され、神経幹細胞の増殖が抑制される。

このときに利用できる結合阻害組成物は、ガレクチン−１とインテグリンβ１との結合を阻害する組成物であれば何でもよく、上記抗インテグリンβ１抗体以外に、例えば、インテグリンβ１に対する結合阻害活性を有する抗ガレクチン−１抗体、ＲＧＤペプチド、ラミニン、フィブロネクチン等が挙げられるが、これらに限定されない。

＝＝結合阻害組成物の投与方法＝＝
このように、ガレクチン−１とインテグリンβ１との結合を阻害する結合阻害組成物を神経幹細胞に作用させると、神経幹細胞の増殖を抑制することができる。

結合阻害組成物の投与方法は特に限定するものではないが、脳内の神経幹細胞の増殖を抑制する場合、結合阻害組成物を脳内、例えば側脳室内や脳挫傷組織内に局所投与してもよく、脳脊髄液（CSF）や血液中に投与して、目的の場所に運んでもよい。具体的には、osmotic pumpを用いて結合阻害組成物を投与する方法（より詳細には、日本生理学雑誌 Vol.63 No.10 pp261-270参照）などが知られている。

＝＝神経損傷治療への応用＝＝
上記のように、ラットの第四脳室内の脳脊髄液に神経幹細胞を注入すると、細胞自らが損傷部を認識し、損傷部に入り込んで修復に関与することが示されている（例えば、上記非特許文献１０参照）。しかしながら、移植した神経幹細胞の増殖は１年以上も止まらない。このような場合に、本発明に従って、ガレクチン−１とインテグリンβ１との結合を阻害する結合阻害組成物を投与することにより、神経幹細胞の増殖を抑制することができる。

例えば、神経損傷を生じたヒトまたはヒト以外の脊椎動物において、脳脊髄液（CSF）に神経幹細胞を投与することにより、神経幹細胞が損傷部分で増殖する。適当な程度増殖した後で、今度はガレクチン−１とインテグリンβ１との結合を阻害する結合阻害組成物を脳脊髄液（CSF）に投与することにより、神経幹細胞の増殖を抑制することができる。結合阻害組成物の投与時期は、目的によって決めればよく、神経幹細胞と同時に投与しても、神経幹細胞の投与後、しばらくして投与しても構わない。また、神経幹細胞や結合阻害組成物の投与方法も特に限定はされず、局所投与でも脳脊髄液内投与でも、また同じ場所に投与しても異なる場所に投与しても構わない。

＝＝がん治療への応用＝＝
悪性腫瘍とは、1)正常の分化能力を失った細胞が 2)自己複製能力を獲得し異常に増殖することにより、正常細胞を駆逐してしまう病態である。

白血病においては、少数の腫瘍性幹細胞(Cancer stem cells)が腫瘍組織の細胞の起源であり、細胞集団として腫瘍組織を維持していることが示されており、固形癌においても、同様の仮説が立てられている。しかし、固形癌に関しては、乳癌以外では、腫瘍性幹細胞の存在は知られていなかったが、最近、Sheilaらが、ＣＤ１３３陽性細胞が腫瘍性幹細胞の性質を有することを発見し（Sheila K. Singh et al., Nature 432, 396-401 (2004)）、脳腫瘍においても、腫瘍性幹細胞の存在が示された。このＣＤ１３３というマーカーは、本来、神経幹細胞のマーカーであるなど、神経腫瘍性幹細胞と神経幹細胞の幹細胞としての共通点は多く、正常幹細胞から腫瘍性幹細胞へ転換するとも考えられており、神経幹細胞の増殖を抑制できれば、神経腫瘍性幹細胞の増殖も抑制できると考えられる。また、神経前駆細胞（neural progenitor）においてRasとAktを同時に活性化すると、グリオブラストーマになることなどから、神経腫瘍性幹細胞の増殖を抑制できれば、神経腫瘍の増大を抑制することができるので、神経幹細胞の増殖抑制作用を有する結合阻害組成物は抗神経腫瘍剤として有用である。

なお、ここで、神経腫瘍とは、神経系細胞に由来して生じた腫瘍細胞から成る腫瘍のことをいい、ニューロブラストーマ、グリオブラストーマ等が挙げられるが、これらに限定されない。

＜参考例＞インテグリンβ１がガレクチン−１の受容体であることの証明
神経幹細胞に対するガレクチン−１の結合に糖が関与しているかどうかを調べるため、ビオチン化Ｃ２Ｓガレクチン−１（C2S-GAL-1-bio）（産総研より提供）を用いて、ラクトースの存在下で組織染色を行った。このC2S-GAL-1は、ガレクチン−１の２番目のシステインをセリンに置換した変異体（Hirabayashi & Kasai, J Biol Chem 266, 23648-23653 1991）で、正常な炭化水素結合能を有することが既に示されている（Purkrabkova et al. Biol Cell 95, 535-545, 2003）。

まず、生後５６日から１０５日目のマウスの脳を取り出し、４％ホルムアルデヒド溶液で潅流固定した後、４℃で一晩、同溶液で後固定し、５０μｍのビブラトーム切片を作成した。

この切片を、２０ｍＭラクトース存在下で、０．５％Triron X-100及び１％BSAを含有するＰＢＳに溶解させた１μｇ／ｍＬ C2S-GAL-1-bio溶液中で、４℃で一晩インキュベートし、ＡＢＣキット（Vectastain社）とＴＳＡ（PerkinElmer社）を用いて蛍光染色したところ、ラクトースを含まないコントロールと比べて、シグナルが有意に弱くなった(図１Ａ）。このことは、神経幹細胞に対するガレクチン−１の結合がラクトースによって阻害されることを示す。

このラクトースによる結合阻害のメカニズムを探り、ガレクチン−１の結合因子を同定するため、C2S-GAL-1アフィニティカラムを用いて、ＳＶＺの抽出物からガレクチン−１結合因子を単離した。まず、組換えC2S-GAL-1をＮＨＳ活性化セファロースカラム（Amersham社）に固定し、容積２ｍｌのカラムに入れ、２ｍＭ ＥＤＴＡ及び４ｍＭの２−メルカプトエタノールを含むＰＢＳ（ＭＥ−ＰＢＳ）で平衡化した。一方、５匹の成体マウスから、脳を摘出後、眼下用メスを用いて実体顕微鏡下で、ＳＶＺの組織を切り出した。得られたＳＶＺ組織をソニケイターで破砕後、２０ｍＭ ラクトース（Wako社）を含むＭＥ−ＰＢＳでピペッティングし、遠心分離して上清を除去するという洗浄工程を３回行い、最後に、１％ Triton X-100を含むＭＥ−ＰＢＳで溶液状にし、ＭＥ−ＰＢＳで平衡化したカラムに注入した。１００ｍＭ α−メチルマンノピラノシド（Sigma社）を含むＭＥ−ＰＢＳでカラムを洗浄し、非特異的に結合した分子を洗い流した後、２０ｍＭ ラクトースまたは１００ｍＭ マンノース（Wako社）を含むＭＥ−ＰＢＳで溶出を試みた。溶出液中にインテグリンβ１が存在するかどうか調べるため、ウエスタン・ブロッティングを行い、１次抗体として抗インテグリン抗体（ＢＤ社マウス anti-integrinβ1 IgG monoclonal、１００倍希釈）を、２次抗体としてＨＲＰ標識抗マウスIgG（Jackson社、５００倍希釈）を用いて、インテグリンβ１を検出したところ、ラクトースを含むＭＥ−ＰＢＳで、インテグリンβ１が溶出されたが、マンノースを含むＭＥ−ＰＢＳでは、インテグリンβ１は溶出されないことが明らかになった(図１Ｂ）。ラクトースはガレクチン−１が受容体に結合するのを阻害することと考え合わせると、少なくともインテグリンβ１は、神経幹細胞上のガレクチン−１の受容体であると考えられた。

そこで、上記マウス脳のビブラトーム切片に対し、C2S-GAL-1と抗インテグリン抗体（Pharmingen社、１０倍希釈）で二重染色をした。C2S-GAL-1の検出には、ＡＢＣキット（Vectastain社）及びＴＳＡ（PerkinElmer社）を用い、インテグリンの検出には、二次抗体として、抗マウスＩｇＧ抗体（Jackson社、５００倍希釈）を用いた。図１Ｃに示すように、インテグリンβ１を発現している細胞は、C2S-GAL-1に対する親和性を有していた。このことは、ガレクチン−１の受容体はインテグリンβ１であることを支持する。

＜実施例＞
ＳＶＺにおいては、ＳＶＺアストロサイトの一部は神経幹細胞として機能し、中間分化段階のＴＡ細胞（transit amplifying cells）を経て、さらに細胞増殖の後、ＮＢ（神経芽細胞）へと分化することが知られている。この神経幹細胞は、比較的ゆっくり増殖することが知られているため、長期的にBrdUを取り込ませることにより、神経幹細胞を同定することができる。

一方、ガレクチン−１をマウス脳に投与すると、ＳＶＺにおける神経幹細胞の増殖が促進する。そこで、ガレクチン−１とインテグリンβ１の相互作用の阻害が、神経幹細胞の増殖にどのような影響があるか調べた。

まず、組換えガレクチン−１（２または１４μｇ）、抗ガレクチン中和抗体（キリンより供与、ウサギＩｇＧ、３０μｇ／ｍｌ）ガレクチンを認識しないコントロール抗体（キリンより供与、ウサギＩｇＧ、３０μｇ／ｍｌ）、抗インテグリンβ１抗体（ＢＤ社、ハムスターＩｇＭ、１０μｇ／ｍｌ）、インテグリンβ１を認識しないコントロール抗体（ＢＤ社、ハムスターＩｇＭ、１０μｇ／ｍｌ）を１ｍｇ／ｍｌのマウス血清アルブミン（Sigma社）を含む０．９％食塩水に溶解し、脳定位手術によってbregmaから後ろ０．２ｍｍ、外側０．８ｍｍ、深さ２．０ｍｍの位置にカニューレを挿入し、osmotic pumpを用いて、０．５μｌ／ｈの速度でガレクチン溶液を側脳室に７日間連続投与した（図２Ａ）。

これらの場合に、神経幹細胞の増殖がどうなるか、長期的にBrdUを取り込ませることにより、増殖細胞を可視化した。まず、ガレクチン−１(図２Ｂ，Ｃ）７日間の連続投与、またはガレクチン−１と抗インテグリン抗体（図３Ａ，Ｂ）の７日間の連続投与の間、１ｍｇ／ｍｌのBrdUを含む水を、飲み水として与えた(図２Ａ）。投与の最後の日から１７日後と３７日後に(図２Ｂ，Ｃ）、または１７日後に（図３Ａ，Ｂ）マウスを解剖し、脳を取り出し、上述のようにＳＶＺの領域でビブラトーム切片を作成した。１次抗体として、ラット抗BrdUモノクローナル抗体（Abcam社rat monoclonal antibody[BU 1/75(ICR)]、１００倍希釈）、２次抗体として、ビオチン標識抗ラットＩｇＧ抗体（Jackson社、１００倍希釈）を用い、コンフォーカルレーザー顕微鏡（LSM-510, Zeiss）で観察した（図２Ｂ及び図３Ａ）。また、シグナルを定量化するために、ＳＶＺ領域で（bregma +0〜+1）７μｍごとに１μｍの断面を取り、BrdＵ陽性の核の数を数え、グラフに表した（図２Ｃ、図３Ｂ）。

図２Ｂ，Ｃに示すように、ガレクチン−１を投与したマウスでは、１７日後及び３７日後の両方において、無処理のコントロール・マウスより、ＳＶＺにおいて、有意にゆっくりと増殖する細胞の数が増えていた（１７日目 ｐ＝０．０１；３７日目 ｐ＜０．００１）。この結果より、ガレクチン−１の脳内への投与は、神経幹細胞の数を増やすことが示された。

また、図３Ａ，Ｂに示すように、抗インテグリン抗体を投与したマウスでは、無処理のコントロール・マウスより、ＳＶＺにおいて、有意にゆっくりと増殖する細胞の数が減っていた（ｐ＜０．０５）。この結果より、抗インテグリン抗体の脳内への投与は、神経幹細胞の数を減らすことが示された。

しかも、ガレクチン−１を投与しても、抗インテグリン抗体を投与すると、ガレクチン−１の効果は生じず、有意にゆっくりと増殖する細胞の数が減っていた（ｐ＜０．０５）。この結果より、抗インテグリン抗体による神経幹細胞数の減少は、抗インテグリン抗体が、ガレクチン−１とインテグリンの相互作用を阻害することによることが示された。

これらの結果から、ガレクチン−１とインテグリンの相互作用を阻害することによって、神経幹細胞の増殖を抑制することができることが明らかになった。

インテグリンβ１がガレクチン−１の受容体であることを証明する実験例を示した図である。（Ａ）in vivoで、神経幹細胞に対するガレクチン−１の結合がラクトースによって阻害されることを示す実験例である。（Ｂ）C2S-GAL-1アフィニティカラムにインテグリンβ１が結合し、溶出されることを示す実験例である。（Ｃ）インテグリンβ１を発現している細胞は、ガレクチン−１に対する親和性を有することを示す実験例である。 実施例において、ガレクチン−１を脳に投与した場合、同時にBrdUを取り込ませた結果を示す図である。（Ａ）実施例における、ＢｒｄＵ及びガレクチン−１の投与方法を示す。（Ｂ）増殖細胞をin situで可視化した結果を示す。（Ｃ）BrdＵ陽性核の数を数えた結果を示す。 実施例において、ガレクチン−１と抗インテグリン抗体を脳に投与した場合、同時にBrdUを取り込ませた結果を示す図である。（Ａ）増殖細胞をin situで可視化した結果を示す。（Ｃ）BrdＵ陽性核の数を数えた結果を示す。

Claims (4)

1. 抗インテグリンβ１抗体を含有する、神経幹細胞の増殖抑制剤。
2. 請求項１に記載の増殖抑制剤を含有する神経損傷治療剤であって、神経損傷を有し、神経幹細胞が投与される脊椎動物に投与され、前記投与された神経幹細胞の増殖を抑制する、神経損傷治療剤。
3. 脳脊髄液に投与されることを特徴とする、請求項２に記載の神経損傷治療剤。
4. 抗インテグリンβ１抗体を含有する、抗神経腫瘍剤。