JP4918627B2 - Sample extract that suppresses false positive reaction - Google Patents
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Description
本発明は、鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、鼻かみ液、咽頭拭い液などの検体中のウイルスをイムノクロマト法にて検出するウイルス測定用イムノクロマト試薬に関し、特定の蛋白成分を含む検体抽出液を用いることによって、偽陽性反応を抑制する技術に関する。 The present invention relates to an immunochromatographic reagent for measuring a virus such as a nasal wipe, nasal suction liquid, nasal discharge, pharyngeal wiping liquid, etc. by an immunochromatography method, and uses a sample extract containing a specific protein component. The present invention relates to a technique for suppressing false positive reactions.
検体中のウイルスを測定する方法としては、分離培養法やＰＣＲ法が知られている。前述の方法は、操作が煩雑で測定に時間がかかることから、迅速診断には適していない。一方、迅速診断に一定の役割を果たしているのが簡易検査キットであり、迅速性、簡便性に優れているため、近年急速に広まってきた。
簡易検査法としては、ニトロセルロース等のメンブレンを用いたイムノクロマト法が知られており、被検出物に特異的に結合するメンブレン固相物質、被検出物、被検出物に特異的に結合する標識物の複合体をメンブレン上に形成させて被検出物を測定する方法である。標識物としては、被検出物と特異的に結合する抗体にアルカリフォスファターゼのような酵素、金コロイドのような金属コロイド及び着色ラテックス粒子が一般的であり、特に金コロイド粒子や着色ラテックス粒子を用いる場合が多い。着色ラテックス粒子の場合、色、粒子径、官能基等、様々な種類のものが製造可能であり、選択性に優れている。また複数の色調のラテックス粒子を用いて、複数の被検出物を検出する方法も提案されている。
これらの簡易検査法では、被検出物と被検出物に対する抗体との特異的な結合以外で生じる偽陽性反応が検出されることがある。偽陽性反応の原因の一つとして、被検検体に含まれるムチンのような粘性物質やＩｇＡ、ＩｇＭといった免疫グロブリンなどが標識物の凝集を促進し、その凝集塊がメンブレン固相物質に非特異的にトラップされることが考えられる。この様な問題を解決するために、例えば、塩基性アミノ酸、無機塩類、及び界面活性剤からなる群より選択される少なくとも２種類の化合物を含むフロースルー式検査法用検体浮遊液組成物を用いる方法（特許文献１）、免疫クロマトグラフィーによるインフルエンザウイルスの検査用検体の前処理液であって、少なくとも非イオン性界面活性剤及びアルカリ金属イオンのみ、このアルカリ金属イオンを少なくとも０．３Ｍ含むことを特徴とする検体前処理液を用いる方法（特許文献２）、及び、イオン性界面活性剤を含む、免疫測定に供する検体浮遊液調製用媒体組成物を用いる方法（特許文献３）、動物由来免疫グロブリン等を添加する方法等（特許文献４）が提案されている。しかし、これらの方法は、偽陽性の発生率を減少させることはできたが、完全に除去するには至っていない。ウイルスの感染を測定する際にこのような偽陽性反応が生じてしまうと、誤った処置が施されてしまう可能性があり、偽陽性を完全に抑制することは簡易検査法において極めて重要な課題といえる。As a method for measuring a virus in a specimen, a separation culture method and a PCR method are known. The above-described method is not suitable for rapid diagnosis because the operation is complicated and measurement takes time. On the other hand, simple test kits play a certain role in rapid diagnosis, and have rapidly spread in recent years because they are excellent in rapidity and simplicity.
As a simple test method, an immunochromatography method using a membrane such as nitrocellulose is known, a membrane solid phase substance that specifically binds to a detection object, a detection object, and a label that specifically binds to the detection object. In this method, a complex of objects is formed on a membrane and an object to be detected is measured. As the labeling substance, an antibody such as alkaline phosphatase, a metal colloid such as a gold colloid, and a colored latex particle are generally used as an antibody that specifically binds to a detection target, and in particular, a gold colloid particle or a colored latex particle is used. There are many cases. In the case of colored latex particles, various types such as color, particle diameter, functional group and the like can be produced, and the selectivity is excellent. There has also been proposed a method for detecting a plurality of objects to be detected using latex particles of a plurality of colors.
In these simple test methods, a false positive reaction that occurs other than specific binding between an object to be detected and an antibody against the object to be detected may be detected. As one of the causes of false positive reaction, viscous substances such as mucin and immunoglobulins such as IgA and IgM contained in the test sample promote the aggregation of the label, and the aggregate is non-specific to the membrane solid phase substance. May be trapped. In order to solve such a problem, for example, a flow-through test specimen suspension composition containing at least two compounds selected from the group consisting of basic amino acids, inorganic salts, and surfactants is used. A method (Patent Document 1), a pretreatment liquid for a specimen for inspection of influenza virus by immunochromatography, comprising at least 0.3M of this alkali metal ion, at least a nonionic surfactant and an alkali metal ion alone A method using a specimen pretreatment liquid as a feature (Patent Document 2), a method using a medium composition for preparing a specimen suspension for immunoassay containing an ionic surfactant (Patent Document 3), animal-derived immunity A method of adding globulin and the like (Patent Document 4) has been proposed. However, although these methods have been able to reduce the incidence of false positives, they have not been completely eliminated. If such a false positive reaction occurs when measuring the infection of a virus, there is a possibility that an erroneous treatment will be performed, and it is extremely important to suppress false positives completely in a simple test method It can be said.
本発明は、鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、鼻かみ液、咽頭拭い液などの検体中のウイルスをイムノクロマト法にて検出するウイルス測定用イムノクロマト試薬に関し、従来の方法で抑制しきれなかった偽陽性反応を簡便で安価に抑制できる検体抽出液を提供することにある。 The present invention relates to an immunochromatographic reagent for virus measurement for detecting a virus in a specimen such as a nasal wipe, nasal suction liquid, nasal discharge, pharyngeal wiping liquid, etc. by immunochromatography, and a false positive that could not be suppressed by conventional methods. An object of the present invention is to provide a sample extract that can easily and inexpensively suppress the reaction.
本発明者は、鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、鼻かみ液、咽頭拭い液などの鼻咽頭由来検体における偽陽性反応を抑制する方法を鋭意検討した結果、偽陽性原因成分と抗検出対象物抗体との親和性を抑制する成分を見出し、これを検体抽出液に添加することによって、これまで検出されていた偽陽性反応を抑制できることを見出し本発明を完成した。
すなわち本発明は、以下の構成を有する。
〔１〕抗検出対象物抗体を用いて検出対象物を検出するイムノクロマト法に用いられる検体抽出液であって、以下の偽陽性反応抑制剤を含む、検体抽出液。
偽陽性反応抑制剤；
以下の１）から３）の性質を有する偽陽性反応原因成分と抗検出対象物抗体との親和性を抑制する成分を含む偽陽性反応抑制剤
１）鼻咽頭由来検体中に含まれる
２）検出対象物以外である
３）抗検出対象物抗体と親和性を有する
〔２〕抗検出対象物抗体が、抗インフルエンザウイルス抗体である前記〔１〕に記載の検体抽出液。
〔３〕偽陽性反応原因成分が、非還元条件下、ポリアクリルアミドゲル（４〜２０％）で電気泳動に供した場合に２６０ｋＤａ付近及び／又は５２〜７２ｋＤａの間にバンドが現れる成分である前記〔１〕または〔２〕に記載の検体抽出液。
〔４〕偽陽性反応抑制剤の濃度が、１％〜１０％である前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の検体抽出液。
〔５〕偽陽性反応抑制剤が、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTM及びＳｍａｒｔＢｌｏｃｋTMから選ばれる１種以上である前記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の検体抽出液。
〔６〕抗検出対象物抗体を用いて検体中の検出対象物を検出するイムノクロマト法であって、以下の偽陽性反応抑制剤を含む検体抽出液と検体を接触させて検出対象物を抽出する工程と、
抽出された検出対象物と抗検出対象物抗体固定化ストリップを接触させて検出対象物を検出する工程と、を含むイムノクロマト法。
偽陽性反応抑制剤；
以下の１）から３）の性質を有する偽陽性反応原因成分と抗検出対象物抗体との親和性を抑制する成分を含む偽陽性反応抑制剤
１）鼻咽頭由来検体中に含まれる
２）検出対象物以外である
３）抗検出対象物抗体と親和性を有する
〔７〕抗検出対象物抗体が、抗インフルエンザウイルス抗体である前記〔６〕に記載の方法。
〔８〕偽陽性反応原因成分が、非還元条件下、ポリアクリルアミドゲル（４〜２０％）で電気泳動に供した場合に２６０ｋＤａ付近及び／又は５２〜７２ｋＤａの間にバンドが現れる成分である前記〔６〕または〔７〕に記載の方法。
〔９〕検体抽出液中の偽陽性反応抑制剤の濃度が、１％〜１０％である前記〔６〕〜〔８〕のいずれかに記載の方法。
〔１０〕偽陽性反応抑制剤が、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTM及びＳｍａｒｔＢｌｏｃｋTMから選ばれる１種以上である前記〔６〕〜〔９〕のいずれかに記載の方法。
〔１１〕以下の構成を含む検出対象物測定用イムノクロマト試薬。
（１）抗検出対象物抗体固定化ストリップ
（２）前記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の検体抽出液
〔１２〕抗検出対象物抗体固定化ストリップが、以下の構成を含む前記〔１１〕に記載のイムノクロマト試薬。
（ａ）標識された抗検出対象物抗体が塗布されたコンジュゲートパッド
（ｂ）抗検出対象物抗体固定化膜
〔１３〕検体の抽出方法であって、鼻咽頭由来の検体と前記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の検体抽出液を接触させる工程を含む、検体の抽出方法。
〔１４〕以下の工程を有するイムノクロマト法の偽陽性反応抑制剤選択方法。
（Ａ）鼻咽頭由来検体のうちイムノクロマト法において偽陽性反応を示す検体に偽陽性反応抑制剤候補物質を添加して混合し、当該混合物を非還元条件下、ポリアクリルアミドゲル（４〜２０％）で電気泳動に供して分離する工程
（Ｂ）工程（Ａ）において分離されたバンド群と、偽陽性反応を示す検体もしくは偽陽性反応抑制剤候補物質のバンド群とを比較し、（i）〜（iii）のいずれかのバンドが消滅もしくは薄くなっているかどうかを判定する工程
（i）偽陽性反応を示す検体のバンド群のうち、２６０ｋＤａ付近に現れるバンドのうちいずれか一以上
（ii）偽陽性反応を示す検体のバンド群のうち、５２〜７２ｋＤａの間に現れるバンドのうちいずれか一以上
（iii）偽陽性反応抑制剤候補物質のバンドのうちいずれか一以上
（Ｃ）工程（Ｂ）においていずれか一以上のバンドが消滅もしくは薄くなっている場合に、前記偽陽性反応抑制剤候補物質を偽陽性反応抑制物質であると判断する工程
As a result of intensive investigations on methods for suppressing false positive reactions in nasopharynx-derived specimens such as nasal wipes, nasal aspirates, nasal swabs, and pharyngeal wipes, the present inventors have found that false positive causative components and anti-detection target antibodies As a result, the present inventors have found that a false positive reaction that has been detected so far can be suppressed by adding a component that suppresses the affinity to the sample extract and adding it to the specimen extract.
That is, the present invention has the following configuration.
[1] A sample extract used in an immunochromatography method for detecting a detection target using an anti-detection target antibody, the sample extract containing the following false positive reaction inhibitor.
False positive reaction inhibitor;
A false positive reaction inhibitor containing a component that suppresses the affinity between a false positive reaction-causing component having the following properties 1) to 3) and an anti-detection target antibody 1) 2) Detected in a nasopharynx-derived specimen [2] The specimen extract according to [1], wherein the anti-detection target antibody is an anti-influenza virus antibody.
[3] The false positive reaction cause component is a component in which a band appears in the vicinity of 260 kDa and / or between 52 and 72 kDa when subjected to electrophoresis on a polyacrylamide gel (4 to 20%) under non-reducing conditions. The specimen extract according to [1] or [2].
[4] The specimen extract according to any one of [1] to [3], wherein the concentration of the false positive reaction inhibitor is 1% to 10%.
[5] The specimen extract according to any one of [1] to [4], wherein the false positive reaction inhibitor is at least one selected from StartingBlock ™ and SmartBlock ™ .
[6] An immunochromatography method for detecting a detection target in a sample using an anti-detection target antibody, wherein the detection target is extracted by contacting the sample with a sample extract containing the following false positive reaction inhibitor. Process,
An immunochromatography method, comprising: contacting the extracted detection object with an anti-detection object antibody-immobilized strip to detect the detection object.
False positive reaction inhibitor;
A false positive reaction inhibitor containing a component that suppresses the affinity between a false positive reaction-causing component having the following properties 1) to 3) and an anti-detection target antibody 1) 2) Detected in a nasopharynx-derived specimen [7] The method according to [6] above, wherein the anti-detection target antibody is an anti-influenza virus antibody.
[8] The false positive reaction-causing component is a component in which a band appears in the vicinity of 260 kDa and / or between 52 and 72 kDa when subjected to electrophoresis on a polyacrylamide gel (4 to 20%) under non-reducing conditions. The method according to [6] or [7].
[9] The method according to any one of [6] to [8], wherein the concentration of the false positive reaction inhibitor in the sample extract is 1% to 10%.
[10] The method according to any one of [6] to [9], wherein the false positive reaction inhibitor is at least one selected from StartingBlock ™ and SmartBlock ™ .
[11] An immunochromatographic reagent for measuring an object to be detected, comprising the following configuration.
(1) Anti-detection object antibody immobilization strip (2) The specimen extract [12] anti-detection object antibody immobilization strip according to any one of [1] to [5] [11] The immunochromatographic reagent according to [11].
(A) Conjugate pad coated with labeled anti-detection target antibody (b) Anti-detection target antibody-immobilized membrane [13] A method for extracting a specimen, wherein the specimen from the nasopharynx and the above [1] A method for extracting a specimen, comprising a step of bringing the specimen extract according to any one of [5] into contact.
[14] A method for selecting a false positive reaction inhibitor in an immunochromatography method comprising the following steps.
(A) A false positive reaction inhibitor candidate substance is added to and mixed with a specimen showing false positive reaction in immunochromatography among nasopharyngeal specimens, and the mixture is polyacrylamide gel (4 to 20%) under non-reducing conditions. (B) The band group separated in the step (A) is separated from the band group of the specimen showing a false positive reaction or a false positive reaction inhibitor candidate substance, (Iii) a step of determining whether any one of the bands is extinguished or thinned (i) one or more of the bands appearing in the vicinity of 260 kDa among the group of specimens showing a false positive reaction (ii) false (C) any one or more of the bands of the false positive reaction inhibitor candidate substance (C) The step of determining that the false positive reaction inhibitor candidate substance is a false positive reaction inhibitor when any one or more of the bands in FIG.
本発明の検体抽出液によれば、カラーラテックス又は金コロイドなどの粒子を標識物として使用し、検体中の被測定物を検出するイムノクロマト法において、偽陽性反応を回避した精度の高いテストストリップを提供できる。また、偽陽性反応による誤った臨床診断を回避できる。 According to the sample extract of the present invention, a highly accurate test strip that avoids a false positive reaction in an immunochromatography method using particles such as color latex or gold colloid as a labeling substance and detecting an object to be measured in the sample. Can be provided. In addition, an erroneous clinical diagnosis due to a false positive reaction can be avoided.
（検体）
本発明が適用可能な検体は、ウイルスの存在が疑われる鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、鼻かみ液、咽頭拭い液等の鼻咽頭由来検体（以下、鼻咽頭由来検体という）であり、このうち鼻腔拭い液、鼻腔吸引液が特に好ましい。(Sample)
Specimens to which the present invention can be applied are nasopharynx-derived specimens (hereinafter referred to as nasopharyngeal specimens) such as nasal wipes, nasal aspirates, nasal swabs, and pharyngeal swabs suspected of having viruses. Nasal wipes and nasal aspirates are particularly preferred.
（検出対象物）
本発明における検出対象物は、上記検体に含まれる可能性のあるウイルスや菌体全般であり、例えばインフルエンザウイルス、アデノウイルス、ＲＳウイルスなどがあるが、特にインフルエンザウイルスが好ましい。インフルエンザウイルスとしてはＡ型インフルエンザウイルスおよびＢ型インフルエンザウイルス等が挙げられる。(Detection target)
The detection target in the present invention is a virus or a whole cell that may be contained in the specimen, and examples include influenza virus, adenovirus, and RS virus. In particular, influenza virus is preferable. Influenza viruses include influenza A virus and influenza B virus.
（検体抽出液）
本発明の検体抽出液は、以下の偽陽性反応抑制剤を含むものであればいずれのものであってもよい。
偽陽性反応抑制；
以下の１）から３）の性質を有する偽陽性反応原因成分と抗検出対象物抗体との親和性を抑制する成分を含む偽陽性反応抑制剤
１）鼻咽頭由来検体中に含まれる
２）検出対象物以外である
３）抗検出対象物抗体と親和性を有する
ここで、偽陽性反応原因成分としては、イムノクロマト法において偽陽性反応を示す検体を非還元条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した場合に分子量が２６０ＫＤａ付近および／又は５２〜７２ＫＤａにバンドが現れる成分が挙げられる。本発明者らは、鼻咽頭由来検体のうちイムノクロマト法において偽陽性反応を示す検体の共通成分について分析し、偽陽性原因成分が上記特定のバンドの成分であることをつきとめた。ここで、偽陽性反応原因成分と抗検出対象物抗体との親和性を抑制する成分であるか否か、すなわち、本発明の偽陽性反応抑制剤かどうかは、以下のように判断することができる。
（１）偽陽性反応抑制候補物質を偽陽性原因成分を含む検体と混合したものをイムノクロマト法で検出した場合に、偽陽性反応を示さない。
（２）偽陽性反応抑制候補物質を、偽陽性原因成分を含む検体と混合した場合に、偽陽性反応抑制剤の有効成分が変化する。
（３）偽陽性反応抑制候補物質を、偽陽性原因成分を含む検体と混合した場合に、偽陽性原因成分が変化する。(Sample extract)
The sample extract of the present invention may be any as long as it contains the following false positive reaction inhibitor.
Suppression of false positive reaction;
A false positive reaction inhibitor containing a component that suppresses the affinity between a false positive reaction-causing component having the following properties 1) to 3) and an anti-detection target antibody 1) 2) Detected in a nasopharynx-derived specimen 3) Affinity with anti-detection target antibody other than the target. Here, as a false-positive reaction-causing component, a sample showing a false-positive reaction in immunochromatography is subjected to SDS-PAGE under non-reducing conditions. In which a band appears in the vicinity of 260 KDa and / or 52 to 72 KDa. The present inventors analyzed common components of samples showing false positive reaction in immunochromatography among nasopharyngeal samples, and found that the false positive cause component is a component of the specific band. Here, whether or not it is a component that suppresses the affinity between the false positive reaction-causing component and the anti-detection target antibody, that is, whether it is a false positive reaction inhibitor of the present invention, can be determined as follows. it can.
(1) No false positive reaction is shown when a substance obtained by mixing a false positive reaction suppression candidate substance with a specimen containing a false positive cause component is detected by immunochromatography.
(2) When a false positive reaction suppression candidate substance is mixed with a specimen containing a false positive cause component, the active ingredient of the false positive reaction inhibitor changes.
(3) When a false positive reaction suppression candidate substance is mixed with a specimen containing a false positive cause component, the false positive cause component changes.
上記（２）の変化は、例えば、偽陽性反応抑制剤の有効成分の量が減少することにより確認できる。量の減少は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で当該有効成分に対応するバンドの発色が薄くなること等で確認できる。すなわち、当該有効成分が有効に働き偽陽性反応を抑制することで消費されるからである。また、偽陽性原因成分と結合するなどして複合体を形成したり、化学変化をした場合も、当該有効成分の量の減少として捉えることができる。また、上記（３）の変化は、例えば、偽陽性原因成分の量が減少することで確認できる。量の減少は、上記（２）と同様に確認できる。
したがって、本発明の偽陽性反応抑制剤の選択は、例えば、次のステップ（Ａ）〜（Ｃ）により行うことができる。
（Ａ）鼻咽頭由来検体のうちイムノクロマト法において偽陽性反応を示す検体に偽陽性反応抑制剤候補物質を添加して混合し、当該混合物を非還元条件下、ポリアクリルアミドゲル（４〜２０％）で電気泳動に供して分離する工程
（Ｂ）工程（Ａ）において分離されたバンド群と、偽陽性反応を示す検体もしくは偽陽性反応抑制剤候補物質のバンド群とを比較し、（i）〜（iii）のいずれかのバンドが消滅もしくは薄くなっているかどうかを判定する工程
（i）偽陽性反応を示す検体のバンド群のうち、２６０ｋＤａ付近に現れるバンドのいずれか一以上
（ii）偽陽性反応を示す検体のバンド群のうち、５２〜７２ｋＤａの間に現れるバンドのうちいずれか一以上
（iii）偽陽性反応抑制剤候補物質のバンドのうちいずれか一以上
（Ｃ）工程（Ｂ）においていずれか一以上のバンドが消滅もしくは薄くなっている場合に、偽陽性反応抑制剤候補物質を偽陽性反応抑制物質であると判断する工程The change of (2) can be confirmed, for example, by a decrease in the amount of the active ingredient of the false positive reaction inhibitor. The decrease in the amount can be confirmed by the fact that the color development of the band corresponding to the active ingredient becomes light on SDS-PAGE. That is, the active ingredient works effectively and is consumed by suppressing the false positive reaction. In addition, when a complex is formed by combining with a false positive causative component or a chemical change is made, it can be regarded as a decrease in the amount of the effective component. Moreover, the change of said (3) can be confirmed by the amount of false positive cause components reducing, for example. The decrease in the amount can be confirmed in the same manner as (2) above.
Therefore, selection of the false positive reaction inhibitor of the present invention can be performed, for example, by the following steps (A) to (C).
(A) A false positive reaction inhibitor candidate substance is added to and mixed with a specimen showing false positive reaction in immunochromatography among nasopharyngeal specimens, and the mixture is polyacrylamide gel (4 to 20%) under non-reducing conditions. (B) The band group separated in the step (A) is separated from the band group of the specimen showing a false positive reaction or a false positive reaction inhibitor candidate substance, (Iii) A step of determining whether any one of the bands is extinguished or thinned (i) One or more of the bands appearing in the vicinity of 260 kDa among the group of specimens showing false positive reaction (ii) False positive (Iii) any one or more of the bands of false positive reaction inhibitor candidate substances (C) in the step (B) ) In the case where any one or more of the bands disappears or becomes thin, the false positive reaction inhibitor candidate substance is judged to be a false positive reaction inhibitor substance.
本発明の検体抽出液は、偽陽性反応抑制剤の効果を維持できるものであれば他の成分を含むことができ、例えば緩衝液が挙げられる。また、本発明の検体抽出液は、偽陽性原因成分に対してなんらかの作用をする偽陽性反応抑制剤を含むものであるが、当該偽陽性反応抑制剤は、イムノクロマト試薬に用いられるテストストリップにあらかじめ固定化しておくこともできる。
検体抽出液中の偽陽性反応抑制剤の濃度は、１％〜１０％が好ましく、２．５〜８％がさらに好ましく、４．５〜５．５％がもっとも好ましい。尚、後述の実施例に記載のＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTM（ＰＢＳ）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ、およびＳｍａｒｔＢｌｏｃｋTMの好ましい濃度もこれと同じである。The sample extract of the present invention can contain other components as long as the effect of the false positive reaction inhibitor can be maintained, and examples thereof include a buffer solution. In addition, the specimen extract of the present invention contains a false positive reaction inhibitor that has some action on the false positive causative component, and the false positive reaction inhibitor is immobilized in advance on a test strip used for an immunochromatographic reagent. You can also keep it.
The concentration of the false positive reaction inhibitor in the sample extract is preferably 1% to 10%, more preferably 2.5 to 8%, and most preferably 4.5 to 5.5%. Incidentally, the same as it is also preferred concentration of StartingBlock TM (PBS) Blocking Buffer, and SmartBlock TM described in the Examples below.
（緩衝液の種類）
本発明の検体抽出液に用いられる緩衝液の種類としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液など通常使用される緩衝液をあげることができる。緩衝液のｐＨはｐＨ６．０〜１０．０の範囲が好ましく、ｐＨ８．０〜９．０がさらに好ましい。ｐＨ８．０〜９．０の緩衝液としては、トリス緩衝液が特に好ましい。前記緩衝液には、さらにＮａＣｌ、ＫＣｌなどの塩類、アルギニンなどの塩基性アミノ酸、ポリエチレングリコールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００）等の非イオン性界面活性剤、スクロースなどの安定化剤や保存剤、プロクリン（登録商標）などの防腐剤等を含んでもよい。塩類は、ＮａＣｌなどのようにイオン強度の調整のために含ませるもののほか、水酸化ナトリウムなど緩衝液のｐＨを調整する工程で存在するようになるものも含まれる。(Buffer type)
Examples of the buffer used in the sample extract of the present invention include commonly used buffers such as phosphate buffer, Tris buffer, and Good's buffer. The pH of the buffer solution is preferably in the range of pH 6.0 to 10.0, more preferably pH 8.0 to 9.0. As the buffer solution having a pH of 8.0 to 9.0, a Tris buffer solution is particularly preferable. In the buffer, nonionic surfactants such as salts such as NaCl and KCl, basic amino acids such as arginine, polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether (for example, Triton (registered trademark) X-100), etc. An agent, a stabilizer such as sucrose, a preservative, and a preservative such as Procrine (registered trademark) may be included. The salts include those that are present in the step of adjusting the pH of the buffer solution, such as sodium hydroxide, in addition to those that are included for adjusting the ionic strength, such as NaCl.
（検体抽出方法）
本発明の検体を抽出する方法は、鼻咽頭由来の検体と本発明の前記検体抽出液を接触させることにより行われる。例えば、検体が鼻腔吸引検体の場合は、鼻腔吸引液に綿棒等を浸し、検体を浸み込ませた綿棒を本発明の検体抽出液に入れて検体を溶解させることで抽出することができる。また、検体が鼻腔拭い検体の場合は、綿棒で鼻腔を拭い、検体を浸み込ませた綿棒を本発明の検体抽出液に入れて検体を溶解させることで抽出することができる。(Sample extraction method)
The method for extracting a sample of the present invention is performed by bringing a sample derived from the nasopharynx into contact with the sample extract of the present invention. For example, when the sample is a nasal aspiration sample, the sample can be extracted by immersing a cotton swab or the like in a nasal aspiration solution and placing the swab soaked in the sample into the sample extract of the present invention to dissolve the sample. When the sample is a nasal wipe, the sample can be extracted by wiping the nasal cavity with a cotton swab and putting the swab soaked with the sample into the sample extract of the present invention to dissolve the sample.
（検出対象物を検出するイムノクロマト法）
本発明の検出対象物をイムノクロマトグラフィーにより検出する方法（イムノクロマト法）は、検出対象物に対する抗体（以下、抗検出対象物抗体ということがある。）を用いた免疫学的検出方法であれば特に限定されないが、抗検出対象物抗体と標識抗検出対象物抗体を用いたサンドイッチ法がより好ましい。さらに、抗検出対象物抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体いずれでもよいが、モノクローナル抗体がより好ましい。
上記イムノクロマト法は、上記検体抽出方法により抽出された検出対象物と抗検出対象物抗体を固定化したストリップ等を接触させることにより行われる。
なお、本発明におけるイムノクロマト法は、定性的な検出、定量的な測定のいずれにも用いることができることはいうまでもない。(Immunochromatography to detect the detection target)
The method for detecting the detection target of the present invention by immunochromatography (immunochromatography) is particularly an immunological detection method using an antibody against the detection target (hereinafter sometimes referred to as an anti-detection target antibody). Although not limited, a sandwich method using an anti-detection target antibody and a labeled anti-detection target antibody is more preferable. Furthermore, the anti-detection target antibody may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but a monoclonal antibody is more preferable.
The immunochromatography method is performed by bringing a detection object extracted by the sample extraction method into contact with a strip or the like on which an anti-detection object antibody is immobilized.
Needless to say, the immunochromatography method in the present invention can be used for both qualitative detection and quantitative measurement.
（標識物）
これらの抗体に標識する標識物としては、金コロイド粒子、白金コロイド粒子、カラーラテックス粒子、磁性粒子などが好ましく、特にカラーラテックスが好ましい。
カラーラテックスは、例えば特開平６−３０６１０８号公報の〔００２２〕記載の方法に従い、乳化剤を使用しないソープフリー重合によりポリスチレン系粒子を作製し、同〔００２５〕から〔００３５〕までに記載された方法に準じて作製可能であり、Ｓｅｒａｄｙｎ社やＭａｇｓｐｈｅｒｅ社などから市販されている着色粒子を用いることも出来る。
以下の説明では、標識物としてカラーラテックス粒子を用いた場合について詳述する。(Marked item)
As a label for labeling these antibodies, gold colloid particles, platinum colloid particles, color latex particles, magnetic particles and the like are preferable, and color latex is particularly preferable.
For example, according to the method described in [0022] of JP-A-6-306108, color latex is prepared by producing polystyrene particles by soap-free polymerization without using an emulsifier, and the method described in [0025] to [0035]. It is also possible to use colored particles commercially available from Seradyn, Magsphere, and the like.
In the following description, the case where color latex particles are used as the label will be described in detail.
（標識抗体固定化方法）
上記抗体のカラーラテックスへの固定化は、通常化学結合によって行うが、この際、抗体濃度は１ｍｇ／ｍＬ〜５ｍｇ／ｍＬに調製されるのが好ましく、緩衝液及びｐＨは、２０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５〜６．５）または５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８〜９）が好ましく、さらに好ましくは２０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）である。また、カラーラテックス上の抗体が結合していない領域は、ＢＳＡなどを結合させブロッキングするのが好適である。このようにして作製されたカラーラテックス標識抗体は、変性を阻止するための保存試薬中に分散され保存される。この変性阻止剤としては、ＢＳＡなどの蛋白質、グリセリン、糖などが用いられる。(Labeled labeled antibody method)
Immobilization of the antibody on the color latex is usually performed by chemical bonding. At this time, the antibody concentration is preferably adjusted to 1 mg / mL to 5 mg / mL, and the buffer and pH are adjusted to 20 mM MES buffer ( pH 5.5-6.5) or 50 mM borate buffer (pH 8-9) is preferred, and 20 mM MES buffer (pH 6.5) is more preferred. In addition, it is preferable to block the region on the color latex where the antibody is not bound by binding BSA or the like. The color latex labeled antibody thus prepared is dispersed and stored in a storage reagent for preventing denaturation. As this denaturation inhibitor, proteins such as BSA, glycerin, sugars and the like are used.
（固相）
また、固相の素材としては、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ナイロン類、ガラス、セルロースやセルロース誘導体などの多糖類、あるいはセラミックス等が挙げられる。具体的には、ミリポア社、東洋濾紙社、ワットマン社、ライデル社などより販売されているガラス繊維ろ紙や、セルロースろ紙などの他、ポリスチレンプレート、ガラス繊維膜、ナイロン膜、ニトロセルロース膜などが好ましく、特にニトロセルロース膜が好ましい。
以下、固相の素材としてニトロセルロース膜を用いた場合について詳述する。(Solid phase)
Examples of the solid phase material include polyethylene, polyethylene terephthalate, nylons, glass, polysaccharides such as cellulose and cellulose derivatives, and ceramics. Specifically, glass fiber filter paper sold by Millipore, Toyo Roshi, Whatman, Leidel, etc., cellulose filter paper, polystyrene plate, glass fiber membrane, nylon membrane, nitrocellulose membrane, etc. are preferable. In particular, a nitrocellulose membrane is preferred.
Hereinafter, the case where a nitrocellulose membrane is used as the solid phase material will be described in detail.
（固相への捕捉用抗体の固定化）
検出対象物としての抗原（例えば、インフルエンザウイルス）と標識抗体との複合体を検出するための捕捉用抗体のニトロセルロース膜への固定化は、一般に周知の方法で実施することができる。例えば、ラテラルフロー式の場合には、ノズルから捕捉用抗体を含む液を一定の速度で吐出しながら水平方向に移動させることのできる機構を有する装置などを用いて、ライン状にニトロセルロース膜に捕捉用抗体液を塗布することにより行われる。この際、抗体の濃度は０．１ｍｇ／ｍＬ〜５ｍｇ／ｍＬが好ましく、０．５ｍｇ／ｍＬ〜２ｍｇ／ｍＬがさらに好適である。また、上記の抗体液は、通常、所定の緩衝液を用いて調製され得る。
前記緩衝液の種類としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液など通常使用される緩衝液をあげることができる。緩衝液のｐＨはｐＨ６．０〜９．５の範囲が好ましく、ｐＨ６．５〜８．５がより好ましく、ｐＨ７．０〜８．０がさらに好ましい。緩衝液には、さらにＮａＣｌなどの塩類、スクロースなどの安定剤や保存剤、プロクリン（登録商標）などの防腐剤等を含んでもよい。塩類はＮａＣｌなどのようにイオン強度の調整のために含ませるもののほか、水酸化ナトリウムなど緩衝液のｐＨを調整する工程で存在するようになるものも含まれる。
ニトロセルロース膜に抗体を固定化した後、さらに、通常使用されるブロッキング剤を溶液あるいは蒸気状にして被覆し、ブロッキングを行うこともできる。
ニトロセルロース膜の孔径を適宜選択することにより、カラーラテックス標識抗体と検出対象物である抗原（例えば、インフルエンザウイルス）との免疫複合体が膜中を流れる速度を制御することが可能である。この流れる速度により、膜に固定化された上記抗体に結合する標識抗体量を調節することができるため、適切な孔径を有する膜を選択することが好ましい。好適には、ミリポア社、Ｈｉ Ｆｌｏｗ Ｐｌｕｓ ＨＦ１８０などが用いられる。(Immobilization of capture antibody on solid phase)
Immobilization of a capture antibody for detecting a complex of an antigen (for example, influenza virus) as a detection target and a labeled antibody to a nitrocellulose membrane can be generally performed by a well-known method. For example, in the case of the lateral flow type, using a device having a mechanism that can move in a horizontal direction while discharging a liquid containing a capture antibody from a nozzle at a constant speed, the nitrocellulose film is formed in a line shape. This is performed by applying a capture antibody solution. In this case, the concentration of the antibody is preferably 0.1 mg / mL to 5 mg / mL, and more preferably 0.5 mg / mL to 2 mg / mL. In addition, the above antibody solution can be usually prepared using a predetermined buffer solution.
Examples of the buffer include normal buffers such as phosphate buffer, Tris buffer, and Good's buffer. The pH of the buffer solution is preferably in the range of pH 6.0 to 9.5, more preferably pH 6.5 to 8.5, and even more preferably pH 7.0 to 8.0. The buffer may further contain salts such as NaCl, stabilizers and preservatives such as sucrose, and preservatives such as Procrine (registered trademark). The salts include those that are present in the step of adjusting the pH of the buffer solution, such as sodium hydroxide, in addition to those that are included for adjusting the ionic strength, such as NaCl.
After the antibody is immobilized on the nitrocellulose membrane, blocking can also be performed by coating a commonly used blocking agent in the form of a solution or vapor.
By appropriately selecting the pore size of the nitrocellulose membrane, it is possible to control the rate at which the immune complex of the color latex-labeled antibody and the antigen to be detected (for example, influenza virus) flows through the membrane. Since the amount of labeled antibody that binds to the antibody immobilized on the membrane can be adjusted by this flow rate, it is preferable to select a membrane having an appropriate pore size. Preferably, Millipore Corporation, Hi Flow Plus HF180, etc. are used.
（イムノクロマト試薬、イムノクロマト試薬キット）
本発明の検体抽出液は、従来のイムノクロマト試薬とともに用いることができ、両者を併せてイムノクロマト試薬またはイムノクロマト試薬キットとして用いることもできる。
尚、「イムノクロマト試薬」とは、イムノクロマト法による測定に必要な試薬成分や、テストストリップ等の部材をも含めたものである。
次に、検出対象物をインフルエンザウイルスとした場合に、本発明の検体抽出液を用いて、インフルエンザウイルス測定用イムノクロマト試薬の偽陽性反応を抑制する技術に関して実施例を挙げて説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。(Immunochromatography reagent, immunochromatography reagent kit)
The specimen extract of the present invention can be used together with a conventional immunochromatographic reagent, and both can be used together as an immunochromatographic reagent or an immunochromatographic reagent kit.
The “immunochromatography reagent” includes reagent components necessary for measurement by the immunochromatography method and members such as a test strip.
Next, when the detection target is an influenza virus, the technique for suppressing the false positive reaction of the immunochromatography reagent for influenza virus measurement using the sample extract of the present invention will be described with reference to examples. Is not limited to these.
＜インフルエンザウイルス測定用イムノクロマト試薬の作製＞
１．青色カラーラテックス標識抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体、赤色カラーラテック
ス標識抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体の調製
（１）下記（i）から（iv）を準備し、（ｉ）５ｍＬ、（ii）０．２ｍＬ、及び（iii）０．８ｍＬを加えて撹拌後、これに（iv）４ｍＬを添加し、室温で２時間撹拌した。
（２）上記（１）で得られた溶液を１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心し上清を除去後、１０％スクロース含有２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）水溶液を１０ｍＬ添加し、さらに２時間撹拌後、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、沈渣（コンジュゲート）を得た。
（３）上記（２）により得られたコンジュゲートに対し、１０％スクロース含有２％ＢＳＡ水溶液を１０ｍＬ添加しコンジュゲートを懸濁させて、青色カラーラテックス標識抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体および赤色カラーラテックス標識抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体を得た。
以下の試験において、コンジュゲートの吸光度の測定は、青色カラーラテックスを用いた場合は６５５ｎｍ（青色カラーラテックスの最大吸収波長）、赤色カラーラテックスを用いた場合は５５１ｎｍ（赤色カラーラテックスの最大吸収波長）、緑色カラーラテックスを用いた場合は６５５ｎｍ（緑色カラーラテックスの最大吸収波長）で測定した。
(ｉ)２％ 青色又は赤色カラーラテックスを含む２０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．５）緩衝液
(ii) ２０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．５）緩衝液
(iii) 架橋剤１−ｅｔｈｙｌ−３−［３−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ］ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ（ＥＤＣ）１５ｍｇ／ｍＬ
(iv) ２．５ｍｇ／ｍＬ 抗Ａ型又は抗Ｂ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体を含む２０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．５）緩衝液<Preparation of immunochromatographic reagent for influenza virus measurement>
1. Preparation of blue color latex-labeled anti-influenza A virus antibody and red color latex-labeled anti-type B influenza virus antibody (1) Prepare the following (i) to (iv): (i) 5 mL, (ii) 0.2 mL, And (iii) 0.8 mL was added and stirred, 4 mL of (iv) was added to this, and it stirred at room temperature for 2 hours.
(2) The solution obtained in (1) above is centrifuged at 13,000 rpm for 10 minutes to remove the supernatant, 10 mL of 10% sucrose-containing 2% bovine serum albumin (BSA) aqueous solution is added, and the mixture is further stirred for 2 hours. The mixture was centrifuged at 13,000 rpm for 10 minutes to obtain a precipitate (conjugate).
(3) To the conjugate obtained in (2) above, 10 mL of 2% BSA aqueous solution containing 10% sucrose is added to suspend the conjugate, and the blue color latex labeled anti-influenza A virus antibody and red color latex are suspended. A labeled anti-B influenza virus antibody was obtained.
In the following tests, the absorbance of the conjugate was measured at 655 nm (maximum absorption wavelength of blue color latex) when using blue color latex and 551 nm (maximum absorption wavelength of red color latex) when using red color latex. When green color latex was used, measurement was performed at 655 nm (maximum absorption wavelength of green color latex).
(i) 20 mM MES (pH 6.5) buffer containing 2% blue or red color latex
(ii) 20 mM MES (pH 6.5) buffer
(iii) Crosslinker 1-ethyl-3- [3- (dimethylamino) propyl] carbodiimide (EDC) 15 mg / mL
(iv) 20 mM MES (pH 6.5) buffer containing 2.5 mg / mL anti-type A or anti-type B influenza virus monoclonal antibody
２．コントロール用緑色カラーラテックス標識ＫＬＨ（カコ貝ヘモシアニン：Ｋｅｙｈｏｌｅ−ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）の調製
（１）下記（i）から（iv）を準備し、（ｉ）５ｍＬに、（ii）１．４ｍＬ、（iii）１．６ｍＬを加えて撹拌後、（iv）２ｍＬを添加し、室温で２時間撹拌した。
（２）上記（１）で得られた溶液を１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心し上清を除去後、１０％スクロース含有２％ＢＳＡ水溶液を１０ｍＬ添加し、さらに２時間撹拌後、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、沈渣（コンジュゲート）を得た。
（３）上記（２）で得られたコンジュゲートに対し、１０％スクロース含有２％ＢＳＡ水溶液を１０ｍＬ添加しコンジュゲートを懸濁させて、コントロール用緑色カラーラテックス標識ＫＬＨを得た。
（ｉ）２％ 緑色カラーラテックスを含む２０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．５）緩衝液
（ii）２０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．５）緩衝液
（iii）１５ｍｇ／ｍＬ ＥＤＣ
（iv）０．５ｍｇ／ｍＬ ＫＬＨを含む２０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．５）緩衝液2. Preparation of green color latex labeled KLH (Keyhole-limpet hemocyanin) for control (1) Prepare the following (i) to (iv), (i) 5 mL, (ii) 1.4 mL, (iii) After adding 1.6 mL and stirring, (iv) 2 mL was added, and it stirred at room temperature for 2 hours.
(2) The solution obtained in (1) above is centrifuged at 13,000 rpm for 10 minutes to remove the supernatant, 10 mL of 10% sucrose-containing 2% BSA aqueous solution is added, and further stirred for 2 hours, and then at 13,000 rpm. The mixture was centrifuged for 10 minutes to obtain a sediment (conjugate).
(3) To the conjugate obtained in (2) above, 10 mL of 10% sucrose-containing 2% BSA aqueous solution was added to suspend the conjugate to obtain a control green color latex-labeled KLH.
(I) 20 mM MES (pH 6.5) buffer containing 2% green color latex (ii) 20 mM MES (pH 6.5) buffer (iii) 15 mg / mL EDC
(Iv) 20 mM MES (pH 6.5) buffer containing 0.5 mg / mL KLH
３．コンジュゲート塗布パッドの作製
上記１．および上記２．で調製したコンジュゲートを、青色６．４ ＯＤ／ｍＬ、赤色１０．４ ＯＤ／ｍＬ、緑色６．５ ＯＤ／ｍＬとなるように、０．５％カゼイン及び１０％スクロース含有トリス緩衝液（ｐＨ８．５）と混合して３色が混合したコンジュゲート溶液を作製した。そして、２２．０ｍｍ×２５４ｍｍ×０．５６ｍｍ（幅×長さ×厚さ）のグラスファイバー製パッド（Ｌｙｄａｌｌ社）にイムノクロマト用ディスペンサー「ＸＹＺ３０５０」（ＢＩＯ ＤＯＴ社）を用いて該コンジュゲート溶液を１０ｕＬ／ｃｍで滲みこませた。その後、ドライオーブン内で７０℃で３０分間加温することにより乾燥させ、コンジュゲート塗布パッドとした。また、界面活性剤などの添加剤を添加する場合には、前記コンジュゲート溶液に必要量を添加した後、同様の操作を行った。3. Preparation of conjugate application pad And 2. The tris buffer solution containing 0.5% casein and 10% sucrose (pH 8) was prepared so that the conjugate prepared in (4) was blue 6.4 OD / mL, red 10.4 OD / mL, and green 6.5 OD / mL. .5) to prepare a conjugate solution in which the three colors were mixed. Then, 10 μL of the conjugate solution was prepared by using an immunochromatographic dispenser “XYZ3050” (BIO DOT) on a 22.0 mm × 254 mm × 0.56 mm (width × length × thickness) glass fiber pad (Lydall). / Cm. Then, it dried by heating for 30 minutes at 70 degreeC in dry oven, and was set as the conjugate application | coating pad. Further, when an additive such as a surfactant was added, the same operation was performed after adding a necessary amount to the conjugate solution.
４．抗インフルエンザウイルス抗体固定化膜の作製
２５ｍｍ×２５４ｍｍ×０．２３５ｍｍ（短辺×長辺×厚さ）のニトロセルロース膜（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）に、０．７５ｍｇ／ｍＬに調製した前記青色カラーラテックス標識抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体とはエピトープを異にする抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体、１．０ｍｇ／ｍＬに調製した前記赤色カラーラテックス標識抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体とはエピトープを異にする抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体、０．７５ｍｇ／ｍＬに調製した抗ＫＬＨ抗体、及び２．５％スクロースを含む１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を、幅約１ｍｍのライン状に塗布した。塗布は、イムノクロマト用ディスペンサー「ＸＹＺ３０５０」（ＢＩＯ ＤＯＴ社）を用い、吐出量を１μＬ／ｃｍとなるよう設定した。ライン塗布後のニトロセルロース膜をドライオーブン内で７０℃、４５分乾燥し、抗インフルエンザウイルス抗体固定化膜とした。ニトロセルロース膜上の抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体を塗布したラインをＡライン、抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体を塗布したラインをＢライン、抗ＫＬＨ抗体を塗布したラインをコントロールラインという。4). Preparation of anti-influenza virus antibody-immobilized membrane The blue color latex labeled anti-antimony prepared at 0.75 mg / mL on a nitrocellulose membrane (Sartorius) of 25 mm × 254 mm × 0.235 mm (short side × long side × thickness) Anti-influenza A virus antibody having an epitope different from that of influenza A virus antibody, anti-influenza B virus having an epitope different from that of the red color latex-labeled anti-influenza B virus antibody prepared to 1.0 mg / mL An antibody, an anti-KLH antibody adjusted to 0.75 mg / mL, and 10 mM phosphate buffer (pH 7.2) containing 2.5% sucrose were applied in a line shape having a width of about 1 mm. The application was performed using an immunochromatographic dispenser “XYZ3050” (BIO DOT), and the discharge amount was set to 1 μL / cm. The nitrocellulose film after the line application was dried in a dry oven at 70 ° C. for 45 minutes to obtain an anti-influenza virus antibody-immobilized film. The line on which the anti-influenza A virus antibody is applied on the nitrocellulose film is referred to as A line, the line on which the anti-influenza B virus antibody is applied is referred to as B line, and the line on which the anti-KLH antibody is applied is referred to as control line.
５．テストストリップの作製
プラスチック製粘着シート（a）に上記抗インフルエンザウイルス抗体固定化膜（b）を貼り、上記３．で作製したコンジュゲート塗布パッド（ｃ）を配置装着し、反対側の端には吸収パッド（ｄ）（Ｗｈａｔｍａｎ社、７４０−Ｅ）を配置装着した。また、最後に抗体固定化膜および吸収パッドを被覆するように上面にポリエステルフィルム（ｅ）を配置装着しラミネートした。このように各構成要素を重ね合わせた構造物を４ｍｍ幅に切断してテストストリップを作製した。該テストストリップの外寸は、４ｍｍ×９８ｍｍ（幅×長さ）であり、イムノクロマトテストストリップの形態にした。図１にテストストリップの模式構成図を示した。5. Preparation of test strip The anti-influenza virus antibody-immobilized membrane (b) is affixed to a plastic adhesive sheet (a), and the above-mentioned 3. The conjugate application pad (c) prepared in (1) was placed and mounted, and the absorbent pad (d) (Whatman, 740-E) was placed and mounted on the opposite end. Finally, a polyester film (e) was placed and laminated on the upper surface so as to cover the antibody-immobilized membrane and the absorption pad. Thus, the structure which piled up each component was cut | disconnected to 4 mm width, and the test strip was produced. The outer dimension of the test strip was 4 mm × 98 mm (width × length) and was in the form of an immunochromatographic test strip. FIG. 1 shows a schematic configuration diagram of a test strip.
６．検体抽出液の調製
２００ｍＭ 塩化カリウム、１５０ｍＭ Ｌ−アルギニン、０．５％ Ｂｒｉｊ３５、０．２５％ ＢＳＡ、及び０．０５％ プロクリン(登録商標)９５０を含む５０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ８．５）を検体抽出液とした。6). Preparation of specimen extract 50 mM Tris buffer (pH 8.5) containing 200 mM potassium chloride, 150 mM L-arginine, 0.5% Brij35, 0.25% BSA, and 0.05% Procrine (registered trademark) 950 An extract was obtained.
試験例１
鼻腔拭い液、もしくは鼻腔吸引液を用いた偽陽性反応原因成分の検討
（１）試験方法
（１−１）使用検体
培養法もしくはＰＣＲ法にてインフルエンザウイルス陰性が確認されている検体のうち、前記５．で作成されたテストストリップ（イムノクロマト試薬）で偽陽性を示す鼻腔拭い検体１本（検体名：ＵＲＡ）と鼻腔吸引検体１本（検体名：Ｃ６０７）、及び偽陽性を示さない鼻腔吸引検体２本（検体名：Ｃ６２１、Ｃ６２２）を用いた。
（１−２）サンプルの調製
ａ．鼻腔吸引検体の場合
鼻腔吸引液に綿棒１本を浸し、検体を浸み込ませた綿棒を３２０μＬのＰＢＳへ入れて、検体成分をＰＢＳへ溶解させて本試験のサンプルとした。
ｂ．鼻腔拭い検体の場合
綿棒２本で鼻腔を拭い、綿棒を３２０μＬのＰＢＳへ溶解して本試験のサンプルとした。
（１−３）測定
サンプルに上記５．で作成したテストストリップを浸し、１０分後にＡライン、Ｂラインおよびコントロ−ルラインの発色強度を測定した。発色強度測定には、青、赤、緑色の各色の発色見本から０．２５〜４．０の数値をつけたカラーチャートを用いた。発色強度の測定方法は以下の試験において同様である。Test example 1
Examination of false positive reaction cause component using nasal wiping liquid or nasal cavity aspirate (1) Test method (1-1) Specimen used Among specimens confirmed to be influenza virus negative by culture method or PCR method, 5. One nasal wipe specimen (specimen name: URA) and one nasal aspiration specimen (specimen name: C607) showing false positives on the test strip (immunochromatography reagent) prepared in step 2 and two nasal aspiration specimens showing no false positives (Specimen names: C621, C622) were used.
(1-2) Sample preparation a. In the case of a nasal aspiration sample, one cotton swab was immersed in the nasal aspirate, and the cotton swab soaked with the sample was placed in 320 μL of PBS, and the sample components were dissolved in PBS to prepare a sample for this test.
b. In the case of a specimen for nasal wiping, the nasal cavity was wiped with two cotton swabs, and the swab was dissolved in 320 μL of PBS to prepare a sample for this test.
(1-3) The above-mentioned 5. The test strip prepared in step 1 was dipped, and the color intensity of the A line, B line and control line was measured 10 minutes later. For color development intensity measurement, a color chart with numerical values of 0.25 to 4.0 was used from color development samples of blue, red, and green. The method for measuring the color intensity is the same in the following tests.
（１−４） 発色強度測定結果
結果を表１に示す。表中、数値が高いほど、偽陽性反応を示しており、「−」は検出限界以下を示している。また、Ａ ｌｉｎｅの数値は、青色カラーラテックス標識抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体による発色ラインの発色強度を示し、Ｂ ｌｉｎｅの数値は、赤色カラーラテックス標識抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体による発色ラインの発色強度を示し、Ｃｏｎｔ．は緑色カラーラテックス標識抗ＫＬＨによる発色ラインの発色強度を示す。これより、検体Ｃ６２１とＣ６２２は偽陽性反応を示さない検体であり、検体ＵＲＡおよびＣ６０７が偽陽性反応を示す検体であることがわかる。以後、偽陽性検体としてＵＲＡおよびＣ６０７を用いた。(1-4) Coloring intensity measurement results Table 1 shows the results. In the table, a higher numerical value indicates a false positive reaction, and “−” indicates a value below the detection limit. The numerical value of A line indicates the coloring intensity of the coloring line by the blue color latex labeled anti-influenza A virus antibody, and the numerical value of B line indicates the coloring intensity of the coloring line by the red color latex labeled anti-type B influenza virus antibody. Cont. Indicates the color intensity of the color development line by the green color latex labeled anti-KLH. Thus, it can be seen that Samples C621 and C622 are samples that do not show false positive reactions, and Samples URA and C607 are samples that show false positive reactions. Thereafter, URA and C607 were used as false positive samples.
（２−１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
（１−１）で用いた４検体について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離パターンを比較した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：非還元条件下、ポリアクリルアミドゲル（４〜２０％）を用いて電気泳動を行った。
サンプルの調製は、上記（１−２）と同様に行い、調製されたサンプル１０μＬにトリス−ＳＤＳサンプル処理液（コスモバイオ社製）１０μＬを添加し混合したものを１０μＬアプライした。(2-1) SDS-PAGE
The separation patterns of the four specimens used in (1-1) were compared by SDS-PAGE.
SDS-PAGE: Electrophoresis was performed using polyacrylamide gel (4-20%) under non-reducing conditions.
The sample was prepared in the same manner as in (1-2) above, and 10 μL of 10 μL of Tris-SDS sample treatment solution (Cosmo Bio) was added to and mixed with 10 μL of the prepared sample.
（２−２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果
結果を図２に示す。図２によれば、偽陽性反応を示すサンプル（ＵＲＡ、Ｃ６０７）のＳＤＳ−ＰＡＧＥのパターン（レーン４、レーン１）において分子量が２６０ＫＤａ付近、および５２〜７２ＫＤａの間のバンドが、偽陽性反応を示さない検体（Ｃ６２１、Ｃ６２２）のパターン（レーン２、レーン３）に比べて濃いことが判明した。したがって、これらの２種類のバンドの成分が偽陽性反応の原因成分であると考えられた。なお、ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥでも同様に分離を行ったところ、同様の結果が得られた。すなわち、偽陽性反応を示さない検体に比べて偽陽性を示す検体で濃くなるバンドが認められた（図３）。(2-2) Results of SDS-PAGE The results are shown in FIG. According to FIG. 2, in the SDS-PAGE pattern (lane 4, lane 1) of the sample showing false positive reaction (URA, C607), the molecular weight is around 260 KDa, and the band between 52-72 KDa shows false positive reaction. It was found that it was darker than the pattern (lane 2, lane 3) of the specimens (C621, C622) not shown. Therefore, the components of these two types of bands were considered to be the causative components of the false positive reaction. In addition, when separation was performed in the same manner with native-PAGE, similar results were obtained. That is, a darker band was observed in the specimen showing false positive than the specimen showing no false positive reaction (FIG. 3).
試験例２
偽陽性反応抑制効果を示す偽陽性反応抑制剤のスクリーニング
（１）試験方法
上記６．で調製した検体抽出液に下記９種類の偽陽性反応抑制剤候補物質を終濃度５％となるように添加して９種類の試験用検体抽出液を調製し、当該試験用検体抽出液３２０μＬに偽陽性反応を起こす鼻腔拭い検体（鼻腔を拭った綿棒４本の綿球部分）を加えて検体を抽出した。
該検体抽出液に上記５．で作製したテストストリップを浸し、１０分、３０分、６０分後にＡライン、Ｂライン、コントールラインの発色強度を測定した。
偽陽性反応抑制剤候補物質：
ＮＥＯ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＡＶＥＲ（ＴＯＹＯＢＯ製）、イムノブロックTM（大日本製薬製）、ＡｐｐｌｉｅＢｌｏｃｋ（生化学バイオビジネス製）、ＳＥＡ ＢＬＯＣＫTM/ＥＩＡ/ＷＢ（ＰＩＥＲＣＥ製）、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ（ナカライテスク製）、ＢＳＡ（プロリアント製）、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＴＯＹＯＢＯ製）、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTM（ＰＢＳ）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＩＥＲＣＥ製）、ＳｍａｒｔＢｌｏｃｋTM（ＣＡＮＤＯＲ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅＧｍｂＨ製）Test example 2
5. Screening for false positive reaction inhibitor showing false positive reaction inhibitory effect (1) Test method Nine kinds of false positive reaction inhibitor candidate substances are added to the specimen extract prepared in step 5 so that the final concentration is 5% to prepare nine kinds of test specimen extracts, and the test specimen extract is made up to 320 μL. A specimen was extracted by adding a specimen for wiping the nasal cavity that caused a false-positive reaction (four cotton swabs with wiped nasal cavity).
In the specimen extract, 5. The test strips prepared in Step 1 were dipped, and the color intensity of the A line, B line and control line was measured after 10 minutes, 30 minutes and 60 minutes.
False positive reaction inhibitor candidate substances:
NEO PROTEIN SAVER (manufactured by TOYOBO), Immunoblock TM (manufactured by Dainippon Pharmaceutical), ApplieBlock (manufactured by Biochemical BIOBUSINESS), SEA BLOCK TM / EIA / WB ( manufactured by PIERCE), Blocking One (Nacalai Tesque), BSA (Purorianto ), Blocking Peptide Fragment (manufactured by TOYOBO), StartingBlock ™ (PBS) Blocking Buffer (manufactured by PIERCE), SmartBlock ™ (manufactured by CANDOR bioscienceGmbH)
（２）試験結果
各種の偽陽性反応抑制剤候補物質を添加した試験用検体抽出液を用いた場合の発色強度測定結果を表２に示す。表２より、ＮＥＯ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＡＶＥＲ、イムノブロックTM、ＡｐｐｌｉｅＢｌｏｃｋ、ＳＥＡ ＢＬＯＣＫTM/ＥＩＡ/ＷＢ、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ、ＢＳＡ、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔの７種では偽陽性反応抑制効果を示さなかったのに対し、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTM（ＰＢＳ）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ(以下、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTM)、ＳｍａｒｔＢｌｏｃｋTMは顕著に偽陽性反応抑制効果を示した。このことから、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTMやＳｍａｒｔＢｌｏｃｋTMは、偽陽性反応原因成分と抗検出対象物抗体との親和性を抑制することにより、偽陽性反応を抑制したと考えられた。(2) Test results Table 2 shows the results of measurement of color intensity when test specimen extracts containing various false positive reaction inhibitor candidate substances were used. Table 2 shows that NEO PROTEIN SAVER, ImmunoBlock ™ , ApplyBlock, SEA BLOCK ™ / EIA / WB, Blocking One, BSA, and Blocking Peptide Fragment did not show a false positive reaction inhibitory effect, whereas StartingBlock ™ PBS) Blocking Buffer (hereinafter referred to as “StartingBlock ™” ) and SmartBlock ™ showed a remarkable false positive reaction inhibitory effect. From this, it was considered that StartingBlock ™ and SmartBlock ™ suppressed the false positive reaction by suppressing the affinity between the false positive reaction-causing component and the anti-detection target antibody.
試験例３
StartingBlockTMの効果確認試験
（１）試験方法
試験例２のＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTMを添加した各検体抽出液検体Ｃ６０７（偽陽性反応を起こす検体）を添加したものと、当該検体を添加しないものについて、試験例１と同様に非還元条件下、ポリアクリルアミドゲル（４〜２０％）を用いて電気泳動した。
試験例１で調製されたＣ６０７のＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルに純水、又は５％にＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTMを等量混合した溶液１０μＬとサンプル処理液１０μＬを添加し混合したものから１０μＬをアプライした（レーン５，６）。また、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTMと純水（ＤＷ）を等量混合した溶液１０μＬとサンプル処理液１０μＬを添加し混合したものから１０μＬをアプライした（レーン７）。Test example 3
StartingBlock TM Effect Confirmation Test (1) Test Method Test Example for each sample extract sample C607 (sample causing false positive reaction) added with StartingBlock TM of Test Example 2 and for those samples not added with the sample In the same manner as in Example 1, electrophoresis was performed using polyacrylamide gel (4 to 20%) under non-reducing conditions.
10 μL was applied to the C607 SDS-PAGE sample prepared in Test Example 1 by adding 10 μL of pure water or 10 μL of a sample processing solution mixed with equal amounts of 5% StartingBlock ™ and 10 μL of the sample treatment solution (lane 5,). 6). Further, 10 μL of a solution obtained by adding 10 μL of a starting block mixed with equal amounts of StartingBlock ™ and pure water (DW) and 10 μL of a sample treatment solution was applied (lane 7).
（２）試験結果
ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTMの場合には、Ｃ６０７を添加した検体抽出液のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンにおいて（レーン６）、Ｃ６０７を添加しないＳｔａｒｔｉｎｇ Ｂｌｏｃｋ単独の検体抽出液（レーン７）に特有の成分（分子量が２８ＫＤａ付近のバンド）の消失が認められた（図２）。このことから、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTMの特有成分が偽陽性反応原因成分に何らかの作用をして、偽陽性反応を抑制していることがわかった。(2) Test results In the case of StartingBlock ™ , in the SDS-PAGE pattern of the sample extract added with C607 (lane 6), components unique to the sample extract containing only Blocking without adding C607 (lane 7) (lane 7) The disappearance of a band having a molecular weight of around 28 KDa was observed (FIG. 2). From this, it was found that the specific component of StartingBlock ™ acts on the false positive reaction cause component in some way to suppress the false positive reaction.
試験例４
ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTM、ＳｍａｒｔＢｌｏｃｋTMの偽陽性反応を抑制する効果の持続期間の確認
（１）試験方法
試験例２でＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTM、ＳｍａｒｔＢｌｏｃｋTMの偽陽性反応抑制効果が認められたことから、これらの効果持続期間を確認するために、前記６．の検体抽出液にＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTM、ＳｍａｒｔＢｌｏｃｋTMをそれぞれ５％（ｗ／ｗ）となるように添加して、６０℃で３日間保管（３０℃、２〜３ヶ月相当）した後、再度、偽陽性検体を摂取し、試験例２と同様にＡライン、Ｂライン、およびコントロールラインの発色強度を測定した。Test example 4
Confirmation of the duration of the effect of suppressing the starting positive effect of StartingBlock ™ and SmartBlock ™ (1) Test method Since the blocking effect of StartingBlock ™ and SmartBlock ™ was confirmed in Test Example 2, the duration of these effects In order to confirm After adding StartingBlock ™ and SmartBlock ™ to 5% (w / w) in each sample extract, and storing at 60 ° C for 3 days (30 ° C, equivalent to 2-3 months), false positive again A sample was ingested, and the color intensity of the A line, B line, and control line was measured in the same manner as in Test Example 2.
（２）試験結果
測定結果を表３に示す。ＳｍａｒｔＢｌｏｃｋTMでは偽陽性抑制効果が消失していたのに対して、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTMでは、６０℃加速試験においても効果を持続していることを確認した。この結果より、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTMは試薬の安定性にも非常に優れていることがわかった。(2) Test results Table 3 shows the measurement results. In contrast to the fact that the SmartBlock ™ had lost its false positive suppression effect, it was confirmed that the StartingBlock ™ maintained the effect even in the 60 ° C. accelerated test. From this result, it was found that StartingBlock ™ is also excellent in reagent stability.
試験例５
ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTMの濃度検討
（１）試験方法
試験例３，４でＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTMがもっとも偽陽性反応の抑制に効果を発揮することが判明したため、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTM至適濃度を検討することとした。検体抽出液におけるＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTMの濃度を０．１％、０．５％、１％、２．５％、５％（ｗ／ｗ）まで変動させて試験例２と同様に各反応ラインの発色強度を測定した。
また、１％、５％（ｗ／ｗ）の濃度のものについては、６０℃加速試験も行い安定性を評価した。Test Example 5
Starting Block ™ Concentration Examination (1) Test Method In Test Examples 3 and 4, it was found that StartingBlock ™ was most effective in suppressing false positive reactions, so the optimum StartingBlock ™ concentration was examined. Color intensity of each reaction line as in Test Example 2 by varying the concentration of StartingBlock ™ in the sample extract to 0.1%, 0.5%, 1%, 2.5%, 5% (w / w) Was measured.
Moreover, about the thing of the density | concentration of 1% and 5% (w / w), the 60 degreeC accelerated test was also done and stability was evaluated.
（２）試験結果
至適濃度の試験結果を表４に、６０℃加速試験の結果を表５に示す。表４によればＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTMの濃度が１％（ｗ／ｗ）以上で偽陽性反応を抑制できることを確認した。また、表５によれば６０℃、７日間（３０℃、６ヶ月相当）で１％以上において偽陽性反応の安定した抑制効果が認められた。以上の試験例４，５の結果より、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTMの好ましい濃度は１％以上であり、より好ましくは５％であることがわかった。(2) Test results Table 4 shows the test results of the optimum concentration, and Table 5 shows the results of the 60 ° C accelerated test. According to Table 4, it was confirmed that the false positive reaction can be suppressed when the concentration of StartingBlock ™ is 1% (w / w) or more. Moreover, according to Table 5, the stable inhibitory effect of the false positive reaction was recognized at 1% or more at 60 ° C. for 7 days (30 ° C., equivalent to 6 months). From the results of Test Examples 4 and 5 above, it was found that the preferred concentration of StartingBlock ™ is 1% or more, and more preferably 5%.
試験例６
ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTM添加による検出感度変化確認
（１）試験方法
５％ ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTMを検体抽出液に添加することによりインフルエンザウイルスの検出感度に影響が見られないかを確認した。具体的には、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTM添加、非添加検体抽出液を用いて、インフルエンザウイルスの検出を行った。Ａ型インフルエンザウイルスのサンプルとして、ＦｌｕＡ抗原 Ａ／Ｋｉｔａｋｙｕｓｙｕ／１５９／９３（ｌｏｔ．０８０５２１，ＳＥＫＩＳＵＩ）を１２２０倍希釈したもの、Ｂ型インフルエンザウイルスのサンプルとしてＦｌｕＢ抗原 Ｂ／Ｌｅｅ（ｌｏｔ．０８１００３，ＳＥＫＩＳＵＩ）を７０４倍希釈したものを用いた。これらの抗原希釈サンプル１３５μＬに、前記５．で作成したテストストリップを浸し、１０分後の発色強度を検出した。Test Example 6
Confirmation of change in detection sensitivity due to addition of StartingBlock ™ (1) Test method It was confirmed whether 5% StartingBlock ™ was added to the specimen extract to see whether the detection sensitivity of influenza virus was affected. Specifically, influenza virus was detected using the starting block extract with or without StartingBlock ™ added. FluA antigen A / Kitakyusyu / 159/93 (lot.080521, SEKISUI) diluted 1220 times as a sample of influenza A virus, FluB antigen B / Lee (lot.081003, SEKISUI) as a sample of influenza B virus Was diluted 704 times. To 135 μL of these antigen-diluted samples, The test strip prepared in (1) was immersed, and the color intensity after 10 minutes was detected.
（２）試験結果
Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルスともに検出感度の変化はほとんど認められず（図示せず）、検体抽出液へのＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTMの添加が検出感度に影響しないことを確認した。(2) Test results Little change in detection sensitivity was observed for both influenza A virus and influenza B virus (not shown), and it was confirmed that the addition of StartingBlock ™ to the sample extract did not affect the detection sensitivity.
本発明の検体抽出液によれば、検体中の被測定物を検出するイムノクロマト法において、偽陽性反応を回避した精度の高い測定方法を実現できる。また、偽陽性反応による誤った臨床診断を回避できる。 According to the sample extract of the present invention, a highly accurate measurement method that avoids false positive reactions can be realized in an immunochromatography method for detecting an object to be measured in a sample. In addition, an erroneous clinical diagnosis due to a false positive reaction can be avoided.
Claims (7)
（Ａ）鼻咽頭由来検体のうちイムノクロマト法において偽陽性反応を示す検体に偽陽性反応抑制剤候補物質を添加して混合し、当該混合物を非還元条件下、ポリアクリルアミドゲル（４〜２０％）で電気泳動に供して分離する工程
（Ｂ）工程（Ａ）において分離されたバンド群と、偽陽性反応を示す検体もしくは偽陽性反応抑制剤候補物質のバンド群とを比較し、（i）〜（iii）のいずれかのバンドが消滅もしくは薄くなっているかどうかを判定する工程
（i）偽陽性反応を示す検体のバンド群のうち、２６０ｋＤａ付近に現れるバンドのうちいずれか一以上
（ii）偽陽性反応を示す検体のバンド群のうち、５２〜７２ｋＤａの間に現れるバンドのうちいずれか一以上
（iii）偽陽性反応抑制剤候補物質のバンドのうちいずれか一以上
（Ｃ）工程（Ｂ）においていずれか一以上のバンドが消滅もしくは薄くなっている場合に、前記偽陽性反応抑制剤候補物質を偽陽性反応抑制剤であると判断する工程A method for selecting a false positive reaction inhibitor in an immunochromatography method comprising the following steps.
(A) A false positive reaction inhibitor candidate substance is added to and mixed with a specimen showing false positive reaction in immunochromatography among nasopharyngeal specimens, and the mixture is polyacrylamide gel (4 to 20%) under non-reducing conditions. (B) The band group separated in the step (A) is separated from the band group of the specimen showing a false positive reaction or a false positive reaction inhibitor candidate substance, (Iii) a step of determining whether any one of the bands is extinguished or thinned (i) one or more of the bands appearing in the vicinity of 260 kDa among the group of specimens showing a false positive reaction (ii) false (C) any one or more of the bands of the false positive reaction inhibitor candidate substance (C) If any one or more of the bands in (B) becomes extinguished or thinner, the step of determining the false positive reaction inhibitor candidate substance to be false positive reaction inhibitor
請求項１に記載の偽陽性反応抑制剤選択方法により選択された偽陽性反応抑制剤と、A false positive reaction inhibitor selected by the false positive reaction inhibitor selection method according to claim 1;
ｐＨ６〜１０であって、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、およびグッド緩衝液からならなる群から選択されるいずれか1以上の緩衝液と、any one or more buffers selected from the group consisting of a phosphate buffer, a Tris buffer, and a Good buffer, having a pH of 6 to 10,
を混合する工程を含む前記製造方法。The said manufacturing method including the process of mixing.
抽出された検出対象物と抗検出対象物抗体固定化ストリップを接触させて検出対象物を検出する工程と、を含むイムノクロマト法。
１）鼻咽頭由来検体中に含まれる
２）検出対象物以外である
３）抗検出対象物抗体と親和性を有する
４）非還元条件下、ポリアクリルアミドゲル（４〜２０％）で電気泳動に供した場合に２６０ｋＤａ付近及び／又は５２〜７２ｋＤａの間にバンドが現れるAn immunochromatography method for detecting a detection target in a specimen using an anti-detection target antibody having affinity for a false positive reaction-causing component having the following properties 1) to 4) : A step of contacting the specimen extract obtained by the production method with the specimen to extract the detection target;
An immunochromatography method, comprising: contacting the extracted detection object with an anti-detection object antibody-immobilized strip to detect the detection object.
1) Contained in nasopharynx-derived specimen 2) Other than detection target 3) Affinity with anti-detection target antibody 4) Electrophoresis on polyacrylamide gel (4-20%) under non-reducing conditions When applied, a band appears around 260 kDa and / or between 52 and 72 kDa
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