JP4916596B1 - 脂質二重膜の表側から裏側にカリウムイオンを輸送する方法 - Google Patents

脂質二重膜の表側から裏側にカリウムイオンを輸送する方法 Download PDF

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Abstract

本発明の目的は、特定の化学物質を高感度かつ高精度に検出することである。
特定の脂質二重膜を利用することにより、化学物質が高感度かつ高精度に検出される。ここで、前記特定の脂質二重膜は、化学物質の受容体、キメラＧタンパク質、およびカリウムイオンチャネルを具備する。前記キメラＧタンパク質は、キメラＧαサブユニットおよびＧβγサブユニット複合体を具備し、前記キメラＧαサブユニットは、Ｇｉ／ｏｌｆ１３（配列番号：０４）、Ｇｉ／ｏｌｆ２８（配列番号：０５）、Ｇｉ／ｏｌｆ９４（配列番号：０７）、Ｇｉ／ｏｌｆ１１３（配列番号：０８）、Ｇｉ／ｏｌｆ
α３−β５，Ｃ（配列番号：１２）、またはＧｉ／ｏｌｆα４−β６，Ｃ（配列番号：１５）からなる群より選択される。
【選択図】図２

Description

本発明は、脂質二重膜の表側から裏側にカリウムイオンを輸送する方法に関する。
細胞の脂質二重膜に存在するＧタンパク質結合型受容体（G protein-coupled receptor)（以下、場合により『ＧＰＣＲ』と称される。）は、細胞の脂質二重膜に存在するＧタンパク質と連動して機能する。図１に示されるように、神経伝達物質のような化学物質がＧＰＣＲに結合すると、細胞内においてＧＰＣＲと共役している三量体Ｇタンパク質が活性化され、Ｇαサブユニットと、ＧβサブユニットおよびＧγサブユニットからなる二量体（以下、場合により『Ｇβγサブユニット複合体』と称される。）とに解離する。それらは各々、種々のシグナルを伝達する。
図２に示されるように、Ｇβγサブユニット複合体のＧタンパク質共役型内向整流カリウムイオンチャネル（G protein-coupled inwardly rectifying potassium channel）（以下、場合により『ＧＩＲＫ』と称される。）への結合は、ＧＩＲＫのゲートが開放することをもたらす。ＧＩＲＫのゲートが開放されると、脂質二重膜の表側に存在するカリウムイオンが当該ゲートを通って脂質二重膜の裏側へ移動する。当該カリウムイオンの移動は、イオン電流測定法を使用することにより検出又は定量され得る。
ＧαサブユニットがキメラＧαサブユニットであると、場合によってはカリウムイオンはより効率的に表側から裏側へと移動する。キメラＧαサブユニットを具備するＧタンパク質が発現した脂質二重膜を、化学物質センサーとして使用することが提案されている。
下記の非特許文献１〜６は、本発明に関連する。
Gloriam D., Fredriksson R., Schioth H., (2007) "The G protein-coupled receptor subset of the rat genome" BMC Genomics 8, 338 - 405 Oldham, W. M. and H. E. Hamm (2008)."Heterotrimeric G protein activation by G-protein-coupled receptors."Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 60-71. Kim W. Chan, Jin-Liang Sui, Michel Vivaudou, and Diomedes E. Logothetis , (1996) "Control of channel activity through a unique amino acid residue of a G protein-gated inwardly rectifying K+ channel subunit" Proc. Natl. Acad. Sci., 93, 14193 - 14198 Gregory J. Digby, Pooja R. Sethi, and Nevin A. Lambert , (2008), "Differential dissociation of G protein heterotrimers" J. Physiol, 586, 3325 - 3335 Thomsen W., Frazer J., Unett D., (2005), "Functional assays for screening GPCR targets" Curr. Opin. Biotech.,16, 655 - 665 Leaney J.L., Milligan G., Tinker A., (2000) "The G Protein a Subunit Has a Key Role in Determining the Specificity of Coupling to, but Not the Activation of, G Protein-gated Inwardly Rectifying K1 Channels" J. Biol. Chem., 275, 921 - 929
本発明の目的は、より高感度に化学物質に応答する、脂質二重膜の表側から裏側にカリウムイオンを輸送する方法を提供することである。
本発明者らは、特定のキメラＧαサブユニットを具備するキメラＧタンパク質が上記課題を解決することを見いだし、本発明を完成した。
すなわち、本発明は下記項目１〜９を提供する。
項目１：
脂質二重膜の表側から裏側にカリウムイオンを輸送する方法であって、以下の工程（ａ）および工程（ｂ）を具備する：
前記脂質二重膜を用意する工程（ａ）
ここで、前記脂質二重膜は、化学物質の受容体、Ｇタンパク質、およびカリウムイオンチャネルを具備し、
前記Ｇタンパク質は、キメラＧαサブユニット、およびＧβγサブユニット複合体を具備し、
前記キメラＧαサブユニットは、Ｇi/olf13（配列番号：０４）、Ｇi/olf28（配列番号：０５）、Ｇi/olf94（配列番号：０７）、Ｇi/olf113（配列番号：０８）、Ｇi/olfα3-β5,C（配列番号：１２）、またはＧi/olf α4-β6,C（配列番号：１５）のいずれかからなり、および
前記化学物質および前記カリウムイオンを前記表側から供給し、前記キメラＧαサブユニットおよび前記Ｇβγサブユニット複合体の放出、および前記Ｇβγサブユニット複合体の前記カリウムイオンチャネルへの結合により、前記表側から前記裏側に前記カリウムイオンを輸送する工程（ｂ）。
項目２：
前記化学物質が、アドレナリン受容体作動薬である項目１に記載の方法。
項目３：
前記カリウムイオンチャネルが、Ｇタンパク質共役型内向き整流カリウムイオンチャネルである、項目１に記載の方法。
項目４：
化学物質を検出又は定量する方法であって以下の工程（ｃ）〜（ｅ）を具備する：
脂質二重膜、前記脂質二重膜の表側に位置する第１液体、および前記脂質二重膜の裏側に位置する第２液体を用意する工程（ｃ）、
ここで、前記脂質二重膜は、化学物質の受容体、Ｇタンパク質、およびカリウムイオンチャネルを具備し、
前記Ｇタンパク質は、キメラＧαサブユニット、およびＧβγサブユニット複合体を具備し、
前記キメラＧαサブユニットは、Ｇi/olf13（配列番号：０４）、Ｇi/olf28（配列番号：０５）、Ｇi/olf94（配列番号：０７）、Ｇi/olf113（配列番号：０８）、Ｇi/olfα3-β5,C（配列番号：１２）、またはＧi/olf α4-β6,C（配列番号：１５）のいずれかからなり、
前記第１液体はカリウムイオンを含有し、
前記第１液体に前記化学物質を供給する工程（ｄ）、および
前記第１および第２液体の少なくともいずれか一方のカリウムイオンの量を測定し、前記カリウムイオンの量に基づいて前記化学物質を検出又は定量する工程（ｅ）。
項目５：
前記化学物質が、アドレナリン受容体作動薬である項目４に記載の方法。
項目６：
前記カリウムイオンチャネルが、Ｇタンパク質共役型内向き整流カリウムイオンチャネルである、項目４に記載の方法。
項目７：
化学物質を検出または定量する方法であって、以下の工程（ｆ）〜（ｈ）を具備する：
脂質二重膜を用意する工程（ｆ）、
ここで、前記脂質二重膜は、化学物質の受容体、Ｇタンパク質、およびカリウムイオンチャネルを具備し、
前記Ｇタンパク質は、キメラＧαサブユニットおよび前記Ｇβγサブユニット複合体を具備し、
前記キメラＧαサブユニットは、Ｇi/olf13（配列番号：０４）、Ｇi/olf28（配列番号：０５）、Ｇi/olf94（配列番号：０７）、Ｇi/olf113（配列番号：０８）、Ｇi/olfα3-β5,C（配列番号：１２）、またはＧi/olfα4-β6,C（配列番号：１５）のいずれかからなり、
前記脂質二重膜の表側および裏側にそれぞれ位置する第１および第２液体を供給し、前記第１および第２液体の間に前記脂質二重膜を挟む工程（ｇ）、
ここで、前記第１液体はカリウムイオンおよび化学物質を含有し、および
前記第１および第２液体の少なくともいずれか一方のカリウムイオンの量を測定し、前記カリウムイオンの量に基づいて前記化学物質を検出または定量する工程（ｈ）。
項目８：
前記化学物質が、アドレナリン受容体作動薬である、項目７に記載の方法。
項目９：
前記カリウムイオンチャネルが、Ｇタンパク質共役型内向き整流イオンチャネルである、項目７に記載の方法。
本発明によれば、脂質二重膜の表側から裏側に輸送されるカリウムイオンの量が増加する。これにより、高感度に標的化学物質の検出がなされる。
三量体Ｇタンパク質によるシグナル伝達を示す模式図 ＧＩＲＫの働きを利用した、化学物質センサを示す模式図 Ｇタンパク質の２次元構造を示す模式図 Ｇαiの二次元構造を示す模式図 Ｇαolfの二次元構造を模式的に示す図 Ｇi/olf5の二次元構造を模式的に示す図 Ｇi/olf13の二次元構造を模式的に示す図 Ｇi/olf28の二次元構造を模式的に示す図 Ｇi/olf45の二次元構造を模式的に示す図 Ｇi/olf94の二次元構造を模式的に示す図 Ｇi/olf113の二次元構造を模式的に示す図 Ｇi/olf156の二次元構造を模式的に示す図 Ｇi/olf195の二次元構造を模式的に示す図 Ｇi/olf α 3-β5の二次元構造を模式的に示す図 Ｇi/olfα3-β5,Cの二次元構造を模式的に示す図 Ｇi/olfα4-β6の二次元構造を模式的に示す図 Ｇi/olfα3-β5,α4-β6の二次元構造を模式的に示す図 Ｇi/olfα4-β6,Cの二次元構造を模式的に示す図 Ｇi/olfα3-β5,α4-β6,Cの二次元構造を模式的に示す図 β１アドレナリン受容体発現プラスミドの作製方法を概念的に示す図 Ｋｉｒ３．１発現プラスミドの作製方法を概念的に示す図 Ｋｉｒ３．１（Ｆ１３７Ｓ）発現プラスミドの作製方法を概念的に示す図 キメラＧタンパク質発現プラスミドの作製方法を概念的に示す図 キメラＧタンパク質発現プラスミドの作製方法を概念的に示す図 キメラＧタンパク質発現プラスミドの作製方法を概念的に示す図 Ｇαi（Ｃ３５１Ｇ）タンパク質発現細胞のイオン電流を示す図 Ｇi/olf13タンパク質発現細胞のイオン電流を示す図 野生型Ｇαolfタンパク質発現細胞のイオン電流を示す図 キメラＧタンパク質発現細胞のイオン電流の変化を示す図 Ｇタンパク質発現細胞のイオン電流の変化を示す図 Ｇタンパク質発現細胞のイオン電流の変化を示す図 本発明の構成による化学センサの、従来の化学物質検出方法に対する優位性を示す図 キメラＧタンパク質発現細胞のカリウムイオン電流の、各種化学物質に対する濃度依存性を示す図
（用語の定義）
本明細書において用いられる用語は以下の通り定義される。
用語『脂質二重膜』は、細胞の表面を構成する膜、すなわち細胞膜を意味する。
用語『キメラＧαサブユニット』は、あるＧαタンパク質（例えば、Ｇαi）の特定の領域を、異なるＧαタンパク質（例えば、Ｇαolf）の対応する領域で置換したＧαサブユニットを意味する。
用語『キメラＧタンパク質』は、αサブユニットがキメラＧαサブユニットであるＧタンパク質を意味する。
本発明で使用される脂質二重膜は、化学物質受容体、キメラＧタンパク質、およびカリウムイオンチャネルを具備する。
脂質二重膜を具備する細胞の一例は、ヒト由来株化細胞である。
（化学物質の受容体）
化学物質の受容体として、Ｇタンパク質共役型受容体が採用される。Ｇタンパク質共役型受容体には、ホルモン受容体、神経伝達物質受容体、フェロモン受容体、嗅覚受容体、および味覚受容体に加えて、種々のオーファンＧタンパク質共役型受容体が含まれる。ホルモン受容体の一例は、アドレナリン受容体である。
（キメラＧタンパク質）
キメラＧタンパク質は、キメラＧαサブユニットおよびＧβγサブユニット複合体を具備する。
本発明において、キメラＧαサブユニットは、Ｇi/olf13、Ｇi/olf28、Ｇi/olf94、Ｇi/olf113、Ｇi/olfα3-β5,C、およびＧi/olfα4-β6,Cからなる群より選択される。キメラＧαサブユニットの名称中に含まれる添え字が、Ｇαiタンパク質のアミノ酸配列が、対応するＧαolfのアミノ酸配列と置換された領域を示している。これらのキメラＧαサブユニットが用いられた場合、化学物質の接触に応答してより多量のカリウムイオンが、脂質二重膜の表側から裏側へ輸送される。各キメラＧαサブユニットのアミノ酸配列が以下に示される。
（Ｇi/olf13）
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（Ｇi/olf28）
MGCTLSAEDKAAVERSKMIDRNLREDGEKAAREVKLLLLGAGESGKSTIVKQMKIIHEAGYSEEECKQYKAVVYSNTIQSIIAIIRAMGRLKIDFGDSARADDARQLFVLAGAAEEGFMTAELAGVIKRLWKDSGVQACFNRSREYQLNDSAAYYLNDLDRIAQPNYIPTQQDVLRTRVKTTGIVETHFTFKDLHFKMFDVGGQRSERKKWIHCFEGVTAIIFCVALSDYDLVLAEDEEMNRMHESMKLFDSICNNKWFTDTSIILFLNKKDLFEEKIKKSPLTICYPEYAGSNTYEEAAAYIQCQFEDLNKRKDTKEIYTHFTCAVDTENIRRVFNDCRDIIQRMHLKQYELL（配列番号：０５）
（Ｇi/olf94）
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（Ｇi/olf113）
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（Ｇi/olfα3-β5,C）
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（Ｇi/olfα4-β6,C）
MGCTLSAEDKAAVERSKMIDRNLREDGEKAAREVKLLLLGAGESGKSTIVKQMKIIHEAGYSEEECKQYKAVVYSNTIQSIIAIIRAMGRLKIDFGDSARADDARQLFVLAGAAEEGFMTAELAGVIKRLWKDSGVQACFNRSREYQLNDSAAYYLNDLDRIAQPNYIPTQQDVLRTRVKTTGIVETHFTFKDLHFKMFDVGGQRSERKKWIHCFEGVTAIIFCVALSDYDLVLAEDEEMNRMHESMKLFDSICNNKWFTDTSIILFLNKKDLFEEKIKKSPLTICYPEYAGSNTYEEAAAYIQCQFEDLNTATGDGKHYCYTHFTCATDTKNVQFVFDAVTDIIQRMHLKQYELL(配列番号１５）
図３に示されるように、Ｇαサブユニットを構成するタンパク質は、ＧＴＰアーゼドメイン（GTPase domain）と称される領域と、らせん領域（helical domain）と称される領域とを具備する。両領域は、リンカー１、リンカー２とそれぞれ称される２つのαヘリックス（α-helix）を介して互いに連結されている。ＧＴＰアーゼドメインは５本のαヘリックス、６本のβシート、およびこれらを連結するループを含む。
図７に示されるように、Ｇi/olf13の二次元構造は、Ｇαi（Ｃ３５１Ｇ）のＣ末端から１３アミノ酸が、Ｇαolfの対応するアミノ酸で置換された構造である。
図８に示されるように、Ｇi/olf28の二次元構造は、Ｇαi（Ｃ３５１Ｇ）のβ６−α５ループを含むＣ末端側の領域が、Ｇαolfの対応する領域で置換された構造である。
図１０に示されるように、Ｇi/olf94の二次元構造は、Ｇαi（Ｃ３５１Ｇ）のαＧ−α４ループを含むＣ末端側の領域が、Ｇαolfの対応する領域で置換された構造である。
図１１に示されるように、Ｇi/olf113の二次元構造は、Ｇαi（Ｃ３５１Ｇ）のα３−β５ループを含むＣ末端側の領域が、Ｇαolfの対応する領域で置換された構造である。
図１５に示されるように、Ｇi/olfα3-β5,Cの二次元構造は、Ｇαi（Ｃ３５１Ｇ）のα３−β５ループ、およびα５−Ｃ末端ループが、Ｇαolfの対応するループで置換された構造である。
図１８に示されるように、Ｇi/olfα4-β6,Cの二次元構造は、Ｇαi（Ｃ３５１Ｇ）のα３−β５ループおよびα５−Ｃ末端ループが、Ｇαolfの対応するループで置換された構造である。
（カリウムイオンチャネル）
カリウムイオンチャネルとしては、Ｇタンパク質共役型内向き整流性カリウムチャネル（ＧＩＲＫ）が用いられる。ＧＩＲＫは、Ｋｉｒ３．１、Ｋｉｒ３．２、Ｋｉｒ３．３およびＫｉｒ３．４の４つのサブタイプに分類される。本発明において、Ｋｉｒ３．１の１３７番目のフェニルアラニンがセリンで置換された変異型Ｋｉｒ３．１（Ｆ１３７Ｓ）が好ましく用いられる。その理由が以下に記述される。サブタイプＫｉｒ３．１〜Ｋｉｒ３．４は、相異なるサブタイプとヘテロ多量体を形成する。換言すると、ＧＩＲＫは２種のサブタイプを含む。しかしながら、変異型Ｋｉｒ３．１（Ｆ１３７Ｓ）はホモ４量体を形成し、当該４量体がカリウムイオンチャネルを構成する。従って、変異型Ｋｉｒ３．１（Ｆ１３７Ｓ）を用いた場合はカリウムイオンチャネルの構成に必要とされるタンパク質の種類は１種類である。
化学物質の受容体、キメラＧタンパク質、およびカリウムイオンチャネルを具備する脂質二重膜は、例えば、以下に記述される方法により調製される。化学物質の受容体をコードする発現プラスミド、キメラＧタンパク質をコードする発現プラスミド、およびカリウムイオンチャネルをコードする発現プラスミドが作製される。作製された各プラスミドが細胞に導入され、発現される。当該方法の具体的な手順は実施例で詳述される。
（カリウムイオンの輸送）
化学物質の受容体、キメラＧタンパク質、およびカリウムイオンチャネルを具備する脂質二重膜の表側と裏側は、それぞれ、適宜な緩衝液に接触している。当該脂質二重膜の表側に接触する緩衝液は、カリウムイオンを濃度１〜１０００ｍＭで含有する。
化学物質が当該脂質二重膜の表側に供給され、化学物質の受容体と結合すると、脂質二重膜の裏側において化学物質受容体と結合しているキメラＧタンパク質が、キメラＧαサブユニットと、Ｇβγサブユニット複合体とに分割され、放出される。Ｇβγサブユニット複合体のカリウムイオンチャネルへの接触は、カリウムイオンチャネルのゲートの開放をもたらす。カリウムイオンチャネルのゲートが開放されると、カリウムイオンが脂質二重膜の表側から裏側へと輸送される。
（化学物質の検出又は定量）
上述の脂質二重膜の表側から裏側にカリウムイオンを輸送する方法を利用して、化学物質が検出又は定量され得る。カリウムイオンの輸送により生じたイオン電流の変化を測定し、脂質二重膜の表側に存在する化学物質が検出又は定量される。具体的には、化学物質は以下に記述されるように検出又は定量される。まず、上述の化学物質の受容体、キメラＧタンパク質、およびカリウムイオンチャネルを具備する脂質二重膜の表側にカリウムイオンが供給される。具体的には、例えば、脂質二重膜の表側に第１液体を、裏側に第２液体を供給する。すなわち、当該脂質二重膜は、第１液体と第２液体との間に挟まれる。第１液体、および第２液体は通常、ｐＨ７付近である緩衝液である。第１液体はカリウムイオンを含有する。第２液体もカリウムイオンを含有していてもよい。
標的化学物質もまた、当該脂質二重膜の表側に供給される。具体的には、第１液体および第２液体との間に脂質二重膜が挟まれた状態で、第１液体に標的化学物質が供給される。標的化学物質は、化学物質の受容体に供給される。化学物質の受容体に標的化学物質が供給されることが、キメラＧタンパク質のサブユニットの放出をもたらし、脂質二重膜の表側に存在する（第１液体に含有される）カリウムイオンが、脂質二重膜の裏側（第２液体）に輸送される。カリウムイオンの輸送によって生じたイオン電流の変化が測定され、当該測定結果に基づいて化学物質が検出又は定量される。上述の化学物質の供給は、脂質二重膜の表側に最初に供給された第１液体を、化学物質を含有する以外は第１液体と同一の組成を有する溶液で置換することにより行われてもよい。
化学物質の定量の目的で、検量線が一般的に用いられる。
（化学物質）
化学物質としては、化学物質の受容体の作動薬として機能しうる化学物質がいずれも使用でき、特に制限されない。化学物質の受容体としてアドレナリン受容体が用いられる場合には、化学物質としては、イソプロテレノール（isoproterenol）、ドーパミン（dopamine）、ドブタミン（dobutamine）等が例示される。
［プラスミドの作製］
実施例および比較例で用いられたプラスミドの作製方法が以下に示される。
（アドレナリン受容体発現プラスミドの作製）
図２０はアドレナリン受容体発現プラスミドの作製手順を示す。βアドレナリン受容体の遺伝子（GenBank登録番号：J05561.1）は、次の手順により増幅された。ラット心臓由来のｃＤＮＡ（ｒａｔ ｈｅａｒｔ ｃＤＮＡ）が２断片に分けて、ＰＣＲ法の実施により増幅された。一方の断片の増幅に用いたプライマーは、プライマー1（配列番号１７）およびプライマー２（配列番号１８）であった。他方の断片の増幅に用いたプライマーは、プライマー３（配列番号１９）およびプライマー４（配列番号２０）であった。得られた２つの断片が、それぞれプラスミドへライゲーションされた。この２つのプラスミドを鋳型にして、ＰＣＲを実施した。一方のプラスミドの増幅に用いられたプライマーは、プライマー５（配列番号２１）およびプライマー２（配列番号１８）であった。他方のプラスミドの増幅に用いられたプライマーは、プライマー３（配列番号１９）およびプライマー６（配列番号２２）であった。これにより、増幅断片の末端に制限酵素サイトが付加された。得られた２種の断片の一方がEcoRIおよびHindIIIで処理された。他方がHindIIIおよびSalIで処理された。処理後の断片が、あらかじめEcoRIおよびSalIで処理された発現プラスミドにライゲーションされ、β１アドレナリン受容体発現プラスミド（以下、『plasmid（βＡＲ）』と称される。）を得た。用いられたプライマーの配列が表１に示される。
（変異型カリウムイオンチャネルKir3.1(F137S)発現プラスミドの作製）
変異型カリウムイオンチャネルKir3.1(F137S)の遺伝子は、マウスKir3.1の遺伝子を部分的に変異させることにより構築された。図２１は、マウスKir3.1発現プラスミドの作製手順を示す。マウスKir3.1の遺伝子は、２断片に分けて増幅された。Mouse Brain cDNA Library（クロンテック製）が鋳型として用いられた。一回目のＰＣＲで、一方の断片の増幅に用いられたプライマーは、プライマー７（配列番号２３）およびプライマー８（配列番号２４）であった。他方の断片の増幅に用いられたプライマーは、プライマー９（配列番号２５）およびプライマー１０（配列番号２６）であった。２回目のＰＣＲで、一方の断片の増幅に用いられたプライマーは、プライマー１１（配列番号２７）およびプライマー１２（配列番号２８）であった。ＰＣＲ産物を切り出す制限酵素としてNhe IおよびCla Iが用いられた。他方の断片の増幅に用いられたプライマーは、プライマー１３（配列番号２９）およびプライマー１４（配列番号３０）であった。ＰＣＲ産物を切り出す制限酵素としてはCla IおよびNot Iが用いられた。得られた遺伝子断片はあらかじめNhe IおよびNot Iで処理した発現プラスミドにライゲーションされ、マウスKir3.1発現プラスミド（以下、『plasmid(Kir3.1)』と称される。）が得られた。用いられたプライマーの配列が表２に示される。
図２２は、変異型カリウムイオンチャネルKir3.1(F137S）発現プラスミドの作製手順を示す。Kir3.1(F137S）遺伝子は、次の手順で作製された。plasmid(Kir3.1)を鋳型として、Kir3.1の遺伝子は、２断片に増幅された。これらの断片は、オーバーラップ・エクステンションＰＣＲ法の実施により連結された。一方の断片の増幅にはプライマー１１（配列番号２７）とプライマー１６（配列番号３２）が用いられ、もう一方の断片の増幅には、プライマー１５（配列番号３１）とプライマー１４′（配列番号７８）が用いられた。ＰＣＲ産物らは混合させられ、熱変性させられ、さらにＰＣＲを実施することにより増幅された。このＰＣＲ反応にはプライマー１１（配列番号２７）およびプライマー１４′（配列番号７８）が用いられた。得られた断片はNhe IおよびXho Iで処理された。処理後の断片は、あらかじめNhe IおよびXho Iで処理されたプラスミドにライゲーションされ、発現プラスミド（以下『plasmid(Kir3.1(F137S))』と称される。）を得た。
（野生型Ｇタンパク質（Ｇαolf）発現プラスミドの作製）
マウス嗅球から単離されたＲＮＡを、逆転写酵素を用いて逆転写することによって、マウス嗅細胞の全ｃＤＮＡが得られた。得られたｃＤＮＡが鋳型として用いられ、ＰＣＲによりＧαｏｌｆの遺伝子が増幅された。プライマー１７（配列番号３３）およびプライマー１８（配列番号３４）が用いられた。得られた遺伝子断片をプラスミドがプラスミドにライゲーションされ、Ｇαolf遺伝子（GenBank登録番号：AY179168.1）がクローニングされた。得られたＧαolf断片が、ＰＣＲによりさらに増幅された。プライマー１９（配列
番号３５）およびプライマー２０（配列番号３６）が用いられた。これにより、増幅断片の末端に制限酵素サイトが付加された。当該制限酵素サイトを有する増幅断片が発現プラスミドにライゲーションされ、野生型Ｇタンパク質（Ｇαolf）発現プラスミド（以下『plasmid（Ｇαolf）』と称される。）を得た。
（Ｇタンパク質（Ｇαi（Ｃ３５１Ｇ））発現プラスミドの作製）
Ｇαiの３５１番目のシステインがグリシンで置換されたＧαi（Ｃ３５１Ｇ）タンパク質発現プラスミドの作製手順が図２３に示される。Ｇαi（Ｃ３５１Ｇ）は、Ｇαi選択的阻害剤である百日咳毒素に対して抵抗性があること以外は野生型のＧαiと同じ機能を有することが明らかとなっている。Ｇαi（mouse Gil:NM-010305)遺伝子が増幅された手順が以下に示される。マウス脾臓由来のｃＤＮＡ（mouse spleen cDNA）は２断片に分けて、ＰＣＲにより増幅された。一方の断片の増幅に用いたプライマーは、プライマー２１（配列番号３７）およびプライマー２２（配列番号３８）であった。他方の断片の増幅に用いたプライマーは、プライマー２３（配列番号３９）およびプライマー２４（配列番号４０）であった。得られた２つの断片が、それぞれプラスミドにライゲーションされた。この２つのプラスミドを鋳型にして、ＰＣＲを実施した。一方のプラスミドの増幅に用いられたプライマーは、プライマー２５（配列番号４１）およびプライマー２６（配列番号４２）であった。他方のプラスミドの増幅に用いられたプライマーは、プライマー２７（配列番号４３）およびプライマー２８（配列番号４４）であった。これにより、増幅断片の末端に制限酵素サイトが付加された。得られた２種の断片の一方がEcoRIおよびBamHIで処理された。他方がBamHIおよびEcoRIで処理された。処理後の断片が、あらかじめEcoRIで処理された発現プラスミドにライゲーションされ、野生型Ｇタンパク質（Ｇαi）発現プラスミド（以下、『plasmid（Ｇαi）』と称される。）が得られた。用いられたプライマーの配列が表３に示される。
（キメラＧタンパク質（Ｇi/olf5）発現プラスミドの作製）
キメラＧタンパク質（Ｇi/olf5）発現プラスミド（以下、『plasmid（Ｇi/olf5）』と称される。）は、プライマー２８に換えてプライマー２９（配列番号４５）が用いられた以外は、plasmid（Ｇαi）の作製と同じ手順により作製された。作製手順が図２３に示される。
（キメラＧタンパク質（Ｇi/s13）発現プラスミドの作製）
キメラＧタンパク質（Ｇi/s13）発現プラスミド（以下、『plasmid（Ｇi/s13）』と称される。）は、プライマー２８に換えてプライマー３０（配列番号４６）が用いられた以外は、plasmid（Ｇαi）の作製と同じ手順により作製された。作製手順が図２３に示される。
（キメラＧタンパク質（Ｇi/olf13）発現プラスミドの作製）
キメラＧタンパク質（Ｇi/olf13）発現プラスミド（以下、『plasmid（Ｇi/olf13）』と称される。）は、プライマー２８に換えてプライマー３１（配列番号４７）が用いられた以外は、plasmid（Ｇαi）の作製と同じ手順により作製された。作製手順が図２３に示される。用いられたプライマーの配列が表４に示される。
（キメラＧタンパク質（Ｇi/olf28）発現プラスミドの作製）
キメラＧタンパク質（Ｇi/olf28）発現プラスミド（以下、『plasmid（Ｇi/olf28）』と称される。）は、鋳型Iとしてplasmid（Ｇi/olf13）を、鋳型IIとしてplasmid（Ｇαolf）をそれぞれ用い、オーバーラップエクステンションＰＣＲによって作製された。図２４に示されるように、鋳型Iを用いたＰＣＲのために、プライマーとしてA-PRIMERおよびB-PRIMERが用いられた。A-PRIMERおよびB-PRIMERを用いると、Ｇαｉの特定の領域のアミノ酸をコードする塩基配列を選択的に増幅させることができる。得られた断片の一部がB-PRIMERの相補的配列に付加され、付着末端が形成された。鋳型IIを用いたＰＣＲのために、プライマーとしてC-PRIMERおよびD-PRIMERが用いられた。C-PRIMERおよびD-PRIMERを用いると、Ｇαolfの特定の領域のアミノ酸をコードする塩基配列を選択的に増幅させることができる。得られた断片の一部がC-PRIMERの相補的配列に付加され、付着末端が形成された。具体的には、A-PRIMERとしてプライマー３２（配列番号４８）が、B-PRIMERとしてプライマー３３（配列番号４９）が用いられた。C-PRIMERとしてはプライマー３４（配列番号５０）が、D-PRIMERとしてはプライマー３５（配列番号５１）が用いられた。オーバーラップエクステンションＰＣＲによって、各ＰＣＲ産物は付着末端を介して互いに連結された。プライマーとしてA-PRIMERおよびD-PRIMERが用いられた。得られた断片はEcoRIおよびSalIにより処理され、あらかじめEcoRIおよびSalIで処理された発現プラスミドにライゲーションされ、plasmid（Ｇi/olf28）を得た。plasmid（Ｇi/olf28）で形質転換された大腸菌が培養された。大腸菌から精製されたplasmid（Ｇi/olf28）が細胞への導入に用いられた。
（キメラＧタンパク質（Ｇi/olf45）発現プラスミドの作製）
表５に示す各プライマーが用いられた以外は、plasmid（Ｇi/olf28）の作製と同じ手順でキメラＧタンパク質（Ｇi/olf48）発現プラスミド（以下『plasmid（Ｇi/olf48）』と称される。）が作製された。
（キメラＧタンパク質（Ｇi/olf94）発現プラスミドの作製）
表５に示す各プライマーが用いられた以外は、plasmid（Ｇi/olf28）の作製と同じ手順でキメラＧタンパク質（Ｇi/olf94）発現プラスミド（以下『plasmid（Ｇi/olf94）』と称される。）が作製された。
（キメラＧタンパク質（Ｇi/olf113）発現プラスミドの作製）
表５に示す各プライマーが用いられた以外は、plasmid（Ｇi/olf28）の作製と同じ手順でキメラＧタンパク質（Ｇi/olf113）発現プラスミド（以下『plasmid（Ｇi/olf113）』と称される。）が作製された。
（キメラＧタンパク質（Ｇi/olf156）発現プラスミドの作製）
表５に示す各プライマーが用いられた以外は、plasmid（Ｇi/olf28）の作製と同じ手順でキメラＧタンパク質（Ｇi/olf156）発現プラスミド（以下『plasmid（Ｇi/olf156）』と称される。）が作製された。
（キメラＧタンパク質（Ｇi/olf195）発現プラスミドの作製）
表５に示す各プライマーが用いられた以外は、plasmid（Ｇi/olf28）の作製と同じ手順でキメラＧタンパク質（Ｇi/olf195）発現プラスミド（以下『plasmid（Ｇi/olf195）』と称される。）が作製された。
各プライマーによって増幅されるアミノ酸配列の領域が表６に示される。
（キメラＧタンパク質（Ｇi/olfα3-β5）発現プラスミドの作製）
キメラＧタンパク質（Ｇi/olfα3-β5）発現プラスミド（以下、『plasmid（Ｇi/olfα3-β5）』と称される。）は、鋳型Iとしてplasmid（Ｇi/olf13）を、鋳型IIとしてplasmid（Ｇαi）をそれぞれ用い、オーバーラップエクステンションＰＣＲによって作製された。図２５に示されるように、鋳型Iを用いたＰＣＲのために、プライマーとしてプライマ
ー３６（配列番号５２）およびE-PRIMERが用いられた。具体的には、E-PRIMERとしてプライマー３７（配列番号５３）が用いられた。得られた断片の一部がE-PRIMERの相補的配列に付加され、付着末端が形成された。鋳型IIを用いたＰＣＲのために、プライマーとしてプライマー３９（配列番号５５）およびF-PRIMERが用いられた。具体的には、F-PRIMERとしてプライマー３８（配列番号５４）が用いられた。得られた断片の一部がF-PRIMERの相補的配列に付加され、付着末端が形成された。プライマー３６およびプライマー３９を用いたオーバーラップエクステンションＰＣＲによって、各ＰＣＲ産物は付着末端を介して互いに連結された。得られた断片はEcoRIにより処理され、あらかじめEcoRIで処理された発現プラスミドにライゲーションされ、plasmid（Ｇi/olfα3-β5）を得た。plasmid（Ｇi/olfα3-β5）で形質転換された大腸菌が培養された。大腸菌から精製されたplasmid（Ｇi/olfα3-β5）が細胞への導入に用いられた。
（キメラＧタンパク質（Ｇi/olfα3-β5,C）発現プラスミドの作製）
キメラＧタンパク質（Ｇi/olfα3-β5,C）発現プラスミド（以下、『plasmid（Ｇi/olfα3-β5,C）』と称される。）は、鋳型、および制限酵素として表７に記載されたものが使用された以外は、plasmid（Ｇolfα3-β5）の作製と同じ手順により作製された。
（キメラＧタンパク質（Ｇi/olfα4-β6）発現プラスミドの作製）
キメラＧタンパク質（Ｇi/olfα4-β6）発現プラスミド（以下、『plasmid（Ｇi/olfα4-β6）』と称される。）は、鋳型、E-PRIMER、F-PRIMER、および制限酵素として表７に
記載されたものが使用された以外は、plasmid（Ｇolfα3-β5）の作製と同じ手順により
作製された。
（キメラＧタンパク質（Ｇi/olfα4-β6,C）発現プラスミドの作製）
キメラＧタンパク質（Ｇi/olfα4-β6,C）発現プラスミド（以下、『plasmid（Ｇi/olfα4-β6,C）』と称される。）は、鋳型、E-PRIMER、F-PRIMER、および制限酵素として表
７に記載されたものが使用された以外は、plasmid（Ｇolfα3-β5）の作製と同じ手順に
より作製された。
（キメラＧタンパク質（Ｇi/olfα3-β5,α4-β6）発現プラスミドの作製）
キメラＧタンパク質（Ｇi/olfα3-β5,α4-β6）発現プラスミド（以下、『plasmid（
Ｇi/olfα3-β5,α4-β6）』と称される。）は、鋳型、E-PRIMER、F-PRIMER、および制限酵素として表７に記載されたものが使用された以外は、plasmid（Ｇolfα3-β5）の作製
と同じ手順により作製された。
（キメラＧタンパク質（Ｇi/olfα3-β5,α4-β6,C）発現プラスミドの作製）
キメラＧタンパク質（Ｇi/olfα3-β5,α4-β6,C）発現プラスミド（以下、『plasmid（Ｇi/olfα3-β5,α4-β6,C）』と称される。）は、鋳型、E-PRIEMR、F-PRIMER、および制限酵素として表７に記載されたものが使用された以外は、plasmid（Ｇolfα3-β5）の作製と同じ手順により作製された。
［電気生理活性の測定］
キメラＧタンパク質と、カリウムイオンチャネルと、化学物質受容体とが発現した細胞（以下、『キメラＧタンパク発現細胞』と称される。）を得た。当該キメラＧタンパク発現細胞の電気生理活性をパッチクランプ法を使用して測定した。キメラＧタンパク発現細胞は以下の手順により作製した。第１に、キメラＧタンパク質発現プラスミドと、カリウムイオンチャネル発現プラスミドと、化学物質受容体発現プラスミドとを作製した。次に、当該３つの発現プラスミドがＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入され、当該細胞中に発現した。
（実施例１）
キメラＧαサブユニットとしてＧi/olf13を具備する、キメラＧタンパク質が採用された。カリウムイオンチャネルとしては、変異型カリウムイオンチャネルKir3.1(F137S)が採用された。化学物質受容体としては、β１アドレナリン受容体が採用された。
（キメラＧタンパク質発現細胞の調製）
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、plasmid（βＡＲ）、plasmidKir3.1(F137S)、およびplasmid（Ｇi/olf13）を発現させた。当該発現の手順が以下に示される。約８０％コンフルエントに培養したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を回収し、新たな培養シャーレに蒔いた。使用した細胞の継代数は１０代以内であった。ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ(fetal bovine serum)、ストレプトマイシン）が用いられた。２４時間培養後、トランスフェクション試薬を用いて当該細胞にプラスミドが導入された。当該細胞はプラスミド導入後４８時間培養され、キメラＧタンパク質発現細胞が調製された。
（電流変化量の測定）
パッチクランプ法を使用して、キメラＧタンパク発現細胞の膜電流が測定された。測定は、β１アドレナリン受容体作動薬であるイソプロテレノール（以下、『ＩＳＯ』と称される。）が供給されない場合と、ＩＳＯが供給された場合において行われた。測定の手順が以下に示される。
（測定のためのサンプル）
ＰＬＬ（ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎ）で処理されたカバーガラス（３ｍｍ×１０ｍｍ、松浪ガラス株式会社製）上にキメラＧタンパク発現細胞を蒔き、４時間静置して計測用サンプルを得た。
（ガラス電極）
測定に用いられたガラス電極の作製手順が以下に記述される。ガラス電極作製装置（Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製『レーザープラ−Ｐ−２０００』）を使用して（ガラス管（外径１．５ｍｍ、内径０．８６ｍｍ、長さ１００ｍｍ）から一端の径が１μｍであるガラスピペットを作製した。当該ガラスピペットに銀／塩化銀（Ａｇ／ＡｇＣｌ）電極を挿入した。当該ガラスピペットは緩衝液Ａで満たされた。緩衝液Ａの組成は細胞内液の組成と類似である。緩衝液Ａの組成が表８に示される。
（測定）
測定作業は顕微鏡（オリンパス株式会社製『ＩＸ７１』）下で行われた。銀／塩化銀（Ａｇ／ＡｇＣｌ）電極上に環流チャンバが設置された。Ｔｙｒｏａｄ緩衝液で満たされた環流チャンバ中に計測用サンプルが配置された。単一の細胞とガラス電極の先端とが接触した状態でガラス電極内を陰圧にした。細胞膜のガラス電極の先端と接触した部分が破断され、等価回路が形成された（全細胞状態（Whole-cell mode)）。細胞の内と外との間の電位差が、パッチクランプアンプ（ＨＥＫＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｉｎｃ．製『ＥＰＣ１０』）を用いて０ｍＶに保持された。この状態下で、環流チャンバ中のＴｙｒｏａｄ緩衝液がＧＩＲＫ緩衝液で置換された。１０秒おきにパルス電位（電位：−５０ｍＶ、継続時間：１００ｍ秒）が印加され、当該印加時に生じた膜電流が測定された。Ｔｙｒｏａｄ緩衝液およびＧＩＲＫ緩衝液の組成が表８に示される。
続いて、β１アドレナリン受容体作動薬であるイソプロテレノール（isoproterenol)（以下、場合により『ＩＳＯ』と称される。）が細胞に接触した場合の膜電流が以下の手順で測定された。環流チャンバ内のＧＩＲＫ緩衝液が試料溶液に置換された。細胞の内と外との間の電位差が０ｍＶに保持された条件下で、１０秒おきにパルス電位（電位：−５０ｍＶ、継続時間：１００ｍ秒）が印加され、当該印加時に生じた膜電流が測定された。試料溶液の組成が表８に示される。
（実施例２〜６）
Ｇi/olf13を具備するキメラＧタンパク質に換えて、それぞれ、表９中に記載されたＧαサブユニットを具備するキメラＧタンパク質が採用されたこと以外は、実施例１と同様にキメラＧタンパク発現細胞が調製され、膜電流が測定された。
（比較例１〜１０）
Ｇi/olf13を具備するキメラＧタンパク質に換えて、それぞれ、表１０中に記載された
Ｇαサブユニットを具備するキメラＧタンパク質が採用されたこと以外は、実施例１と同様にキメラＧタンパク発現細胞が調製され、膜電流が測定された。
（比較例１１）
キメラＧタンパク質発現細胞の調製において、plasmid（Ｇi/olf13）が導入されなかったこと以外は、実施例１と同様に細胞が調製され、膜電流が測定された。
比較例１で用いられたＧαサブユニット（Ｇαi(C351G)）のアミノ酸配列が以下に示される。図４は（Ｇαi(C351G)）の二次元構造を模式的に示す。
MGCTLSAEDKAAVERSKMIDRNLREDGEKAAREVKLLLLGAGESGKSTIVKQMKIIHEAGYSEEECKQYKAVVYSNTIQSIIAIIRAMGRLKIDFGDSARADDARQLFVLAGAAEEGFMTAELAGVIKRLWKDSGVQACFNRSREYQLNDSAAYYLNDLDRIAQPNYIPTQQDVLRTRVKTTGIVETHFTFKDLHFKMFDVGGQRSERKKWIHCFEGVTAIIFCVALSDYDLVLAEDEEMNRMHESMKLFDSICNNKWFTDTSIILFLNKKDLFEEKIKKSPLTICYPEYAGSNTYEEAAAYIQCQFEDLNKRKDTKEIYTHFTCATDTKNVQFVFDAVTDVIIKNNLKDIGLF（配列番号１）
比較例２で用いられたＧαサブユニット（Ｇαolf）のアミノ酸配列が以下に示される。図５は（Ｇαolf）の二次元構造を模式的に示す。
MGCLGNSSKTAEDQGVDEKERREANKKIEKQLQKERLAYKATHRLLLLGAGESGKSTIVKQMRILHVNGFNPEEKKQKILDIRKNVKDAIVTIVSAMSTIIPPVPLANPENQFRSDYIKSIAPITDFEYSQEFFDHVKKLWDDEGVKACFERSNEYQLIDCAQYFLERIDSVSLVDYTPTDQDLLRCRVLTSGIFETRFQVDKVNFHMFDVGGQRDERRKWIQCFNDVTAIIYVAACSSYNMVIREDNNTNRLRESLDLFESIWNNRWLRTISIILFLNKQDMLAEKVLAGKSKIEDYFPEYANYTVPEDATPDAGEDPKVTRAKFFIRDLFLRISTATGDGKHYCYPHFTCAVDTENIRRVFNDCRDIIQRMHLKQYELL（配列番号２）
比較例３で用いられたキメラＧαサブユニット（Ｇi/olf5）のアミノ酸配列が以下に示される。Ｇ i/olf5 はＧαｉタンパク質のＣ末端側から５アミノ酸が、Ｇαolfの対応するアミノ酸で置換したされたキメラＧαサブユニットである。図６はＧi/olf5の二次元構造を模式的に示す。
MGCTLSAEDKAAVERSKMIDRNLREDGEKAAREVKLLLLGAGESGKSTIVKQMKIIHEAGYSEEECKQYKAVVYSNTIQSIIAIIRAMGRLKIDFGDSARADDARQLFVLAGAAEEGFMTAELAGVIKRLWKDSGVQACFNRSREYQLNDSAAYYLNDLDRIAQPNYIPTQQDVLRTRVKTTGIVETHFTFKDLHFKMFDVGGQRSERKKWIHCFEGVTAIIFCVALSDYDLVLAEDEEMNRMHESMKLFDSICNNKWFTDTSIILFLNKKDLFEEKIKKSPLTICYPEYAGSNTYEEAAAYIQCQFEDLNKRKDTKEIYTHFTCATDTKNVQFVFDAVTDVIIKNNLKQYELL（配列番号３）
比較例４で用いられたキメラＧαサブユニット（Ｇi/olf45）のアミノ酸配列が以下に示される。図９はＧi/olf45の二次元構造を模式的に示す。
MGCTLSAEDKAAVERSKMIDRNLREDGEKAAREVKLLLLGAGESGKSTIVKQMKIIHEAGYSEEECKQYKAVVYSNTIQSIIAIIRAMGRLKIDFGDSARADDARQLFVLAGAAEEGFMTAELAGVIKRLWKDSGVQACFNRSREYQLNDSAAYYLNDLDRIAQPNYIPTQQDVLRTRVKTTGIVETHFTFKDLHFKMFDVGGQRSERKKWIHCFEGVTAIIFCVALSDYDLVLAEDEEMNRMHESMKLFDSICNNKWFTDTSIILFLNKKDLFEEKIKKSPLTICYPEYAGSNTYEEAAAYIQCQFEDLNTATGDGKHYCYPHFTCAVDTENIRRVFNDCRDIIQRMHLKQYELL（配列番号６）
比較例５で用いられたＧαサブユニット（Ｇi/olf156）のアミノ酸配列が以下に示される。図１２はＧi/olf156の二次元構造を模式的に示す。
MGCTLSAEDKAAVERSKMIDRNLREDGEKAAREVKLLLLGAGESGKSTIVKQMKIIHEAGYSEEECKQYKAVVYSNTIQSIIAIIRAMGRLKIDFGDSARADDARQLFVLAGAAEEGFMTAELAGVIKRLWKDSGVQACFNRSREYQLNDSAAYYLNDLDRIAQPNYIPTQQDVLRTRVKTTGIVETHFTFKDLHFKMFDVGGQRSERKKWIHCFNDVTAIIYVAACSSYNMVIREDNNTNRLRESLDLFESIWNNRWLRTISIILFLNKQDMLAEKVLAGKSKIEDYFPEYANYTVPEDATPDAGEDPKVTRAKFFIRDLFLRISTATGDGKHYCYPHFTCAVDTENIRRVFNDCRDIIQRMHLKQYELL（配列番号９）
比較例６で用いられたキメラＧαサブユニット（Ｇi/olf195）のアミノ酸配列が以下に示される。図１３はＧi/olf195の二次元構造を模式的に示す。
MGCTLSAEDKAAVERSKMIDRNLREDGEKAAREVKLLLLGAGESGKSTIVKQMKIIHEAGYSEEECKQYKAVVYSNTIQSIIAIIRAMGRLKIDFGDSARADDARQLFVLAGAAEEGFMTAELAGVIKRLWKDSGVQACFNRSREYQLNDSAAYYLNDLDRIAQPNYIPTQQDVLRCRVLTSGIFETRFQVDKVNFHMFDVGGQRDERRKWIQCFNDVTAIIYVAACSSYNMVIREDNNTNRLRESLDLFESIWNNRWLRTISIILFLNKQDMLAEKVLAGKSKIEDYFPEYANYTVPEDATPDAGEDPKVTRAKFFIRDLFLRISTATGDGKHYCYPHFTCAVDTENIRRVFNDCRDIIQRMHLKQYELL(配列番号１０）
比較例７で用いられたキメラＧαサブユニット（Ｇi/olfα3-β5）のアミノ酸配列が以下に示される。図１４はＧi/olfα3-β5の二次元構造を模式的に示す。
MGCTLSAEDKAAVERSKMIDRNLREDGEKAAREVKLLLLGAGESGKSTIVKQMKIIHEAGYSEEECKQYKAVVYSNTIQSIIAIIRAMGRLKIDFGDSARADDARQLFVLAGAAEEGFMTAELAGVIKRLWKDSGVQACFNRSREYQLNDSAAYYLNDLDRIAQPNYIPTQQDVLRTRVKTTGIVETHFTFKDLHFKMFDVGGQRSERKKWIHCFEGVTAIIFCVALSDYDLVLAEDEEMNRMHESMKLFDSICNNKWLRTISIILFLNKKDLFEEKIKKSPLTICYPEYAGSNTYEEAAAYIQCQFEDLNKRKDTKEIYTHFTCATDTKNVQFVFDAVTDVIIKNNLKDCGLF（配列番号１１）
比較例８で用いられたキメラＧαサブユニット（Ｇi/olfα4-β6）のアミノ酸配列が以下に示される。図１６はＧαi/olfα4-β6の二次元構造を模式的に示す。
MGCTLSAEDKAAVERSKMIDRNLREDGEKAAREVKLLLLGAGESGKSTIVKQMKIIHEAGYSEEECKQYKAVVYSNTIQSIIAIIRAMGRLKIDFGDSARADDARQLFVLAGAAEEGFMTAELAGVIKRLWKDSGVQACFNRSREYQLNDSAAYYLNDLDRIAQPNYIPTQQDVLRTRVKTTGIVETHFTFKDLHFKMFDVGGQRSERKKWIHCFEGVTAIIFCVALSDYDLVLAEDEEMNRMHESMKLFDSICNNKWFTDTSIILFLNKKDLFEEKIKKSPLTICYPEYAGSNTYEEAAAYIQCQFEDLNTATGDGKHYCYTHFTCATDTKNVQFVFDAVTDVIIKNNLKDCGLF（配列番号１３）
比較例９で用いられたキメラＧαサブユニット（Ｇi/olfα3-β5,α4-β6）のアミノ酸配列が以下に示される。図１７はＧαi/olfα3-β5,α4-β6の二次元構造を模式的に示す。
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比較例１０で用いられたキメラＧαサブユニット（Ｇi/olfα3-β5,α4-β6,C）のアミノ酸配列が以下に示される。図１９はＧi/olfα3-β5,α4-β6,Cの二次元構造を模式的に示す。
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実施例１〜４、比較例１〜６、および比較例１１の測定結果が表１１および図３０に示される。測定結果は、電流密度の変化量、すなわち、ＩＳＯが供給されていない場合に測定された膜電流の電流密度（電流値／細胞膜容量）とＩＳＯが供給された場合に測定された膜電流の電流密度の差として示される。
実施例１、実施例５、実施例６、比較例１、および比較例７〜１０の測定結果が表１２および図３０に示される。測定結果は、電流密度の変化量、すなわち、ＩＳＯが供給されていない場合に測定された膜電流の電流密度（電流値／細胞膜容量）とＩＳＯが供給された場合に測定された膜電流の電流密度の差として示される。
（ｃＡＭＰ法との比較）
本発明による化学物質の検出感度を、慣用の化学物質検出方法であるｃＡＭＰ法の検出感度と比較した。ｃＡＭＰ法は、作動薬と受容体との相互作用により増加した細胞内液中のｃＡＭＰ濃度が測定され、該測定値に基づいて作動薬の濃度が定量される方法である。具体的には、β１アドレナリン受容体とカリウムイオンチャネルKir3.1(F137S)とを発現
した細胞が、ＩＳＯを含む緩衝液に接触した後に破砕された。得られた破砕液に含有されるｃＡＭＰの濃度が測定された。当該濃度測定は、測定用キット（ａｓｓａｙ ｄｅｓｉｇｎｓ社製；ｃｙｃｌｉｃ ＡＭＰ ＥＩＡ ｋｉｔ）を用いて測定された。当該キットは競合ＥＩＡ（competitive enzyme immunoassay)を用いてｃＡＭＰ濃度を測定する。緩
衝液中のＩＳＯ濃度が１０００ｎＭである場合のｃＡＭＰ濃度を１００とした、各ＩＳＯ濃度でのｃＡＭＰ濃度の比が算出された。一方、ＩＳＯ濃度を変化させて測定を行った以外は、実施例３と同様の測定が行われた。ＩＳＯ濃度が３０ｎＭである場合の電流密度の変化値を１００とした、各ＩＳＯ濃度における電流密度の変化値の比が算出された。結果が表１３および図３２に示される。
表１３および図３２から理解されることが以下に記述される。ｃＡＭＰ法を用いた場合に検出可能なＩＳＯ濃度の下限は約１０ｎＭであると考えられる。なぜならば、ＩＳＯ濃度０〜１ｎＭの緩衝液に接触した場合は、ｃＡＭＰ濃度の、ＩＳＯ濃度に依存的な上昇は観測されなかったからである。ＩＳＯの検出感度の指標となる、β1アドレナリン受容体
に対するＩＳＯの半数効果濃度（ＥＣ50）は１３５ｎＭであった。一方、キメラαサブユニットＧi/olf94タンパク質を用いた本発明の方法では、ＩＳＯの検出下限濃度は０．３
ｎＭであった。イオン電流の変化量は、ＩＳＯ濃度約３０ｎＭで飽和した。この場合のβ１アドレナリン受容体に対するＩＳＯの半数効果濃度は１ｎＭであった。本発明のキメラＧαサブユニットタンパク質を用いた化学物質の検出方法によれば、従来、一般的に用いられてきたｃＡＭＰ法に比して、約１００倍の感度で、ＩＳＯが検出され得る。細胞内の複雑な分子間反応に依拠することなく、化学物質の受容体への結合を、キメラＧタンパク質を介して直接イオンチャネルに伝達したことが、当該高感度な検出を可能にしたと考えられえる。
（βアドレナリン受容体作動薬の検出）
イソプロテレノール以外のβ１アゴニストの検出を行った。化学物質として、ＩＳＯに加えて、β１アドレナリン受容体選択的な作動薬であるドブタミン（dobutamine）、およびβアドレナリン受容体の作動薬であるドーパミン（dopamine）を用いた以外は実施例３と同様の測定を行った。測定結果が表１４および図３３に示される。測定結果は、ドーパミンについては３００００ｎＭ、ドブタミンについては１００ｎＭ、ＩＳＯについては濃度３０ｎＭで観測された電流密度の変化値を１００とした相対値として記載される。
いずれの作動薬を用いた場合においても作動薬濃度の増加に伴い、電流密度の変化値が増加した。ドーパミン、およびドブタミンのＥＣ50値は、それぞれ、１０００ｎＭおよび５０ｎＭであった。電流密度の変化は、作動薬が化学物質の受容体を介して、キメラＧタンパク質を活性化させ、イオンチャネルのゲートを開かせることによって生じていることが合理的に推測される。なぜならば、作動薬の種類によってＥＣ50値が異なるからである。すなわち、作動薬は直接ではなく、間接的にキメラＧタンパク質を活性化している。
（参考例）
本発明者らは、本発明に先立って以下の検討を行い、キメラＧαサブユニットの設計方針を決定した。Ｇαサブユニットとして、Ｇαi（Ｃ３５１Ｇ）、Ｇαolf、およびＧi/olf13を使用して、ＩＳＯとの接触により生じるイオン電流を測定した。測定は、実施例１と同様の方法により行われた。
図２６に示されるように、キメラＧαサブユニットとしてＧαｉ（Ｃ３５１Ｇ）が用いられ、ＩＳＯが供給されていない場合、パルス波が印加された直後に約−０．２ｎＡの電流値が計測された。ここで、電流値が−（マイナス）であることは、カリウムイオンが脂質二重膜の表側から裏側（細胞外から細胞内）へ移動したことを示している。ＩＳＯが供給された場合、電流値は変化し、約０．５ｎＡとなった。
図２７に示されるように、キメラＧαサブユニットとしてＧi/olf13が用いられた場合、ＩＳＯの供給により電流値は変化し、約−２．５ｎＡとなった。図２８に示されるように、キメラＧαサブユニットとしてＧαolfタンパク質が用いられた場合、Ｇαi（Ｃ３５１Ｇ）が用いられた場合と同様に、約０．５ｎＡの電流値が測定され、ＩＳＯ添加による電流値の変化量は小さかった。
本発明者らは、上記測定結果から以下の結論を導いた。Ｇαi（Ｃ３５１Ｇ）はカリウムイオンチャネルを活性化することができるが、化学物質の受容体と結合することはできない。Ｇαolfは化学物質の受容体と結合することができるが、カリウムイオンチャネルを活性化することはできない。そのためＩＳＯ添加による電流変化量は小さかった。一方、Ｇi/olf13が用いられた場合、キメラＧαサブユニットはＣ末端のＧαolf領域を介して化学物質の受容体と結合することができるとともに、Ｇαi領域がカリウムイオンチャネルを活性化するため、ＩＳＯの添加によって大きな電流変化が観察された。従って、Ｇαサブユニットのキメラ化は、ＩＳＯ添加による電流変化量を増加させる。
さらに、キメラＧαサブユニットとしてＧi/s13が用いられた場合と、Ｇi/olf13が用いられた場合における、電流変化量が比較された。測定結果が表１５および図２９に示される。Ｇαi（Ｃ３５１Ｇ）およびＧolfが用いられた場合の測定結果が参考のために並べて示される。
Ｇi/ofl13が用いられた場合の方が電流変化量はＧi/s13が用いられた場合の電流変化量よりも大きかった。従って、ＧαiとＧαolfとのキメラが用いられた場合、より大きな電流変化が期待できると判断された。従って、Ｇαiのアミノ酸配列で、化学物質の受容体との連動に関与すると一般に考えられている領域が、対応するＧαolfのアミノ酸配列で置換された、キメラＧαサブユニットを作製することを決定した。
本発明のキメラＧタンパク質によれば、化学物質受容体と結合する化学物質を検出することができる。

Claims (9)

  1. 脂質二重膜の表側から裏側にカリウムイオンを輸送する方法であって、以下の工程（ａ）および工程（ｂ）を具備する：
    前記脂質二重膜を用意する工程（ａ）
    ここで、前記脂質二重膜は、化学物質の受容体、Ｇタンパク質、およびカリウムイオンチャネルを具備し、
    前記Ｇタンパク質は、キメラＧαサブユニット、およびＧβγサブユニット複合体を具備し、
    前記キメラＧαサブユニットは、Ｇi/olf13（配列番号：０４）、Ｇi/olf28（配列番号：０５）、Ｇi/olf94（配列番号：０７）、Ｇi/olf113（配列番号：０８）、Ｇi/olfα3-β5,C（配列番号：１２）、またはＧi/olfα4-β6,C（配列番号：１５）のいずれかからなり、および
    前記化学物質および前記カリウムイオンを前記表側から供給し、前記キメラＧαサブユニットおよび前記Ｇβγサブユニット複合体の放出、および前記Ｇβγサブユニット複合体の前記カリウムイオンチャネルへの結合により、前記表側から前記裏側に前記カリウムイオンを輸送する工程（ｂ）。
  2. 前記化学物質が、アドレナリン受容体作動薬である請求項１に記載の方法。
  3. 前記カリウムイオンチャネルが、Ｇタンパク質共役型内向き整流カリウムイオンチャネルである、請求項１に記載の方法。
  4. 化学物質を検出又は定量する方法であって以下の工程（ｃ）〜（ｅ）を具備する：
    脂質二重膜、前記脂質二重膜の表側に位置する第１液体、および前記脂質二重膜の裏側に位置する第２液体を用意する工程（ｃ）、
    ここで、前記脂質二重膜は、化学物質の受容体、Ｇタンパク質、およびカリウムイオンチャネルを具備し、
    前記Ｇタンパク質は、キメラＧαサブユニット、およびＧβγサブユニット複合体を具備し、
    前記キメラＧαサブユニットは、Ｇi/olf13（配列番号：０４）、Ｇi/olf28（配列番号：０５）、Ｇi/olf94（配列番号：０７）、Ｇi/olf113（配列番号：０８）、Ｇi/olfα3-β5,C（配列番号：１２）、またはＧi/olf α4-β6,C（配列番号：１５）のいずれかからなり、
    前記第１液体はカリウムイオンを含有し、
    前記第１液体に前記化学物質を供給する工程（ｄ）、および
    前記第１および第２液体の少なくともいずれか一方のカリウムイオンの量を測定し、前記カリウムイオンの量に基づいて前記化学物質を検出又は定量する工程（ｅ）。
  5. 前記化学物質が、アドレナリン受容体作動薬である請求項４に記載の方法。
  6. 前記カリウムイオンチャネルが、Ｇタンパク質共役型内向き整流カリウムイオンチャネルである、請求項４に記載の方法。
  7. 化学物質を検出または定量する方法であって、以下の工程（ｆ）〜（ｈ）を具備する：
    脂質二重膜を用意する工程（ｆ）、
    ここで、前記脂質二重膜は、化学物質の受容体、Ｇタンパク質、およびカリウムイオンチャネルを具備し、
    前記Ｇタンパク質は、キメラＧαサブユニットおよび前記Ｇβγサブユニット複合体を具備し、
    前記キメラＧαサブユニットは、Ｇi/olf13（配列番号：０４）、Ｇi/olf28（配列番号：０５）、Ｇi/olf94（配列番号：０７）、Ｇi/olf113（配列番号：０８）、Ｇi/olfα3-β5,C（配列番号：１２）、またはＧi/olfα4-β6,C（配列番号：１５）のいずれかからなり、
    前記脂質二重膜の表側および裏側にそれぞれ位置する第１および第２液体を供給し、前記第１および第２液体の間に前記脂質二重膜を挟む工程（ｇ）、
    ここで、前記第１液体はカリウムイオンおよび化学物質を含有し、および
    前記第１および第２液体の少なくともいずれか一方のカリウムイオンの量を測定し、前記カリウムイオンの量に基づいて前記化学物質を検出または定量する工程（ｈ）。
  8. 前記化学物質が、アドレナリン受容体作動薬である、請求項７に記載の方法。
  9. 前記カリウムイオンチャネルが、Ｇタンパク質共役型内向き整流イオンチャネルである、請求項７に記載の方法。
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