JP4899038B2 - 抗ゼラチン抗体の測定法 - Google Patents

Description

産業上の利用分野

本発明は、
イ、血液中の抗ゼラチン抗体、そのアレルゲンとなるゼラチン動物種及びその分画を測定する方法と試薬
ロ、特定動物のみから得られるゼラチンと、これを添加した食品・薬剤
に関する物である。

従来、ゼラチンアレルギ−者を発見するには、反応を起こした食品や薬剤の共通成分を推定いくのが一般的で、時間を要した。又、専門医にゼラチンアレルギ−者と診断されても、ゼラチンは、様々な食品や薬剤に微量ずつ含まれているのでどの食品を避けるべきか不明で、又ゼラチンアレルギ−者用の食品もない。
更にゼラチンアレルギ−者は、一般に用いられる薬剤、例えば疾病予防の為に当然投与されるべき必要なワクチンも、ゼラチンを含む為、時には避けなくてはならなかった。

発明が解決しょうとする課題

本発明者は、長い間、ゼラチンアレルギ−者の簡便な発見方法、食品・薬剤中の微量ゼラチンの検出方法、及びゼラチンアレルギ−者用の食品・薬剤の研究に努めた。

課題を解決するための手段

その結果、本発明者は、ゼラチンアレルギ−者の簡便な発見方法として、下記１、２、３、４を確立した。

１血液中の抗ゼラチン抗体とその由来動物種を免疫反応を用いて測定する方法とその試薬。
ヒト血清中の抗ゼラチン抗体を、酵素免疫反応（ＥＬＩＳＡ）で測定する時、どの種のゼラチンと交叉するか知る為、あらかじめ動物種が明確なゼラチンを、種別にプレ−トにコ−トする事、及び抗ゼラチン抗体として、ＩｇＥを捕捉する為、第二抗体として、抗ヒトＩｇＥ抗体を用いる測定法及びその試薬。
つまり試薬として、１）各種動物由来のゼラチンをコ−トしたプレ−ト２）酵素標識抗ヒトＩｇＥ抗体３）発色基質（ＴＭＢ，過酸化水素）４）反応停止液（硫酸）を用い、一般の酵素免疫反応によりヒト血清を検体として測定する。

もちろん、免疫反応として、酵素免疫反応に限定されず、ＲＩＡ，免疫発光法、凝集反応他を含み、酵素標識の抗体としては、ポリクロ−ナル又はモノクロ−ナル抗体を問わず、又それを放射性物質、発光物質で標識した物、無標識物でも良い。
プレ−トをゼラチンでコ−トする時、プレ−ト毎に動物種を変えても良いが、同一プレ−トの穴毎にかえて、パネルにする方が望ましい。同一検体と複数のゼラチンとの反応を、一目で観察できるからである。又、動物種毎にプレ−トや穴に、マ−クや色をつければ識別しやすい。
用いるゼラチンの動物種としては、ウシ、ブタ、ニワトリ、羊、鮭、タコ等、又これに限定されない。
単に、ゼラチン抗体を検出するなら、プレ−トにコ−トするゼラチンは、複数種を混合したもので良いが、それでは、避けるべきゼラチンの動物種までは明確に成らない。更に第二抗体は、抗ヒトＩｇＥ抗体に限定されず、抗ヒトイムノグロブリン抗体でも良いが、抗ヒトＩｇＥ抗体の方が望ましい。

２血液中の抗特定分画ゼラチン抗体を免疫反応を用いて測定する方法と試薬。
各動物種のゼラチンを電気泳動で分画した後、この各分画を採取し、前述「１」と同様に、プレ−トにコ−トする。他は前述「１」と同様の試薬と測定法である。これにより、抗ゼラチン抗体と反応する動物種のみならず、反応するゼラチンの分画まで確定できる。

３ゼラチンを用いた皮内注射法とその注射剤
各動物種由来の微量のゼラチンを、例えばウシ、ニワトリ、サケの、１μｇ〜０．０１μｇ／ｍｌを各別個のリン酸バッファ−に溶解し、その０．１ｍｌ〜０．０１ｍｌを皮内注射し、その部位に発赤を生じる時にどの動物種由来のゼラチンに陽性かを判定できる。
この時、ゼラチンは、前述「２」の電気泳動分画を用いれば、より適格にアレルゲンを推定できる。
ゼラチンの注射量は、濃度０．０１μｇ／ｍｌの液を、０．０１ｍｌ投与で、充分であるが、これに限定されない。溶解液は、リン酸バッファ−が望ましいが、それ自身が反応に影響を与えないものであれば、代用できる。

４ゼラチンを用いたパッチ反応法とその試薬。
各種動物由来の、例えばウシ、ニワトリ、鮭由来の微量のゼラチン、例えば１ｍｇ〜０．５μｇ／平方ｃｍを各別個のパッチに付着させ、これを、通常のパッチ試験と同様、背部に貼り、その部位に発赤を生じる時、どの動物由来のゼラチンに陽性か判定できる。
この時、ゼラチンは、前述「２」の電気泳動分画を用いれば、より適格にアレルゲンを推定できる。

従来ゼラチンアレルギ−と称されていた人が、全ての動物由来のゼラチンに反応するものではなく、ウシ由来のみに反応することを発見した。又、特定分画としてウシ由来α２のみと反応した。他方各種市販ゼラチンを調べたところその由来は全てウシであった。ウシがゼラチンの原料として繁用されるから、いわゆるゼラチンアレルギ−者は、ウシ由来のゼラチンのみに反応するのである。ゼラチンとしてブタが汎用されれば、ゼラチンアレルギ−者のアレルゲンは、ブタゼラチンに特定される可能性を示す。
これは、「ゼラチンはコラ−ゲンの変性したものであり、コラ−ゲンは構造上動物種差がないから、どの動物由来のゼラチンも一緒だろう。だから、ゼラチンアレルギ−者は、全ての動物由来のゼラチンに反応するはずだ。」と言う一般の思い込みを否定するものであった。
つまり、ゼラチンは、構造上、機能上、由来動物の種差はないが、アレルギ−反応のような免疫上の違いを示すと言う事である。
本発明者は、以上の発明と発見から、更に下記５・６の発明を完成した。

５食品・薬剤中のゼラチンの存在と、その由来動物種を免疫反応を用いて測定する方法と試薬。
例えば、食品や薬剤、具体的には、ケ−キやワクチン中のゼラチンの存在と、その由来動物種を知る為、サンドイッチ法による酵素免疫反応（ＥＬＩＳＡ）で測定する時、サンドイッチ法の一方又は両方を、特定動物種のゼラチンにのみ反応する抗ゼラチン抗体を用いることを特長とする測定法及びその試薬である。
試薬としては、１）特定動物種のゼラチンに反応する抗ゼラチン抗体をコ−トしたプレ−ト２）特定動物種のゼラチンに反応する酵素標識抗体３）発色基質（ＴＭＢ、過酸化水素）４）反応停止液（硫酸）を用い一般の酵素免疫反応により、食品又は薬剤を検体として測定する。
食品や薬剤が直接検体として用い難い形状の時は、これを強酸（又はアルカリ）で処理すれば、ゼラチンが抽出されるので、強酸（又はアルカリ）を除き、適当な緩衝液、例えばリン酸バッファ−に溶解させて検体とする。
免疫反応としては、酵素免疫反応のみでなく、ＲＩＡ、免疫発光法、凝集反応他を含み、サンドイッチ法で使用する抗体はポリクロ−ナル又はモノクロ−ナル抗体を問わず、又、それを、酵素、放射性物質、発光物質で標識したものでも良い。特定動物種としては、ウシ、ブタ、ニワトリ、鮭に限定されない。

６特定動物由来のゼラチンとこれを含む食品、薬剤。
特定動物由来のゼラチンを得るには、ゼラチン製造時には、単一動物種のみを扱い、得られたゼラチンを他種のものと混合しない。用いるゼラチンの動物種としては、ウシ、ブタ、ニワトリ、羊、鮭、タコなど、これに限定されない。
ウシゼラチンは、その骨を原料とし、強酸（強アルカリ）、脱灰の処理で製するが、他の動物でも、例えば、ブタ、羊、ニワトリでも同様に可能で有る。
動物でも、魚類は、例えば鮭は、皮を用いる。軟体類は、例えばタコ、イカは、そのまま用いる。又、ウシ、ブタ、羊、ニワトリは、皮も利用できる。
皮を原料とする時は、真皮のみを用いる事が望ましい。軟体類や皮からの場合、強酸（強アルカリ）に漬け、加熱することで抽出される。
ゼラチンの製法は、本法に限定されず、例えば、コラ−ゲンを製し、これを、加熱変性させても良い。

７特定動物由来のゼラチンを含む食品及び又は薬剤。
前述の各種由来のゼラチンを、従来の原料不明のゼラチンに代えて、食品や薬剤に加えれば、特定動物由来のゼラチンを含む食品・薬剤が得られる。特定動物由来のゼラチンを、できるだけ多くそろえることは、将来、ウシ以外の動物ゼラチンにアレルギ−が現れた時に、有用である。
食品に加えるゼラチンは、その食味の点から他の材料に代え難い。例えば、ゼラチンゼリ−や、煮凝である。
薬剤に加えるゼラチンは、薬剤の安定化の為に代え難い。例えば、ワクチンやカプセルである。ワクチンに、代用物質としてウシ血清アルブミンやヒト血清アルブミンを加える事は、抗原性、安全性で問題がある。
又、ワクチンは、時に、ゼラチンを培地として用い、ふけい剤として用いる。
これらの時、一般に用いられるゼラチンに代えて、特定動物種、例えば、ニワトリ由来のゼラチンを使用すれば、従来製していたものと同じ食品や薬剤が、同じ製法で得られ、同じ効果を得られ、ウシゼラチンアレルギ−者は安心して利用できる。

ゼラチンアレルギ−患者血清中の抗ゼラチン抗体とその由来動物種を測定した。健常者血清を対照とし、次の試薬で酵素免疫反応を行った。
試薬１、ウシ（タイプＩコラ−ゲン型）ゼラチン、ニワトリ（タイプＩコラ−ゲン型）ゼラチン、鮭由来ゼラチンを各０．５μｇ／穴をコ−トしたマイクロプレ−ト
試薬２、ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＥ抗体（ラット由来ポリクロ−ナル）
試薬３、ＴＭＢ試薬（ＴＭＢ０．１％，過酸化水素０．０２％、０．１Ｍクエン酸緩衝液）
試薬４、反応停止液（０．５Ｍ硫酸）
検体は、リン酸緩衝液で１００倍に希釈し、１００μｌ／穴を用いた。
測定方法：試薬１に検体１００μｌ／穴→２時間インキュベ−ション及び洗浄→試薬２、１００μｌ／穴→１時間インキュベ−ションおよび洗浄→試薬３、１００μｌ→３０分インキュベ−ション→試薬４、５０μｌ→測定（吸光度４５０ｎｍ）
結果：検体中には、抗ウシゼラチン抗体が認められたが、抗ニワトリゼラチン抗体、抗鮭ゼラチン抗体は認められなかった。よって、このゼラチンアレルギ−患者は、ウシゼラチンアレルギ−で、ウシゼラチンのみ避ければ良い。又、本法は、血清中の抗ゼラチン抗体の存在とその由来動物種を測定する方法となり得る。

ウシ由来ゼラチンを電気泳動により分画した。この分画の中から、α１とα２を、「実施例２」の「試薬１」を置き換え「実施例２」と同様の実験を行った。
結果：検体中の抗ウシ由来ゼラチン抗体はα２分画にのみ反応し、α１分画とは反応しなかった。よって、このゼラチンアレルギ−患者は、ウシα２分画のみがアレルゲンで、ウシ由来ゼラチンを食品や薬剤に用いる時、α２分画を除いて用いれば良い。

ゼラチンアレルギ−者にウシ由来ゼラチン、ニワトリ由来ゼラチン、サケ由来ゼラチンの各０．００１μｇ／１０μｌリン酸バッファ−を皮内注射した。
又、日をあらため、これらの注射薬を、同量、同一人に皮下注射した。
結果：皮内注射後、ウシ由来ゼラチンのみ、翌日に発赤を示し、ニワトリ及びサケ由来ゼラチンは発赤を観察されなかった。皮下注射についても、異常がなかった。
よって、ゼラチンを用いた皮内注射反応法は、ゼラチンアレルギー患者の発見と、そのゼラチン由来種を明確にする。又、非ウシ由来ゼラチンを含む注射薬剤はウシゼラチンアレルギ−者に安全に投与し得る。

ゼラチンアレルギ−患者の背部に、ウシ由来ゼラチン、ニワトリ由来ゼラチン、サケ由来ゼラチンの１００μｇ／９平方ミリメ−トルのガ−ゼをしっかりと貼り付けた。
結果：付着後、ウシ由来ゼラチンのみが、２日後赤色斑を示し、ニワトリ及びワケ由来ゼラチンには赤色斑が観察されなかった。よって、ゼラチンを用いたパッチ反応法は、ゼラチンアレルギ−患者の発見と、そのアレルギ−由来種を明確にする。

食品及び薬剤のゼラチンの存在とその由来動物を測定した。ゼラチンを大量に含む水菓子及びＭＭＲワクチンを検体とし、次の試薬で酵素免疫反応を行った。対象検体には、ウシゼラチン、ニワトリゼラチン（共にタイプＩコラ−ゲン型）を使用した。
試薬１、抗ウシ（タイプＩコラ−ゲン型）ゼラチン抗体、抗ニワトリ（タイプＩコラ−ゲン型）ゼラチン抗体を各０．５μｇ／穴をコ−トしたマイクロプレ−ト
試薬２−１、ＨＲＰ標識抗ウシ（タイプＩコラーゲン型）ゼラチン抗体
試薬２−２、ＨＲＰ標識抗ニワトリ（タイプＩコラ−ゲン型）ゼラチン抗体
試薬３、ＴＭＢ試薬（ＴＭＢ０．１％，過酸化水素０．０２％、０．１Ｍクエン酸緩衝液）
試薬４、反応停止液（０．５Ｍ硫酸）
検体は、リン酸緩衝液に溶解させ、１００μｌ／穴を用いた。
測定方法：試薬１に検体１００μｌ／穴→２時間インキュベーション及び洗浄→試薬２−１、２−２、各１００μｌ／穴→１時間インキュベ−ションおよび洗浄→試薬３、１００μｌ→３０分インキュベ−ション→試薬４、５０μｌ→測定（吸光度４５０ｎｍ）し、ＯＤ値の高さで判定。
結果：検体中には、ウシ由来ゼラチンが認められたが、ニワトリ由来ゼラチンは認められなかった。よって、本法は、食品・薬剤中のゼラチンの存在とその由来動物種を測定する方法となり得る。

ゼラチンアレルギ−者に、ウシ由来ゼラチン、ニワトリ由来ゼラチン、サケ由来ゼラチン各０．０３％含有０．０１Ｍクエン酸水１０ｍｌを口くう内に２０秒間含ませ、吐き出させた後、観察した。
結果：ウシ由来ゼラチンの時のみ、口くう内に発赤が見られたが、ニワトリ由来ゼラチン及びサケ由来ゼラチンの時には、口くう内に変化は見られなかった。よって、非ウシ由来ゼラチンを用いた食品や内服薬剤はウシゼラチンアレルギ−者に使用できる。

鮭由来ゼラチン、ニワトリ皮膚由来ゼラチンを、別々に、温湯で希釈した出汁に加え、加熱した後、冷却し、鮭由来ゼラチンとニワトリ由来ゼラチンの煮凝を得た。ウシゼラチンアレルギ−者に、各１０ｇを、食してもらったが、まったく変化はなかった。
これにより、単一動物由来のゼラチンを加えた食品が得られる事、非ウシゼラチン添加の食品を、ウシゼラチンアレルギ−者は、食することができることが明らかである。

ニワトリ由来ゼラチンを３％濃度に、０．０１Ｍ酢酸に溶解させた後、乾燥させて、シ−ト状にした。このシ−トで、乳糖１００ｍｇを包み、ウシゼラチンアレルギ−者に、内服してもらったが、まったく変化は見られなかった。
これにより、非ウシ由来のゼラチンは、ウシゼラチンアレルギ−者に、カプセルとして使用できる。

発明の効果

従来、ゼラチンアレルギ−は、卵、牛乳、そば等の食物アレルギ−と同様切実な問題であった。卵、牛乳、そばは、その食品を食べなければ済むが、ゼラチンは、そのままの形の事はなく、安定剤として薬剤に、食感剤として食品に、又その他の理由で、多くの食品、薬剤に含まれている。しかし含有を明示されていることは少ない。
それ故、薬剤や食品で、異常反応を示した時、主成分以外のゼラチンが原因であることを特定することは困難であった。又、ゼラチンがアレルゲンと判明しても、避けるべき食品は不明であった。治療上、予防上、必要な薬剤を使用するのに不安であった。
本発明は、このような状況を憂慮し、ゼラチンアレルギ−者を見つけだし、アレルゲンとなる動物種のゼラチン及びその分画を特定し、避けるべき食品、薬剤を示すことを可能にし、更に彼等の為に必要な食品と薬剤の供給を可能にした。

Claims (2)

1. アレルゲンであるα２分画を除いたゼラチン又はコラーゲンを含有する食品。
2. 請求項１のゼラチン又はコラーゲンを含有するワクチン又はカプセル。