JP4888622B2

JP4888622B2 - Oligonucleotide and method for detecting batylscore glance using the same as primer

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Publication number: JP4888622B2
Application number: JP2001167901A
Authority: JP
Inventors: 章武内
Original assignee: QP Corp
Current assignee: QP Corp
Priority date: 2001-06-04
Filing date: 2001-06-04
Publication date: 2012-02-29
Anticipated expiration: 2021-06-04
Also published as: JP2003038182A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、バチルスコアグランスの検出方法に関する。さらに詳しくは、特定の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしてポリメラーゼ連鎖反応法（Polymerase Chain Reaction、以下ＰＣＲ法と省略する）を行い、増幅されたプライマーの伸長物を検出することによりバチルスコアグランスを検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
バチルスコアグランス（Bacillus coagulans）は耐熱性のグラム陽性細菌の一つであり、中でも、缶詰、レトルト製品等の１００℃以上の加熱殺菌が施される容器詰め食品において、フラットサワーを引き起こす細菌として知られている。ここで、フラットサワーとは、容器の外観が正常であるにもかかわらず、内容物が細菌により酸敗している状態をいう。
【０００３】
バチルスコアグランスによる汚染を確認するためには、検査材料が患者の吐瀉物、糞便、又は食品等の抜き取り材料である場合、一般に、増菌培養、分離培養を経て各種確認試験が行なわれる。この方法でバチルスコアグランスによる汚染を確認するまでには、通常、１週間程度が必要である。その際に温度、培地等の環境が適切に調整されていないと培養できない。例えば、バチルスコアグランスの中でも培養中の増殖が遅いものは、共存する微生物により増殖が阻害されることがある。さらに、缶詰中でフラットサワーが起きた場合、バチルスコアグランス自体が産生される酸により死滅し、培養法ではバチルスコアグランスを検出できない場合もある。このため、バチルスコアグランスによる汚染の確認試験の操作は、煩雑で熟練を要するものとなっている。
【０００４】
これに対して、近年、藤原らはＰＣＲ法を使用し、そのプライマーとして、バチルスコアグランスのspoIIＡ遺伝子をコードするヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的となるように化学合成した２種のオリゴヌクレオチドを使用することにより、バチルスコアグランスの特定領域のオリゴヌクレオチドを増幅し、これを検出することを試みている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、藤原らのバチルスコアグランスの検出方法は、芽胞形成蛋白をコードする遺伝子（spoIIＡ）を標的としており、蛋白質をコードする遺伝子の一般的性質として、２つおきに保存されにくいヌクレオチドが存在することから、バチルスコアグランス種内でプライマーを規定した特定領域のオリゴヌクレオチドが保存されているとは考えにくい。
【０００６】
本発明は、このような従来技術の課題に対し、ＰＣＲ法でバチルスコアグランスを検出するための新規のプライマーを開発し、雑菌としてバチルス属の異種が存在してもバチルスコアグランスを良好に検出できるようにすることを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、バチルスコアグランスにおいて、16SrRNAをコードするヌクレオチド配列では種又は属のレベルで配列が保存され、またこの配列には、保存されにくいヌクレオチドが２つおきに存在することもないので、ＰＣＲ法で標的とするのに好適であり、さらにＰＣＲ法で特定のプライマーを使用することにより、バチルスコアグランスを異属あるいは同属異種と区別して良好に検出できることを見出した。
【０００８】
即ち、本発明は、バチルスコアグランスの16SrRNAをコードするヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的となるように化学合成されたオリゴヌクレオチドであって、配列番号１又は２に示される塩基配列
(5´)CATGGAGGAAAAAGG(3´) （配列番号１）
(5´)CCTGTTCGAACGGC(3´) （配列番号２）
を含むことを特徴とするオリゴヌクレオチドを提供する。
【０００９】
また、バチルスコアグランスの16SrRNAをコードするヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的となるように化学合成された２種のオリゴヌクレオチドからなるプライマーであって、少なくともその一方が上述のオリゴヌクレオチドからなることを特徴とするプライマーを提供する。
【００１０】
さらに、そのようなプライマーを検体に加え、ＰＣＲ法によりプライマーの伸長反応と標的とするヌクレオチド配列の増幅を行い、そのヌクレオチド配列の検出を行うことを特徴とするバチルスコアグランスの検出方法を提供する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】
本発明がバチルスコアグランスの検出のために行うＰＣＲ法は、Saikiが開発したPolymerase Chain Reaction法（Science,230,1350(1985)）に基づくものである。
【００１３】
本発明では、ＰＣＲ法によりバチルスコアグランスを検出するに際して使用するプライマーとして、特定の塩基配列を有する本発明のオリゴヌクレオチド、即ち、バチルスコアグランスの16SrRNAをコードするヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的となるように化学合成されたオリゴヌクレオチドであって、配列番号１又は２に示される塩基配列
(5´)CATGGAGGAAAAAGG(3´) （配列番号１）
(5´)CCTGTTCGAACGGC(3´) （配列番号２）
を含むオリゴヌクレオチドを使用する。
【００１４】
これら配列番号１又は２で示されるオリゴヌクレオチドの配列は、バチルスコアグランスの同属異種及び異属の16SrRNAの塩基配列を詳細に解析した結果、バチルスコアグランスの異株間に保存され、同属異種及び異属と完全に識別される領域を見出すことにより決定されたものである。
【００１５】
本発明のオリゴヌクレオチドとしては、配列番号１又は２で示される塩基配列を含む限り、その5´末端側又は3´末端側が延長されていてもよく、連鎖する塩基数が１４〜４０のものが好ましい。例えば、好ましいオリゴヌクレオチドとして、配列番号３又は４に示される塩基配列
(5´)TCCGCATGGAGGAAAAAGG(3´) （配列番号３）
(5´)CGCCCTGTTCGAACGGC(3´) （配列番号４）
を有するオリゴヌクレオチドをあげることができる。
【００１６】
これに対し、連鎖する塩基数が少なすぎるとバチルスコアグランスの16SrRNAをコードするヌクレオチド配列以外の遺伝子と反応し、バチルスコアグランスの検出の選択性が低下するので好ましくない。また、連鎖する塩基数が多すぎるとバチルスコアグランスの16SrRNAをコードするヌクレオチド配列との結合が不安定となりやすいので好ましくない。
【００１７】
本発明のオリゴヌクレオチドとしては、配列番号１又は２で示される塩基配列を含む限り、オリゴヌクレオチドを構成するデオキシリボースや塩基について、その一部に他の分子が付加したり、その一部が他の分子で置換されるなどにより修飾されているものも含まれる。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドには、バチルスコアグランスの16SrRNAをコードするオリゴヌクレオチドをＰＣＲ法で増幅した後、そのオリゴヌクレオチドの検出を簡略化するため、プライマーとするオリゴヌクレオチドの5´末端を蛍光色素であるフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識したものが含まれる。この他、5´末端にビオチンを結合し、アビジンと共有結合させたペルオキシダーゼを結合させ得るものや、デオキシリボース骨格間を結合しているリン酸の中の酸素をイオウ原子に置き換えることによりアンチセンス化したもの等が含まれる。
【００１８】
本発明のオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲ法でバチルスコアグランスを検出する場合の１組のプライマーの一方として使用する場合に、これと組み合わせて使用するもう一方のプライマーとしては、正規鎖側プライマーとして公知のものも使用できるが、前述の配列番号１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとを一対のプライマーとして使用することが好ましい。
【００１９】
正規鎖側と相補鎖側の１組のプライマーを使用し、バチルスコアグランスに特異的なオリゴヌクレオチドを増幅するＰＣＲ法自体は公知の方法に従うことができる。即ち、まず、検体を熱処理することにより検体中の二本鎖ＤＮＡを一本鎖に分離し、これに１組のプライマーを作用させて、相補的な検体のオリゴヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズさせ、次に、ＤＮＡポリメラーゼと４種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）との存在下でプライマーの下流の領域を選択的に合成する。そしてこの操作を２０〜４０サイクル程度繰り返すことにより、検体中の特異的なオリゴヌクレオチドをプライマーの伸長物として増幅することができる。また、この増幅は、電気泳動、クロマトグラフィー等により確認することができ、これにより検体中のバチルスコアグランスを容易にかつ確実に検出することが可能となる。
【００２０】
なお、このＰＣＲ法を適用する検体としては、患者の吐瀉物、糞便、又は食品等の抜き取り材料等をあげることができる。
【００２１】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明する。
【００２２】
実施例１
（１）検体の調製
バチルスコアグランスとして、表１中の縦の見出し欄に示したものを用い、それぞれ増菌用の平板培地に接種し、４５℃で一晩培養した。菌体を掻き取り、０．８５％食塩水に懸濁し、沸騰水中で１０分間加熱することによりＤＮＡを抽出し、遠心分離した上澄液を検体とした。なお、この懸濁液中の菌濃度は１０⁷ｃｆｕ／ｍｌ程度であった。
【００２３】
（２）プライマーの合成
バチルスコアグランスの16SrRNAをコードするヌクレオチド配列を標的とする、相補鎖側又は正規鎖側プライマーとして、配列番号１、２、３又は４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをホスホアミダイト法により合成した。
【００２４】
（３）反応液の調製とＰＣＲ反応
検体液５μｌに１０倍に濃縮されている反応用バッファー５μｌ（宝酒造株式会社製、ＴａＫａＲａＴａｑに付属のＢｕｆｆｅｒ）、４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）混合液（宝酒造株式会社製、ＴａＫａＲａＴａｑに付属のｄＮＴＰ混合液）４μｌ、表１に示すように、正規鎖側プライマーとして配列番号１又は配列番号３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド２０ｐｍｏｌ、相補鎖側プライマーとして配列番号２又は配列番号４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド２０ｐｍｏｌ、ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造株式会社製、ＴａＫａＲａＴａｑ）０．２５μｌを加え、水で５０μｌとした。
【００２５】
一組のプライマーとして配列番号１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとを使用する場合、熱変成（９４℃、１分）、アニーリング（５０℃、１分）、重合反応（７２℃、１分）からなる過程を１サイクルとし、これを３５サイクル繰り返し反応させた。また、一組のプライマーとして配列番号３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとを使用する場合、アニーリングを５５℃、１分で行う以外は同様に繰り返し反応させた。
【００２６】
反応液中にヌクレオチド配列が増幅されたか否かを見るために、アガロースゲル電気泳動及び臭化エチジウムによる染色を行った。即ち、電気泳動は３％のアガロースゲルを使用し、ＴＢＥバッファー中、１００ボルトで３０分行った。次いでゲルを取り出し、０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウム水溶液中に３０分浸漬して染色後、トランスイルミネーターで発色させ、ポラロイドカメラで撮影した。この場合、電気泳動時に塩基対数が既知のＤＮＡ断片を一緒に流すことにより、相対比較によって、検出されたヌクレオチド配列断片の長さを算出した。
【００２７】
結果を表１に示す。表１中の＋は、プライマーの組合せが、配列番号１のオリゴヌクレオチドと配列番号２のオリゴヌクレオチドの場合２８８塩基対、配列番号３のオリゴヌクレオチドと配列番号４のオリゴヌクレオチドの場合２９５塩基対に相当する大きさの増幅物が観察されたことを示している。
【００２８】
【表１】

【００２９】
表１の結果から、バチルスコアグランスを正しく検出できることがわかる。
【００３０】
実施例２
実施例１の各プライマーの組合せで行ったＰＣＲ反応によるバチルスコアグランスの検出結果が、バチルスコアグランスに対し選択的であることを確認するため、臨床検査、食品衛生検査等において高頻度で現れるバチルス属でコアグランス以外の種の菌を表２に示すように選び、バチルスステアロサーモフィルスは５５℃で、他種は３５℃で平板培養後、実施例１と同様にして各プライマーの組合せごとに特定の長さの塩基対が増幅された否かを調べた。
【００３１】
結果を表２に示す。表２中の−は、プライマーの組合せが、配列番号１のオリゴヌクレオチドと配列番号２のオリゴヌクレオチドの場合２８８塩基対、配列番号３のオリゴヌクレオチドと配列番号４のオリゴヌクレオチドの場合２９５塩基対に相当する大きさの増幅物が観察されなかったことを示している。
【００３２】
【表２】

【００３３】
表２の結果から、各プライマーの組合せとも、バチルスコアグランス以外の細菌は検出できないことがわかる。
【００３４】
実施例３
通常の臨床検体や食品検体の場合、大量の雑菌が共存するので、雑菌の共存条件下でもバチルスコアグランスを検出できることが必要である。そこで、前述の実施例１の操作において、各検体液中に、バチルスコアグランスと同様にバチルス属のフラットサワー原因菌として知られているバチルスステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus IFO12550）２．４×１０⁷ｃｆｕ／ｍｌと、バチルスコアグランス３．９×１０²〜３．９×１０⁶ｃｆｕ／ｍｌとを共存させ、実施例１と同様にして特定の長さの塩基対が増幅されたか否かを調べた。結果を表３に示す。なおこの場合、正規鎖側のプライマーとして配列番号３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを使用し、相補鎖側のプライマーとして配列番号４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを使用した。
【００３５】
【表３】

【００３６】
表３の結果から、雑菌としてバチルスステアロサーモフィルスが大過剰に共存すると否とを問わず、本発明の方法によりバチルスコアグランスを良好に検出できることがわかる。
【００３７】
【発明の効果】
本発明によれば、ＰＣＲ法でバチルスコアグランスを検出するにあたり、高い検出感度と選択性を得ることができる。また試料中に存在する同属異種あるいは異属の細菌の増殖を考慮にいれる必要がなくなり、熟練を必要とすることなく、簡易にバチルスコアグランスを検出することができる。
【配列表】

[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for detecting a bacil score glance. More specifically, a polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as PCR method) is performed using a synthetic oligonucleotide having a specific base sequence as a primer, and an extended product of the amplified primer is detected. It relates to a method of detecting.
[0002]
[Prior art]
Bacillus coagulans is one of the heat-resistant gram-positive bacteria, and is known as a bacterium that causes flat sour in canned and retort products such as canned and retort products that are heat-sterilized at 100 ° C or higher. It has been. Here, “flat sour” refers to a state in which the contents are rancid by bacteria despite the appearance of the container being normal.
[0003]
In order to confirm the contamination due to the bacillus scourance, various confirmation tests are generally performed through enrichment culture and isolation culture when the test material is a material extracted from a patient's sputum, feces, food, or the like. It usually takes about one week to confirm the contamination by the bacillus glance by this method. In this case, the culture cannot be performed unless the environment such as temperature and culture medium is appropriately adjusted. For example, among bacillus scent glands, those that grow slowly during culture may be inhibited by the coexisting microorganisms. In addition, when flat sour occurs in canned food, the batyl score fragrance itself is killed by the acid produced, and the cultivating method may not detect the batyl score lance. For this reason, the operation of the confirmation test for contamination by the batyl score glance is complicated and requires skill.
[0004]
In contrast, in recent years, Fujiwara et al. Used a PCR method, and as a primer, targeted was a nucleotide sequence encoding the spoIIA gene of Bacilscore glands, and chemically synthesized to be complementary to the nucleotide sequence. In other words, an oligonucleotide of a specific region of the Bacillus sorghum is amplified and detected.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
However, Fujiwara et al.'S method for detecting a bacillus gland is targeted to a gene encoding a spore-forming protein (spoIIA), and there are two nucleotides that are difficult to conserve as a general property of a gene encoding a protein. For this reason, it is unlikely that the oligonucleotides in the specific region that defined the primer in the Bacillus sorghum species are conserved.
[0006]
The present invention has developed a new primer for detecting the Bacillus gland by the PCR method in response to such problems of the prior art, and successfully detects the Bacillus gland even if a Bacillus genus is present as a miscellaneous bacterium. The purpose is to be able to.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present inventor, in the Bacillus scourance, in the nucleotide sequence encoding 16S rRNA, the sequence is conserved at the species or genus level, and this sequence does not have every second nucleotide that is difficult to conserve, It has been found that it is suitable for targeting by the PCR method, and further, by using a specific primer in the PCR method, it is possible to detect batylscore glance separately from different genera or homologous species.
[0008]
That is, the present invention is an oligonucleotide chemically synthesized so as to be complementary to the nucleotide sequence encoding the 16S rRNA of Bacillus sproens, and having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2
(5´) CATGGAGGAAAAAGG (3´) (SEQ ID NO: 1)
(5´) CCTGTTCGAACGGC (3´) (SEQ ID NO: 2)
An oligonucleotide characterized by comprising:
[0009]
A primer comprising two oligonucleotides that are chemically synthesized to target a nucleotide sequence that encodes 16S rRNA of bacillus glance and is complementary to the nucleotide sequence, at least one of which is the oligonucleotide described above A primer characterized by comprising:
[0010]
Furthermore, the present invention provides a method for detecting a bacillus scorance characterized in that such a primer is added to a sample, a primer extension reaction and amplification of a target nucleotide sequence is performed by PCR, and the nucleotide sequence is detected. .
[0011]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0012]
The PCR method that the present invention performs for the detection of batyl score glands is based on the Polymerase Chain Reaction method (Science, 230, 1350 (1985)) developed by Saiki.
[0013]
In the present invention, as a primer used for detecting Bacillus gland by the PCR method, the oligonucleotide of the present invention having a specific base sequence, that is, a nucleotide sequence encoding 16S rRNA of Bacillus gland, is targeted, and the nucleotide sequence thereof An oligonucleotide chemically synthesized so as to be complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2
(5´) CATGGAGGAAAAAGG (3´) (SEQ ID NO: 1)
(5´) CCTGTTCGAACGGC (3´) (SEQ ID NO: 2)
Are used.
[0014]
These oligonucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 1 or 2 were conserved between different strains of the genus Bacilscores, as a result of detailed analysis of the nucleotide sequences of the 16S rRNAs belonging to the genus and species of the genus Bacilscores. It was determined by finding a region that was completely distinguished from the genus.
[0015]
As long as it contains the base sequence shown by sequence number 1 or 2, as the oligonucleotide of this invention, the 5 'terminal side or the 3' terminal side may be extended, and the thing of the number of bases 14-40 is connected. preferable. For example, as a preferred oligonucleotide, the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 4
(5´) TCCGCATGGAGGAAAAAGG (3´) (SEQ ID NO: 3)
(5´) CGCCCTGTTCGAACGGC (3´) (SEQ ID NO: 4)
Can be mentioned.
[0016]
On the other hand, if the number of linked bases is too small, it reacts with a gene other than the nucleotide sequence encoding the 16S rRNA of batyl score glance, which is not preferable because the selectivity for detection of batyl score glance is reduced. Further, it is not preferable that the number of linked bases is too large, since the binding with the nucleotide sequence encoding the 16S rRNA of the bacillus gland tends to be unstable.
[0017]
As long as the oligonucleotide of the present invention includes the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, deoxyribose and base constituting the oligonucleotide may be added with some other molecules, or some of them may be others. Those modified by, for example, substitution with the above molecule are also included. For example, in the oligonucleotide of the present invention, the oligonucleotide encoding the 16S rRNA of Bacillus glucan is amplified by PCR, and then the 5 ′ end of the oligonucleotide used as a primer is fluorescent to simplify detection of the oligonucleotide. Those labeled with a dye, fluorescein isothiocyanate (FITC) are included. In addition, it is possible to bind biooxidase to the 5 'end and bind peroxidase covalently bonded to avidin, or antisense by replacing oxygen in phosphoric acid bonding between deoxyribose skeletons with sulfur atoms. Included.
[0018]
When the oligonucleotide of the present invention is used as one of a pair of primers for detecting a bacillus gland by a PCR method, the other primer used in combination with this is known as a normal strand primer. Although one can be used, it is preferable to use the oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 as a pair of primers.
[0019]
The PCR method itself using a pair of primers on the normal strand side and the complementary strand side and amplifying an oligonucleotide specific for the batyl score glance can follow a known method. That is, by first heat-treating the sample, the double-stranded DNA in the sample is separated into single strands, and a set of primers is allowed to act on this to specifically hybridize with the complementary oligonucleotide sequence of the sample. Next, the region downstream of the primer is selectively synthesized in the presence of DNA polymerase and four deoxyribonucleotide triphosphates (dNTPs). By repeating this operation for about 20 to 40 cycles, a specific oligonucleotide in the sample can be amplified as a primer extension product. In addition, this amplification can be confirmed by electrophoresis, chromatography or the like, thereby making it possible to easily and reliably detect the batyl score fragrance in the specimen.
[0020]
Examples of samples to which this PCR method is applied include patient's sputum, feces, food sampling materials and the like.
[0021]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be specifically described based on examples.
[0022]
Example 1
(1) Preparation of Specimen As the bacil score fragrance, the one shown in the vertical heading column of Table 1 was used to inoculate a plate medium for enrichment and cultured at 45 ° C. overnight. The bacterial cells were scraped off, suspended in 0.85% saline, heated for 10 minutes in boiling water, DNA was extracted, and the centrifuged supernatant was used as a specimen. The bacterial concentration in this suspension was about 10 ⁷ cfu / ml.
[0023]
(2) Primer synthesis The oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 2, 3 or 4 is used as the complementary strand or normal strand primer targeting the nucleotide sequence encoding the 16S rRNA of the basil score gland. Synthesized by the method.
[0024]
(3) Reaction solution preparation and PCR reaction sample solution 5 μl of reaction buffer 5 μl (Takara Ra Taq, Buffer attached to Takara Shuzo Co., Ltd.), 4 types of deoxyribonucleotide triphosphate (dNTP) 4 μl of mixed solution (Takara Ra Taq, manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.), as shown in Table 1, 20 pmol of oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 as a normal strand primer, complementary strand side As a primer, 20 pmol of an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 and 0.25 μl of DNA polymerase (TaKaRa Taq, manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) were added, and the volume was adjusted to 50 μl with water.
[0025]
When using the oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and the oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 as a set of primers, thermal denaturation (94 ° C, 1 minute), annealing (50 ° C, 1 minute) The process consisting of a polymerization reaction (72 ° C., 1 minute) was defined as 1 cycle, and this was repeated for 35 cycles. In addition, when the oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and the oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 are used as a set of primers, the reaction is repeated in the same manner except that annealing is performed at 55 ° C for 1 minute. It was.
[0026]
In order to see whether or not the nucleotide sequence was amplified in the reaction solution, agarose gel electrophoresis and staining with ethidium bromide were performed. That is, electrophoresis was performed using a 3% agarose gel in TBE buffer at 100 volts for 30 minutes. Next, the gel was taken out, immersed in an aqueous solution of ethidium bromide of 0.5 μg / ml for 30 minutes, dyed, developed with a transilluminator, and photographed with a polaroid camera. In this case, the length of the detected nucleotide sequence fragment was calculated by relative comparison by flowing together DNA fragments having a known base pair number during electrophoresis.
[0027]
The results are shown in Table 1. + In Table 1 indicates that the primer combination is 288 base pairs for the oligonucleotide of SEQ ID NO: 1 and the oligonucleotide of SEQ ID NO: 2, and 295 base pairs for the oligonucleotide of SEQ ID NO: 3 and the oligonucleotide of SEQ ID NO: 4. This shows that a correspondingly large amplified product was observed.
[0028]
[Table 1]

[0029]
From the results in Table 1, it can be seen that the bacil score glance can be detected correctly.
[0030]
Example 2
In order to confirm that the detection result of Bacilscore glands by the PCR reaction performed with the combination of each primer of Example 1 is selective to Bacilscore grans, Bacillus appears frequently in clinical tests, food hygiene tests, etc. Bacteria of a genus other than coagulans are selected as shown in Table 2, and Bacillus stearothermophilus is plated at 55 ° C., and other species are plated at 35 ° C. It was examined whether or not a specific length of base pair was amplified.
[0031]
The results are shown in Table 2. -In Table 2 indicates that the primer combination is 288 base pairs in the case of the oligonucleotide of SEQ ID NO: 1 and the oligonucleotide of SEQ ID NO: 2, and 295 base pairs in the case of the oligonucleotide of SEQ ID NO: 3 and the oligonucleotide of SEQ ID NO: 4. This shows that no correspondingly amplified product was observed.
[0032]
[Table 2]

[0033]
From the results shown in Table 2, it can be seen that bacteria other than the batyl score glands cannot be detected with each primer combination.
[0034]
Example 3
In the case of normal clinical specimens and food specimens, a large amount of various bacteria coexist, and it is necessary to be able to detect batyl score grans even under conditions of the presence of various bacteria. Therefore, in the operation of Example 1 described above, in each sample solution, Bacillus stearothermophilus IFO12550, which is known as a causative bacterium of the genus Bacillus, is 2.4 × 10 4 in the same manner as the bacillus scorgance. Whether or not a base pair having a specific length was amplified in the same manner as in Example 1 by coexisting ⁷ cfu / ml and Bacilscore glances 3.9 × 10 ^{2 to} 3.9 × 10 ⁶ cfu / ml I investigated. The results are shown in Table 3. In this case, an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 3 was used as the primer on the normal strand side, and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 4 was used as the primer on the complementary strand side.
[0035]
[Table 3]

[0036]
From the results shown in Table 3, it can be seen that the Bacillus gland can be detected well by the method of the present invention regardless of whether Bacillus stearothermophilus coexists in a large excess as miscellaneous bacteria.
[0037]
【Effect of the invention】
According to the present invention, high detection sensitivity and selectivity can be obtained in detecting a bacillus gland by the PCR method. In addition, it is not necessary to take into consideration the growth of homologous or heterogenous bacteria present in the sample, and it is possible to easily detect the batyl score lance without requiring skill.
[Sequence Listing]

Claims

The nucleotide sequences encoding the 16SrRNA Bacillus core glance which target, a combination of primers consisting of a pair of oligonucleotides chemically synthesized to be complementary to its nucleotide sequence, the pair of oligonucleotides, sequence The oligonucleotide of the base sequence shown in No. 1 and the oligonucleotide of the base sequence shown in SEQ ID No. 2, or the oligonucleotide of the base sequence shown in SEQ ID No. 3 and the oligonucleotide of the base sequence shown in SEQ ID No. 4 A primer combination that is
(5´) CATGGAGGAAAAAGG (3´) (SEQ ID NO: 1)
(5´) CCTGTTCGAACGGC (3´) (SEQ ID NO: 2)
(5´) TCCGCATGGAGGAAAAAGG (3´) (SEQ ID NO: 3)
(5´) CGCCCTGTTCGAACGGC (3´) (SEQ ID NO: 4)

A combination of the primers according to claim 1 is added to a sample, a primer extension reaction and a target nucleotide sequence are amplified by PCR (Polymerase Chain Reaction) method, and the nucleotide sequence is detected. Coagrance detection method.