JP4873518B2

JP4873518B2 - Matrix metalloproteinase inhibitor

Info

Publication number: JP4873518B2
Application number: JP2004357559A
Authority: JP
Inventors: 俊史秋澤; 正治矢原; 徹数岡
Original assignee: MORIKAWA KENKODO CO., LTD.
Current assignee: MORIKAWA KENKODO CO., LTD.
Priority date: 2004-12-10
Filing date: 2004-12-10
Publication date: 2012-02-08
Anticipated expiration: 2024-12-10
Also published as: JP2006160700A

Description

本発明は、ポプラ抽出物、ポプラを起源植物とするプロポリスの抽出物、またはそれらの含有成分を有効成分とするマトリックスメタロプロテアーゼ（matrix
metalloproteinase：以下、MMPと略記することがある）阻害剤に関する。 The present invention relates to a poplar extract, an extract of propolis originating from poplar, or a matrix metalloprotease (matrix) containing these components as an active ingredient.
metalloproteinase: hereinafter referred to as MMP).

ＭＭＰは細胞外マトリックスを分解する酵素群で、19種のヒトＭＭＰが報告されている〔岡田保典産科と婦人科9（7）：1115−1124,2000（非特許文献１）〕。例えば、ゼラチナーゼであるＭＭＰ２は細胞外マトリックスの構成要素であるゼラチン、ラミニン、アグリカン、コラーゲン、フィブロネクチンおよびエラスチンを分解する酵素であり、この酵素の働きを阻害することにより癌細胞の浸潤と転移が抑制されることが報告されている〔Imren
S. 他、Cancer Res 56：2891-2895,1996（非特許文献２）〕。MMP２は特に乳がんの転移に深く関与している〔中島元夫日本婦人科腫よう学会雑誌16巻：２号 1998年（非特許文献３）〕。マトリライシンと呼ばれるＭＭＰ７は癌細胞特異的に産生され、ＭＭＰ２と同様にゼラチン、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチンおよびエラスチンを分解する。胃癌や大腸癌ではＭＭＰ７の発現と癌転移との相関が報告されている。また、細胞膜と結合するＭＴ１−ＭＭＰはプロテオグリカン、ゼラチン、ラミニン、コラーゲンおよびフィブロネクチンを分解し、大腸癌細胞や乳癌細胞の遊走を引き起こすことが知られている〔Koshikawa N.他、J Cell Biol 148：615-624,2000（非特許文献４）〕。 MMP is an enzyme group that degrades extracellular matrix, and 19 types of human MMPs have been reported [Yoshinori Okada, Obstetrics and Gynecology 9 (7): 1115-1124, 2000 (Non-patent Document 1)]. For example, gelatinase MMP2 is an enzyme that degrades gelatin, laminin, aggrecan, collagen, fibronectin and elastin, which are components of the extracellular matrix. By inhibiting the action of this enzyme, invasion and metastasis of cancer cells are suppressed. [Imren
S. et al., Cancer Res 56: 2891-2895, 1996 (Non-Patent Document 2)]. MMP2 is particularly deeply involved in breast cancer metastasis [Motoo Nakajima Journal of Gynecologic Oncology 16: 2 1998 (Non-patent Document 3)]. MMP7 called matrilysin is produced specifically for cancer cells and, like MMP2, degrades gelatin, laminin, collagen, fibronectin and elastin. In gastric cancer and colorectal cancer, a correlation between the expression of MMP7 and cancer metastasis has been reported. MT1-MMP that binds to cell membrane is known to degrade proteoglycan, gelatin, laminin, collagen and fibronectin, causing migration of colon cancer cells and breast cancer cells [Koshikawa N. et al., J Cell Biol 148: 615-624, 2000 (Non-Patent Document 4)].

細胞外マトリックスは哺乳動物の組織において細胞間のすきまを埋めている生体高分子であるが、この細胞外マトリックスの代謝はこれらのＭＭＰとＭＭＰ阻害因子（ＴＩＭＰ: Tissue inhibitors of matrix metalloproteinase）とのバランスにより調節されている。細胞外マトリックス成分の構造異常や、合成・分解の代謝バランスの崩れは、腫瘍転移、アレルギー（例：関節炎疾患，慢性関節リウマチ）、骨吸収疾患（例：骨粗鬆症）、歯周病、角膜潰瘍，皮膚の潰瘍化、糖尿病に付随するコラーゲン崩壊などの疾患の原因となる。よって、ＭＭＰ活性を阻害する物質は、これら６つの疾患に対する治療または予防薬として利用できる可能性がある。 The extracellular matrix is a biopolymer that fills the gaps between cells in mammalian tissues, but the metabolism of this extracellular matrix is a balance between these MMPs and TMP inhibitors (Tissue inhibitors of matrix metalloproteinase). It is adjusted by. Structural abnormalities of extracellular matrix components and disruption of synthesis / degradation metabolic balance include tumor metastasis, allergy (eg, arthritic disease, rheumatoid arthritis), bone resorption disease (eg, osteoporosis), periodontal disease, corneal ulcer, It causes diseases such as skin ulceration and collagen breakdown associated with diabetes. Therefore, a substance that inhibits MMP activity may be used as a therapeutic or prophylactic agent for these six diseases.

これまでにＭＭＰ活性を阻害する物質が幾つか報告されている。例として、ヒドロキサム誘導体〔特開平08−81443（特許文献１）〕、フラボノイド類〔特開平8−104628（特許文献２）〕、特開2000−80035（特許文献３）〕、エスクレチン誘導体〔特開平08−183785（特許文献４）〕、スルホニルアミノ酸誘導体〔特開平09−309875（特許文献５）〕、テルペン類〔特開平11−139947（特許文献６）〕、タンニン類〔特開2000−344672（特許文献７）〕などが知られている。その他、有効成分は特定できていないが、ユーカリなどの植物エキスに、ＭＭＰの阻害作用があることも報告されている〔特開2001-64192（特許文献８）、特開2001−192316（特許文献９）〕。 Several substances that inhibit MMP activity have been reported so far. Examples include hydroxam derivatives [JP 08-81443 (Patent Document 1)], flavonoids [JP 8-104628 (Patent Document 2)], JP 2000-80035 (Patent Document 3), esculetin derivatives [JP 08-183785 (Patent Document 4)], sulfonyl amino acid derivatives [JP 09-309875 (Patent Document 5)], terpenes [JP 11-139947 (Patent Document 6)], tannins [JP 2000-344672 Patent Document 7)] and the like are known. In addition, although an active ingredient has not been specified, it has been reported that plant extracts such as eucalyptus have an inhibitory action on MMP [JP 2001-64192 (Patent Document 8), JP 2001-192316 (Patent Document). 9)].

ポプラは東アジアなどに生息する植物で、その芽は民間療法的に去痰薬として利用されている〔野呂征男ら薬用植物学ｐ106 1992年改訂第４版（非特許文献５）〕。その関与成分はサポニン、タンニン、精油とされる。しかしながら、ポプラの抽出物がＭＭＰ阻害活性を有しているという報告はない。また、ＭＭＰ阻害に関わる疾患である腫瘍転移、アレルギー、骨吸収疾患、歯周病、角膜潰瘍，皮膚の潰瘍化、糖尿病に付随するコラーゲン崩壊などの緩和に効果があるとする報告もない。 Poplar is a plant inhabiting East Asia and its buds are used as an expectorant in folk remedies [Noro Seio et al. Medicinal Botany p106 1992 revised 4th edition (Non-patent Document 5)]. The components involved are saponin, tannin, and essential oil. However, there is no report that poplar extracts have MMP inhibitory activity. In addition, there is no report that it is effective for alleviation of tumor metastasis, allergy, bone resorption disease, periodontal disease, corneal ulcer, skin ulceration, collagen collapse associated with diabetes, which is a disease related to MMP inhibition.

一方、プロポリスはミツバチがアレクリン（Baccharis dracunculifolia）などの植物の葉、新芽、実などの樹脂や樹液と唾液を混合して構築する物質で〔田澤茂実ら Natural Medicines 54(6)：306‐313，2000（非特許文献６）〕、抗菌性や抗酸化作用に優れ、特に癌治療・予防に民間療法的に利用されてきた。マウスを用いた動物試験においてプロポリス抽出物が直腸癌細胞の肺へ転移を抑制することが報告されている〔新井成之ミツバチ科学15（4）：155−162，1994（非特許文献７）〕。しかしながら、そのメカニズムは十分に解明されておらず、プロポリス抽出物がマクロファージを主体とする免疫細胞の活性化したことによるものと推測されているにすぎない。 On the other hand, propolis is a substance that bees are constructed by mixing resin and sap and saliva such as leaves, shoots and berries of plants such as Aleklin (Baccharis dracunculifolia) [Shigemi Tazawa et al. Natural Medicines 54 (6): 306-313, 2000 (Non-patent Document 6)], which is excellent in antibacterial properties and antioxidative effects, and has been used in folk remedies especially for cancer treatment and prevention. In animal studies using mice, it has been reported that propolis extract suppresses metastasis of rectal cancer cells to the lung [Naruyuki Arai Bee Science 15 (4): 155-162, 1994 (Non-patent Document 7)] . However, the mechanism has not been fully elucidated, and it is only speculated that the propolis extract is due to the activation of immune cells mainly composed of macrophages.

また、プロポリスには抗アレルギー作用、抗炎症作用、歯周病予防作用もあることが知られているが、その作用メカニズムは不明な点が多い。抗アレルギー作用および抗炎症作用についてはプロポリス抽出物のヒアルロニターゼ活性抑制作用〔八並一寿フードリサーチ165：35−39，2000（非特許文献８）〕、歯周病予防についてはプロポリス抽出物の抗菌作用及び抗酸化作用によるものと考えられていた〔歯科学報：97（6）649−653，1997（非特許文献９）〕。よって、プロポリスエキスやその含有成分がＭＭＰ活性を顕著に阻害するであろうとは考えられていなかった。 Propolis is also known to have antiallergic action, anti-inflammatory action, and periodontal disease prevention action, but its action mechanism has many unclear points. For antiallergic and anti-inflammatory effects, propolis extract suppresses hyaluronidase activity [Kazutoshi Yanami Food Research 165: 35-39, 2000 (Non-patent Document 8)], for prevention of periodontal disease, antimicrobial of propolis extract It was thought to be due to its action and antioxidant effect [Dental Science Report: 97 (6) 649-653, 1997 (Non-patent Document 9)]. Therefore, it was not thought that propolis extract and its components would significantly inhibit MMP activity.

また、これらの報告で実験材料として使用されたプロポリスはブラジル産（その起源植物は主にアレクリンでポプラは全く含まれない）であり、ポプラを起源植物とする中国産のプロポリスとは内容成分が本質的に異なる。実際、採取された国または地域によって、プロポリスに含まれる有効成分の種類と含有量に差がある。その理由はプロポリスの起源植物が異なるためであると考えられている〔熊澤茂則：ミツバチ科学，22(1)：1-8，2001（非特許文献１０）〕。
特開平08−81443 特開平8−104628 特開2000−80035 特開平08−183785 特開平11−139947 特開平11−139947 特開2000−344672 特開2001-64192 特開2001−192316 岡田保典産科と婦人科9（7）：1115−1124,2000 Imren S.他、Cancer Res 56:2891-2895,1996 中島元夫日本婦人科腫よう学会雑誌16巻：２号 1998年 Koshikawa N.他、J Cell Biol 148:615-624,2000 野呂征男ら薬用植物学ｐ106 1992年改訂第４版田澤茂実ら Natural Medicines 54(6):306‐313，2000 新井成之ミツバチ科学15（4）：155−162，1994 八並一寿フードリサーチ 165：35−39，2000 歯科学報：97（6）649−653，1997 熊澤茂則：ミツバチ科学，22(1)：1-8，2001 In addition, the propolis used as experimental material in these reports is from Brazil (its plant origin is mainly alectrin and does not include poplar at all). Essentially different. In fact, there are differences in the types and contents of active ingredients contained in propolis depending on the country or region where they are collected. The reason is considered to be because the origin of propolis is different [Shigenori Kumazawa: Bee Science, 22 (1): 1-8, 2001 (Non-patent Document 10)].
JP 08-81443 JP-A-8-104628 JP2000-80035 JP 08-183785 JP-A-11-139947 JP-A-11-139947 JP2000-344672 JP2001-64192 JP2001-192316 Yasunori Okada Obstetrics and Gynecology 9 (7): 1115-1124,2000 Imren S. et al., Cancer Res 56: 2891-2895,1996 Motoo Nakajima Journal of Gynecological Oncology 16: 2 1998 Koshikawa N. et al., J Cell Biol 148: 615-624,2000 Noro Seio et al. Medicinal Botany p106 1992 revised 4th edition Tazawa Shigeru et al. Natural Medicines 54 (6): 306-313, 2000 Arai Naruyuki Bee Science 15 (4): 155-162, 1994 Kazutoshi Yanami Food Research 165: 35-39,2000 Dentistry Report: 97 (6) 649-653, 1997 Shigenori Kumazawa: Bee Science, 22 (1): 1-8, 2001

本発明の目的は、ＭＭＰ阻害物質の各種分野における利用を促進するために、ＭＭＰを阻害する新たな有効成分とその供給源を開発することにある。 An object of the present invention is to develop a new active ingredient that inhibits MMP and its source in order to promote the utilization of MMP inhibitors in various fields.

本発明者はポプラに着目し、ＭＭＰ活性の阻害の程度を調べた結果、ポプラ抽出物が優れたＭＭＰ阻害剤であることを発見し、また、ポプラを起源植物とするプロポリス、特に中国産のプロポリスにおいても同等のＭＭＰ阻害活性があることを発見した。さらに、その抽出物を精製することにより関与成分の同定および構造決定を行い、下記の式（Ｉ）で表されるカフェ酸エステルであることを見出し、実際に化学合成された標品を用いてこれらの関与成分がＭＭＰ阻害活性を有することをも証明した。 As a result of investigating the degree of inhibition of MMP activity, the present inventor discovered that the poplar extract is an excellent MMP inhibitor, and propolis originating from poplar, particularly from China. It was discovered that propolis also has an equivalent MMP inhibitory activity. Furthermore, the extract is purified to identify the components involved and determine the structure, find that it is a caffeic acid ester represented by the following formula (I), and use a sample that is actually chemically synthesized. It was also demonstrated that these participating components have MMP inhibitory activity.

かくして、本発明は、ポプラ抽出物、または、ポプラを起源植物とするプロポリス（特に中国産プロポリス）の抽出物を含有することを特徴とするＭＭＰ阻害剤を提供するものである。さらに、本発明は、上記の構造式（Ｉ）で示される化合物であるジメチルアリルカフェ酸エステルを含有することを特徴とするＭＭＰ阻害剤も提供する。
また、本発明に従えば、上記のごとき本発明のＭＭＰ阻害剤の用途として該阻害剤を含有する飲食用または口腔用組成物が提供される Thus, the present invention provides an MMP inhibitor characterized by containing a poplar extract or an extract of propolis (especially Chinese propolis) originating from poplar. Furthermore, this invention also provides the MMP inhibitor characterized by containing the dimethylallyl caffeic acid ester which is a compound shown by said structural formula (I).
In addition, according to the present invention, as a use of the MMP inhibitor of the present invention as described above, a food or drink composition or oral cavity composition containing the inhibitor is provided.

本発明は、これまでに認識されていなかったポプラ抽出物、ポプラを起源植物とするプロポリス抽出物、およびジメチルアリルカフェ酸エステルから成る新しいタイプのＭＭＰ阻害剤とそれを含有する各種組成物を可能にするものである。 The present invention enables an unrecognized poplar extract, a propolis extract derived from poplar, and a new type of MMP inhibitor comprising dimethylallyl caffeic acid ester and various compositions containing the same. It is to make.

以下、本発明を詳細に説明する。本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤はポプラもしくはポプラを起源植物とするプロポリスの抽出物、またはその成分物質を含む。プロポリスはブラジル、中国、オーストラリア、ヨーロッパなど世界各国で採取されているが、その地域に生育しているプロポリスの源となる植物が異なるため、プロポリスに含まれる成分の種類や量に差がある場合もある（既述の非特許文献１０）。本発明において使用するプロポリスは起源植物としてポプラを含むものに限定される。この種のプロポリスは主に中国で採取される。 Hereinafter, the present invention will be described in detail. The matrix metalloprotease inhibitor of the present invention includes poplar or an extract of propolis originating from poplar, or a component substance thereof. Propolis is collected in various countries such as Brazil, China, Australia, Europe, etc., but there are differences in the types and amounts of ingredients contained in propolis because the source plant of propolis growing in that region is different (Non-Patent Document 10 described above). The propolis used in the present invention is limited to those containing poplar as a source plant. This kind of propolis is mainly collected in China.

本発明のＭＭＰ阻害剤を構成するポプラ抽出物またはプロポリス抽出物（ポプラを起源植物とするプロポリスの抽出物）を得るには、ポプラ（特にその新芽）またはプロポリスを抽出操作に供する。この抽出操作は、特に限定されるものではないが、一般に、エタノール、グリセロールなどのアルコールまたはアルコール水溶液（水とアルコールの混合物）または疎水性有機溶媒（例：へキサン）または超臨界状態（二酸化炭素の臨界温度及び臨界圧力を超えた状態）の二酸化炭素を抽出剤として用いることによって効率的に抽出される。なお、疎水性有機溶媒を用いて得られた抽出物からなる素材を医薬食品に用いる場合にその溶媒が残留していると安全衛生上問題があるので、精製して完全にその溶媒を除去する必要がある。 In order to obtain a poplar extract or propolis extract (an extract of propolis originating from poplar) that constitutes the MMP inhibitor of the present invention, poplar (particularly, its sprouts) or propolis is subjected to an extraction operation. Although this extraction operation is not particularly limited, it is generally an alcohol such as ethanol or glycerol or an aqueous alcohol solution (a mixture of water and alcohol) or a hydrophobic organic solvent (eg, hexane) or a supercritical state (carbon dioxide). The carbon dioxide in a state exceeding the critical temperature and critical pressure of the gas) is efficiently extracted by using it as an extractant. In addition, when using a material composed of an extract obtained using a hydrophobic organic solvent for pharmaceutical food, if the solvent remains, there is a problem in terms of safety and health, so purify and completely remove the solvent. There is a need.

ポプラ抽出物は精製または濃縮または希釈して、あるいはそのままの状態で食品として用いることができる。界面活性剤を用いて水に乳化させて使用することもできるし、単独でまたは副原材料と混合してカプセルや錠剤に包含して製剤化することもできる。ポプラ抽出物を混合して得られた飲食組成物（例：菓子、パン、飴、ガム、飲料水など）は癌転移などの病気予防を目的として利用できる。また、ポプラ抽出物を歯磨き粉またはうがい液等に混合して得られた口腔組成物を歯周病予防のために利用することもできる。 The poplar extract can be purified, concentrated or diluted, or used as it is as a food. It can be used by emulsifying in water using a surfactant, or it can be used alone or mixed with an auxiliary raw material to be included in a capsule or tablet. Food and drink compositions obtained by mixing poplar extracts (eg, confectionery, bread, rice cake, gum, drinking water, etc.) can be used for the purpose of preventing diseases such as cancer metastasis. An oral composition obtained by mixing poplar extract with toothpaste or gargle can also be used for preventing periodontal disease.

ポプラを起源植物とするプロポリスの抽出物（特に中国産プロポリス）も同様の仕様・形状で利用できる。 Extracts of propolis originating from poplar (especially Chinese propolis) can also be used with similar specifications and shapes.

ポプラ抽出物を歯磨き粉等に混合して得られた口腔組成物を歯周病予防のために利用する場合、歯磨き粉に対するポプラおよびプロポリス抽出物の含有率は特に限定しない。ただし、十分な効果を期待するためにはポプラ抽出物濃度は３％（W／W）以上が望ましい。
以下に本発明を実施例を示して詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 When using the oral composition obtained by mixing poplar extract with toothpaste etc. for periodontal disease prevention, the content rate of poplar and propolis extract with respect to toothpaste is not specifically limited. However, in order to expect a sufficient effect, the poplar extract concentration is desirably 3% (W / W) or more.
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.

ポプラ抽出物のＭＭＰ阻害活性測定
２種のＭＭＰ〔膜結合型のＭＴ１−ＭＭＰ、およびゼラチナーゼ（ＭＭＰ−２）〕に対する阻害率を測定した。これらのＭＭＰの活性型タンパク質の調製は公知の方法（特許文献７：特開２０００−３４４６７２）に従って大略次のように行なった。
まず、これら２種のｃDNAを発現ベクターに組み込み、大腸菌に感染させ、その大腸菌内で大量発現させた。発現したタンパク質をアフィニティーカラムで精製し、再構成（リフォールディング）を行った。MT1−MMPはトリプシンと反応させて、活性型のタンパク質を調整した。一方、MMP−２についてはｐ‐ＡＭＰＡ（p-aminophenylmercuric acetate：ｐ−アミノフェニル酢酸第二水銀）と反応させ、活性型のタンパク質を調整した。 Measurement of MMP inhibitory activity of poplar extract The inhibition rate against two types of MMPs [membrane-bound MT1-MMP and gelatinase (MMP-2)] was measured. These active proteins of MMP were prepared according to a known method (Patent Document 7: Japanese Patent Laid-Open No. 2000-344672) in the following manner.
First, these two cDNAs were incorporated into an expression vector, infected with E. coli, and expressed in large quantities in the E. coli. The expressed protein was purified with an affinity column and reconstituted (refolded). MT1-MMP was reacted with trypsin to prepare an active protein. On the other hand, MMP-2 was reacted with p-AMPA (p-aminophenylmercuric acetate) to prepare an active protein.

ポプラ（Populus lasiocarpa）の新芽の乾燥物1グラムを粉砕し、木屑などのゴミを除去した後、3mlの95％濃度エタノールまたはエタノール水溶液と混合し、3日間室温で攪拌した。その混合物を絞り、フィルターろ過（６μｍメッシュ）して得られた上清をポプラ抽出物（1番絞り）とした。さらに、その絞り残渣にエタノールを加え、同様に抽出した（２番絞り）。最終的に、これらの抽出物を混合し、試験用のポプラ抽出物とした。
One gram of dried poplar (Populus lasiocarpa ) sprouts was pulverized to remove debris such as wood chips, and then mixed with 3 ml of 95% ethanol or an aqueous ethanol solution and stirred at room temperature for 3 days. The mixture was squeezed and filtered to obtain a poplar extract (No. 1 squeeze). Further, ethanol was added to the squeezed residue and extracted in the same manner (second squeezing). Finally, these extracts were mixed into a poplar extract for testing.

ポプラ抽出物原液を100％エタノールで50mg/mlに調製したものを、70μlをHPLC（カラム：CAPCELLPAKC18 10mm×250mm）に注入し、フラクション採取（溶出条件：70％アセトニトリル/30mn、UV280nm、Flow rate 3.0ml/min）を行った。分取したサンプルを凍結乾燥後、乾重量を測定し、50％エタノールで１mg/mlに調製した。 Poplar extract stock solution prepared with 100% ethanol to 50 mg / ml, 70 μl is injected into HPLC (column: CAPCELLPAKC18 10 mm × 250 mm) and fraction collected (elution conditions: 70% acetonitrile / 30 mn, UV 280 nm, Flow rate 3.0) ml / min). The aliquot sample was freeze-dried, the dry weight was measured, and it was adjusted to 1 mg / ml with 50% ethanol.

これらの各フラクションサンプルおよび適当に希釈したプロポリス抽出物（抽出物濃度：0.1〜10000μg/ml）の20μl、アッセイバッファー 20μl（Tris-HCl pH7.5 500mM、NaCl 1.5M、CaCl₂ 100mM、ZnSO₄ 500μM、NaN₃ 30mM、Brij35 0.05%）、MT1−MMPを加え、37℃で15分間プレインキュベーション後、MOCAc/DNPペプチド 120μl（4.16μM）を加えて、37℃に保ちながら蛍光マイクロプレートリーダー（検出条件：励起波長320nm、蛍光波長390nm）で15分ごとに、120分間経時的に測定を行った。測定後に20mM EDTA 20μlを加えて反応を停止させ、蛍光UV検出器付HPLCに5μl注入してペプチドの検出を行った（検出条件：70％アセトニトリル/0.1%TFA/30mn、UV280nm、Flow rate 1.0ml/min）。なお、阻害率の算出は以下の計算法に従った。
阻害率： HPLCによる分析結果から算出した阻害率
阻害率（％）＝(A-B)/A×100
A=MT1のpeak height
B=各sampleのpeak height 20 μl of each of these fraction samples and appropriately diluted propolis extract (extract concentration: 0.1-10000 μg / ml), assay buffer 20 μl (Tris-HCl pH 7.5 500 mM, NaCl 1.5 M, CaCl ₂ 100 mM, ZnSO ₄ 500 μM) , NaN ₃ 30mM, Brij35 0.05%), MT1-MMP, preincubation for 15 minutes at 37 ° C, then add MOCAc / DNP peptide 120µl (4.16µM) and keep at 37 ° C for fluorescence microplate reader (detection conditions) : Excitation wavelength 320 nm, fluorescence wavelength 390 nm) every 15 minutes and measured over time for 120 minutes. After the measurement, 20 μl of 20 mM EDTA was added to stop the reaction, and 5 μl was injected into HPLC with fluorescent UV detector to detect the peptide (detection conditions: 70% acetonitrile / 0.1% TFA / 30mn, UV280 nm, Flow rate 1.0 ml / min). The inhibition rate was calculated according to the following calculation method.
Inhibition rate: Inhibition rate calculated from HPLC analysis results
Inhibition rate (%) = (AB) / A × 100
A = MT1 peak height
B = peak height of each sample

さらに、MMP阻害活性の程度を定量的に比較評価するため、各サンプルの阻害率からIC₅₀を算出し、評価指標として用いた。IC₅₀とは「一定条件下でMMPの活性を50％阻害するために必要な検体の濃度」であり、この数値が小さいほど阻害活性が高いと言える。 Furthermore, in order to quantitatively evaluate the degree of MMP inhibitory activity, IC ₅₀ was calculated from the inhibition rate of each sample and used as an evaluation index. IC ₅₀ is the “concentration of the sample necessary to inhibit the activity of MMP by 50% under a certain condition”, and the smaller this value, the higher the inhibitory activity.

ポプラ抽出物のMT1-MMPに対するIC₅₀（mg/ml）を測定した結果、0.031であった。よって、ポプラ抽出物に高いMMP阻害活性があることが明らかとなった。 The IC ₅₀ (mg / ml) of Poplar extract against MT1-MMP was measured and found to be 0.031. Therefore, it was revealed that the poplar extract has a high MMP inhibitory activity.

中国産プロポリス抽出物のＭＭＰ阻害活性測定
中国産プロポリスはミツバチがポプラ等の植物の葉、新芽、実などから構築する物質である。一方、ブラジル産プロポリスの主な起源植物はアレクリンである。そこで、それぞれのプロポリス1グラムに3ｍｌの８０％エタノールを加え、実施例１のポプラ抽出物の調整方法と同様にして、試験用のプロポリス抽出物とした。ＭＭＰ活性の阻害率を測定し、MT1-MMPに対するIC₅₀（mg/ml）を算出した。その結果、中国産プロポリス抽出物のIC₅₀（mg/ml）は0.034であった。中国産プロポリス抽出物はポプラとほぼ同程度のMMP阻害活性があることが明らかとなった。 Measurement of MMP inhibitory activity of Chinese propolis extract Chinese propolis is a substance that bees are constructed from the leaves, shoots, and berries of plants such as poplar. On the other hand, the main plant of Brazilian propolis is Aleklin. Therefore, 3 ml of 80% ethanol was added to 1 gram of each propolis to prepare a propolis extract for testing in the same manner as in the preparation method of the poplar extract of Example 1. The inhibition rate of MMP activity was measured, and IC ₅₀ (mg / ml) against MT1-MMP was calculated. As a result, the IC ₅₀ (mg / ml) of the Chinese propolis extract was 0.034. Chinese propolis extract was found to have MMP inhibitory activity almost the same as poplar.

ジメチルアリルカフェ酸エステルのＭＭＰ阻害活性測定
ブラジル産プロポリスと比較して中国産プロポリスにはカフェ酸誘導体が多く含まれることから、その一つであるジメチルアリルカフェ酸エステルのMMP阻害活性を測定した。
なお、比較対照として試験するため、市販されているカフェ酸を購入した。一方、ジメチルアリルカフェ酸エステルは、次の手順により自社で合成した。1.8グラムの3,4−dihydroxycinnamic acidをピリジンに溶解し、2.2グラムの無水酢酸を滴下した。ピリジンを減圧下で留去し、酢酸エチル40mlに溶かし、0.1規定の塩酸で洗浄し、ピリジンを除去する。酢酸エチルを乾燥後、残渣をアセトンで再結晶し、3,4−diacetoxycinnamic
acidを得た。 Measurement of MMP inhibitory activity of dimethylallyl caffeic acid ester Since Chinese propolis contains more caffeic acid derivatives than Brazilian propolis, the MMP inhibitory activity of one of them, dimethylallyl caffeic acid ester, was measured.
In addition, commercially available caffeic acid was purchased for testing as a comparative control. On the other hand, dimethylallyl caffeic acid ester was synthesized in-house by the following procedure. 1.8 grams of 3,4-dihydroxycinnamic acid was dissolved in pyridine and 2.2 grams of acetic anhydride was added dropwise. Pyridine is distilled off under reduced pressure, dissolved in 40 ml of ethyl acetate, washed with 0.1N hydrochloric acid to remove pyridine. After drying ethyl acetate, the residue is recrystallized with acetone and 3,4-diacetoxycinnamic
Obtained acid.

次に、1.32グラムの3,4−diacetoxycinnamic acidをCH₂Cl₂に溶解し、1.53グラムの2−chloro−N−methylpyridinium chlorideを加え、攪拌しながらEt３Nを滴下した。CH₂Cl₂を塩酸、10％炭酸水素ナトリウムおよび水で洗浄し、CH₂Cl₂層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧留去後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで処理し、prenyl
3,4−diacetoxycinnamateを得た。これをCH₂Cl₂とメタノールの１：１混合液に溶解し、10％炭酸水素ナトリウムを加え、攪拌後、CH₂Cl₂を加え、CH₂Cl₂層を分離し、水で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧留去してジメチルアリルカフェ酸エステルを得た。単離した化合物をNMRで分析し、構造を確認した。その結果を表１に示す。ポプラや中国産プロポリスに特異的に含まれるジメチルアリルカフェ酸エステルは２種のMMPに対してカフェ酸よりもそれぞれ高い阻害活性が確認された。 Next, the 3,4-diacetoxycinnamic acid 1.32 grams dissolved in CH ₂ Cl _2, the 2-chloro-N-methylpyridinium chloride of 1.53 g was added, dropwise Et3N while stirring. CH ₂ Cl ₂ was washed with hydrochloric acid, 10% sodium hydrogen carbonate and water, and the CH ₂ Cl ₂ layer was dried over anhydrous magnesium sulfate. After evaporation under reduced pressure, the residue was treated with silica gel column chromatography, prenyl
3,4-diacetoxycinnamate was obtained. This was dissolved in a 1: 1 mixture of CH ₂ Cl ₂ and methanol, 10% sodium hydrogen carbonate was added, and after stirring, CH ₂ Cl ₂ was added, and the CH ₂ Cl ₂ layer was separated and washed with water. The extract was dried over anhydrous magnesium sulfate and distilled under reduced pressure to obtain dimethylallyl caffeic acid ester. The isolated compound was analyzed by NMR to confirm the structure. The results are shown in Table 1. Dimethylallyl caffeic acid ester specifically contained in poplar and Chinese propolis was confirmed to have higher inhibitory activity than caffeic acid on two types of MMPs.

本発明により、ポプラ抽出物、ポプラを起源植物とするプロポリスの抽出物またはジメチルアリルカフェ酸エステルを用いてマトリックスメタロプロテアーゼの活性を阻害することが可能になった。これらの阻害剤を経口摂取または塗布することにより、腫瘍転移、アレルギー、骨吸収疾患、歯周病、角膜潰瘍、皮膚の潰瘍化、糖尿病に付随するコラーゲン崩壊などのマトリックスメタロプロテアーゼ関連疾患を予防または治療することができる。
According to the present invention, it has become possible to inhibit the activity of matrix metalloprotease using a poplar extract, an extract of propolis originating from poplar, or dimethylallyl caffeic acid ester. Ingestion or application of these inhibitors can prevent or prevent matrix metalloprotease related diseases such as tumor metastasis, allergy, bone resorption disease, periodontal disease, corneal ulcer, skin ulceration, collagen breakdown associated with diabetes Can be treated.

Claims

A matrix metalloproteinase inhibitor characterized by containing an extract of Populus lasiocarpa , a kind of poplar.

An oral composition for inhibiting matrix metalloproteinases , comprising the extract according to claim 1.