JP4863341B2

JP4863341B2 - DNA vaccine for fish infected with lamellabudovirus

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Publication number: JP4863341B2
Application number: JP2001294473A
Authority: JP
Inventors: 宙青木; 育生廣野
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date: 2001-09-06
Filing date: 2001-09-26
Publication date: 2012-01-25
Anticipated expiration: 2021-09-26
Also published as: JP2003155254A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はヒラメラブドウイルス（Hirame Rhabdovirus）の魚類への感染症に対する防御免疫を刺激するためのDNAワクチンに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
魚介類を代表とする多くの水生生物の養殖産業において、閉鎖系である養殖領域でのウイルス性疾患及び細菌性疾患は、個体が高密度に存在していることから、それらの感染の影響は大きく、養殖産業において深刻な問題となっている。
1984年、養殖ヒラメにおいてヒラメラブドウイルス（以下、「HIRRV」と略記することもある）感染が確認されて以来、HIRRVはヒラメのみならず、アユ及びクロダイなどの養殖魚種にも該ウイルス感染症を発生する。特に、養殖ヒラメに対して強い病原性を示し、水温15℃以下の1月から4月に多発している。HIRRVに感染したヒラメは、体色の黒化、異常遊泳、腹部の貯留、筋肉中及び鰓基部の出血などの症状を示し、死亡に至るケースが多い。特に、養殖ヒラメではその死亡率も高く、ヒラメ養殖業において経済的損失が大きく、重要なウイルス感染症である。ほとんどの魚介類用ワクチンが細菌に対して開発されているが、ウイルス性疾患又は寄生性疾患に効果のあるワクチンは、ほとんど開発されていない。
【０００３】
ウイルス感染症の予防又は治療には、一般的にワクチンが使用されている。ワクチンには不活化ワクチン（日本脳炎、ワイル病など）、トキソイド（破傷風、ジフテリアなど）、弱毒ワクチン（BCG、ポリオなど）、遺伝子組換えワクチン（B型肝炎ウイルスなど）などがある。不活化ワクチン及び外毒素を無毒化したトキソイドは、これらに対する抗体を誘導する比較的安全なワクチンである。遺伝子組換えワクチンは、不活化ワクチンと比較すると、不純物を含まないので、さらに安全なワクチンと考えられている。
【０００４】
しかしながら、これらのワクチンは抗体産生は誘導できるが、細胞性免疫は誘導されにくい。また、不活化ワクチン及び弱毒ワクチンは、抗原となるウイルスを産業的には大量に得るため、適当な細胞の確保が必須である。さらに、弱毒ワクチンで獲得した免疫は、長期維持される場合が多いが、一方で副作用、危険性が指摘されている。不活化ワクチン及び遺伝子組換えワクチンは、抗原の持続性が短いと考えられ、アジュバントなどを必要とする。従来型のワクチンは製造から被検体に接種するまでの間、冷蔵保存する必要があるため、コストの増加と効力の低下が生じる問題点があった。
【０００５】
ワクチン分野での最近の研究の発展により、免疫原性タンパク質をコードするプラスミドDNAの投与による免疫の誘発に基づく新しいワクチン種が開発され、次に述べるような従来型ワクチンの不利益が改善されてきている。すなわち、DNAワクチンは、体液性免疫応答のみならず、細胞性免疫を強力に誘導できるので、病気に対する防御が可能となること、DNAワクチンは高度に純化できること、室温又は高温下でも安定であり、冷蔵保存は必須でなく長期間の貯蔵が可能であること、遺伝子工学的手法によりDNAワクチンの迅速な改良がし易いこと、ワクチン開発に費やす時間の短縮、などの利点がある。
【０００６】
ラブドウイルス（Rhabdovirus）は、５つの蛋白質で構成されている。すなわち、グリコプロテイン、ヌクレオキャプシドプロテイン、RNA依存的RNA合成酵素並びにマトリックスプロテインＭ１及びＭ２（室賀清邦、江草周三編集、魚病学概論、T. Nishizawa等、Dis. Aquat. Org., 10, 167-172 ,1991 ）である。これらの内のグリコプロテインは、ワクチン効果があることが報告されている（P.Boudinot, et al., VIROLOGY 249, 297−306, 1998、N. Lorenzen, et al.,Aquaculture 172, 41-61, 1999、S. Corbeil, et al., Vaccine, 18,2817−2824, 2000）。また、グリコプロテイン以外にもVHSV（viral hemorrhagic septicemia virus）などで、ヌクレオキャプシドプロテインについてもDNAワクチン効果が研究されている。
【０００７】
また、HIRRVの病原性に関するグリコプロテインのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列が報告されている（H.A.Bjorklun, et al., Virus Research,, 42, 65-80,1996）。しかし、ヒラメにおけるHIRRV感染症に対する防御免疫を刺激するためのワクチンの報告はない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、HIRRV感染症に対する防御免疫を刺激するためのHIRRV感染魚類用DNAワクチンを提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、HIRRV感染症に対する有効なワクチンを鋭意研究した結果、HIRRVのグリコプロテインをコードする遺伝子を有するプラスミドDNAをヒラメに接種したところ、HIRRV感染に対する免疫効果を有すること及び免疫関連遺伝子の発現量が増加されることを見出し、本発明を完成した。すなわち本発明は、
１．ヒラメラブドウイルスに対する免疫能を付与するためのDNA構築物が、ヒラメラブドウイルスの免疫原性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列及び該ヌクレオチド配列に操作可能に結合した転写調節配列がサイトメガロウイルス即時型プロモーターを含むことを特徴とするヒラメラブドウイルス感染魚類用DNAワクチン、
２．ヒラメラブドウイルスの免疫原性ポリペプチドが、グリコプロテインであることを特徴とする上記１に記載のヒラメラブドウイルス感染魚類用DNAワクチン、
３．グリコプロテインが配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列との相同性が80%以上であることを特徴とする上記２に記載のヒラメラブドウイルス感染魚類用DNAワクチン、
４．グリコプロテインが配列番号２で示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする上記２に記載のヒラメラブドウイルス感染魚類用DNAワクチン、
５．ヌクレオチド配列が、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有する_、又は配列番号１に記載のヌクレオチド配列との相同性が80%以上であることを特徴とする上記１に記載のヒラメラブドウイルス感染魚類用DNAワクチン、
６．ヌクレオチド配列が、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有することを特徴とする上記１に記載のヒラメラブドウイルス感染魚類用DNAワクチン、
７．独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、FERM P-18504の受託番号のもと寄託されているpCMV−HRVgであることを特徴とする上記１に記載のヒラメラブドウイルス感染魚類用DNAワクチン、
８．上記１〜７のいずれか一項に記載のヒラメラブドウイルス感染魚類用DNAワクチンを魚類に投与する方法、
９．遺伝子銃を用いることを特徴とする上記８に記載の方法、
１０．魚類がカレイ科又はヒラメ科に属する魚種であることを特徴とする上記８又は上記９に記載の方法、
１１．ヒラメラブドウイルスに対する免疫応答の誘発に用いられる上記１〜７のいずれか一項に記載のヒラメラブドウイルス感染魚類用DNAワクチンの使用に関するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明は、HIRRV感染症に対する免疫応答の誘発に用いるDNAワクチンを製造するためのDNA構築物の使用が提供され、該DNA構築物は魚類の細胞内で発現可能な発現ベクター、HIRRV免疫原性ポリペプチドをコードする１つ以上の単離されたヌクレオチド配列、該配列に操作可能に結合した転写調節配列などを含む。
【００１１】
免疫原性タンパク質をコードするヌクレオチド配列としては、ラブドウイルス科の構造タンパク質である５つのタンパク質（室賀清邦、江草周三編集、魚病学概論）、すなわち、グリコプロテイン、ヌクレオキャプシドプロテイン、RNA依存的RNA合成酵素並びにマトリックスプロテインＭ１及びＭ２（（室賀清邦、江草周三編集、魚病学概論、T. Nishizawa等、Dis. Aquat. Org., 10, 167-172 ,1991 ）をコードするヌクレオチド配列の一部又は全部が挙げられる。好ましくは、HIRRV由来のグリコプロテインをコードするヌクレオチド配列の一部又は全部であり、さらに好ましくは配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の一部又は全部であり、最も好ましくは配列番号１に記載のヌクレオチド配列の一部又は全部である。また、ここでいうヌクレオチド配列の一部とは、グリコプロテインをコードするヌクレオチドと相同性（例えば80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95以上、最も好ましくては98%以上の相同性）を有するものであり、かつ本発明が適用される魚類に対して免疫を付与することのできるヌクレオチド配列が好ましい。
【００１２】
さらに、本発明にはグリコプロテインの改変タンパク質が含まれる。本発明において、改変タンパク質とは、上記のアミノ酸配列において、１以上、好ましくは１〜数個のアミノ酸の付加、挿入、削除、欠失又は置換などの改変が生じたタンパク質であって、依然として本発明が適用される魚類に対して免疫を付与することのできるものを意味する。また、本発明によるヌクレオチド配列は、天然由来のものであっても、全合成したものであっても良く、また、天然由来のものの一部を利用して合成を行ったものでもよい。
【００１３】
本発明に用いるグリコプロテインをコードするヌクレオチド配列は、ラブドウイルス科に属するウイルス、具体的にはHIRRVから得ることができる。本発明による該ヌクレオチド配列の典型的な取得方法としては、遺伝子工学の分野で慣用されている方法、例えば、部分アミノ酸配列の情報を基にして作製した適当なDNAプローブを用いて、スクリーニングを行う方法などが挙げられる。
【００１４】
本発現ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、染色体外の独立体として存在し、その複製が染色体の複製に依存しない、例えばプラスミドを基本に構築することができる。また、本発現ベクターは、宿主に導入されたとき、その宿主のゲノム中に取り込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであったもよい。本発明によるベクターの構築の手順及び方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているのものを用いることができる。
【００１５】
単離された該配列に操作可能に結合した転写調節配列は、構成プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター又は発現されている抗原の遺伝子由来のプロモーターなどが挙げられるが、特にそれらに限定されない。構成プロモーターは、例えばサイトメガロウイルス（CMV）由来のプロモーター配列、ラウス肉腫ウイルス（RSV）、シミアンウイルス−４０（SV-40）又は単純ヘルペスウイルス（HSV）などの強力プロモーターなどが挙げられる。組織特異的プロモーターは、筋βアクチンプロモーター又はチミヂンキナーゼプロモーターなどが挙げられる。誘導性あるいは調節性プロモーターは成長ホルモン調節性プロモーター、lacオペロン配列の制御下にあるプロモーター又は亜鉛誘導性メタロチオネインプロモーターを含み得る。
【００１６】
該調節配列はプロモーター（例えば、上記の誘導性又は構成性プロモーター）DNA配列を含む発現制御配列を含み、そしてエンハンサー要素、転写又はポリアデニル化シグナル（例えば、シミアンウイルス−４０（ＳＶ−４０）又はウシ成長ホルモン由来）のスプライシングのためのイントロン配列、又はＣｐＧモチーフとして知られている免疫刺激DNA配列のうち１つ若しくはそれ以上のコピーを含み得る。
【００１７】
また、発現ベクターは、細菌複製起点配列、選別させるための抗生物質耐性（例えばアンピシリンなど）遺伝子又は非抗生物質耐性遺伝子（例えばβ−ガラクトシダーゼ遺伝子など）に用いられ得る選択性マーカーを有する。
【００１８】
非メチル化ＣｐＧヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドは、免疫系を活性化する事が知られている（A. Kriegら、Nature, 1995, 374, 546-549）。フランキング配列に依存して、あるＣｐＧモチーフはＢ細胞又はＴ細胞応答に対してより免疫刺激的であり、優先的にある種を刺激する。DNA発現ベクターにおけるＣｐＧモチーフのコピ−は、発現タンパク質に対する免疫応答を誘発するアジュバントとして作用する。ＣｐＧモチーフ、すなわち特異化された配列内のＣｐＧジヌクレオチドを含むDNA伸長部は、長さが５〜４０塩基対程度から選ばれる。複数のＣｐＧモチーフが、発現ベクターの非コード領域に挿入されれもよい。体液性応答が所望であるとき、好ましいＣｐＧモチーフはＣＤ８＋Ｔ細胞応答を刺激することが知られているサイトカインの分泌を刺激するＣｐＧモチーフである。
【００１９】
他のＣｐＧモチーフは、免疫応答を阻害することが見出された。本発明の好ましい実施態様において、これらの免疫阻害性ＣｐＧモチーフは、そこからポリペプチドの発現を中断させることなく、本発明の方法によって用いられる発現ベクターにおいて除去又は変異される。
【００２０】
本発明が適応できる魚類としては、カレイ科、ヒラメ科に属する魚種（例えばカレイ、ヒラメなどが挙げられる）又はアユ、クロダイなどが挙げられる。
【００２１】
DNAワクチンの接種法は、例えば経口投与、筋肉内注射、腹腔内注射、遺伝子銃を用いた投与及び液浸が挙げられるが、好ましくは筋肉内注射、遺伝子銃を用いた投与である。遺伝子銃を用いた投与とは、プラスミドを1μm程の大きさの金粒子にコーティングし、高圧ヘリウムガスを用い、専用の器具で被検体の皮膚、細胞又は組織に空気銃の要領で撃ち込む方法である。この遺伝子銃による投与は、筋肉内注射と比較し、100〜1000分の1のDNA量で、同等の免疫効果を挙げることができる点、筋肉内注射と比較し再現性に優れている点などの優れた特徴を有している。
【００２２】
本発明のDNAワクチンは、トランスフェクション試薬としてリポソーム、フルオロカーボン乳剤、リン脂質カルシウム沈澱剤、筒状剤、金粒子、生分解性マイクロスフェア及びカチオン性ポリマーを共に処方し得る。リン脂質カルシウム沈澱剤は、ホスファチジルセリン、コレステロール及びカルシウムからなる。また、筒状剤はらせん状に巻かれた二層の脂質からなり、その縁が合わされてパックされている脂質ベースの微小筒として知られている。
【００２３】
また、アジュバントは、免疫系を刺激して抗原に対する免疫反応を高めるものであり、主にワクチンに補助剤として添加される。代表的なアジュバントとしては、アルミニウム化合物、ポリヌクレオチド又は細菌の菌体成分などが知られているが、これらの中には本発明に適用するには十分な効果が得られないものも多い。特に、アジュバントの作用は抗原物質に広く有効であるため、抗原に含まれる不純物の抗原刺激性を増強したり、有害な副作用を生ずる危険もあり、使用する抗原の純度に十分な配慮をする必要があるなどの問題がある。そのような中で、例えばIL-1βはアジュバントとして有効であることが報告されている（J. Y. Scheerlinck, Genetic adjuvants for DNA Vaccine, 19, 2647-2656, 2001）。本発明においては、魚類（例えばヒラメなど）の体内で発現可能なようにIL-1β遺伝子を挿入したプラスミドを作製し、本発明のワクチンとともに魚類に接種することができる。
【００２４】
免疫機構は、様々な役割を担った細胞が相互に機能調節を行いながら、多様な生理機能を発揮している。生体防御に重要な役割を担っている因子であるT細胞及びB細胞の細胞表面上に存在しているT細胞抗原レセプター（TCR）、主要組織適合性複合体（MHC）、又は免疫グロブリン（Ig）の発現量を指標に、免疫システムの活性化を調べることが可能である。本発明においては、例えばHIRRV感染症に対するDNAワクチンをヒラメに接種後、魚体内における生体防御機構の活性化について解析するため、TCR、MHC及びIgの発現量の変化についてリアルタイムPCRを行い定量的に確認し、免疫システムの活性化を調べることができる。
【００２５】
リアルタイムPCRとは、PCRによる遺伝子の増幅の過程を蛍光検知装置により、リアルタイムで追跡し、そのPCR反応曲線をプロファイリングする検出技術である。検査対象の検体がPCRにより増幅された場合、指数増加カーブに到達するPCRサイクル数を検査すれば、正確なDNA量を計算する事が可能となる。リアルタイムPCRには、Perkin-Elmer社製のTaqMan、BioRad社製のiCyclerを用い行うことができる。
【００２６】
リアルタイムPCRでは、リアルタイムPCR用（SG）及び標準DNA用（SG200）の二種類のプライマーを用いる。リアルタイムPCR用(SG)は、アンプリコンは短め(60〜100 bp)でGC含量が少なくなるよう設計する。3' UTR部分にプライマーを作製すると、比較的容易で、かつ正確に遺伝子特異的プライマーを設計することができる。また、primer expressのソフトを使ってコンピュータ上でも設計する方法もある。リアルタイムPCRで設計したプライマーの外側に標準DNA用プライマー(SG200)を設計する。遺伝子同士を比較したい場合、アンプリコンは揃えるのが望ましい。
【００２７】
標準DNAの調製は、まず測定したい遺伝子それぞれに対し特異的なプライマー(SG200)を用い、全量 50μlのPCRをプラトーに達するまで反応させる（PCRは95℃で2分間処理後、次いで95℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃で1分間を１サイクルとする処理を30回行う。その後、PCR産物をMicrocon-PCR Centrifugal Filter Devices (MILLIPORE社製)などのカラムを用い余分なプライマーを除去し、濃度を測る。アボガドロ定数(1mol=6.022×10²³molecules)よりコピー数を算出する。次いで、PCR産物は21段階の希釈系列（コピー数10¹³〜10^‐ ⁷）を作り、内側に設計したプライマー(SG)を用いて再度PCRを行う。この際、増幅が指数関数的に起こる様、サイクル数は14サイクルで行う。このようにして得たPCR産物をアガロースゲル電気泳動し、バンドが全く見えなくなってからの5段階が指数関数的に増幅しているためこの5段階を標準DNAとして実際のリアルタイムPCRに用いる。
【００２８】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に詳述するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２９】
実施例１ HIRRV由来グリコプロテイン遺伝子の単離
（１）PCRプライマーの作製
H.A.Bjorklund等によって報告されている（Virus Research,42, 65-80, 1996）グリコプロテイン遺伝子（GenBank=AAB39502,1）のアミノ酸配列を元に、対応するDNAの塩基配列から下記のPCRプライマーを、常法に従い、作製した。
HRV-glys:5-GAGAATTCGTCATGGACCCTCGAATAAT-3（配列番号３）
HRV-glya:5-GAGTCGACTTACCCTCGACTGGCGAGGT-3 （配列番号４）
第１図にHIRRV8601株由来グリコプロテイン遺伝子を増幅するために作製したPCRプライマーのDNA塩基配列及びグリコプロテイン遺伝子（GenBank=AAB39502,1）のDNA塩基配列を示す。
【００３０】
（２）cDNAの単離
HINAE細胞（Hirame natural embryo cell;北海道大学水産学部海洋生物資源科学科で分譲可能な状態で保管中である）を市販のL-15 培地に、20％となるようにFBSを加えペニシリン及びストレプトマイシンの終濃度がそれぞれ100units/ml と100μg/mlとなるように調整後、20℃にて培養した。コンフルエントとなるまで培養したHINAE細胞に−80℃で保管しておいたHIRRV 8601株（Kimura, T., et al., Diseases of Aquatic Organisms 1, 209−217, 1986）を感染させた。HIRRV 8601株がHINAE細胞に感染後、2〜5日でCPE（Cytopathic Effect）が観察できる。
【００３１】
HIRRV 8601株の培養液（1.0x10⁸TCID₅₀/ml）150μl及びTRIzol（GIBCO社製） 1mlを混和し、5分間室温に静置した。次に200μlのクロロホルムを加えよく混和し、室温で5分間静置した後、遠心分離（15,000rpm、4℃、5分間）を行い、上層を新しい遠心管に移した。上層に対して等量のイソプロピルアルコールを加え、10分間室温に放置した。遠心分離後（15,000rpm、10分間）、上層を捨てペレット状態となったゲノミックRNAを乾燥させ、10μlのDEPC処理水に溶解した。
【００３２】
このように抽出したゲノミックRNAから、cDNA SYNTHESIS KIT 1^st STRAND with AMV Reverse Transcriptase (宝酒造社製)により、添付の操作方法に従ってcDNAを合成した。このcDNAを鋳型に、実施例１（１）で作製したPCRプライマーを用いて、常法に従いPCRを行なった。PCRは、添付の10xbuffer 5μl、dNTP 4μl、HRV-glys 1μl(25pmol/μl)、HRV-glya 1μl(25pmol/μl)、DNA polymerase 0.5μl(5units/μl)、cDNA 3μl(10ng)、滅菌水35.5μlで50μlに調製後、95℃で5分間処理後、次いで95℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃で2分間を1サイクルとする処理を30回施した後、2℃で2分間処理するという反応条件で行った。得られたPCR産物をアガロースゲル電気泳動した結果、約1.5kbp程のDNA断片が増幅されていたことを目視にて確認した。
【００３３】
（３）DNA塩基配列の解析
その増幅されたDNA断片をpGEM-T Eazy vector (プロメガ社製)へと挿入し、蛍光標識されたM13primer（日清紡績社製）及びThermo Sequence Fluorescent Labeled Primer Cycle Sequencing Kit with 7-deaza-dGTP(amersham pharmacia bitech社製) を用いてダイデオキシ法（Dideoxy method）でサンプルを作成した後、DNA sequencer model 4000（LI-COR社製）を用いて塩基配列を決定した。この配列を解析したところ、PCRで増幅されたDNA断片は、1527bpからなるオープンリーディングフレーム（ORF）が存在した（配列番号１）。このORFから予測されるタンパク質は、508アミノ酸残基であり、相同性検索（FASTA）を行なった結果、H.A.Bjorklund等によって報告されている（Virus Research,1996, 42, 65-80）グリコプロテイン遺伝子（GenBank=AAB39502,1）のDNA塩基配列との相同性は99.9%であり、アミノ酸配列との相同性は99.8%であった。
【００３４】
実施例２ pCMV−HRVgの作製
実施例１（３）のDNA塩基配列の解析で用いたプラスミドをEcoRI及びSalIで処理した。そしてpGEM-T Easy vectorから切り出された実施例１（２）で得られたHIRRV 8601株由来のグリコプロテイン遺伝子を、pCI-neo(5474bp、プロメガ社製)のヒトサイトメガロウイルス由来のプロモーター領域がコードされている配列の下流に位置するマルチクローニングサイトのEcoRI及びSalIへ挿入し、pCMV−HRVg（第２図）を作製した。尚、pCMV−HRVgは、2001年9月5日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、FERM P-18504の受託番号のもと寄託されている。
【００３５】
実施例３グリコプロテイン遺伝子の発現確認
HINAE細胞にpCMV−HRVgをEffectene^TM Transfection Reagent (QIAGEN社製) を用いてトランスフェクションした後、一ヶ月間経代培養した。次に、培養した細胞を遠心管に集め遠心分離（3,000rpm、5分間）し培地のみを捨て、実施例１（２）と同様の方法で培養細胞のtotal RNAを抽出しRT-PCRを行った。その結果、グリコプロテイン遺伝子が発現していることを確認した。
【００３６】
実施例４ pCMV−HRVgのヒラメへの導入方法
遺伝子銃（Helios^TMGene Gun、BIO-RAD社製）を用いて、添付の操作方法に従い、稚魚のヒラメ一尾当りpCMV−HRVg 1μg を１ショットでヒラメ驅幹部へ接種した。遺伝子銃における１ショットの条件は、金粒子サイズは0.6μm、1ショット当りの金粒子の量は0.5mg、ヘリウムガスの圧力は200psiである。
【００３７】
実施例５ヒラメに対する感染防御試験
各試験区には、ヒラメ稚魚（全長約4〜5cm、平均魚体重1.66g）50尾を用いた。試験魚は、60Lの水槽で、ろ過処理した天然海水を注水（0.5L/min）し、平均水温13.0℃（12℃〜14.5℃）で飼育した。
まず、実施例４の方法に準じて、pCMV−HRVg、コントロールとしてpCI-neo(プロメガ社製)をそれぞれヒラメへ接種した。その接種の４週間後に、実施例１（２）の条件のようにHINAE細胞で培養したHIRRV 8601株培養上澄（1.0×10⁸TCID⁵⁰/ml）を5×10²TCID₅₀まで希釈した濃度で、ヒラメ1尾当り50μlを筋肉注射により接種した。感染防御試験を行なった区画は、次の通りである。
試験区１：pCMV−HRVg＋5×10²TCID₅₀HIRRV 8601株/ヒラメ1尾
試験区２：pCI-neo＋5×10²TCID₅₀HIRRV 8601株/ヒラメ1尾
【００３８】
HIRRV 8601株感染後、ヒラメを２週間観察し続け、試験区１及び試験区２とのヒラメの累積死亡率（死亡個体数／試験個体数）×100（%）を算出し、その結果を第３図に示す。ワクチンの効果は、その比較によって判定した。
その結果、試験区２は約66%累積死亡率であるのに対して、試験区１のそれは約30%であったことから、HIRRV 8601株感染に対するpCMV−HRVgの感染防御の有効性、すなわちワクチン効果が明らかとなった。
【００３９】
実施例６免疫関連遺伝子の発現量解析
（１）リアルタイムＰＣＲ
測定対象の遺伝子と標準DNAは、全量 50μl (1×SYBR Green Buffer 5μl、25mM MgCl₂ 6μl、dNTP Blend 4μl、AmpliTaq Gold (5U/μl) 0.25μl、AmpErase UNG (1U/μl) 0.5μl、primer-F (3μM) 5μl、primer-R (3μM) 5μl、鋳型cDNA5μl)で行う。この時用いる鋳型cDNAは1000μg/mlの濃度に調製する。PCRは、50℃で2分間、次いで95℃で10分間処理後に、95℃で15秒間、58℃で60秒間を１サイクルとする処理を40回行った。これらリアルタイムPCR用の試薬及び機械はGeneAmp 5700 Sequence Detection System(PE Applied Biosystems社製)を用い、添付の操作方法に従い行った。また、primer-F、primer-Rに対応する各遺伝子のリアルタイムPCR用プライマー（SG）、標準DNA用プライマー（SG200）を第４図に示す。
【００４０】
（２）mRNAの発現量の解析
ヒラメ（平均体重1.66g）の筋肉に各1μgのプラスミドDNA(pCMV-HRVg、pCMV-HRVg + pCMV-IL-1β、pCI-neo)を実施例４の方法に準じてそれぞれ接種し、1日、3日及び7日後の筋肉組織より常法に従い、ｍRNAを抽出し、cDNAを合成した。次いで、IgD、IgM、MHCクラス1α、MHCクラス2α、MHCクラス2β、TCRα、TCRβC1、TCRβC2、TCRδの発現量の変化についてリアルタイムPCRを用い定量的に解析した。解析した結果を第５図から第７図に示す。尚、定量した各々の遺伝子は、β-actinで統一化した。また、pCMV-IL-1βは、常法に従い、pCI-neoのEcoRIとXbaIの間にヒラメIL-1β遺伝子（DDBJ=AB070835）を挿入し作製したものであり、アジュバントとして使用した。
【００４１】
解析を行った遺伝子の発現量は、コントロールであるベクター（pCI-neo）のみの筋肉組織と比べ接種区の方が、IgDでは57倍、IgMでは2倍、MHCクラス1αでは15倍、MHCクラス2αでは7倍、MHCクラス2βでは3倍、TCRαでは3倍、TCRβC1では10倍、TCRβC2では5倍及びTCRδでは4倍のmRNAコピー数の増加が認められた。
【００４２】
【発明の効果】
本発明のpCMV−HRVgは、ヒラメでのHIRRV感染防御試験及び免疫関連の遺伝子の発現量の大幅な増加を確認した結果から、DNAワクチンとして有効であり、HIRRVの感染の予防に期待ができる。
【００４３】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】グリコプロテイン遺伝子を増幅するために設計したPCRプライマーの位置を示す図である。
【図２】pCMV-HRVgの構成図である。
【図３】DNAワクチン処理によるヒラメの累積死亡率の経時的変化を示す図である。
【図４】リアルタイムPCRに用いたプライマーを示す図である。
【図５】各遺伝子の発現量の変化についてリアルタイムPCRを用い定量的に解析した結果の図である。G-proteinとはpCMV-HRVgで、G-protein＋IL-1βとはpCMV-HRVg + pCMV-IL-1βで、 VectorとはpCI-neoを意味し、その順に左から接種1、3、7日後（図の横軸）における発現量を各遺伝子毎にまとめて表示した。
【図６】各遺伝子の発現量の変化についてリアルタイムPCRを用い定量的に解析した結果の図である。G-proteinとはpCMV-HRVgで、G-protein＋IL-1βとはpCMV-HRVg + pCMV-IL-1βで、 VectorとはpCI-neoを意味し、その順に左から接種1、3、7日後（図の横軸）における発現量を各遺伝子毎にまとめて表示した。
【図７】各遺伝子の発現量の変化についてリアルタイムPCRを用い定量的に解析した結果の図である。G-proteinとはpCMV-HRVgで、G-protein＋IL-1βとはpCMV-HRVg + pCMV-IL-1βで、 VectorとはpCI-neoを意味し、その順に左から接種1、3、7日後（図の横軸）における発現量を各遺伝子毎にまとめて表示した。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a DNA vaccine for stimulating protective immunity against fish infection with Hirame Rhabdovirus.
[0002]
[Prior art]
In the aquaculture industry of many aquatic organisms such as seafood, viral and bacterial diseases in aquaculture areas that are closed systems exist in high density of individuals. It is a big problem in the aquaculture industry.
Since 1984, when flounder larvae virus (hereinafter sometimes abbreviated as “HIRRV”) infection was confirmed in cultured flounder, HIRRV is not only found in flounder but also in cultured fish species such as sweetfish and black sea bream. Is generated. In particular, it exhibits strong pathogenicity against cultured flounder, and occurs frequently from January to April when the water temperature is 15 ° C or lower. The flounder infected with HIRRV often exhibits death such as blackening of body color, abnormal swimming, abdominal retention, bleeding in the muscles and heel, and death. In particular, cultured flounder has a high mortality rate, which is a significant economic loss in the flounder aquaculture industry and is an important viral infection. Although most seafood vaccines have been developed against bacteria, few vaccines that are effective against viral or parasitic diseases have been developed.
[0003]
Vaccines are generally used for the prevention or treatment of viral infections. Vaccines include inactivated vaccines (Japanese encephalitis, Weil disease, etc.), toxoids (tetanus, diphtheria, etc.), attenuated vaccines (BCG, polio, etc.), and genetically modified vaccines (hepatitis B virus, etc.). Inactivated vaccines and toxoids detoxified with exotoxins are relatively safe vaccines that induce antibodies against them. Genetically modified vaccines are considered safer vaccines because they do not contain impurities when compared to inactivated vaccines.
[0004]
However, these vaccines can induce antibody production but are less likely to induce cellular immunity. Furthermore, inactivated vaccines and attenuated vaccines are required to secure appropriate cells in order to obtain a large amount of virus as an antigen industrially. Furthermore, immunity acquired with attenuated vaccines is often maintained for a long time, but side effects and risks have been pointed out. Inactivated vaccines and genetically engineered vaccines are considered to have a short antigen persistence and require an adjuvant or the like. Conventional vaccines need to be stored refrigerated from the time of manufacture to the time of inoculation of a subject, resulting in increased costs and reduced efficacy.
[0005]
Recent research developments in the vaccine field have led to the development of new vaccine species based on the induction of immunity by administration of plasmid DNA encoding immunogenic proteins, improving the disadvantages of conventional vaccines as described below. ing. That is, DNA vaccine can induce not only humoral immune response but also cellular immunity, so that it can protect against disease, DNA vaccine can be highly purified, stable at room temperature or high temperature, Refrigerated storage is not essential and can be stored for a long period of time. It is easy to quickly improve DNA vaccines by genetic engineering techniques, and there are advantages such as shortening the time spent for vaccine development.
[0006]
Rhabdovirus is composed of five proteins. That is, glycoprotein, nucleocapsid protein, RNA-dependent RNA synthetase and matrix proteins M1 and M2 (Kurokuni Muroga, Shuzo Egusa, Introduction to Fish Diseases, T. Nishizawa et al., Dis. Aquat. Org., 10, 167 -172,1991). Of these, glycoproteins have been reported to have vaccine efficacy (P. Boudinot, et al., VIROLOGY 249, 297-306, 1998, N. Lorenzen, et al., Aquaculture 172, 41-61). 1999, S. Corbeil, et al., Vaccine, 18,2817-2824, 2000). In addition to glycoproteins, VHSV (viral hemorrhagic septicemia virus) has been used to study the effects of DNA vaccines on nucleocapsid proteins.
[0007]
In addition, the nucleotide sequence and amino acid sequence of glycoprotein related to the pathogenicity of HIRRV have been reported (H.A.Bjorklun, et al., Virus Research, 42, 65-80, 1996). However, there is no report of a vaccine for stimulating protective immunity against HIRRV infection in Japanese flounder.
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a DNA vaccine for HIRRV-infected fish for stimulating protective immunity against HIRRV infection.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive research on effective vaccines against HIRRV infection, the present inventors have inoculated flounder with plasmid DNA having a gene encoding a glycoprotein of HIRRV, and have an immune effect against HIRRV infection and immune-related genes. As a result, the present invention was completed. That is, the present invention
1. A DNA construct for conferring immunity against lamellabudovirus comprises a nucleotide sequence encoding an immunogenic polypeptide of lamellabudovirus and a transcriptional regulatory sequence operably linked to said nucleotide sequence comprising a cytomegalovirus immediate promoter. A DNA vaccine for fish infected with flounder virus,
2. 2. The DNA vaccine for fishes infected with the lamellabudovirus according to the above 1, wherein the immunogenic polypeptide of the flounder virus is a glycoprotein,
3. 2. The DNA for fish infected with the lamellabudovirus according to 2 above, wherein the glycoprotein consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or has a homology of 80% or more with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. vaccine,
4). 2. The DNA vaccine for fishes infected with flounder virus according to 2 above, wherein the glycoprotein consists of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
5. The nucleotide sequence has the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1_,Or a DNA vaccine for a fish infected with lamellabudovirus according to 1 above, wherein the homology with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 is 80% or more,
6). The DNA vaccine for fishes infected with flounder virus according to 1 above, wherein the nucleotide sequence has the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
7). The DNA for the fish infected with the lamellabudovirus according to 1 above, which is pCMV-HRVg deposited under the accession number of FERM P-18504 at the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology. vaccine,
8). A method of administering to a fish a DNA vaccine for a flounder virus-infected fish according to any one of 1 to 7 above,
9. 9. The method according to 8 above, wherein a gene gun is used,
10. 10. The method according to 8 or 9 above, wherein the fish is a fish species belonging to the flatfish family or the flatfish family,
11. The present invention relates to the use of a DNA vaccine for fish infected with lamellabudovirus according to any one of 1 to 7 above, which is used for inducing an immune response against lamellabudovirus.
[0010]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention provides use of a DNA construct for producing a DNA vaccine for use in inducing an immune response against HIRRV infection, wherein the DNA construct is an expression vector that can be expressed in fish cells, HIRRV immunogenic polypeptide One or more isolated nucleotide sequences encoding, transcriptional regulatory sequences operably linked to the sequences, and the like.
[0011]
Nucleotide sequences that encode immunogenic proteins include five proteins that are structural proteins of the Rhabdoviridae family (Kurokuni Muraga, Shuzo Egusa, Introduction to Fish Diseases): glycoprotein, nucleocapsid protein, RNA-dependent Of nucleotide sequences encoding RNA synthase and matrix proteins M1 and M2 ((Muroga Kiyokuni, Shuzo Egusa, Introduction to Fish Diseases, T. Nishizawa et al., Dis. Aquat. Org., 10, 167-172, 1991)) Preferably, it is a part or all of a nucleotide sequence encoding a glycoprotein derived from HIRRV, more preferably a part or all of a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2. And most preferably a part or all of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1. A part of the nucleotide sequence is homologous to a nucleotide encoding a glycoprotein (for example, 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, further preferably 95 or more, most preferably 98% or more). The nucleotide sequence that can confer immunity to fish to which the present invention is applied is preferred.
[0012]
Furthermore, the present invention includes glycoprotein-modified proteins. In the present invention, the modified protein is a protein in which one or more, preferably one to several amino acids are added, inserted, deleted, deleted or substituted in the amino acid sequence described above, and are still present. It means that can immunize fish to which the invention is applied. In addition, the nucleotide sequence according to the present invention may be naturally derived, fully synthesized, or synthesized using a part of the naturally derived nucleotide sequence.
[0013]
The nucleotide sequence encoding the glycoprotein used in the present invention can be obtained from a virus belonging to the Rhabdoviridae family, specifically HIRRV. A typical method for obtaining the nucleotide sequence according to the present invention is a method commonly used in the field of genetic engineering, for example, screening using an appropriate DNA probe prepared based on partial amino acid sequence information. The method etc. are mentioned.
[0014]
This expression vector can be constructed on the basis of a self-replicating vector, that is, a plasmid that exists as an extrachromosomal independent and whose replication does not depend on chromosomal replication. Further, when the expression vector is introduced into a host, the expression vector may be incorporated into the genome of the host and replicated together with the chromosome into which it has been integrated. As the procedure and method for constructing the vector according to the present invention, those conventionally used in the field of genetic engineering can be used.
[0015]
Transcriptional regulatory sequences operably linked to the isolated sequences include, but are not limited to, constitutive promoters, inducible promoters, tissue specific promoters or promoters derived from the gene of the expressed antigen. . Examples of the constitutive promoter include a promoter sequence derived from cytomegalovirus (CMV), a strong promoter such as Rous sarcoma virus (RSV), simian virus-40 (SV-40) or herpes simplex virus (HSV). Examples of the tissue specific promoter include muscle β-actin promoter and thymidine kinase promoter. Inducible or regulatable promoters can include growth hormone regulatable promoters, promoters under the control of the lac operon sequence, or zinc inducible metallothionein promoters.
[0016]
The regulatory sequences include expression control sequences including promoter (eg, inducible or constitutive promoters as described above) DNA sequences, and enhancer elements, transcription or polyadenylation signals (eg, simian virus-40 (SV-40) or bovine). One or more copies of an intron sequence for splicing (derived from growth hormone) or an immunostimulatory DNA sequence known as a CpG motif may be included.
[0017]
The expression vector also has a bacterial replication origin sequence, a selectable marker that can be used for an antibiotic resistance (eg, ampicillin) gene for selection or a non-antibiotic resistance gene (eg, a β-galactosidase gene).
[0018]
Oligonucleotides with unmethylated CpG nucleotides are known to activate the immune system (A. Krieg et al., Nature, 1995, 374, 546-549). Depending on the flanking sequence, some CpG motifs are more immunostimulatory to B cell or T cell responses and preferentially stimulate certain species. A copy of the CpG motif in the DNA expression vector acts as an adjuvant that elicits an immune response against the expressed protein. The DNA extension comprising the CpG motif, i.e. the CpG dinucleotide in the specified sequence, is selected from about 5 to 40 base pairs in length. Multiple CpG motifs may be inserted into non-coding regions of the expression vector. When a humoral response is desired, a preferred CpG motif is a CpG motif that stimulates secretion of cytokines known to stimulate CD8 + T cell responses.
[0019]
Other CpG motifs were found to inhibit the immune response. In a preferred embodiment of the invention, these immunoinhibitory CpG motifs are removed or mutated in the expression vector used by the method of the invention without interrupting the expression of the polypeptide therefrom.
[0020]
Examples of fish to which the present invention can be applied include fish species belonging to the flounder family and the flounder family (for example, flounder, flounder and the like), sweetfish and black sea bream.
[0021]
Examples of the DNA vaccine inoculation method include oral administration, intramuscular injection, intraperitoneal injection, administration using a gene gun, and immersion, and intramuscular injection and administration using a gene gun are preferable. Administration using a gene gun is a method in which a plasmid is coated with gold particles of about 1 μm in size, and high-pressure helium gas is used to shoot the skin, cells, or tissues of the subject with a special instrument in the manner of an air gun. is there. Compared with intramuscular injection, this gene gun can provide the same immune effect with 100 to 1000 times less DNA, and it has better reproducibility than intramuscular injection. It has excellent characteristics.
[0022]
The DNA vaccine of the present invention can be formulated together with liposomes, fluorocarbon emulsions, phospholipid calcium precipitants, cylinders, gold particles, biodegradable microspheres and cationic polymers as transfection reagents. The phospholipid calcium precipitant consists of phosphatidylserine, cholesterol and calcium. Cylindrical agents are also known as lipid-based microcylinders, which are composed of two layers of lipids wound in a spiral and packed together with their edges together.
[0023]
Adjuvants stimulate the immune system and enhance the immune response to antigens, and are mainly added as adjuvants to vaccines. As typical adjuvants, aluminum compounds, polynucleotides, bacterial cell components, and the like are known, but many of these do not provide sufficient effects for application to the present invention. In particular, since the action of an adjuvant is widely effective for antigenic substances, there is a risk of enhancing the antigenic irritation of impurities contained in the antigen and causing harmful side effects, and it is necessary to give due consideration to the purity of the antigen used. There are problems such as. Among them, for example, IL-1β has been reported to be effective as an adjuvant (J. Y. Scheerlinck, Genetic adjuvants for DNA Vaccine, 19, 2647-2656, 2001). In the present invention, a plasmid into which IL-1β gene has been inserted so that it can be expressed in the body of fish (eg, flounder) can be prepared and inoculated into fish together with the vaccine of the present invention.
[0024]
The immune mechanism exerts a variety of physiological functions while cells that play various roles mutually regulate the function. T cell antigen receptor (TCR), major histocompatibility complex (MHC), or immunoglobulin (Ig) present on the cell surface of T cells and B cells, factors that play an important role in host defense It is possible to examine the activation of the immune system using the expression level of In the present invention, for example, after inoculating flounder with a DNA vaccine against HIRRV infection, analysis of activation of the biological defense mechanism in the fish body is performed quantitatively by performing real-time PCR on changes in the expression level of TCR, MHC and Ig. You can confirm and examine the activation of the immune system.
[0025]
Real-time PCR is a detection technique for profiling the PCR reaction curve by tracking the gene amplification process by PCR in real time using a fluorescence detector. When the sample to be examined is amplified by PCR, it is possible to calculate an accurate DNA amount by examining the number of PCR cycles reaching the exponential increase curve. For real-time PCR, TaqMan manufactured by Perkin-Elmer and iCycler manufactured by BioRad can be used.
[0026]
In real-time PCR, two types of primers for real-time PCR (SG) and standard DNA (SG200) are used. For real-time PCR (SG), the amplicon should be designed to be short (60-100 bp) and low GC content. Generating a primer in the 3 ′ UTR portion makes it possible to design a gene-specific primer relatively easily and accurately. There is also a method of designing on a computer using the primer express software. A standard DNA primer (SG200) is designed outside the primer designed by real-time PCR. If you want to compare genes, it is desirable to have amplicons.
[0027]
For preparation of standard DNA, first use a primer (SG200) specific to each gene to be measured, and react with a total volume of 50 μl of PCR until it reaches a plateau (PCR is treated at 95 ° C. for 2 minutes, then at 95 ° C. for 30 minutes). 30 times for 1 second at 55 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 1 minute, and then remove excess primers using a column such as Microcon-PCR Centrifugal Filter Devices (MILLIPORE). The concentration is measured by Avogadro constant (1mol = 6.022 × 10^{twenty three}The number of copies is calculated from molecules). The PCR product is then diluted in 21 steps (copy number 10¹³~Ten^- ⁷) And repeat PCR using the primer (SG) designed on the inside. At this time, the number of cycles is 14 so that amplification occurs exponentially. The PCR product thus obtained is subjected to agarose gel electrophoresis, and five steps after the band is completely invisible are amplified exponentially, so these five steps are used as standard DNA for actual real-time PCR.
[0028]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention concretely in detail, this invention is not limited to these.
[0029]
Example 1 Isolation of HIRRV-derived glycoprotein gene
(1) Preparation of PCR primers
Based on the amino acid sequence of the glycoprotein gene (GenBank = AAB39502,1) reported by HABjorklund et al. (Virus Research, 42, 65-80, 1996) Prepared according to a conventional method.
HRV-glys: 5-GAGAATTCGTCATGGACCCTCGAATAAT-3 (SEQ ID NO: 3)
HRV-glya: 5-GAGTCGACTTACCCTCGACTGGCGAGGT-3 (SEQ ID NO: 4)
FIG. 1 shows the DNA base sequence of the PCR primer prepared for amplifying the glycoprotein gene derived from the HIRLV8601 strain and the DNA base sequence of the glycoprotein gene (GenBank = AAB39502,1).
[0030]
(2) Isolation of cDNA
HINAE cells (Hirame natural embryo cell; currently being stored in the department of marine bioresource science, Hokkaido University) can be stored in a commercially available L-15 medium with FBS added to a concentration of 20% and penicillin and streptomycin After adjusting the final concentrations to be 100 units / ml and 100 μg / ml, the cells were cultured at 20 ° C. HINAE cells cultured until confluent were infected with HIRRV 8601 strain (Kimura, T., et al., Diseases of Aquatic Organisms 1, 209-217, 1986) stored at −80 ° C. CPE (Cytopathic Effect) can be observed 2 to 5 days after HIRRV 8601 strain is infected with HINAE cells.
[0031]
HIRRV 8601 strain culture solution (1.0x10⁸TCID₅₀/ ml) 150 μl and TRIzol (GIBCO) 1 ml were mixed and allowed to stand at room temperature for 5 minutes. Next, 200 μl of chloroform was added and mixed well, allowed to stand at room temperature for 5 minutes, centrifuged (15,000 rpm, 4 ° C., 5 minutes), and the upper layer was transferred to a new centrifuge tube. An equal amount of isopropyl alcohol was added to the upper layer and left at room temperature for 10 minutes. After centrifugation (15,000 rpm, 10 minutes), the upper layer was discarded and the pelleted genomic RNA was dried and dissolved in 10 μl of DEPC-treated water.
[0032]
From genomic RNA extracted in this way, cDNA SYNTHESIS KIT 1^st CDNA was synthesized by STRAND with AMV Reverse Transcriptase (Takara Shuzo) according to the attached operation method. Using this cDNA as a template, PCR was performed according to a conventional method using the PCR primer prepared in Example 1 (1). PCR was performed using the attached 10x buffer 5 μl, dNTP 4 μl, HRV-glys 1 μl (25 pmol / μl), HRV-glya 1 μl (25 pmol / μl), DNA polymerase 0.5 μl (5 units / μl), cDNA 3 μl (10 ng), sterile water 35.5 After preparing 50 μl in 50 μl, treated at 95 ° C. for 5 minutes, then treated 30 times at 95 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, 72 ° C. for 2 minutes, then 2 times at 2 ° C. The reaction was carried out for 1 minute. As a result of agarose gel electrophoresis of the obtained PCR product, it was visually confirmed that a DNA fragment of about 1.5 kbp was amplified.
[0033]
(3) Analysis of DNA base sequence
The amplified DNA fragment was inserted into pGEM-T Eazy vector (manufactured by Promega) and fluorescently labeled M13primer (Nisshinbo Co., Ltd.) and Thermo Sequence Fluorescent Labeled Primer Cycle Sequencing Kit with 7-deaza-dGTP (amersham A sample was prepared by the Dideoxy method using pharmacia bitech, and the nucleotide sequence was determined using DNA sequencer model 4000 (manufactured by LI-COR). When this sequence was analyzed, the DNA fragment amplified by PCR had an open reading frame (ORF) consisting of 1527 bp (SEQ ID NO: 1). The protein predicted from this ORF has 508 amino acid residues. As a result of homology search (FASTA), it has been reported by HABjorklund et al. (Virus Research, 1996, 42, 65-80) The homology with the DNA base sequence of (GenBank = AAB39502,1) was 99.9%, and the homology with the amino acid sequence was 99.8%.
[0034]
Example 2 Preparation of pCMV-HRVg
The plasmid used in the analysis of the DNA base sequence of Example 1 (3) wasEcoRI andSalI processed. The glycoprotein gene derived from the HIRRV 8601 strain obtained in Example 1 (2) excised from the pGEM-T Easy vector is the human cytomegalovirus-derived promoter region of pCI-neo (5474 bp, manufactured by Promega). Of the multiple cloning site located downstream of the encoded sequenceEcoRI andSalPCMV-HRVg (FIG. 2) was prepared by inserting into I. Note that pCMV-HRVg was deposited at the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology on September 5, 2001, under the deposit number of FERM P-18504.
[0035]
Example 3 Confirmation of Glycoprotein Gene Expression
PCMV-HRVg in HINAE cells^TM After transfection using Transfection Reagent (QIAGEN), the cells were subcultured for one month. Next, the cultured cells are collected in a centrifuge tube, centrifuged (3,000 rpm, 5 minutes), the medium alone is discarded, and the total RNA of the cultured cells is extracted and RT-PCR is performed in the same manner as in Example 1 (2). It was. As a result, it was confirmed that the glycoprotein gene was expressed.
[0036]
Example 4 Method of introducing pCMV-HRVg into Japanese flounder
Gene gun (Helios^TMUsing a gene gun (manufactured by BIO-RAD), in accordance with the attached operation method, 1 μg of pCMV-HRVg per fry flounder was inoculated into the sole of the flounder. The conditions for one shot in the gene gun are as follows: the gold particle size is 0.6 μm, the amount of gold particles per shot is 0.5 mg, and the pressure of helium gas is 200 psi.
[0037]
Example 5 Infection protection test against Japanese flounder
In each test section, 50 flounder larvae (total length: about 4 to 5 cm, average fish weight: 1.66 g) were used. The test fish was raised in an average water temperature of 13.0 ° C. (12 ° C. to 14.5 ° C.) by injecting filtered natural seawater (0.5 L / min) in a 60 L water tank.
First, in accordance with the method of Example 4, pCMV-HRVg and pCI-neo (manufactured by Promega) as a control were inoculated into flounder. Four weeks after the inoculation, HIRRV 8601 strain culture supernatant (1.0 × 10 6) cultured in HINAE cells as in Example 1 (2).⁸TCID⁵⁰/ ml) 5x10²TCID₅₀50 μl per flounder was inoculated by intramuscular injection at a concentration diluted to The compartments where the infection protection test was conducted are as follows.
Test group 1: pCMV-HRVg + 5 × 10²TCID₅₀HIRRV 8601 shares / flounder 1
Test Zone 2: pCI-neo + 5 × 10²TCID₅₀HIRRV 8601 shares / flounder 1
[0038]
After infection with the HIRRV 8601 strain, flounder was continuously observed for 2 weeks, and the cumulative mortality (number of dead / tested individuals) x 100 (%) of flounder in the test area 1 and test area 2 was calculated. Shown in FIG. The effectiveness of the vaccine was determined by comparison.
As a result, test group 2 had a cumulative mortality rate of about 66%, whereas that of test group 1 was about 30%. Therefore, the effectiveness of pCMV-HRVg protection against HIRRV 8601 infection, The vaccine effect became clear.
[0039]
Example 6 Analysis of expression level of immune-related genes
(1) Real-time PCR
The total amount of gene to be measured and standard DNA is 50 μl (1 × SYBR Green Buffer 5 μl, 25 mM MgCl₂ 6 μl, dNTP Blend 4 μl, AmpliTaq Gold (5 U / μl) 0.25 μl, AmpErase UNG (1 U / μl) 0.5 μl, primer-F (3 μM) 5 μl, primer-R (3 μM) 5 μl, template cDNA 5 μl). The template cDNA used at this time is prepared at a concentration of 1000 μg / ml. PCR was performed at 50 ° C. for 2 minutes and then at 95 ° C. for 10 minutes, followed by 40 treatments at 95 ° C. for 15 seconds and 58 ° C. for 60 seconds. These reagents and machines for real-time PCR were performed using GeneAmp 5700 Sequence Detection System (manufactured by PE Applied Biosystems) according to the attached operation method. FIG. 4 shows real-time PCR primers (SG) and standard DNA primers (SG200) for each gene corresponding to primer-F and primer-R.
[0040]
(2) Analysis of mRNA expression level
1 μg each of plasmid DNA (pCMV-HRVg, pCMV-HRVg + pCMV-IL-1β, pCI-neo) was inoculated in the muscles of Japanese flounder (average body weight 1.66 g) according to the method of Example 4 for 1 day. MRNA was extracted from muscle tissue 3 days and 7 days later according to a conventional method, and cDNA was synthesized. Subsequently, changes in the expression levels of IgD, IgM, MHC class 1α, MHC class 2α, MHC class 2β, TCRα, TCRβC1, TCRβC2, and TCRδ were quantitatively analyzed using real-time PCR. The analysis results are shown in FIGS. In addition, each quantified gene was unified with β-actin. In addition, pCMV-IL-1β is a pCI-neoEcoWith RIXbaA flounder IL-1β gene (DDBJ = AB070835) was inserted between I and used as an adjuvant.
[0041]
The expression level of the analyzed genes is 57 times in IgD, 2 times in IgM, 15 times in MHC class 1α, and MHC class in the inoculated group compared to the control vector (pCI-neo) -only muscle tissue There was a 7-fold increase in mRNA copy number for 2α, a 3-fold increase for MHC class 2β, a 3-fold increase for TCRα, a 10-fold increase for TCRβC1, a 5-fold increase for TCRβC2, and a 4-fold increase for TCRδ.
[0042]
【The invention's effect】
The pCMV-HRVg of the present invention is effective as a DNA vaccine from the result of confirming a significant increase in the expression level of HIRRV infection protection test and immunity-related genes in Japanese flounder, and can be expected to prevent HIRRV infection.
[0043]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the positions of PCR primers designed for amplifying a glycoprotein gene.
FIG. 2 is a block diagram of pCMV-HRVg.
FIG. 3 is a graph showing changes over time in the cumulative mortality rate of Japanese flounder due to DNA vaccine treatment.
FIG. 4 shows primers used for real-time PCR.
FIG. 5 is a diagram showing the results of quantitative analysis of changes in the expression level of each gene using real-time PCR. G-protein is pCMV-HRVg, G-protein + IL-1β is pCMV-HRVg + pCMV-IL-1β, and Vector means pCI-neo. The expression level on the horizontal axis of the figure was collectively displayed for each gene.
FIG. 6 is a diagram showing the results of quantitative analysis of changes in the expression level of each gene using real-time PCR. G-protein is pCMV-HRVg, G-protein + IL-1β is pCMV-HRVg + pCMV-IL-1β, and Vector means pCI-neo. The expression level on the horizontal axis of the figure was collectively displayed for each gene.
FIG. 7 is a diagram showing the results of quantitative analysis of changes in the expression level of each gene using real-time PCR. G-protein is pCMV-HRVg, G-protein + IL-1β is pCMV-HRVg + pCMV-IL-1β, and Vector means pCI-neo. The expression level on the horizontal axis of the figure was collectively displayed for each gene.

Claims

A DNA construct for conferring immunity against flounder virus is a flounder in which the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a glycoprotein having a homology of 80% or more with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 A DNA vaccine for flounder virus-infected fish, wherein the nucleotide sequence encoding the immunogenic polypeptide of rhabdovirus and the transcriptional regulatory sequence operably linked to the nucleotide sequence comprise a cytomegalovirus immediate promoter.

The fish of claim 1, wherein the nucleotide sequence has the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, or has a homology of 90 % or more with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1. DNA vaccine.

Incorporated administrative agency National Institute of Advanced Industrial Science and Technology It is pCMV-HRVg deposited under the accession number of P-18504, The DNA vaccine for the fishes infected with the lamellabudovirus according to claim 1.

A method of administering to a fish a DNA vaccine for a fish infected with hiraramabidovirus according to any one of claims 1 to 3 .

The method according to claim 4 , wherein a gene gun is used.

The method of claim 4 or claim 5 fish characterized in that it is a species belonging to Pleuronectidae or flounder family.

The use of a DNA vaccine for fishes infected with lamellabudovirus according to any one of claims 1 to 3 , which is used for inducing an immune response against lamellabudovirus.