JP4851714B2 - Pbx依存性遺伝子調節を阻害するペプチド - Google Patents
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Description
Mann et al. , 1996, Trends Genet. , 12(7), p258-262 Phelan et al., 1995, Mol. Cell.BioI., 15(8), p3989-3997 Neuteboom et al.,1995, PNAS, 92, p9166-9170 Peltenburg & Murre, 1996, EMBO Journal, 15(13), p3385-3393
X1X2X3WMX4X5X6X7
(式中、配列X1〜X7は、少なくとも9個のアミノ酸を含むアミノ酸配列であり、ここに記載の9個のアミノ酸位置のうちの1又はそれ以上の間に1個又は2個のアミノ酸残基が任意に割り込んでいてもよく;
X1はW、T、PE、KQI、VV、PQT、H、RI及び非存在から選択されるものであり;
X2は芳香族側鎖を有するアミノ酸であり;
X3はP又はDであり;
X4は塩基性側鎖を有するアミノ酸であり;
X5は帯電側鎖を有するアミノ酸であり;
X6は帯電側鎖を有するアミノ酸であり;
X7は塩基性側鎖を有するアミノ酸又はセリンである。)
を含むペプチドの、異常な細胞分割が発生する障害を治療又は防止するための医薬品の製造における使用を提供する。
WYPWMKKHHRQIKIWFQNRRMKWK、
WYPWMKKHHRQIKIWFQNRRMKWKK、及び
WYPWMKKHHR
である。
異常な細胞分割が発生する障害の治療又は防止において同時、連続又は分割使用するための医薬品の製造における、本発明のペプチド及び細胞毒性薬又は化学療法剤の使用。
細胞毒性薬又は化学療法剤の副作用を低減するための医薬品の製造における、本発明のペプチドの使用。
生体内での幹細胞個体数を維持又は増殖させるための医薬品の製造における、本発明のペプチドの使用。
ヒト又は動物における異常な細胞分割が発生する障害を治療する方法であって、前記ヒト又は動物に、治療上有効な量の本発明のペプチドを投与することを含む、前記方法。
生体外で幹細胞を維持又は増殖させる方法であって、前記幹細胞に本発明のペプチドを接触させることを含む、前記方法。このような方法はさらに、前記ペプチドの非存在下で前記細胞を培養するステップ、及び/又は前記幹細胞をそれらを必要とする患者に投与するステップを含んでいてもよい。このような方法によって維持又は増殖された幹細胞も、本発明の一態様を形成する。
幹細胞のレベル低下を引き起こす病状の治療又は防止のための医薬品の製造における、本発明の幹細胞の使用。
本発明のペプチド及び薬学的に許容し得る担体を含む薬学的組成物。
Y1−X1−X2−X3−W−M−X4−X5−X6−X7−Y2 (I)
(式中、
配列X1〜X7は、少なくとも9個のアミノ酸を含むアミノ酸配列であり、ここに記載の9個のアミノ酸位置のうちの1又はそれ以上の間に1個又はそれ以上(好ましくは1個又は2個)のアミノ酸残基が任意に割り込んでいてもよく;
Y1は、存在していても非存在でもよい、X1(又は、X1が非存在のときはX2)に結合した部分であり、好ましくは、X1(又はX2)の側鎖を介する場合を除き、X1(又はX2)の利用可能なアミノ基を介して結合しており、ここでY1は、好ましくは任意に置換されている50個又はそれ以下のアミノ酸のペプチドであり;
Y2は、存在していても非存在でもよい、X7に結合された部分であり、好ましくは、X7の側鎖を介する場合を除き、X7のカルボキシル基を介して結合しており、ここでY2は、好ましくは任意に置換されている50個又はそれ以下のアミノ酸のペプチドであり;
X1は、存在していても非存在でもよい、1又はそれ以上のアミノ酸であり、好ましくはW、T、PE、KQI、VV、PQT、H又はRIであり;
X2は、芳香族側鎖を有するアミノ酸、好ましくはY、F又はWであり;
X3は、アミノ酸P又はDであり;
X4は、塩基性側鎖を有するアミノ酸、好ましくはK、R又はHであり;
X5は、帯電側鎖、好ましくは側鎖を有するアミノ酸、特に好ましくはK、R、E、H、D、N又はQであり;
X6は、帯電側鎖、好ましくは側鎖を有するアミノ酸、特に好ましくはK、R、E、H、D、N又はQであり;
X7は、塩基性側鎖を有するアミノ酸又はセリンであり、特に好ましくはH、S、R又はKである。)
又はその機能的に同等な誘導体、変異体若しくは断片を有するものである。
X1−X2−X3−W−M−X4−X5−X6−X7
を含むものであり、式中、X1〜X7は上で定義したとおりである。
Y1WYPWMKKHHY2(配列番号:5)
を有するものであり、式中、Y1、X1及びY2は本明細書において先に定義したとおりである。
WYPWMKKHH(配列番号:6)、若しくは
WYPWMKKHHR(配列番号:7)。
を有するものであるか、又は含むものである。
X8QIKIWFQNRRMKWKK (II)
(式中、X8はアミノ酸R又はQである。)
を有するものであるか、又はその機能的に同等の誘導体、変異体若しくは断片である。
X8QX9X10X11WFQNX12X13MX14WX15X16(配列番号:9)
(式中、X8はR又はQ又は非存在であり;
X9、X11はそれぞれ独立してI又はLであり;
X10、X12、X13、X14、X15及びX16はそれぞれ独立してK又はRである。)
によって定義されるものであってもよい。
QIRIWFQNRRMKWKK(配列番号:10);
QIKIWFQNKRMKWKK(配列番号:11);
QIKIWFQNKKMKWKK(配列番号:12);
QIRIWFQNRKMKWKK(配列番号:13);
QIRIWFQNRRMRWKK(配列番号:14);
QIRIWFQNRRMKWRK(配列番号:15);
QIRIWFQNRRMKWKR(配列番号:16);
QIRIWFQNRRMKWRR(配列番号:17);
QIRIWFQNRRMKWKK(配列番号:18);
QIKIWFQNRRMKWRK(配列番号:19);
QIRIWFQNKRMKWRK(配列番号:20);
QIKLWFQNRRMKWKK(配列番号:21)、
QLKLWFQNRRMKWKK(配列番号:22);又は
QLRIWFQNRRMKWKK(配列番号:23)。
の形式を有するものである。
WYPWMKKHHR(配列番号:7)
を有するペプチド、又はその機能的に同等の誘導体、変異体若しくは断片を有する。
WYPWMKKHHRQIKIWFQNRRMKWKK(配列番号:24)、
又はその機能的に同等の誘導体、変異体若しくは断片を有する。
ペアワイズアラインメントパラメータ法:accurate、マトリクス:PAM、ギャップ挿入時のペナルティ:10.00、ギャップ伸長時のペナルティ:0.10;
マルチプルアラインメントパラメータマトリクス:PAM、ギャップ挿入時のペナルティ:10.00、遅延の%同一性:30、ペナルティ付与ギャップエンド:オン、ギャップ分離距離:0、ネガティブマトリクス:なし、ギャップ伸長時のペナルティ:0.20、残基特異性ギャップペナルティ:オン、親水性ギャップペナルティ:オン、親水性残基:GPSNDQEKR。特定の残基での配列同一性は、単に誘導体化された同一の残基を含むものとする。
a)培養物中の前記細胞に、上述したようなPBX依存性転写調節を低減又は防止する薬剤、好ましくはアンタゴニスト、特に好ましくはHOXとPBXとの相互作用のアンタゴニスト、例えば上述したようなペプチドを接触させるステップと;
b)前記細胞を前記薬剤の非存在下で培養するステップと;を含む。ペプチドは培養中に数日以内に分解されるようになり、それゆえ活性ペプチドが消耗されることに注意すべきである。それゆえステップb)は、分解が発生するのに十分な時間が経過している場合は事前の洗浄を行わずに実施できる。前述したように、好適な培養時間は少なくとも2時間、好ましくは24時間を超え、例えば24時間〜8週間の間である。
a)ドナーから幹細胞を収集するステップと;
b)上述した方法に従って前記幹細胞を培養するステップと;
c)前記培養幹細胞を前記レシピエントの個体に投与するステップと
を含む。
a)化学療法又は放射線療法の前に、前記患者から幹細胞を収集するステップと;
b)上述した方法に従って前記幹細胞を培養するステップと;
c)化学療法又は放射線療法の完了後に、前記培養幹細胞を前記患者に投与するステップと
を含む。
本実施例において、HOXタンパク質の保存領域、特にHOXB−4のヘキサペプチド領域を模倣するように産生されたペプチドであるHXPペプチドを試験管内アッセイで使用して、種々の正常及び異常細胞系又は一次細胞培養物の細胞増殖、細胞周期及び細胞死に対するその効果を判定する。
1.HXPペプチド
PBXタンパク質とHOXタンパク質との相互作用を防止できる試薬を設計するために、このプロセスに影響を与えることが既知である(Morgan et al., 2000)高度に保存されたHOXヘキサペプチド配列WYPWMKKHH(配列番号:6)を、細胞膜でのタンパク質の効率的な移動に影響を与えることが以前から知られている(Derossi et al., 1998)ショウジョウバエAntennapediaタンパク質に基づく、第二のペプチド('ペネトラチン')に結合させた。このペプチドは、HXPペプチド又はHXP4と呼ばれる。
(N末端) WYPWMKKHHRQIKIWFQNRRMKWK (C末端)
を有し、ルーチンの化学合成によって調製された。
2.1.臍帯血収集及び単核細胞単離
臍帯血(UCB)試料は病院倫理規則に従って、選択帝王切開が予定された満期産から収集した。
AC133+細胞は、AC133 mini−MACS選択キット(Miltenyi Biotec、ドイツ)を用いた免疫磁気分離後にMNCより得た:Fcレセプター遮断試薬(100μl、インキュベーション5分、4℃)を含有するACD−A緩衝液中で体積500μl/108細胞に標識してから、モノクローナルマウス抗ヒトAC133/1抗体(100μl IgGIアイソタイプ、インキュベーション25分、4℃)に結合したコロイド状超常磁性MACSマイクロビーズを添加した。次に細胞を洗浄してから(5ml ACD−A緩衝液、400g、10分、4℃)、500μlのACD−A緩衝液中の再懸濁細胞を磁石上の冷却MACSポジティブ選択カラム(MS+/RS+)に加えた。カラムを冷ACD−A緩衝液(4×500μl)ですすぎ、AC133細胞個体群を4℃にて保持した。磁石除去後、AC133+細胞を1mlの冷ACD−A緩衝液で溶出させた。細胞数計測及び生存性アッセイの前に、AC133+細胞画分を新たなカラムに再度加えた。
AC133+細胞は、液体培養系に2〜4×104細胞/mlで2通り播種した。液体培養系(全体で1.5ml)は、胎仔ウシ血清(10%、Sigma Aldrich)及びゲンタマイシン(50μg/ml Life Technologies)を添加したIscoveダルベッコ変法培地(Life Technologies、英国)より構成されていた。培養系は、成長因子「TPOFLK」(トロンボポイエチン 10ng/ml、Flt−3リガンド 50ng/ml)及びHXPペプチド(20μg/ml)を添加した。AC133+細胞もTPOFLK及び対照ペプチド(WAPWEDDHHRQIKIWFQNRRMKWKK(配列番号:25)、HXPと同じ濃度)を用いて培養した。7日ごとに培地を交換し、必要に応じ:(i)HXPペプチドを添加した(濃度は維持)又は(ii)回収した、(iii)HoxB4タンパク質(20μg/ml、組換え全長アフリカツメガエル配列)を添加した。細胞は37℃、5%CO2、湿潤雰囲気下で最大18日間培養した。培養細胞は次に、上述のトリパンブルー排除法を用いて各種の時点でカウントした。
KG1a、KG1、HL60及びU937細胞系をATCCから入手した(カタログ番号はそれぞれCCL−246.1、CCL−246、CCL−240及びCRL−1593.2)。
調査する細胞を収集し、PBS中で400gにて10分間洗浄した。次にペレット化細胞を氷冷70%エタノール中で固定した。固定細胞を続いてPBS中で2回洗浄し(600g;10分間)、100μlのリボヌクレアーゼ(100μg/ml;Sigma Aldrich)中で5分間インキュベート(室温)してから、400μlのヨウ化プロピジウム(50μg/ml;Sigma Aldrich)を添加し、30分間インキュベーションした(37℃)。次に細胞を細胞周期ステータスについてFACScanフローサイトメーター(Becton Dickinson、米国)にて、WinMDI及びCylchredソフトウェアを用いて解析した。
全RNAをRneasyミニキット(Quiagen)をメーカーの説明に従って使用して、培養したヒト細胞から抽出した。3μgのRNAを次の逆転写反応で使用した。RNAはポリT15オリゴと5マイクログラム/mlまで混合し、75℃まで5分間加熱した。氷上で冷却した後、次の追加試薬;dNTPを0.4mMまで、RNase OUT(Promega)を1.6U/μlまで、モロニーマウス白血病ウィルス逆転者酵素(M-MLRvT)RnaseH−ポイントミュータント(Promega)を8U/μlまで、そして適当な緩衝液(メーカーが供給)を×l濃度まで添加した。混合物を37℃にて1時間インキュベートし、70℃まで2分間加熱して、氷で冷却した。
AC133(U):5’CAGTCTGACCAGCGTGAAAA3
AC133(D):5’GGCCATCCAAATCTGTCCTA3
ベータ−アクチン(U):5’ATGTACCCTGGCATTGCCGAC3’
ベータ−アクチン(D):5’’GACTCGTCATACTCCTGCTTG3’
CD34(U):5’TGAAGCCTAGCCTGTCACCT3’
CD34(D):5’CGCACAGCTGGAGGTCTTAT3’
CD38(U):5’GGGTGATACATGGTGGAAGAG3’
CD38(D):5’TGTGCAAGATGAATCCTCAGG3’
HOXA9(U):5’AATAACCCAGCAGCCAACTG3
HOXA9(D):5’ATTTTCATCCTGCGGTTCTG3
HOXB4(U):5’AGCGATTACCTACCCAGCGAC3’
HOXB4(D):5’AGGGTCCCGGCAGGCCGC3’
HOXB8(U):5’TGGAGCTGGAGAAGGAGTTC3’
HOXB8(D):5’CGCTCCAGCTTCTGTTTCTC3’
結果
方法
HXP及び対照ペプチドは、実施例1で述べたとおりであった。KG1a細胞は実施例1で述べたように増殖させた。KG1a細胞は、処理なしで、又は1μMのHXPペプチドの存在下で、又は対照ペプチドの存在下で24時間培養した。細胞は収集し、溶解させた。等分した細胞の一方を架橋させた。凍結細胞は、標準技法を用いて溶解させ、100JLIの溶解物を室温にて、4mMの1−エチル−3−[3−(ジメチル−アミノ)プロピル]カルボジイミド(EDC)、4mMのスルホ−NHS、20mM HEPES(pH7.5)、5mMのMgCl2、及び0.03%(w/v)f3−DM中で30分間インキュベートして、非共有結合タンパク質を架橋させた。反応は、最終濃度50mMまでの酢酸アンモニウムの添加によって停止させた。等分したもう一方は、架橋せずに凍結させた。
図6から、未処理細胞及び対照のペプチド処理細胞からのPBXタンパク質は、他のタンパク質(すなわちHOXタンパク質)と結合されたが、HXPペプチド処理細胞からのPBXアイソフォームはいずれも他のタンパク質と結合されなかったことが示されるであろう。これは、本発明のペプチドがすべてのPBXタンパク質に対して包括的な効果を有し、それゆえすべてのPBX及びHOXタンパク質間の相互作用を防止することが示される。
1.細胞培養
CD133+細胞(AC133+細胞の別名)は、すべて英国のR and D systems Ltd.より入手したIMDM(Life Technologies)、10%FCS(Sigma Aldrich)及びゲンタマイシン(50μg/ml Life Technologies)及び10ng/mlのトロンボポイエチン(TPO)、50ng/mlのFlt3−Ligand(FL)及び20ng/mlのc−KitL(K)中に4×104細胞/mlにて2通り播種した(Forraz et al., 2002)HXPペプチド(N末端:WYPWMKKHHRQIKIWFQNRRMKWKK:C末端;Eurogentec、ベルギー)及び対照CXPペプチド(N末端:WCCLADRHGRQIKIWFQNRRMKWKK:C末端;Eurogentec、ベルギー)は20μg/mlの濃度で培地に添加した。培養物からペプチドを回収するために、細胞をIMDM又はRPMI中で2回洗浄し、洗浄前細胞密度で再播種した。一次細胞は37℃、5%CO2、湿潤雰囲気下にて3週間にわたって培養し、トリパンブルー排除法によって血球計算板を用いて細胞数を計測した。
HXP処理又はCXP処理されたCD133+細胞(20μg/ml)からタンパク質を抽出した。3つのヒトPBX遺伝子タンパク質をすべて認識するC−20抗体(sc-888、Santa Cruz Biotechnology Inc., 米国;Monica et al.,1991)。タンパク質架橋は、2mMの1−エチル−3−[3−(ジメチルアミノ)プロピル]カルボジイミド(EDC)(Pierce Biotechnology、米国)を用いて、コンジュゲーション緩衝液(0.1M 2−[N−モルホリノ]エタンスルホン酸、pH5)中で1:10に希釈された細胞溶解物中で実施した。室温で15分後、2−メルカプトエタノールを20mMまで添加することによって反応を停止させ、D−Salt Dextran脱塩カラム(Pierce、米国)を使用して過剰な試薬を除去した。
全RNAは、液体窒素急速凍結細胞から、RNeasyミニキットプロトコル(Qiagen、Crawley、英国)を使用して単離した。反応当たりRNA 1μgを用いた逆転写反応物50μlは、75℃ cDNAにてオリゴdT 1μgと共に10分間加熱した。サンプルを氷上で冷却し、その結合緩衝液中のM−MLV逆転写酵素(Promega、サウサンプトン、英国)200ユニット、400μMのdNTP(Promega)、及びRNAseout(Invitrogen、ペーズリー、英国)40ユニットと混合した。次にサンプルを37℃にて1時間インキュベートし、最後に75℃にて5分間加熱した。PCR反応(35サイクル、94℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 1分)を20μlの反応物中で、JumpStart ReadyMix REDTaq DNAポリメラーゼ(Sigma-Aldrich)を使用して、反応物当たり同量のcDNAをフォワードプライマー及びリバースプライマー 1μMと共に用いて実施した。
HXPペプチドがHOX/PBX相互作用を防止する能力は、試験管内でCD133+HSPC個体群にそれを添加することによって試験した。これらの細胞は臍帯血に由来し、初期HSPCの既知のマーカーである、表面抗原CD133のその発現のために選択される(Forraz et al., 2002)。CD133+細胞タンパク質は、PBXの3つ異なるアイソフォーム(Monica et al., 1991)について、ウェスタンブロットによって、架橋を用いて又は用いずに分析した(図6)。対照ペプチドCXPではなく、HXPペプチドは、これらの条件下で、PBXの他のタンパク質への結合を防止した。
CD133+細胞は液体培養物を添加したサイトカイン中でHXPペプチド又はCXPペプチドを用いて 、初期HSPCにおける細胞増殖に対するHXPペプチドの効果を判断するために、18日間にわたって増殖させた(図7a)。HXPペプチドを用いたCD133+細胞の処理は、CXPペプチド処理細胞と比較した場合に、18日目に平均3.7倍で増殖を阻害した(p<0.001)。7日目の細胞培養物からのHXPペプチドの回収は、18日目のHXPペプチド処理細胞個体群と比較した場合に、細胞増殖の再開を可能にし(p<0.01)、HXPペプチド阻害が可逆性であることを示している。これらの個体群の細胞形態及び完全性は、HXPペプチド又はCXPペプチド添加に反応して明らかな変化を示さなかった(データは示さず)。
HSPC分化及び細胞周期制御と関連付けられたいくつかの遺伝子の発現は、図7aに示した増殖特性を有する細胞から抽出したRNAのRT−PCRによって調査した。18日後、トロンボポイエチン中でのFlt−3リガンド及びc−kitリガンド(TPOFLK)添加培養物中で、対照ペプチド処理CD133+細胞は、CD133、TERT(テロメア逆転写酵素)、HOXB8、HOXA9、及びHOXB4(トロンボポイエチン自体によってアップレギュレートされた)を含む非分化HSPC表現型に関連する一連の遺伝子の発現を維持した(Kirito et al. , 2003)。HSPC分化と関連したCD38遺伝子は発現されなかった。CD133+細胞のHXPペプチド処理は、細胞周期(CDC25(Donzelli and Draetta, 2003)及びCDK2(Siebert et al., 1996))、増殖(N−Ras(Hall et al., 1993;Scheele et al., 2003)、Ras様GTP結合タンパク質(Bos, 1997))、移動(マトリクスメタロプロテイナーゼ−MMP19−及び−MMP1−(Stamenkovic, 2003;Murphy et al., 1999))、成長因子仲介シグナル伝達(マイトジェン活性化プロテインキナーゼ−MAPK−(Reddy et al., 2003)及びRAB27A(Chen et al., 1997;Seabra et al., 2002))、アポトーシス(Bcl−2同族体−Bak2−及び腫瘍サプレッサ−p53−(Vermeulen et al., 2003))、転写(CCCTC結合因子−CTCF−(Ohlsson et al., 2001)、真核翻訳開始因子4E−EIF4E−(Thornton et al., 2003)、及び一次HSPCマーカー(CD133(Forraz et al., 2002)、CD34(REF)、TERT(Allsopp et al., 2003)、HOX B4、B8及びA9)に関与する一連のHOX-PBX標的遺伝子(図7b)を著しくダウンレギュレートした。CD38遺伝子はアップレギュレートされた。7日目のHXPペプチドの回収は、MAPKを除くこれら遺伝子すべてのアップレギュレーション、及びCD38のダウンレギュレーションを引き起こした。
CD133+細胞の細胞周期ステータスは、HXPを用いて及び用いずにTPOFLK添加培養物中で解析した(図8)。濃縮幹細胞個体群と一致して、細胞の93%が0日目にG0−G1にあった。18日を過ぎると、CXP4処理細胞と比較して、HXPペプチド処理CD133+細胞のより多い個体群が細胞周期のGO−G1期にあった。この相違は、培養の18日目の対照群と比べて、9.9%多い細胞が細胞周期のGO−G1期にあるHXPペプチド処理細胞で徐々に上昇した(p<0.05)(図8)。液体培養物からHXPペプチドを回収したときに、HXPペプチド処理群と比較すると、より低い割合の細胞が細胞周期のGO−G1期のままであった。
血液悪性腫瘍におけるHOX遺伝子調節不全の役割は、白血病細胞系KG1a(MO French-American-British(FAB)分類)、HL60(M2/M3 FAB分類(Collins et al., 1977))及びU937二表現型細胞(骨髄性組織球増殖症(Sundstrom and Nilsson, 1976))の増殖を調査することによって研究した。U937は骨髄性及びリンパ性系統の両方の小児白血病において、そして二次性白血病を誘発する治療において最も頻繁な遺伝子変化の1つである、11q23転座に位置するHRX遺伝子の染色体再配置を含有する(Butler et al., 1997)。KG1aはKG1細胞に由来し、これらは一次骨髄性前駆体と同様に、CD34 high CD38陰性表現型を示すため、非常に未分化であると見なされる(Koeffler et al., 1980)。KG1a及びHL60は刺激に応じて、顆粒球又は単球細胞に分化することができる(Koeffler and Golde, 1978, Sundstrom and Nilsson, 1976)。HXPペプチドは、3つのすべての細胞系に、2時間以内に明らかとなった強力な細胞増殖阻害を及ぼした(図9a)。これらの個体群の細胞形態及び健全性は、HXPペプチド又はCXP4添加に反応して明らかな変化を示さなかった(データは示さず)。
HOX/PBX標的遺伝子に対するHXPペプチドの効果を白血病細胞系において調査した(図9b)。比較的未分化の骨髄細胞であるKG1a細胞系では、HXPペプチド処理は、CD133、CD34、HOXB4、B8及びA9遺伝子発現のダウンレギュレーション、並びにCD38のアップレギュレーションを誘起した。U937及びHL60細胞系は、CD133又はCD34を発現しなかった。しかしながらHOXB4及びA9遺伝子発現のダウンレギュレーションは、HXPペプチド処理時に見られたが、CD38はアップレギュレートされ、HOXB8遺伝子発現は不変であった。
KG1a、HL60及びU937細胞周期特性をHXPペプチド又は対照ペプチドを用いて、培養物中で48時間に渡って解析した(図10)。非同期細胞に対するHXPペプチドの効果は大きく変化した(データは示さず)。細胞を予備調整してG0−G1に同期させることは、HXPペプチドが、G0−G1期を離れて、細胞周期に入る細胞の著しい高い割合を誘起することを示す。
大半のHOX遺伝子の機能は、保存ヘキサペプチド配列を介したPBX補助因子とのその相互作用に依存している(Chang et al., 1996;Piper et al., 1999;Passner et al. , 1999)。本研究では、HOX/PBX相互作用は、Antennapediaタンパク質に由来する送達モチーフに融合したHOXヘキサペプチドのミミックである、HXPペプチドによって遮断された(Derossi et al., 1998)。
使用した方法は、別途規定しない限り、先の実施例と同じであった。
固形腫瘍細胞系(Cancer Research UK)は、10%FCS(Sigma Aldrich)及びpenstrep(1% Sigma)を添加した適当な培地(表を参照、Sigma-Aldrich、英国)より成る液体培養系に4×104細胞/mlで播種した。すべての細胞系は、HXPペプチド(実施例3と同様、20μg/ml又は200μg/ml)又は対照ペプチドCXP(20μg/ml又は200μg/ml)を用いて増殖させた。
使用したRT−PCRプライマーの配列を以下に示す。各プライマー対について、増幅領域は、GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez)を通じて入手できる既知の遺伝子配列に関連付けて与える。
本発明者らは、前に述べたのと同様のアッセイを使用して、いくつかの異なる悪性細胞系の対するHXPペプチドの活性を試験した。以下の癌:結腸直腸癌、膵臓癌、小細胞肺癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮頚癌、卵巣癌及び胃癌(図11)に由来する細胞の増殖を遮断するには、20μg/mlの用量で十分であったが、腎臓癌、乳癌及び非小細胞肺癌に由来する細胞によっては著しい影響は見られなかった。増殖の低減には、遺伝子発現の特異的変化が伴い(図11)、少なくとも2つの異なるHox遺伝子は各ケースで転写的にサイレントであった。Hox遺伝子の別個のセットが各癌細胞系においてダウンレギュレートされ、HOX機能の包括的なインヒビターとしてのHXPペプチド及び癌細胞増殖の対する必然的に幅広いその効果を反映していることは、注目に値する。
20μg/mlでのHXPペプチドの使用は、細胞増殖で著しい低減を引き起こし、一部のケースでは増加倍数は1未満であり、すなわち培養物中で7日後に生存している細胞数は、開始個体群未満であることが明らかである。したがって、HXPペプチドの用量増加は開始培養物中のすべての細胞を除去できるということが考えられる。
本発明者らは、より小型のペプチドがHXPペプチドを置換できるかどうかについて調査した。1つの可能性は、ヘキサペプチド配列のみに基づくが、以前に特徴付けられた細胞浸透剤によって要求されるものと一致する電荷及び疎水性比を備えたペプチドである。これは、HXP4(10)と呼ばれる10個のアミノ酸のペプチドの設計につながった。これは、元の分子によって使用された細胞浸透性ドメインを欠いた、はるかに小型の分子である。HXP4(10)は、アミノ酸配列WYPWMKKHHR(配列番号:7)を有する。HXPペプチドと同様に、HXP4(10)は、一部の悪性細胞系の増殖を高度に特異的な方法で遮断することもできる(図13)。それはなお、一部の悪性細胞系に対して著しい活性を示す。より小さいサイズのHXP4(10)は、生産コストを著しく(約80%)低減する。
HXPペプチド及びHXP4(10)の安定性は、今回、ヒト血清で試験されている(図14)。これは、それぞれが生体内で使用された場合にどれだけ強力であるかの指標を与える。HXPペプチドは1時間の半減期を有し、HXP4(10)は約4時間の半減期を有する。これは、ペプチドに基づく他の薬剤の好適な場合に匹敵している;例えば血液凝固を防止するために通常使用される低分子量ヘパリンは、わずか30分の血清半減期を有する。
Claims (16)
- アミノ酸配列
X1X2X3WMX4X5X6X7
(式中、X1はWであり;
X2はYであり;
X3はPであり;
X4はK又はRであり;
X5はK又はRであり;
X6はH又はKであり;
X7はH又はKである。)
を含むアミノ酸残基数が25以下のペプチドの、癌を治療又は防止するための医薬品の製造における使用。 - 前記ペプチドX1〜X7がアミノ酸配列WYPWMKKHHRを有する、請求項1に記載の使用。
- 前記ペプチドが細胞浸透部分をさらに含む、請求項1又は2に記載の使用。
- 前記細胞浸透部分がペプチドX1〜X7のカルボキシ末端に直接結合されている、請求項3に記載の使用。
- 前記細胞浸透部分がアミノ酸配列:
X8QIKIWFQNRRMKWKK
(式中、X8はR又はQである。)
を有する、請求項3又は4に記載の使用。 - 前記細胞浸透部分がアミノ酸配列:
X8QX9X10X11WFQNX12X13MX14WX15X16
(式中、X8はR又はQであり、
X9、X11はそれぞれ独立してI又はLであり;
X10、X12、X13、X14、X15及びX16はそれぞれ独立してK又はRである。)
を有する、請求項3又は4に記載の使用。 - 前記細胞浸透部分がアミノ酸配列:
QIRIWFQNRRMKWKK;
QIKIWFQNKRMKWKK;
QIKIWFQNKKMKWKK;
QIRIWFQNRKMKWKK;
QIRIWFQNRRMRWKK;
QIRIWFQNRRMKWRK;
QIRIWFQNRRMKWKR;
QIRIWFQNRRMKWRR;
QIRIWFQNRRMKWKK;
QIKIWFQNRRMKWRK;
QIRIWFQNKRMKWRK;
QIKLWFQNRRMKWKK、
QLKLWFQNRRMKWKK;又は
QLRIWFQNRRMKWKK
を有する、請求項3又は4に記載の使用。 - 前記ペプチドが配列
WYPWMKKHHRQIKIWFQNRRMKWK、又は
WYPWMKKHHRQIKIWFQNRRMKWKK
を有する、請求項3に記載の使用。 - 前記ペプチドが配列
WYPWMKKHHR
を有する、請求項1に記載の使用。 - 前記癌細胞が1又はそれ以上のHox遺伝子を発現する、請求項1〜9のうちいずれか1項に記載の使用。
- PBXが前記癌細胞において癌遺伝子として作用しない、請求項1〜10のうちいずれか1項に記載の使用。
- 生体内で幹細胞個体群を維持又は増殖させるための医薬品の製造における請求項1〜9のうちいずれか1項に記載のペプチドの使用。
- 生体外で幹細胞を維持又は増殖させる方法であって、試験管内で前記幹細胞に請求項1〜9のうちいずれか1項に記載のペプチドを接触させることを含む、前記方法。
- 試験管内で前記細胞を前記ペプチドの非存在下で培養するステップをさらに含む、請求項13に記載の方法。
- 請求項1〜9のうちいずれか1項に記載のペプチド及び薬学的に許容し得る担体を含む、薬学的組成物。
- 細胞毒性薬又は化学療法剤をさらに含む、請求項15に記載の薬学的組成物。
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