JP4843127B2 - アポトーシス誘導剤 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
この発明は、アポトーシスを誘導し、癌細胞の増殖を阻害する作用を有するアポトーシス誘導剤に関する。
【0002】
【従来の技術】
癌は、我が国における死亡原因の第一位を占めている。この癌に対する治療として、外科療法、化学療法、免疫療法等があるが、その治療の効果は、癌の種類、進行度等により異なり、癌に対する効果的な治療法が今なお求められている。
【0003】
このうち、化学療法による治療法として、多種の化学療法剤が開発されている。例えば、エトポシド、シスプラチンは癌細胞中の核酸に傷害を与えることを特徴とするものである。また、タキソール、ビンクリスチンは細胞骨格のチュブリンの生理機能を阻害して癌細胞に傷害を与えることを特徴とするものである。
【0004】
しかし、上記従来の化学療法剤は、癌細胞にとどまらず正常細胞にも傷害を与え副作用を引き起こすという欠点を有していた。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、1970年代に細胞死の新しい概念としてアポトーシスが報告された。アポトーシスが誘導された細胞は、その内容物が流出することなくアポトーシス小体が形成され、このアポトーシス小体はマクロファージ等により貪食されて消滅する。したがって、炎症反応が起きないので副作用を伴わない。
【0006】
したがって、癌細胞にのみアポトーシスを誘導させることができれば、正常細胞に傷害を与えることなく癌細胞のみを消滅させることができるので、このような性質を有する活性物質は、従来の化学療法剤のような副作用を有さない新たな作用機構を有する化学療法剤となることが期待できる。
【0007】
この発明は、癌細胞に特異的にアポトーシス誘導能を有する活性物質を見いだすことを目的として、抗癌作用があると民間に言い伝えられている中国の種々の生薬からスクリーニングを行い、豆科のSophora subprostrata Chun et T. Chenの根を乾燥した生薬である山豆根から抽出されるフラボノイド化合物であるソフォラノン(Sophoranone)がアポトーシス誘導能を有することを見いだし、これをアポトーシス誘導剤として提供するものである。
【0008】
なお、山豆根は、従来から解熱、鎮痛薬として用いられている生薬であり、約40年前に抗腫瘍効果があることが報告されている。しかし、その活性物質の同定、作用機構の解明は未だされていない。
【0009】
また、フラボノイド(Flavonoids)は、野菜や果物中に多量に含まれており、抗癌作用があることが知られている。また、抗癌作用の一部は、癌細胞にアポトーシスを誘導するためであることが明らかにされている。現在までにアポトーシス誘導作用があることが知られているフラボノイドには、図6に示すように、baicalein,tangeretin,quercetin,genistein,daidzein,flavopiridol 等が知られている。ソフォラノンは、このようなフラボノイド化合物とは異なり、側鎖にイソプレニル基を有しているのが特徴である。
【0010】
【課題を解決するための手段】
上記スクリーニングの結果、式
【0011】
【化2】
【0012】
で表される側鎖にイソプレニル基を有するソフォラノンをアポトーシス誘導剤として豆科のSophora subprostrata Chun et T. Chenの根を乾燥した生薬である山豆根から抽出し、この側鎖にイソプレニル基を有するソフォラノンがヒト白血病細胞やヒト固形癌細胞に対し、アポトーシスを誘導し、その増殖を阻害する作用を有することを明らかにした。
【0013】
【発明の実施の形態】
(ソフォラノンの抽出・単離)
山豆根1kgを粉砕し、メタノールで3回抽出した後、メタノールを留去する。留去後の残さにエーテルを加えた後、1MのNaOH水溶液を加えて振とうし、水層を分取する。水層に塩酸を加えて酸性にし、これにエーテルを加えて振とうした後、エーテル層を濃縮する。残さを酢酸エチルに溶解し、アルミナカラムにのせ、酢酸エチルに溶出する画分を濃縮する。次に、残さをシリカゲルカラムにかけ、ヘキサン:エーテル(2:1)によって精製する。溶媒を留去後、再びシリカゲルクロマトグラフィにより、精製する。その結果、収量970mgのソフォラノン(Sophoranone)が得られた。
【0014】
得られたソフォノランをJEOL JNM−GX 500 MHz NMRスペクトロメータにより1H−及び13C−NMRスペクトルを測定しその構造を同定した。ここで、内部標準としてはテトラメチルシラン(TMS)を用いて測定し、得られた化学シフト(δppm)を表1に示した。
【0015】
【表1】
【0016】
(細胞増殖測定法)(XTT法)
後述の各種細胞にSophoranone溶液を加え、4日間培養後、XTT(2,3-bis〔2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl〕-2H-tetorazoliumu-5-carboxanilide)を加え、4時間後に540nmの吸光度で測定した。
(アポトーシスの分析法)
1.ヘキスト染色法 細胞をヘキスト(Hoechst 33342)で染色し、蛍光顕微鏡で測定した。
2.DNA fragmentation の測定 細胞を0.5% SDS(sodium dodecyl sulfate) で可溶化後、DNAを1%アガロースゲル中で40mM Tris 緩衝液を用い、50Vで1時間電気泳動後、エチジウムブロミドで染色した。DNA fragmentation の定量化は、アポトーシスを起こした細胞をTriton X-100 で可溶化して遠心し、上清中の断片化されたDNA及び沈殿画分に回収される高分子のDNAをDAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)で染色し、その蛍光を蛍光光度計で測定する。全DNA量に対する上清中のDNA量の割合から断片化されたDNA量を算出した。
3.カスペース3活性測定方法 カスペース3により特異的に切断されると蛍光強弩が増加する(7-methoxycoumarin-4-yl-acetyl-DEVDAPK(2,4-dinitrophenyl)-NH2 を用いて測定した。
(MAPキナーゼ活性の測定)
MAPキナーゼの活性は、リン酸化ERK、リン酸化JNK、リン酸化p38に対する特異抗体を用いたウエスタンブロット法により測定し、各タンパクバンドの濃さから定量した。
【0017】
【実施例】
(実施例1)
ヒト白血病細胞であるU937細胞に対するソフォラノンのアポトーシス誘導作用を測定した。すなわち、ヒト白血病U937細胞を種々の濃度のソフォラノンで処理した後、上記ヘキスト染色法により細胞を染色することによりアポトーシスが誘導された細胞の割合を測定した。その結果を図1に示す。
【0018】
この結果、図1に示すように、ソフォラノンを添加して6時間後に50%のU937細胞にアポトーシスを誘導する濃度(IC50)は、18μMであった。
【0019】
同じ条件では、他のフラボノイド化合物であるケルセチン、ゲニスタイン、ダイゼインでは、アポトーシス誘導効果はほとんど見られなかった。そこで、フラボノイド化合物による処理時間を長くして2日後に測定すると、ソフォラノンでは18μM、ケルセチン及びゲニスタインでは180μM以上で、ダイゼインではアポトーシスはほとんど誘導されなかった。これは、ソフォラノンが他のフラボノイド化合物であるケルセチン(quercetin)、ゲニスタイン(genistein)よりも10倍以上強いIC50値をもつことを示している。また、発生起源の異なるヒト白血病HL−60細胞にも同様のアポトーシス誘導能を有することが確認できた。
(実施例2)
抗癌剤が一般的に作用しにくいとされるヒト固形癌細胞に対する増殖阻害作用を測定した。すなわち、ヒト卵巣癌細胞TYK-nu細胞を種々の濃度のソフォラノンで4日間処理し、細胞増殖を上記XTT法で測定し、未処理の細胞数に対する割合を測定した。その結果を図2に示す。
【0020】
その結果、卵巣癌細胞TYK-nu細胞に対して濃度依存的に増殖阻害作用を示した。細胞増殖を50%阻害する濃度(IC50)は16μMであった。
【0021】
同様に、胃癌細胞AZ-521、大腸癌細胞COLO、膵臓癌細胞MIAPaCa-2、肝癌細胞PLC/PRF/5、子宮癌細胞HeLa、神経芽腫細胞Neuro-2Aに対しても30μM以下の濃度で完全に増殖を阻害した(表2)。
【0022】
【表2】
【0023】
これらの結果は、ソフォラノンが種々のヒト固形癌細胞に対して非常に強い増殖阻害作用を有することを示している。
【0024】
強い増殖阻害作用はアポトーシスが誘導された結果であることは、ソフォラノン処理後DNA-fragmentation を定量した結果(図3)から明らかである。すなわち、白血病HL60及びU937細胞だけでなく、胃癌AZ-521細胞及び大腸癌COLO320DM細胞もソフォラノンによる6時間の処理でも強いDNAの断片化が誘導された。
【0025】
(実施例3)
白血病細胞U937細胞を用いてソフォラノンによるアポトーシス誘導機構の特徴を調べた。すなわち、U937細胞を25μMのソフォラノンで処理し、上記MAPキナーゼ活性の測定法により、MAPキナーゼの活性変化を測定した。その結果を図4(A)〜(C)に示す。(A)はERK活性、(B)はJNK活性、(C)はp38活性を示している。
【0026】
その結果、ERKの中のERK1及びERK2活性とも、ソフォラノン処理後直ちに阻害され、1時間後には活性がほとんど消失したが、3時間後から再び活性化された。これに対して、JNKの中のJNK1及びJNK2は、ソフォラノン処理後から経時的に増加した。p38活性は、1時間後に一過性に上昇し、3時間後以降は活性が消失した。このようなERK、JNK、p38の活性変化は、これまでアポトーシス誘導剤による処理では報告されておらず、ソフォラノンがユニークな機構でアポトーシスを誘導していることを示唆している。
【0027】
他方、U937細胞をソフォラノンで処理した場合に、システインプロテアーゼであるカスパーゼ3が活性化され(図5)、カスパーゼ3の細胞内基質であるpoly(ADP-ribose) polymerase の切断が見られた。これは、多くのアポトーシス誘導剤で、カスパーゼ3が活性化されるのと同様の効果である。
【0028】
また、ソフォラノンで処理したHL60細胞やU937細胞を可溶化して、DNAをアガロースゲル電気泳動で分析した結果、典型的なアポトーシス誘導の特徴であるDNAラダーが観察された。したがって、ソフォラノンにより誘導されるアポトーシスの最終的な過程は、多くの薬物やストレスによるアポトーシスと共通の機構であることが分かった。
【0029】
【発明の効果】
以上説明したように、豆科のSophora subprostrata Chun et T. Chenの根を乾燥した生薬である山豆根から、ソフォラノンを単離・同定し、このソフォラノンがヒト白血病U937細胞及びHL-60細胞にアポトーシスを誘導する作用を有し、増殖を阻害すること、及びアポトーシス誘導作用は他のフラボノイド化合物であるケルセチン、ゲニスタイン、ダイゼインよりも10倍以上強いことをを明らかにした。また、化学合成フラボノイド化合物であるフラボピリドールはサイクリン依存性キナーゼ(CDK1,CDK2,CDK4,CDK7)を阻害し、細胞周期をG1期とG2期とで阻止することが報告されているが、ソフォラノンは細胞周期に影響を与えないので、フラボピリドールとはアポトーシス誘導機構が異なると考えられる。
【0030】
また、ヒトの発生組織の異なる7種類の固形癌細胞に対して増殖阻害作用を示すことを明らかとし、その中の胃癌AZ-521細胞及び大腸癌COLO320DM細胞を使って実際にアポトーシスが誘導されることを証明した。このように、ソフォラノンが、抗癌剤が一般的に作用しにくいとされるヒト固形癌細胞に対してもアポトーシスを誘導し、増殖阻害作用を有することを明らかにした。
【0031】
さらに、ソフォラノンによる処理を行ったときのMAPキナーゼの活性変化を測定し、これまでのアポトーシス誘導剤による処理では報告されていないERK、JNK、p38の活性変化を見いだし、ソフォラノンがユニークな機構でアポトーシスを誘導していることを明らかにした。
【図面の簡単な説明】
【図1】ヒト白血病U937細胞に対するアポトーシス誘導作用を示すグラフである。
【図2】ヒト卵巣癌TYK-nu細胞に対する増殖阻害作用を示すグラフである。
【図3】ソフォラノンによるDNA-fragmentation の誘導を示すグラフである。
【図4】ソフォラノン処理のMAPキナーゼファミリーの活性に与える影響を示すグラフであり、(A)はERK活性、(B)はJNK活性、(C)はp38活性を示している。
【図5】ソフォラノンによりカスパーゼ3が活性化されることを示すグラフである。
【図6】従来から知られているフラボノイド骨格を有する化合物の例を示している。
Claims (2)
- 式
ト白血病細胞に対する医薬用アポトーシス誘導剤。 - 請求項1に記載の側鎖にイソプレニル基を有するソフォラノンを有効成分とするヒト卵巣癌細胞、胃癌細胞、大腸癌細胞、膵臓癌細胞、肝癌細胞、子宮癌細胞及び神経芽種細胞から選択されるヒト固形癌細胞に対する医薬用アポトーシス誘導剤。
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JPS6185324A (ja) * | 1984-10-04 | 1986-04-30 | Satoshi Sasaki | 抗癌剤の製造法 |
JPH04169580A (ja) * | 1990-11-02 | 1992-06-17 | Eisai Co Ltd | フラボン誘導体 |
-
2000
- 2000-03-07 JP JP2000061386A patent/JP4843127B2/ja not_active Expired - Lifetime
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