JP4841749B2 - Method for producing purified antigen - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、疎水性基を導入した浮遊流動床を用いて、破傷風トキシン等の精製抗原を製造する新規方法に関する。また、精製されたトキシンからトキソイドを製造する方法、該トキソイドを含有するワクチン等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、破傷風トキソイドの製造には、破傷風菌Harvard株またはこれと同等以上の毒素産生能を持つ株を液体培地で５〜１０日培養し、除菌したものが原料として用いられる。原料中の毒素は、免疫原性を損なわない程度にホルマリンで無毒化され、無毒化の前あるいは後に適当な方法で精製される。その精製方法には、主に塩化亜鉛沈殿法、硫安分画法、吸着担体ろ過法、イオン交換クロマトグラフィー法の工程を組み合わせて行う方法がある（図１）。
【０００３】
精製後のトキソイドの純度は、たん白窒素１ｍｇあたり１７００〜２７００Lfのものが現在製造されている。（国立予防衛生研究所学友会 編、ワクチンハンドブック）
【０００４】
しかしながら、このような従来方法では原料としての毒素含有液を得るために除菌工程を行なうことが余儀なくされ、また、原料の精製法の塩化亜鉛沈殿法、硫安分画法など、不連続（これらの工程を個々に行なうことが必要）で煩雑な処理が必要であるばかりでなく、使用した塩類を透析等で除去する必要が生じ工業的なワクチン製造法としては充分簡便であるとはいえなかった。
【０００５】
また、同様に菌体を培養し、その菌体によって産生されるタンパク質を精製する為に、除菌・精製する手法として浮遊性流動床が充填されたカラムクロマトグラフィーが知られているが（特表２０００−５０００６３）、トキシンの除菌・精製として用いることは具体的に記載されていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
菌体培養液からトキシンを精製する従来法における除菌工程、塩化亜鉛沈殿法、硫安分画法による濃縮などの不連続で煩雑な処理を避け、より迅速且つ簡便に目的物を除菌・精製する方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために種々研究を重ねた結果、目的物質産生菌の培養液を除菌することなく、そのまま浮遊性流動床クロマトグラフィーによって処理することにより、除菌と同時にトキシンが精製できることを見出し、本発明を完成するに至った。特に、除菌前の培養液に塩を加えたものを高速且つ上昇方向に疎水性官能基を有する高比重吸着担体の浮遊性流動床と接触させ、抗原を吸着担体に吸着させ、菌体のみを素通りさせる方法を見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は、
（１）浮遊流動床を形成した疎水性官能基を有する吸着担体に抗原を吸着させることを特徴とする精製抗原の製造法；
（２）浮遊流動床を形成した疎水性官能基を有する吸着担体に抗原含有液を接触せしめ該抗原を吸着させた後、該吸着担体より抗原を溶出する前記（１）記載の製造法；
（３）抗原がトキシンである前記（１）記載の製造法；
（４）トキシンが破傷風トキシンである前記（３）記載の製造法；
（５）塩類を添加した抗原含有液を用いる前記（２）記載の製造法；
（６）塩類が硫酸アンモニウムまたは塩化ナトリウムである前記（５）記載の製造法；
（７）抗原含有液が菌の培養液である前記（２）記載の製造法；
（８）疎水性官能基がフェニル基である前記（１）記載の製造法；
（９）吸着担体が多孔性の架橋アガロースである前記（１）記載の製造法；
（１０）吸着担体の平均粒子径が約１０〜約１０００μｍである前記（１）記載の製造法；
（１１）浮遊流動床の平均粒子密度が１ｇ／ｃｍ２より大きいものである前記（１）記載の製造法；
（１２）約０〜約３０℃および電気伝導度約１２０〜約１６０ｍＳ／ｃｍの緩衝液で洗浄した吸着担体である前記（１）記載の製造法；
（１３）溶出前に吸着担体を電気伝導度約１２０〜約１６０ｍＳ／ｃｍの緩衝液で洗浄する前記（２）記載の製造法；
（１４）電気伝導度約０〜約２０ｍＳ／ｃｍの緩衝液を用いて溶出する前記（２）記載の製造法；
（１５）浮遊流動床をカラム内に形成する前記（１）記載の製造法；
（１６）抗原含有液をカラム下部より約２００〜約４００ｃｍ／ｈの線速度でカラムに添加する前記（１４）記載の製造法；
（１７）吸着処理後、吸着担体をパックする前記（１）項記載の製造法；
（１８）吸着処理とは逆の方向に溶出液を適用する前記（１５）記載の製造法；
（１９）前記（３）記載の製造法により製造されたトキシンを無毒化することを特徴とするトキソイドの製造法；
（２０）トキソイドが破傷風トキソイドである前記（１９）記載の製造法；
（２１）ホルマリンで無毒化する前記（１９）記載の製造法；
（２２）前記（２０）記載の方法で製造された破傷風トキソイド；
（２３）前記（２２）記載の破傷風トキソイドとジフテリアトキソイドを配合した二種混合トキソイド；
（２４）前記（２２）記載の破傷風トキソイドとジフテリアトキソイドおよび百日咳ワクチンを配合した三種混合ワクチン；等
である。
【０００９】
本発明で用いられる吸着担体は、通常のカラムクロマトグラフィーで使用されるポリマーで基本マトリックスを構成するものであれば適宜使用することが可能である。該吸着担体は通常ビーズ状で使用される。すなわち幾分球形であり得、従って、不規則な形、例えば顆粒形、つぶれた形なども含み得るが、好ましくは、球形または他の丸形である。また、該吸着担体は、通常、充填剤が封入されたポリマー基本マトリックスからなり、疎水性であり得、例えば、スチレン―ジビニルベンゼンコポリマーからなるビーズを、例えば、表面を適当な親水性ポリマー（好ましくは、ヒドロキシまたはアミノ基を有するポリマー）でコーティングし親水性とする。また、吸着担体は、不溶性または可溶性親水性ポリマー、例えばアガロース、セルロース、デキストラン、デンプン等の基本マトリックスからなり、必要であれば、既知の方法（例えば、特表２０００−５０００６３）で架橋して望ましい有孔度及び安定性を持たせる。なかでも多孔性の架橋アガロースが好ましい。
また、このような吸着担体は精製しようとする物質を産生する菌体自体と親和性がなく、菌体が吸着してしまわないような素材で調製されているものが望ましい。菌体の種類に応じて適宜選択されるものである。
【００１０】
この吸着担体に疎水性官能基が導入されているものを本発明では用いる。この疎水性官能基としては、アリール基（例えば、フェニル基、ナフチル基等のＣ６−１４アリール基）、アルキル基（炭素数２〜８の分枝、直鎖、環状のアルキル基；例えば、ブチル、オクチル等）等が挙げられる。好ましくは、フェニル基、ブチル基、オクチル基等、更に好ましくは、フェニル基等である。
このような疎水性官能基を吸着担体に導入する方法は、自体公知の手法、例えば、「Hydrophobic Interaction Chromatography、Principles And Methods」（ファルマシアバイオテク）、特表２０００−５０００６３に記載の方法に従って行うことができる。例えば、グリシジルエーテル結合法により、疎水性官能基を10−50μmoles/ｍＬ吸着担体に導入するのが好ましい。
吸着担体の粒子径は、約１０〜約１０００μｍであり、好ましくは、約５０〜約７００μｍ、更に好ましくは、約１００〜約３００μｍである。粒子が長径と短径を有する場合には、その長径が前記の範囲で示されるサイズのものが用いられる。
【００１１】
また、本発明で用いる吸着担体の比重は、如何なるものでも使用できるが、通常は１ｇ／ｃｍ３より大きいものが用いられる。好ましくは、約１．１ｇ／ｃｍ３以上、更に好ましくは約１．２ｇ／ｃｍ３以上の比重のものである。このような比重の吸着担体を使用するため、媒体の流れに応じて吸着担体の沈降が平衡状態となり、安定な浮遊流動床が形成される。特にカラムを用いた場合、カラム下部から上昇する除菌前の培養液の流れと、吸着担体の沈降が平衡状態となり、吸着体がカラム内で互いに離れたまま安定した浮遊平衡状態を形成する。この安定平衡時の浮遊流動床中の吸着担体の平均粒子密度は、１ｇ／ｃｍ３より大きいもの、好ましくは、１．１ｇ／ｃｍ３以上、更に好ましくは１．２ｇ／ｃｍ３以上である。
吸着処理では、この浮遊流動床を形成した疎水性官能基を有する吸着担体に抗原含有液（菌の培養液）を接触させることにより、抗原含有液に含まれる菌体を素通りさせて、目的の抗原を吸着担体に吸着させる。従来法における除菌、塩化亜鉛沈殿法、硫安分画法による濃縮などの不連続で煩雑な処理を1回の操作のみで効率よく行うことを可能にせしめるものである。
【００１２】
この吸着担体は抗原含有液と接触させる前処理として、洗浄しておくことが望ましい。洗浄液としては、精製目的とする物質が当該吸着担体の疎水性官能基に十分吸着し、他の夾雑物質がなるべく吸着しない程度に疎水性を付与するものであれば特に限定されるものではない。一般的には、電気伝導度約４５〜約１８０ｍＳ／ｃｍの緩衝液が用いられる。好ましくは約１２０〜約１６０ｍＳ／ｃｍの緩衝液である。緩衝液の種類としては、リン酸緩衝液、トリス-塩酸緩衝液、グリシン-塩酸緩衝液、グリシン‐水酸化ナトリウム緩衝液等である。好ましくは、リン酸緩衝液である。緩衝液のｐＨは通常、約３〜約１１、好ましくは約５〜約８．５、更に好ましくは約７〜約８である。また、緩衝液には更に塩濃度を調節するために適当なイオンを含有する塩を添加することができ、陰イオンとしては、例えばリン酸、硫酸、酢酸、塩素、臭素、硝酸、過塩素酸、ヨウ素、チオシアン酸などが含まれ、陽イオンとしてはアンモニウム、カリウム、ナトリウム、リチウム、マグネシウム、カルシウム、バリウム等が含まれる。これらを含む塩としては、例えば硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化リチウム、チオシアン酸カリウム等があげられる。
洗浄方法としては、前記した緩衝液に吸着担体を浸し、一定時間放置（５分以上）あるいは攪拌し、洗浄液を捨てるという操作を数回（最低３回、好ましくは５回程度）繰り返すことによって行なわれる。通常、吸着担体１００ｍＬに対して、洗浄液は約２００ｍＬ、好ましくは約５００ｍＬ、さらに好ましくは約１０００ｍＬ以上の割合で用いられる。あるいは、カラムに吸着担体を充填し、洗浄液を通液することによっても行うことができる。この場合に通液する洗浄液の量は前記と同程度のものである。この際の緩衝液の温度は通常約０〜約３０℃、好ましくは約２０〜約３０℃、さらに好ましくは約２５℃のものが用いられ、洗浄中もこの温度が保たれていることが望ましい。
【００１３】
吸着した目的物質を吸着担体から溶出するための溶出液としては、目的物質が疎水性官能基から十分に遊離し、他の夾雑物質がなるべく遊離しない程度の疎水性を有するものが用いられる。一般的には、電気伝導度約０〜約４５mS/cmの緩衝液が用いられる。好ましくは約０〜約３０mS/cm、さらに好ましくは約０〜約２０mS/cmの緩衝液である。緩衝液の種類としては、緩衝液の種類としては、リン酸緩衝液、トリス-塩酸緩衝液、グリシン-塩酸緩衝液、グリシン‐水酸化ナトリウム緩衝液等である。好ましくは、リン酸緩衝液である。緩衝液のｐＨは通常、約３〜約１１、好ましくは約５〜約８．５、更に好ましくは約７〜約８である。このような緩衝液は更に塩濃度を調節する為に、塩化ナトリウムや塩化カリウム等の塩が添加されていてもよい。また、緩衝液には更に塩濃度を調節するために適当なイオンを含有する塩を添加することができ、陰イオンとしては、例えばリン酸、硫酸、酢酸、塩素、臭素、硝酸、過塩素酸、ヨウ素、チオシアン酸などが含まれ、陽イオンとしてはアンモニウム、カリウム、ナトリウム、リチウム、マグネシウム、カルシウム、バリウム等が含まれる。これらを含む塩としては、例えば硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化リチウム、チオシアン酸カリウム等があげられる。
溶出方法としては、前記した緩衝液に吸着担体を浸し、一定時間放置（５分以上）あるいは攪拌し、溶出液を回収するという操作を数回（最低1回、好ましくは3回程度）繰り返すことによって行なわれる。通常、吸着担体１００ｍＬに対して、溶出液は約２００ｍＬ、好ましくは約３００ｍＬ、さらに好ましくは約５００ｍＬの割合で用いられる。溶出液量を増やすと、回収率は良くなるのが一般的である。あるいは、カラムに吸着担体を充填し、溶出液を通液することによっても行うことができる。この場合に通液する洗浄液の量は前記と同程度のものである。この際の緩衝液の温度は、たん白が凍結あるいは変性しない程度の温度であれば特に限定されないが、通常約０〜約４５℃、好ましくは約２０〜約３０℃、さらに好ましくは約２５℃のものが用いられる。
【００１４】
本発明で用いられる抗原としては、トキソイドやワクチンの原料となる、トキシン（例えば、破傷風トキシン、ジフテリアトキシン等）、百日咳抗原等が挙げられる。なかでも、本発明製造法は破傷風トキシンの製造に有効である。
本発明においては上記の抗原が菌体内で産生されるものであっても、菌体外に産生されるものであってもよい。特に、上記抗原が菌体内で産生されるものであって菌体外へ放出されにくい場合は目的物質が培養液中に遊離された状態にする為に、菌の培養は菌が自己融解（autolysis）する程度に行うのが望ましい。また別の方法としては菌体内産生物質の場合には培養後にホモジナイザー、ディスパーサー、マイクロフルイダイザー、超音波破砕機等を用い自体公知の菌体を破壊する操作を施すことによって、目的物質を培養液中に遊離させることが望ましい。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明の精製抗原の製造法では、まず、目的物質産生菌をその菌の至適条件において培養し、必要なら前記した菌体破壊する。例えば、破傷風菌培養液は、破傷風菌Harvard株またはこれと同等以上の毒素産生能を持つ株を液体培地で５〜１０日培養したものが通常は用いられる。得られた培養液自体を本発明の製造法に適用することができる。また、培養液からろ過等の手段によって除菌したものも適用可能である。また、これらはそのまま吸着担体に適用することもできるが、適宜希釈等を施してから担体に適用してもよい。通常、原料液における毒素量は２０〜７０Ｌｆ／ｍＬであるが、この範囲を超えた原料液においても無論精製は可能である。
該原料液（培養液または除菌培養液等）に必要に応じて、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム等の塩類を加えよく攪拌し、目的物質に十分の疎水性を持たせる。塩類の添加量は、目的物質が吸着担体に十分に吸着でき、他の夾雑物質がなるべく吸着しないような程度に調製される。培養液自体がそのような特性を有している場合には塩類の添加は不要となる。例えば、破傷風菌を培養した場合には、これに硫酸アンモニウムを約１．２〜約１．３mol/Lになる程度添加し、攪拌する。
【００１６】
次に、疎水性官能基を有する吸着担体による浮遊性流動床を形成する。吸着処理はバッチ処理でもよいし、カラムクロマトグラフィーでもよい。バッチ処理の場合には適宜吸着担体を前記洗浄液中に浮遊させることができる容器であれば如何なるものでも使用できる。また、カラムクロマトグラフィー処理の場合には、市販されている通常のクロマトグラフィー用カラムであれば使用可能であるが、カラムの上部、下部から共に溶液の導入排出が可能なものがよく、特に上部アダプターは可動式であるものが望ましい。このようなカラムも市販されている。
カラムを用いた場合の典型的な方法としては次のような例が挙げられる。
静置したときに高さが約10〜約30cm以内になるように、適宜前記方法によって洗浄した吸着担体を約１００cmの上部アダプター可動式カラムに充填する。その後、培養液に添加した濃度、あるいはそれに近い濃度の塩溶液を約200〜約400cm/hの線速度でカラム下部より上昇方向に流し、吸着担体を平衡化させると同時に吸着担体を浮遊させ、安定した浮遊流動床を形成させる。浮遊流動床の吸着担体の平均粒子密度は前記した範囲のものとなるように調節する。この場合は約１．２g/ｍＬ程度である。このとき、吸着担体が十分に浮遊し流動床が形成されるよう、カラム上部のアダプターは十分な高さまで上昇させておく。通常、静置した時の吸着担体の高さの約３〜４倍の高さまでアダプターをあげておく。また、通常浮遊している吸着担体の最上部は、カラム下部より静置吸着担体高さの約３倍のところで安定する。
【００１７】
次いで、吸着担体が安定した浮遊流動床を形成したら、前もって調製した塩を加えた培養液を、カラム下部より約200〜400cm/hの線速度でカラムに添加する。従来のカラムクロマトグラフィーではこの時点でカラムが詰まりクロマトを継続することは不可能となるが、本発明では、吸着担体が浮遊しているため目詰まりの原因となる菌体や塩類で塩析した水不溶物は吸着担体の間を抜け出て、カラム上部から排出されるので、カラムが詰まることはない。また、流動床が一定かつ十分な高さで安定しているため、目的物質は、カラム上部から排出される以前に吸着担体と十分接触する機会を有し吸着担体に吸着されるため、菌体や塩類で塩析した水不溶物などと共にカラム上部より排出されることはない。
培養液を添加し終わったら、同塩溶液を約200〜約400cm/hの線速度でカラム下部より上昇方向に流し、安定した浮遊流動床を形成させたままカラム内部の吸着担体を洗浄する。これは、菌体や不溶物がカラム内に残存すると目詰まりを起こす危険があるために行う処理である。洗浄液の濃度は精製目的とする物質が当該吸着担体の疎水性官能基に十分吸着し、他の夾雑物質がなるべく吸着しない程度に疎水性を付与するものであれば特に限定されるものではない。一般的には、電気伝導度約４５〜約１８０mS/cmの緩衝液が用いられる。好ましくは約１２０〜約１６０mS/cm、の緩衝液である。緩衝液の種類としては、リン酸緩衝液、トリス-塩酸緩衝液、グリシン-塩酸緩衝液、グリシン‐水酸化ナトリウム緩衝液等である。好ましくは、リン酸緩衝液である。緩衝液のｐＨは通常、約３〜約１1、好ましくは約５〜約８．５、更に好ましくは約７〜約８である。また、緩衝液には更に塩濃度を調節するために適当なイオンを含有する塩を添加することができ、陰イオンとしては、例えばリン酸、硫酸、酢酸、塩素、臭素、硝酸、過塩素酸、ヨウ素、チオシアン酸などが含まれ、陽イオンとしてはアンモニウム、カリウム、ナトリウム、リチウム、マグネシウム、カルシウム、バリウム等が含まれる。これらを含む塩としては、例えば硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化リチウム、チオシアン酸カリウム等があげられる。
洗浄方法としては、通常、吸着担体約７５ｍＬに対して、洗浄液は約２００ｍＬ、好ましくは約５００ｍＬ、さらに好ましくは約１０００ｍＬ以上の割合で用いられ、洗浄液を通液することによって行う。この際の緩衝液の温度は通常約０〜約３０℃、好ましくは約２０〜約３０℃、さらに好ましくは約２５℃のものが用いられ、洗浄中もこの温度が保たれていることが望ましい。
吸着担体洗浄後は、同塩溶液のカラムへの添加方向を逆の方向に切り替え吸着担体をパックする。これと同時に上昇させておいたカラムの上部アダプターをパックした吸着担体の高さまで下降させる。この操作は、溶出操作を行う際に吸着担体の体積を最小にし、溶出画分の採取液量を最小限まで小量化することにより濃縮された目的物質画分を得るために有効な手段である。この後、前記した溶出液を用いて、溶出処理を行い目的とする粗精製画分を得る。
【００１８】
また、バッチ処理の場合は次のような方法が例としてあげられる。
すなわち前記方法で十分に平衡化した担体に十分な疎水性を付与した培養液を添加し、液と担体が十分に接触する機会を与えるよう、例えば攪拌など適当な処置を施す。この操作を十分な時間すなわち、一般的には１時間以上行い培養液を適当な方法、すなわちデキャンテーション、サクションなどの方法で廃棄する。しかる後に担体を平衡化させた時と同様の操作で担体を洗浄し、担体に化学的に吸着したもの以外を全て洗い流しめる。溶出操作としては、可能な限り少量の溶出バッファーを添加し液と担体が十分に接触する機会を与えるよう、例えば攪拌など適当な処置を施す。溶液を分取し目的とする粗精製画分を得る。バッチ法の場合は、溶出操作を２回望ましくは３回程度繰り返すことがより高い回収率を上げるためには効果的である。
【００１９】
このようにして得られた画分は、更に精製を行うためイオン交換クロマトグラフィーに供することができる。従来法では、塩析等の手法を用いることが多く、そのためイオン交換クロマトグラフィー等を行うには、事前に試料（粗精製物）を透析、限外ろ過など適当な方法で脱塩する必要があったが、前述のとおり、本発明では、粗精製画分は通常塩濃度の低い溶出液、例えば希リン酸ナトリウム緩衝液によって溶出されるため、塩濃度が低い状態で得ることができるので、透析、限外ろ過などの方法で脱塩するは必要ない。若干量の蒸留水を添加して塩濃度を低くするのみで次工程（例えば、ＤＥＡＥあるいはＣＭ等の陰イオンあるいは陽イオンクロマトグラフィー）へサンプルを供給することができ、更なる時間短縮が可能となる。
具体的には、例えば、DEAE Sepharose Fast Flowゲルをカラムに約１５cm高さに充填し０．０１ｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化し、蒸留水で数倍に希釈した粗精製毒素を添加し毒素をカラムに吸着させ、これを０．０２ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含む０．０１ｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄、０．１５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含む０．０１ｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム緩衝液で溶出させることにより精製毒素画分を得ることが可能である。また、この毒素画分は、更にバッファー置換のため０．１４５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含む０．００４ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液で平衡化したSephacryl−S200HRカラムに添加し、必要な画分を採取することによりバッファー置換が可能である。
本発明の方法で得られた粗精製破傷風菌トキシンの純度は、タンパク質窒素1mgあたり約８００Lfであった。これを定法に従い、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーで精製し、ホルマリンでトキソイド化し、限外ろ過で脱塩およびホルマリンの除去を行い、精製トキシンを得ることができる。この純度は、タンパク質窒素1mgあたり約2900Lfにまで精製が容易に行うことができる。しかも、これは従来の方法で精製したトキシンより、更に純度の高いものである。
トキシンの無毒化（トキソイド化）の方法は例えば次の通りである。毒素濃度を約２５０Ｌｆ／ｍＬとなるよう約０．１４５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含む約０．００４ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液で希釈し、約０．３ｖｏｌ％ホルマリンを約３９℃で１０日間程度反応させ、毒素をトキソイド化する。トキソイドは更に濃縮し、かつホルマリンを除去するため、分画分子量約３０，０００の限外ろ過膜に供し液量が１／１０程度になるよう濃縮することによりトキソイド原液が得られる。
【００２０】
本発明の製造法で得られた破傷風トキソイドにジフテリアトキソイドを配合して、ＤＴワクチン（ジフテリア破傷風混合トキソイド）を製造することができる。ジフテリア破傷風混合トキソイドに使用するジフテリアトキソイドは自体公知の方法で製造可能であり、その製法は、例えばワクチンハンドブック（国立予防衛生研究所学友会 編、丸善株式会社）等に記載されている(図２)。
また、ジフテリア破傷風混合トキソイドとしての製法は、例えば、日本薬局方沈降ジフテリア破傷風混合トキソイド「タケダ」の添付文書に記載の方法がある。具体的には、リン酸塩緩衝塩化ナトリウム溶液にジフテリアトキソイド、および破傷風トキソイドを加え、各々約50Lf、約10Lfとなるよう調製し、更に免疫増強剤として塩化アルミニウムをアルミニウム換算０．０５ｗ／ｖ％含有するよう調製することにより製造可能である。
【００２１】
さらに、本発明の製造法で得られた破傷風トキソイドにジフテリアトキソイドおよび百日咳ワクチンを配合して、ＤＴＰワクチン（沈降精製百日せきジフテリア破傷風混合ワクチン）を製造することもできる。沈降精製百日せきジフテリア破傷風混合ワクチンに使用するジフテリアトキソイドは自体公知の方法で製造可能であり、その製法は、例えばワクチンハンドブック（国立予防衛生研究所学友会 編、丸善株式会社）等に記載されている（図２）。また、百日せきジフテリア破傷風混合ワクチンに使用する百日せきワクチン原液は自体公知の方法で製造可能であり、その製法は、例えばワクチンハンドブック（国立予防衛生研究所学友会 編、丸善株式会社）等に記載されている(図３)。
また、沈降精製百日せきジフテリア破傷風混合ワクチンとしての製法は、例えば、日本薬局方沈降精製百日せきジフテリア破傷風混合ワクチン「タケダ」の添付文書に記載の方法がある。具体的には、リン酸塩緩衝塩化ナトリウム溶液に百日せきワクチン原液、ジフテリアトキソイド、および破傷風トキソイドを加え、各々8国際単位以上、約30Lf、および約5Lfとなるよう調製し、更に免疫増強剤として塩化アルミニウムをアルミニウム換算０．０２ｗ／ｖ％含有するよう調製することにより製造可能である。
【００２２】
吸着担体の再生方法は、目的とする精製物質に含まれる不純物の種類により個別に設定される必要があるが、一般的には自体公知の方法にて吸着担体を再生できる。その方法は、例えば「Hydrophobic Interaction Chromatography、Principles And Methods」（ファルマシアバイオテク）に記載されている方法である。具体的には、まずたん白を除去するため０．５〜１．０ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ溶液でゲルを洗浄し、更に吸着担体に疎水結合した物質を除去するために蒸留水で洗浄して吸着担体を再生する。カラムを使用して再生を行う場合には、吸着担体75ｍＬに対して、ＮａＯＨ溶液を一般的には３００ｍＬ、望ましくは４５０ｍＬ程度添加し、ついで蒸留水を一般的には１５０〜２２５ｍＬ望ましくは３００ｍＬ程度添加する。吸着担体を再生するために添加する溶液の添加速度は、溶液と吸着担体を必要かつ十分に接触せしめる速度であれば如何なる速度でも構わないが、一般的には４０ｃｍ／Ｈ程度の速度が採用される。一般的には上記の方法で吸着担体の再生は可能であるが、強固に結合した疎水性物質の除去には、蒸留水の代わりに更に極性の低いエタノールやプロパノールを使用するのも有効的である。エタノールは一般的には７０％あるいはそれ以下の濃度で、プロパノールは一般的には３０％あるいはそれ以下の濃度で使用される。カラムを使用して再生を行う場合には、吸着担体75ｍＬに対して、エタノールまたはプロパノール溶液を一般的には３００〜７５０ｍＬ、望ましくは７５０ｍＬ程度添加し、ついで蒸留水を一般的には１５０〜２２５ｍＬ望ましくは３００ｍＬ程度添加する。吸着担体を再生するために添加する溶液の添加速度は、溶液と吸着担体を必要かつ十分に接触せしめる速度であれば如何なる速度でも構わないが、一般的には４０ｃｍ／Ｈ程度の速度が採用される。その他、一般的にカラムクロマトグラフィーで採用されている吸着担体の再生方法であれば、適宜使用可能である。このように再生された吸着担体は繰り返し本発明の精製抗原の製造法に用いられる。例えば、破傷風トキシンの精製の場合は最低でも５０回は繰り返し使用できる。
【００２３】
【実施例】
以下、実施例を示してこの発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。
実施例１
まず出発物質である破傷風毒素培養液は、破傷風菌Harvard株を液体培地で窒素通気下５日間培養したものを使用した。この破傷風培養液に、培養液１リッターあたり１６５ｇの硫酸アンモニウムを加えよく攪拌し毒素に十分の疎水性を持たせた。
次に、静置したときにゲルの高さが１５ｃｍとなるよう７５ｍＬのゲルを本クロマト専用の上部アダプター可動式カラム（高さ：１００ｃｍ、カラム径：２５ｍｍ）に充填した。その後、１．２５ｍｏｌ／Ｌの硫酸アンモニウム溶液を２００ｃｍ／ｈの線速度でカラム下部より上昇方向に流し、ゲルを平衡化させると同時にゲルを浮遊させ、安定した浮遊流動床を形成させた。このとき、ゲルが十分に浮遊し流動床が形成されるよう、カラム上部のアダプターは６０ｃｍまで上昇させておいた。また、浮遊しているゲルの最上部は、カラム下部より約４５ｃｍのところで安定した。安定した浮遊流動床を形成後、前もって調製した硫酸アンモニウムを加えた培養液１８７５ｍＬを、カラム下部より２００ｃｍ／ｈの線速度でカラムに添加した。
培養液を添加後、１．２５ｍｏｌ／Ｌの硫酸アンモニウム溶液を２００ｃｍ／ｈの線速度でカラム下部より上昇方向に流し、安定した浮遊流動床を形成させたままカラム内部のゲルを洗浄した。
ゲル洗浄後は、１．２５ｍｏｌ／Ｌの硫酸アンモニウム溶液のカラムへの添加方向を逆の方向に切り替えゲルを１５ｃｍの高さまでパックした。これと同時に上昇させておいたカラムの上部アダプターをパックしたゲルの高さまで下降させた。この後、０．０１ｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム緩衝液で溶出を行い目的とする粗精製毒素画分を得た。
【００２４】
得られた毒素画分は更に精製を行うためイオン交換クロマトグラフィーに供された。基本的操作は、教科書等に参照される方法であるが、より具体的には、DEAE Sepharose Fast Flowゲルをカラムに１５cm高さに充填し０．０１ｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化し、蒸留水で数倍に希釈した粗精製毒素を添加し毒素をカラムに吸着させた。これを０．０２ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含む０．０１ｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄、０．１５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含む０．０１ｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム緩衝液で溶出させ精製毒素画分を得た。この毒素画分はバッファー置換のため０．１４５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含む０．００４ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液で平衡化したSephacryl−S200HRカラムに添加され、必要な画分を採取した。画分中の毒素濃度を２５０Ｌｆ／ｍＬとなるよう０．１４５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含む０．００４ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液で希釈し、０．３ｖｏｌ％ホルマリンを３９℃で１０日間反応させ、毒素をトキソイド化した。トキソイドを濃縮しホルマリンを除去するため、分画分子量３０，０００の限外ろ過膜を使用して液量が１／１０程度になるよう濃縮した。
本発明で精製したトキソイドの純度は、平均２９００Ｌｆ／ｍｇＰＮと従来法で精製したトキソイドのそれを上回るものであった。また、トキソイド化の日数を除いた精製のみのリードタイムは、２１日から６日と大幅に短縮された（表１）。
【表１】
＊＊：従来法とは、除菌、塩化亜鉛沈殿、リン酸ソーダ抽出、硫酸アンモニウム沈殿、透析、（トキソイド化、）イオン交換クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿、透析工程の８工程を含む一般的な破傷風トキソイド精製法を意味する。
【００２５】
【発明の効果】
従来の方法では、純度の高い抗原、例えば精製トキシンを得るには、除菌、塩化亜鉛沈殿、硫酸アンモニウム塩析、透析、イオン交換クロマトグラフィー等の精製工程が必要であり、不連続な数週間にわたる作業で得られていたが、本発明では、簡便かつ迅速な方法を発明したため、およそ１週間（トキソイド化工程を除く精製工程のみ）で得られるようになった。
【図面の簡単な説明】
【図１】 破傷風トキソイド製造の従来の方法を示す図である。
【図２】 ジフテリアトキソイドの製法の１例を示す図である。
【図３】 百日せきワクチンの製法の１例を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel method for producing a purified antigen such as tetanus toxin using a floating fluidized bed into which a hydrophobic group has been introduced. The present invention also relates to a method for producing a toxoid from a purified toxin, a vaccine containing the toxoid, and the like.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, for the production of tetanus toxoid, a tetanus bacterium Harvard strain or a strain having a toxin producing ability equivalent to or higher than this is cultured in a liquid medium for 5 to 10 days, and then sterilized is used as a raw material. The toxin in the raw material is detoxified with formalin to the extent that the immunogenicity is not impaired, and purified by an appropriate method before or after detoxification. As the purification method, there is mainly a method in which the steps of zinc chloride precipitation method, ammonium sulfate fractionation method, adsorption carrier filtration method and ion exchange chromatography method are combined (FIG. 1).
[0003]
The purity of toxoid after purification is currently 1700-2700 Lf / mg protein nitrogen. (National Institute of Preventive Hygiene, Alumni Association, Vaccine Handbook)
[0004]
However, in such conventional methods, it is necessary to perform a sterilization step in order to obtain a toxin-containing liquid as a raw material, and discontinuous (these methods such as a zinc chloride precipitation method and an ammonium sulfate fractionation method as a raw material purification method). It is necessary to remove the used salts by dialysis or the like, and it is not easy enough as an industrial vaccine production method. It was.
[0005]
Similarly, column chromatography packed with a floating fluidized bed is known as a method for sterilization and purification in order to cultivate bacterial cells and purify proteins produced by the bacterial cells. Table 2000-500063), use as a sterilization / purification of toxin is not specifically described.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
Eliminate and purify the target product more quickly and easily by avoiding discontinuous and complicated treatments such as the sterilization process, zinc chloride precipitation method, and concentration by ammonium sulfate fractionation method in the conventional method of purifying toxin from bacterial cell culture It is to provide a way to do.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted various studies in order to solve the above problems, and as a result, without sterilizing the culture solution of the target substance-producing bacterium, it is treated as it is by floating fluidized bed chromatography. At the same time, it was found that the toxin can be purified, and the present invention has been completed. In particular, a culture solution prior to sterilization with salt added is brought into contact with a floating fluidized bed of a high-specific gravity adsorbent having a hydrophobic functional group in a rising direction at high speed, and the antigen is adsorbed on the adsorbent and only the cells I found a way to pass through.
[0008]
That is, the present invention
(1) A method for producing a purified antigen, wherein the antigen is adsorbed on an adsorption carrier having a hydrophobic functional group in which a floating fluidized bed is formed;
(2) The production method according to (1) above, wherein the antigen-containing liquid is brought into contact with an adsorption carrier having a hydrophobic functional group forming a floating fluidized bed to adsorb the antigen, and then the antigen is eluted from the adsorption carrier;
(3) The production method according to the above (1), wherein the antigen is a toxin;
(4) The production method according to (3), wherein the toxin is tetanus toxin;
(5) The production method according to the above (2), which uses an antigen-containing solution to which salts are added;
(6) The production method according to the above (5), wherein the salt is ammonium sulfate or sodium chloride;
(7) The production method according to the above (2), wherein the antigen-containing solution is a bacterial culture solution;
(8) The production method according to the above (1), wherein the hydrophobic functional group is a phenyl group;
(9) The production method according to (1), wherein the adsorption carrier is porous cross-linked agarose;
(10) The production method according to the above (1), wherein the average particle size of the adsorption carrier is about 10 to about 1000 μm;
(11) The average particle density of the floating fluidized bed is 1 g / cm 2 The production method according to (1), which is larger than the above;
(12) The production method according to the above (1), which is an adsorption carrier washed with a buffer having a temperature of about 0 to about 30 ° C. and an electric conductivity of about 120 to about 160 mS / cm;
(13) The production method according to (2), wherein the adsorption carrier is washed with a buffer having an electric conductivity of about 120 to about 160 mS / cm before elution;
(14) The production method according to (2) above, wherein elution is performed using a buffer solution having an electric conductivity of about 0 to about 20 mS / cm;
(15) The production method according to the above (1), wherein the floating fluidized bed is formed in the column;
(16) The method according to (14), wherein the antigen-containing liquid is added to the column at a linear velocity of about 200 to about 400 cm / h from the bottom of the column;
(17) The production method according to the above (1), wherein the adsorption carrier is packed after the adsorption treatment;
(18) The production method according to the above (15), wherein the eluate is applied in a direction opposite to the adsorption treatment;
(19) A method for producing a toxoid, wherein the toxin produced by the production method according to (3) is detoxified;
(20) The production method according to the above (19), wherein the toxoid is tetanus toxoid;
(21) The production method according to the above (19), which is detoxified with formalin;
(22) Tetanus toxoid produced by the method according to (20) above;
(23) A two-mixed toxoid containing the tetanus toxoid and diphtheria toxoid according to (22) above;
(24) A triple vaccine comprising the tetanus toxoid, diphtheria toxoid and pertussis vaccine according to (22);
It is.
[0009]
The adsorption carrier used in the present invention can be appropriately used as long as it constitutes a basic matrix with a polymer used in ordinary column chromatography. The adsorption carrier is usually used in the form of beads. That is, it may be somewhat spherical, and thus may include irregular shapes such as granule shapes, collapsed shapes, etc., but preferably spherical or other round shapes. The adsorbent carrier is usually composed of a polymer base matrix in which a filler is encapsulated, and can be hydrophobic, for example, a bead composed of a styrene-divinylbenzene copolymer, for example, a surface of a suitable hydrophilic polymer (preferably Is made hydrophilic by coating with a polymer having a hydroxy or amino group. Further, the adsorption carrier is composed of a basic matrix such as an insoluble or soluble hydrophilic polymer, for example, agarose, cellulose, dextran, starch, etc., and is desirably crosslinked by a known method (for example, JP 2000-500063) if necessary. Provide porosity and stability. Of these, porous cross-linked agarose is preferable.
Further, it is desirable that such an adsorption carrier is prepared with a material that has no affinity with the microbial cells themselves that produce the substance to be purified and does not adsorb the microbial cells. It is appropriately selected according to the type of fungus body.
[0010]
In the present invention, the adsorbent carrier having a hydrophobic functional group introduced therein is used. Examples of the hydrophobic functional group include aryl groups (for example, C groups such as a phenyl group and a naphthyl group). 6-14 Aryl groups), alkyl groups (C2-C8 branched, straight chain, cyclic alkyl groups; for example, butyl, octyl, etc.) and the like. A phenyl group, a butyl group, an octyl group and the like are preferable, and a phenyl group and the like are more preferable.
Such a hydrophobic functional group can be introduced into the adsorption carrier according to a method known per se, for example, the method described in “Hydrophobic Interaction Chromatography, Principles And Methods” (Pharmacia Biotech), Special Table 2000-500063. it can. For example, it is preferable to introduce a hydrophobic functional group into a 10-50 μmoles / mL adsorption carrier by a glycidyl ether bonding method.
The particle size of the adsorption carrier is about 10 to about 1000 μm, preferably about 50 to about 700 μm, more preferably about 100 to about 300 μm. When the particles have a major axis and a minor axis, those having a major axis of the size indicated in the above range are used.
[0011]
Further, any specific gravity of the adsorption carrier used in the present invention can be used, but usually 1 g / cm. 3 Larger ones are used. Preferably, about 1.1 g / cm 3 More preferably, about 1.2 g / cm 3 It has the above specific gravity. Since the adsorption carrier having such a specific gravity is used, the adsorption carrier settles in an equilibrium state according to the flow of the medium, and a stable floating fluidized bed is formed. In particular, when a column is used, the flow of the culture solution before sterilization rising from the bottom of the column and the sedimentation of the adsorption carrier are in an equilibrium state, and the adsorbent forms a stable floating equilibrium state while being separated from each other in the column. The average particle density of the adsorbent carrier in the floating fluidized bed at this stable equilibrium is 1 g / cm 3 Larger, preferably 1.1 g / cm 3 Or more, more preferably 1.2 g / cm 3 That's it.
In the adsorption treatment, the antigen-containing liquid (bacterial culture solution) is brought into contact with the adsorption carrier having the hydrophobic functional group that forms the floating fluidized bed, so that the cells contained in the antigen-containing liquid pass through, The antigen is adsorbed on the adsorption carrier. This makes it possible to efficiently perform discontinuous and complicated treatments such as sterilization by conventional methods, zinc chloride precipitation method, and concentration by ammonium sulfate fractionation method by only one operation.
[0012]
It is desirable that this adsorption carrier is washed as a pretreatment for contacting with the antigen-containing liquid. The cleaning liquid is not particularly limited as long as the substance to be purified is sufficiently adsorbed on the hydrophobic functional group of the adsorption carrier and imparts hydrophobicity to the extent that other contaminants do not adsorb as much as possible. In general, a buffer having an electrical conductivity of about 45 to about 180 mS / cm is used. A buffer solution of about 120 to about 160 mS / cm is preferred. Examples of the buffer include phosphate buffer, Tris-hydrochloric acid buffer, glycine-hydrochloric acid buffer, and glycine-sodium hydroxide buffer. A phosphate buffer is preferable. The pH of the buffer is usually about 3 to about 11, preferably about 5 to about 8.5, more preferably about 7 to about 8. Further, a salt containing an appropriate ion can be added to the buffer to adjust the salt concentration. Examples of the anion include phosphoric acid, sulfuric acid, acetic acid, chlorine, bromine, nitric acid, perchloric acid. Iodine, thiocyanic acid and the like, and cations include ammonium, potassium, sodium, lithium, magnesium, calcium, barium and the like. Examples of salts containing these include sodium sulfate, potassium sulfate, ammonium sulfate, sodium phosphate, sodium chloride, lithium chloride, and potassium thiocyanate.
The washing method is carried out by immersing the adsorbent carrier in the above-mentioned buffer solution, allowing it to stand for a certain time (more than 5 minutes) or stirring and discarding the washing solution several times (minimum 3 times, preferably about 5 times). It is. Usually, the cleaning liquid is used at a ratio of about 200 mL, preferably about 500 mL, more preferably about 1000 mL or more with respect to 100 mL of the adsorption carrier. Alternatively, it can also be carried out by filling the column with an adsorption carrier and passing the washing liquid. In this case, the amount of cleaning liquid to be passed is about the same as described above. The temperature of the buffer solution at this time is usually about 0 to about 30 ° C., preferably about 20 to about 30 ° C., more preferably about 25 ° C., and it is desirable that this temperature be maintained even during washing. .
[0013]
As an eluent for eluting the adsorbed target substance from the adsorbent carrier, an eluent having such a degree of hydrophobicity that the target substance is sufficiently released from the hydrophobic functional group and other contaminants are not released as much as possible is used. In general, a buffer having an electric conductivity of about 0 to about 45 mS / cm is used. The buffer solution is preferably about 0 to about 30 mS / cm, more preferably about 0 to about 20 mS / cm. Examples of the buffer solution include phosphate buffer, Tris-hydrochloric acid buffer, glycine-hydrochloric acid buffer, glycine-sodium hydroxide buffer, and the like. A phosphate buffer is preferable. The pH of the buffer is usually about 3 to about 11, preferably about 5 to about 8.5, more preferably about 7 to about 8. Such a buffer may further contain a salt such as sodium chloride or potassium chloride in order to adjust the salt concentration. Further, a salt containing an appropriate ion can be added to the buffer to adjust the salt concentration. Examples of the anion include phosphoric acid, sulfuric acid, acetic acid, chlorine, bromine, nitric acid, perchloric acid. Iodine, thiocyanic acid and the like, and cations include ammonium, potassium, sodium, lithium, magnesium, calcium, barium and the like. Examples of salts containing these include sodium sulfate, potassium sulfate, ammonium sulfate, sodium phosphate, sodium chloride, lithium chloride, and potassium thiocyanate.
As an elution method, the operation of immersing the adsorbent carrier in the buffer solution described above, leaving it for a certain time (more than 5 minutes) or stirring and collecting the eluate is repeated several times (at least once, preferably about 3 times). Is done by. Usually, the eluent is used at a ratio of about 200 mL, preferably about 300 mL, more preferably about 500 mL with respect to 100 mL of the adsorption carrier. Generally, the recovery rate increases as the amount of eluate increases. Alternatively, it can also be carried out by filling the column with an adsorption carrier and passing the eluate through. In this case, the amount of cleaning liquid to be passed is about the same as described above. The temperature of the buffer solution at this time is not particularly limited as long as the protein does not freeze or denature, but is usually about 0 to about 45 ° C, preferably about 20 to about 30 ° C, more preferably about 25 ° C. Is used.
[0014]
Examples of the antigen used in the present invention include toxins (for example, tetanus toxin, diphtheria toxin, etc.), pertussis antigen, and the like, which are raw materials for toxoids and vaccines. Among these, the production method of the present invention is effective for the production of tetanus toxin.
In the present invention, the antigen may be produced inside the microbial cell or produced outside the microbial cell. In particular, when the above antigen is produced in the microbial cell and is not easily released outside the microbial cell, the culturing of the bacterium is carried out in order to make the target substance released in the culture solution. ) To the extent that you want to. As another method, in the case of a substance produced in the cell, the target substance is cultured by performing an operation of destroying the cell itself known using a homogenizer, a disperser, a microfluidizer, an ultrasonic crusher or the like after the culture. It is desirable to release it in the liquid.
[0015]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In the method for producing a purified antigen of the present invention, first, a target substance-producing bacterium is cultured under the optimum conditions of the bacterium, and if necessary, the cells are destroyed. For example, a tetanus bacteria culture solution is usually used that is obtained by culturing a tetanus bacterium Harvard strain or a strain capable of producing toxins equivalent to or higher in a liquid medium for 5 to 10 days. The obtained culture solution itself can be applied to the production method of the present invention. Moreover, what was sterilized from the culture solution by means such as filtration is also applicable. These can be applied to the adsorption carrier as they are, but may be applied to the carrier after appropriate dilution or the like. Usually, the amount of toxin in the raw material solution is 20 to 70 Lf / mL. However, purification of the raw material solution exceeding this range is possible.
If necessary, salts such as ammonium sulfate and sodium chloride are added to the raw material solution (culture solution or sterilized culture solution, etc.), and the mixture is stirred well so that the target substance has sufficient hydrophobicity. The amount of the salt added is adjusted to such an extent that the target substance can be sufficiently adsorbed on the adsorption carrier and other contaminants are not adsorbed as much as possible. When the culture solution itself has such characteristics, it is not necessary to add salts. For example, when tetanus is cultured, ammonium sulfate is added to this so as to be about 1.2 to about 1.3 mol / L and stirred.
[0016]
Next, a floating fluidized bed is formed by the adsorption carrier having a hydrophobic functional group. The adsorption process may be a batch process or column chromatography. In the case of batch processing, any container can be used as long as the adsorption carrier can be suspended in the cleaning liquid as appropriate. In the case of column chromatography, any commercially available column for chromatography can be used. However, it is preferable that the solution can be introduced and discharged from both the upper and lower parts of the column. The adapter is preferably movable. Such columns are also commercially available.
The following example is given as a typical method using a column.
The adsorption carrier washed by the above method is appropriately packed in an about 100 cm movable upper adapter column so that the height is within about 10 to about 30 cm when left standing. Thereafter, a salt solution having a concentration added to the culture medium or a concentration close thereto is flowed upward from the bottom of the column at a linear velocity of about 200 to about 400 cm / h to equilibrate the adsorption carrier and simultaneously float the adsorption carrier. A stable floating fluidized bed is formed. The average particle density of the adsorbent carrier in the floating fluidized bed is adjusted to be in the above-mentioned range. In this case, it is about 1.2 g / mL. At this time, the adapter at the top of the column is raised to a sufficient height so that the adsorption carrier is sufficiently floated and a fluidized bed is formed. Usually, the adapter is raised to a height of about 3 to 4 times the height of the adsorption carrier when left standing. Moreover, the uppermost part of the adsorbing carrier that is normally suspended is stabilized at about three times the height of the stationary adsorbing carrier from the bottom of the column.
[0017]
Next, when the adsorbent support forms a stable floating fluidized bed, the culture solution added with the salt prepared in advance is added to the column at a linear velocity of about 200 to 400 cm / h from the bottom of the column. In the conventional column chromatography, the column is clogged at this point and it is impossible to continue the chromatography. However, in the present invention, since the adsorption carrier is floating, salting out with the cells and salts causing clogging is performed. The water-insoluble matter escapes between the adsorption carriers and is discharged from the upper part of the column, so that the column is not clogged. In addition, since the fluidized bed is stable at a constant and sufficient height, the target substance has sufficient opportunity to come into contact with the adsorption carrier before being discharged from the top of the column and is adsorbed on the adsorption carrier. And water insoluble matter salted out with salts are not discharged from the top of the column.
When the culture solution has been added, the salt solution is caused to flow upward from the bottom of the column at a linear velocity of about 200 to about 400 cm / h, and the adsorbent inside the column is washed while forming a stable floating fluidized bed. This is a process performed because there is a risk of clogging when cells and insoluble matter remain in the column. The concentration of the washing liquid is not particularly limited as long as the substance to be purified is sufficiently adsorbed on the hydrophobic functional group of the adsorption carrier and imparts hydrophobicity to the extent that other contaminants do not adsorb as much as possible. In general, a buffer having an electrical conductivity of about 45 to about 180 mS / cm is used. Preferably, the buffer is about 120 to about 160 mS / cm. Examples of the buffer include phosphate buffer, Tris-hydrochloric acid buffer, glycine-hydrochloric acid buffer, and glycine-sodium hydroxide buffer. A phosphate buffer is preferable. The pH of the buffer is usually from about 3 to about 11, preferably from about 5 to about 8.5, more preferably from about 7 to about 8. Further, a salt containing an appropriate ion can be added to the buffer to adjust the salt concentration. Examples of the anion include phosphoric acid, sulfuric acid, acetic acid, chlorine, bromine, nitric acid, perchloric acid. Iodine, thiocyanic acid and the like, and cations include ammonium, potassium, sodium, lithium, magnesium, calcium, barium and the like. Examples of salts containing these include sodium sulfate, potassium sulfate, ammonium sulfate, sodium phosphate, sodium chloride, lithium chloride, and potassium thiocyanate.
As a washing method, the washing liquid is usually used in a ratio of about 200 mL, preferably about 500 mL, more preferably about 1000 mL or more with respect to about 75 mL of the adsorption carrier, and the washing liquid is passed through. The temperature of the buffer solution at this time is usually about 0 to about 30 ° C., preferably about 20 to about 30 ° C., more preferably about 25 ° C., and it is desirable that this temperature be maintained even during washing. .
After the adsorption carrier washing, the adsorption carrier is packed by switching the addition direction of the salt solution to the column in the opposite direction. At the same time, the upper adapter of the column that has been raised is lowered to the height of the packed adsorption carrier. This operation is an effective means for obtaining a concentrated target substance fraction by minimizing the volume of the adsorbent carrier during the elution operation and reducing the volume of the collected eluate to a minimum. . Thereafter, elution treatment is performed using the eluate described above to obtain a target crudely purified fraction.
[0018]
In the case of batch processing, the following method is given as an example.
That is, a culture solution imparted with sufficient hydrophobicity is added to the carrier that has been sufficiently equilibrated by the above-described method, and an appropriate treatment such as stirring is performed so as to give an opportunity for sufficient contact between the solution and the carrier. This operation is performed for a sufficient time, generally 1 hour or longer, and the culture solution is discarded by an appropriate method, such as decantation or suction. Thereafter, the carrier is washed in the same manner as when the carrier is equilibrated, and everything except those chemically adsorbed on the carrier is washed away. As an elution operation, an appropriate amount of elution buffer, for example, stirring is performed so as to give an opportunity for sufficient contact between the liquid and the carrier. The solution is fractionated to obtain the desired crude purified fraction. In the case of the batch method, repeating the elution operation twice, preferably about three times, is effective for increasing the recovery rate.
[0019]
The fraction thus obtained can be subjected to ion exchange chromatography for further purification. In the conventional method, a method such as salting out is often used. Therefore, in order to perform ion exchange chromatography or the like, it is necessary to desalt the sample (crude product) by an appropriate method such as dialysis or ultrafiltration in advance. However, as described above, in the present invention, since the crudely purified fraction is usually eluted with an eluate having a low salt concentration, for example, a diluted sodium phosphate buffer, it can be obtained at a low salt concentration. It is not necessary to desalinate by methods such as dialysis and ultrafiltration. The sample can be supplied to the next process (eg anion or cation chromatography such as DEAE or CM) just by adding a small amount of distilled water to lower the salt concentration, and the time can be further reduced. Become.
Specifically, for example, DEAE Sepharose Fast Flow gel is packed in a column at a height of about 15 cm, equilibrated with 0.01 mol / L sodium phosphate buffer, and a crude purified toxin diluted several times with distilled water is added. Toxin is adsorbed on the column, washed with 0.01 mol / L sodium phosphate buffer containing 0.02 mol / L NaCl, and 0.01 mol / L phosphoric acid containing 0.15 mol / L NaCl. It is possible to obtain a purified toxin fraction by elution with a sodium buffer. This toxin fraction was further added to a Sephacryl-S200HR column equilibrated with a 0.004 mol / L phosphate buffer containing 0.145 mol / L NaCl for buffer replacement, and the required fraction was collected. By doing so, buffer replacement is possible.
The purity of the crude purified tetanus toxin obtained by the method of the present invention was about 800 Lf per 1 mg of protein nitrogen. This can be purified by ion exchange chromatography and gel filtration chromatography according to a conventional method, toxoided with formalin, desalted and removed with formalin, and purified toxin can be obtained. This purity can be easily purified to about 2900 Lf per mg of protein nitrogen. Moreover, it is more pure than the toxin purified by the conventional method.
A method for detoxification of toxin (toxoid) is, for example, as follows. Dilute with about 0.004 mol / L phosphate buffer containing about 0.145 mol / L NaCl so that the toxin concentration is about 250 Lf / mL, and react with about 0.3 vol% formalin at about 39 ° C for about 10 days. Toxoidize the toxin. In order to further concentrate the toxoid and remove formalin, the toxoid stock solution is obtained by subjecting it to an ultrafiltration membrane having a molecular weight cut off of about 30,000 and concentrating the solution to about 1/10.
[0020]
A DT vaccine (diphtheria tetanus mixed toxoid) can be produced by blending diphtheria toxoid with the tetanus toxoid obtained by the production method of the present invention. The diphtheria toxoid used for the diphtheria tetanus mixed toxoid can be produced by a method known per se, and its production method is described in, for example, the vaccine handbook (edited by National Institute of Preventive Health, Alumni Association, Maruzen Co., Ltd.) (FIG. 2). ).
Moreover, the manufacturing method as a diphtheria tetanus mixed toxoid has the method as described in the package insert of the Japanese Pharmacopoeia sedimentation diphtheria tetanus mixed toxoid "Takeda", for example. Specifically, diphtheria toxoid and tetanus toxoid are added to a phosphate buffered sodium chloride solution to prepare about 50 Lf and about 10 Lf, respectively, and aluminum chloride as an immunopotentiator is 0.05 w / v% in terms of aluminum. It can be manufactured by preparing to contain.
[0021]
Furthermore, a DTP vaccine (a sedimentation-purified pertussis diphtheria tetanus mixed vaccine) can be produced by blending diphtheria toxoid and pertussis vaccine with the tetanus toxoid obtained by the production method of the present invention. Diphtheria toxoid used in the sedimentation-purified pertussis diphtheria tetanus mixed vaccine can be produced by a publicly known method, and its production method is described in, for example, the vaccine handbook (edited by National Institute of Preventive Health, Alumni Association, Maruzen Co., Ltd.) (FIG. 2). In addition, a pertussis vaccine stock solution used for pertussis diphtheria tetanus mixed vaccine can be produced by a method known per se. For example, a vaccine handbook (edited by National Institute of Preventive Health, Alumni Association, Maruzen Co., Ltd.), etc. (FIG. 3).
Moreover, the manufacturing method as a sedimentation refined pertussis diphtheria tetanus mixed vaccine has the method as described in the package insert of the Japanese Pharmacopoeia sedimentation refined pertussis diphtheria tetanus mixed vaccine "Takeda", for example. Specifically, pertussis vaccine stock solution, diphtheria toxoid, and tetanus toxoid are added to phosphate buffered sodium chloride solution to prepare 8 international units or more, about 30 Lf, and about 5 Lf, respectively, and an immunopotentiator It can be produced by preparing aluminum chloride as 0.02 w / v% in terms of aluminum.
[0022]
The regeneration method of the adsorption carrier needs to be set individually depending on the type of impurities contained in the target purified substance, but in general, the adsorption carrier can be regenerated by a method known per se. The method is, for example, a method described in “Hydrophobic Interaction Chromatography, Principles And Methods” (Pharmacia Biotech). Specifically, the gel is first washed with a 0.5 to 1.0 mol / L NaOH solution to remove protein, and further washed with distilled water to remove substances that are hydrophobically bound to the adsorption carrier. Regenerate the carrier. When regeneration is performed using a column, a NaOH solution is generally added to 300 mL, preferably about 450 mL to 75 mL of an adsorption carrier, and then distilled water is generally added to 150 to 225 mL, preferably about 300 mL. Added. The addition rate of the solution added to regenerate the adsorption carrier may be any rate as long as the solution and the adsorption carrier are brought into necessary and sufficient contact with each other, but a rate of about 40 cm / H is generally adopted. The In general, it is possible to regenerate the adsorption carrier by the above method, but it is also effective to use ethanol or propanol with lower polarity instead of distilled water to remove the strongly bound hydrophobic substance. is there. Ethanol is generally used at a concentration of 70% or less, and propanol is generally used at a concentration of 30% or less. When regeneration is performed using a column, an ethanol or propanol solution is generally added to 300 to 750 mL, preferably about 750 mL to 75 mL of an adsorption carrier, and then distilled water is generally added to 150 to 225 mL. Desirably about 300 mL is added. The addition rate of the solution added to regenerate the adsorption carrier may be any rate as long as the solution and the adsorption carrier are brought into necessary and sufficient contact with each other, but a rate of about 40 cm / H is generally adopted. The In addition, any adsorption carrier regeneration method generally employed in column chromatography can be used as appropriate. The adsorbent carrier regenerated in this way is repeatedly used in the method for producing a purified antigen of the present invention. For example, in the case of purification of tetanus toxin, it can be used repeatedly at least 50 times.
[0023]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail and specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
Example 1
First, a tetanus toxin culture solution as a starting material was obtained by culturing a tetanus strain Harvard strain in a liquid medium under nitrogen aeration for 5 days. To this tetanus culture solution, 165 g of ammonium sulfate per liter of the culture solution was added and stirred well to make the toxin sufficiently hydrophobic.
Next, 75 mL of the gel was packed in an upper adapter movable column (height: 100 cm, column diameter: 25 mm) dedicated for this chromatography so that the gel height would be 15 cm when allowed to stand. Thereafter, a 1.25 mol / L ammonium sulfate solution was flowed upward from the bottom of the column at a linear velocity of 200 cm / h to equilibrate the gel and simultaneously float the gel to form a stable floating fluidized bed. At this time, the adapter at the top of the column was raised to 60 cm so that the gel was sufficiently floated and a fluidized bed was formed. Further, the uppermost part of the floating gel was stabilized at about 45 cm from the lower part of the column. After the formation of a stable floating fluidized bed, 1875 mL of a previously prepared culture solution containing ammonium sulfate was added to the column at a linear velocity of 200 cm / h from the bottom of the column.
After adding the culture solution, a 1.25 mol / L ammonium sulfate solution was flowed upward from the bottom of the column at a linear velocity of 200 cm / h, and the gel inside the column was washed while forming a stable floating fluidized bed.
After gel washing, the addition direction of the 1.25 mol / L ammonium sulfate solution to the column was switched to the opposite direction and the gel was packed to a height of 15 cm. At the same time, the upper adapter of the column that had been raised was lowered to the height of the packed gel. Thereafter, elution was carried out with a 0.01 mol / L sodium phosphate buffer to obtain a target crude purified toxin fraction.
[0024]
The resulting toxin fraction was subjected to ion exchange chromatography for further purification. The basic operation is a method referred to in textbooks and the like. More specifically, DEAE Sepharose Fast Flow gel is packed in a column at a height of 15 cm and equilibrated with 0.01 mol / L sodium phosphate buffer. The crude purified toxin diluted several times with distilled water was added and the toxin was adsorbed on the column. The purified toxin was washed with 0.01 mol / L sodium phosphate buffer containing 0.02 mol / L NaCl and eluted with 0.01 mol / L sodium phosphate buffer containing 0.15 mol / L NaCl. A fraction was obtained. This toxin fraction was added to a Sephacryl-S200HR column equilibrated with a 0.004 mol / L phosphate buffer containing 0.145 mol / L NaCl for buffer replacement, and the necessary fraction was collected. Dilute with 0.004 mol / L phosphate buffer containing 0.145 mol / L NaCl so that the toxin concentration in the fraction is 250 Lf / mL, and react with 0.3 vol% formalin at 39 ° C. for 10 days. The toxin was toxoidized. In order to concentrate toxoid and remove formalin, an ultrafiltration membrane with a molecular weight cut off of 30,000 was used to concentrate the liquid volume to about 1/10.
The purity of the toxoid purified by the present invention was an average of 2900 Lf / mg PN, which exceeded that of the toxoid purified by the conventional method. In addition, the lead time for purification alone, excluding the days of toxoidization, was greatly reduced from 21 days to 6 days (Table 1).
[Table 1]
**: Conventional tetanus toxoid including 8 steps of sterilization, zinc chloride precipitation, sodium phosphate extraction, ammonium sulfate precipitation, dialysis, (toxoidization), ion exchange chromatography, ammonium sulfate precipitation, dialysis step Means a purification method.
[0025]
【The invention's effect】
Conventional methods require purification steps such as sterilization, zinc chloride precipitation, ammonium sulfate salting out, dialysis, ion exchange chromatography, etc. to obtain highly purified antigens such as purified toxins, which take discontinuous weeks. Although it was obtained by work, in the present invention, since a simple and rapid method was invented, it can be obtained in about one week (only the purification step excluding the toxoid step).
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows a conventional method of tetanus toxoid production.
FIG. 2 is a diagram showing an example of a method for producing diphtheria toxoid.
FIG. 3 is a diagram showing an example of a method for producing a pertussis vaccine.
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