JP5501589B2 - Purification method of hyaluronic acid and / or salt thereof - Google Patents
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Description
本発明は、ヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液からヒアルロン酸及び／又はその塩（以下、総称してヒアルロン酸類という）を分離・精製する方法に関する。ヒアルロン酸は化粧品の保湿剤の他、眼科、整形外科、皮膚科等で医薬品としての用途が開かれている。 The present invention relates to a method for separating and purifying hyaluronic acid and / or a salt thereof (hereinafter collectively referred to as hyaluronic acid) from a solution containing hyaluronic acid and / or a salt thereof. Hyaluronic acid is used as a medicine in cosmetics, moisturizers, ophthalmology, orthopedics, and dermatology.
ヒアルロン酸は、動物組織、例えば、工業規模では、鶏の鶏冠等からの抽出物により製造されているが、夾雑物としてコンドロイチン硫酸が混入したり、組織内に含まれるヒアルロニダーゼ等によって低分子量化されやすい。従って高分子量で高純度に精製されたものは、コスト高になる。 Hyaluronic acid is produced by an extract from animal tissues, for example, chicken crowns on an industrial scale. However, hyaluronic acid is mixed with chondroitin sulfate as a contaminant or is reduced in molecular weight by hyaluronidase contained in the tissues. Cheap. Therefore, a product purified with high molecular weight and high purity is costly.
これら問題点を解決するため、発酵法によりヒアルロン酸を製造することが行なわれている。ヒアルロン酸がストレプトコッカス属のある群のバクテリアにより生産されることは、古くから知られ、多くの報告がある（非特許文献１及び特許文献１）。発酵法によって製造されるヒアルロン酸は、抽出法と比べ、一定の原料で、一定の方法で製造されるため、製品の品質が一定に保たれることから、産業上の利用価値は大きい。 In order to solve these problems, hyaluronic acid is produced by a fermentation method. It has been known for a long time that hyaluronic acid is produced by a group of bacteria belonging to the genus Streptococcus (Non-patent Document 1 and Patent Document 1). The hyaluronic acid produced by the fermentation method is produced by a certain method using a certain raw material as compared with the extraction method, so that the quality of the product is kept constant, and thus the industrial utility value is great.
しかしながら、発酵液には、低分子化合物が不純物として存在することから、それらを分離除去して高純度のヒアルロン酸製品を得る方法が検討されてきた。例えば、塩化セチルピリジニウム等の第４級アンモニウム塩とヒアルロン酸とのアダクトを形成させ不純物を分離し、さらにフロリジルのようなケイ酸マグネシウムのカラムに不純物を吸着させる方法がある（特許文献２）。また、マクロレティキュラー型アニオン交換樹脂を用いて、発酵液から発熱物質、蛋白質等を除去するヒアルロン酸の精製法が開示されている（特許文献３）。しかしながら、これらの精製法により得られたヒアルロン酸は、エンドトキシンの除去が不十分であり、医薬として使用することができなかった。 However, since low molecular weight compounds exist as impurities in the fermentation broth, methods for separating and removing them to obtain high-purity hyaluronic acid products have been studied. For example, there is a method in which an adduct of a quaternary ammonium salt such as cetylpyridinium chloride and hyaluronic acid is formed to separate impurities, and the impurities are adsorbed on a magnesium silicate column such as florisil (Patent Document 2). Moreover, the refinement | purification method of hyaluronic acid which removes a pyrogen, a protein, etc. from a fermented liquid using a macroreticular type anion exchange resin is disclosed (patent document 3). However, hyaluronic acid obtained by these purification methods has not been able to remove endotoxin and cannot be used as a medicine.
本発明者らは、ヒアルロン酸類を精製する方法についてさらなる検討を行い、エンドトキシン、蛋白質、核酸等を除去するためにヒアルロン酸類含有液をアルミナに接触させる方法（特許文献４）及びヒアルロン酸類含有液をアルミナに接触させた後、シリカゲルに接触させる方法について提案した（特許文献５）。しかしながら、これらの方法においても、工業的規模で医薬品として使用できる高純度のヒアルロン酸類を得るには、（ｉ）不純物のアルミナ、シリカゲル等への吸着量が少ないので、アルミナやシリカゲルを多量に消費する、（ｉｉ）ヒアルロン酸類の回収率が低い、などの課題が残っていた。 The present inventors have further studied a method for purifying hyaluronic acid, and in order to remove endotoxin, protein, nucleic acid, etc., a method of contacting a hyaluronic acid-containing solution with alumina (Patent Document 4) and a hyaluronic acid-containing solution After contacting with alumina, a method of contacting with silica gel was proposed (Patent Document 5). However, even in these methods, in order to obtain high-purity hyaluronic acids that can be used as pharmaceuticals on an industrial scale, (i) since the amount of impurities adsorbed on alumina, silica gel, etc. is small, a large amount of alumina or silica gel is consumed. However, (ii) the recovery rate of hyaluronic acids is low, and other problems remain.
また、強塩基性イオン交換樹脂を用いてエンドトキシンを含む溶液からヒアルロン酸を精製する方法が開示されている（特許文献６）。しかしながら、この方法を用いてエンドトキシンを除去する場合、プレチャージした後にＮａＣｌの濃度勾配で溶出し、分画するという操作が必要となり、エンドトキシン除去を目的とするプロセスとしては操作が煩雑かつ効率が悪いので、工業的規模でヒアルロン酸類を精製するのには適さなかった。 In addition, a method for purifying hyaluronic acid from a solution containing endotoxin using a strongly basic ion exchange resin is disclosed (Patent Document 6). However, when endotoxin is removed using this method, it is necessary to perform pre-charging, elution with a NaCl concentration gradient, and fractionation, and the process for removing endotoxin is complicated and inefficient. Therefore, it was not suitable for purifying hyaluronic acids on an industrial scale.
さらに、ポリカチオンのマルチアタッチメント効果を利用するエンドトキシン吸着除去剤等も開発されている。しかしながら、これらのエンドトキシン吸着除去剤は、電荷の相違を利用してエンドトキシンを含む蛋白質含有液から蛋白質を精製する目的で開発されたものであり、ヒアルロン酸がエンドトキシンと同様にポリアニオンであることから、ヒアルロン酸含有液からのエンドトキシン除去効率は、蛋白質のそれと同程度を期待することはできない（非特許文献２）。
そこで、工業的規模で実施可能な方法であって、かつ医薬として利用可能なヒアルロン酸類を精製できる方法の開発が望まれていた。本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、簡便に医薬として利用可能なヒアルロン酸類を分離・精製することができ、工業的規模で実施できる方法を提供することを目的とする。 Therefore, development of a method that can be carried out on an industrial scale and that can purify hyaluronic acid that can be used as a medicine has been desired. This invention is made | formed in view of the said situation, and it aims at providing the method which can isolate | separate and refine | purify hyaluronic acid which can be utilized as a pharmaceutical simply, and can be implemented on an industrial scale.
本発明者らは、ヒアルロン酸類を高純度に精製する簡便な方法の開発という課題について、これまでにヒアルロン酸類含有液をアルミナに接触させる方法、ヒアルロン酸類含有液をアルミナに接触させた後にシリカゲルに接触させる方法、強塩基性イオン交換樹脂を用いてヒアルロン酸類を精製する方法などを検討してきた。しかしながら、何れの方法も、工業的規模で利用するには操作が煩雑、もしくは、医薬として使用できる程度までヒアルロン酸類を精製できないなど、課題を解決するには至らなかった。
そこで、本発明者らは、主として研究されている、電荷の違いを利用したヒアルロン酸類の精製方法から発想を転換し、当業者の間では、通常水系で使用されないこと及び担体が比較的高価であるという事実によりヒアルロン酸の精製には適さないと考えられていた逆相クロマトグラフィーを用いてヒアルロン酸類の精製を試みた。その結果、逆相クロマトグラフィーを用いてエンドトキシンを含むヒアルロン酸類含有液からヒアルロン酸類の精製が可能であることが見出された。さらなる鋭意検討の結果、従来の方法に比較して非常に効率的にその目的が達せられる方法を見出し、本発明を完成するに至った。
As for the problem of developing a simple method for purifying hyaluronic acid with high purity, the present inventors have so far made a method of contacting a hyaluronic acid-containing liquid with alumina, contacting a hyaluronic acid-containing liquid with alumina, and then applying it to silica gel. A method of contacting and a method of purifying hyaluronic acids using a strongly basic ion exchange resin have been studied. However, none of these methods have solved the problems such as complicated operations for use on an industrial scale, or the inability to purify hyaluronic acids to the extent that they can be used as pharmaceuticals.
Therefore, the present inventors changed the idea from the method of purification of hyaluronic acids utilizing the difference in charge, which has been mainly studied, and among those skilled in the art, the present invention is not normally used in an aqueous system and the carrier is relatively expensive. Attempts were made to purify hyaluronic acids using reverse phase chromatography, which was thought to be unsuitable for the purification of hyaluronic acid due to the fact that it was. As a result, it has been found that hyaluronic acid can be purified from a hyaluronic acid-containing solution containing endotoxin using reverse phase chromatography. As a result of further intensive studies, the inventors have found a method that can achieve the object very efficiently as compared with the conventional method, and have completed the present invention.
すなわち、本発明は、ヒアルロン酸及び／又はその塩の精製方法であって、前記精製方法は、ヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液を、逆相クロマトグラフィー用充填剤に接触させる工程を含んでなり、前記逆相クロマトグラフィー用充填剤は、担体に鎖長が炭素数８以上の置換又は未置換の炭化水素基を結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤であることを特徴とする、ヒアルロン酸及び／又はその塩の精製方法を提供する。本発明は、ヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液を、担体に鎖長が炭素数８以上の置換又は未置換の炭化水素基を結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤に接触させるため、ヒアルロン酸及び／又はその塩が精製される。 That is, the present invention is a method for purifying hyaluronic acid and / or a salt thereof, and the purification method includes a step of bringing a liquid containing hyaluronic acid and / or a salt thereof into contact with a packing material for reverse phase chromatography. Wherein the packing material for reverse phase chromatography is a packing material for reverse phase chromatography in which a substituted or unsubstituted hydrocarbon group having a chain length of 8 or more carbon atoms is bound to a carrier, Provided is a method for purifying hyaluronic acid and / or a salt thereof. In the present invention, a solution containing hyaluronic acid and / or a salt thereof is brought into contact with a filler for reversed phase chromatography in which a substituted or unsubstituted hydrocarbon group having a chain length of 8 or more carbon atoms is bonded to a carrier. Hyaluronic acid and / or its salts are purified.
本発明の方法によれば、エンドトキシン、蛋白質、核酸等の除去された高純度なヒアルロン酸類を、簡便かつ高収率かつ工業的規模で製造することができる。またこの方法で得られたヒアルロン酸類は医薬用途、特にエンドトキシン量が低いことが必須となる関節への注射剤などに用いることができる。 According to the method of the present invention, high-purity hyaluronic acids from which endotoxins, proteins, nucleic acids and the like have been removed can be produced simply, at a high yield and on an industrial scale. The hyaluronic acids obtained by this method can be used for pharmaceutical purposes, particularly for joint injections where low endotoxin levels are essential.
さらに、本発明は、逆相クロマトグラフィー用充填剤として、担体に置換又は未置換のオクタデシル基及び／又はこれらの末端を改変した官能基を結合させたものを用いてもよい。置換又は未置換のオクタデシル基及び／又はこれらの末端を改変した官能基を結合させた担体を用いることにより、より高純度なヒアルロン酸及び／又はその塩の精製が実施可能となる。 Furthermore, in the present invention, as a filler for reverse phase chromatography, a carrier in which a substituted or unsubstituted octadecyl group and / or a functional group whose terminal is modified is bonded to a carrier may be used. By using a carrier to which a substituted or unsubstituted octadecyl group and / or a functional group whose terminal is modified is bound, purification of higher-purity hyaluronic acid and / or a salt thereof can be performed.
本実施形態のヒアルロン酸類は、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の塩、又はヒアルロン酸とヒアルロン酸の塩の混合物を包含してもよい。ヒアルロン酸類の由来は特に限定されないが、一定の原料で、一定の方法で製造されるため、製品の品質を一定に保持しやすい発酵法により生産されたものが好ましい。 The hyaluronic acids of this embodiment may include hyaluronic acid, hyaluronic acid salts, or a mixture of hyaluronic acid and hyaluronic acid salts. Although the origin of hyaluronic acid is not particularly limited, it is preferably produced by a fermentation method that easily keeps the quality of the product constant because it is produced by a certain method using a certain raw material.
発酵法によるヒアルロン酸はストレプトコッカス属のバクテリアを使用して既知の方法で得ることができる。発酵法で使用する菌株は、自然界から分離されるストレプトコッカス属等のヒアルロン酸生産能を有する微生物、または、特許文献１に記したストレプトコッカス・エキＦＭ−１００（微工研菌寄９０２７号）のような高収率で安定にヒアルロン酸を生産する変異株が望ましい。 Hyaluronic acid obtained by fermentation can be obtained by a known method using bacteria belonging to the genus Streptococcus. The strain used in the fermentation method is a microorganism having the ability to produce hyaluronic acid such as Streptococcus genus isolated from the natural world, or Streptococcus ex FM-100 described in Patent Document 1 (No. 9027 by Kogyokenbyo). A mutant that stably produces hyaluronic acid at a high yield is desirable.
そのようなヒアルロン酸生産能を有する微生物をグルコース、シュークロース等の炭素源、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス等の窒素源、ビタミン、無機塩等を用いた培地中で好気的に培養して得られる培養液を、ヒアルロン酸が０．１〜５ｇ／Ｌ濃度になるように希釈後、既知の方法、例えば遠心分離、濾過、凝集剤、カーボン、ゼオライト等などの方法で除菌した液を逆相クロマトグラフィー用充填剤に接触させることによりヒアルロン酸類を精製することが可能である。 Obtained by aerobically cultivating microorganisms capable of producing such hyaluronic acid in a medium using carbon sources such as glucose and sucrose, nitrogen sources such as peptone, polypeptone, and yeast extract, vitamins, inorganic salts, etc. The resulting culture solution is diluted so that the concentration of hyaluronic acid is 0.1 to 5 g / L, and then sterilized by a known method such as centrifugation, filtration, flocculant, carbon, zeolite, etc. Hyaluronic acids can be purified by contacting with a packing material for phase chromatography.
医薬品として使用できるヒアルロン酸類を製造する場合には、上記の除菌液を更に精製処理した後に逆相クロマトグラフィー用充填剤に接触させることが望ましい。この精製処理としては、透析処理による低分子化合物の除去、精密濾過処理による水不溶微粒子の除去、アルコール、アセトン、ジオキサン等の水溶性有機溶剤添加による析出分離後の再溶解、等を挙げることができ、これら処理は、単独あるいは組み合わせて実施することができる。ここで、「医薬品として使用できる」ヒアルロン酸類は、エンドトキシン、蛋白質、核酸等の不純物を実質的に含有しない。なお、「実質的に含有しない」とは、不純物が一分子も含まれないことを意味するのではなく、不純物が含まれていないと当業者に認識される程度（現在の技術では検出できない程度、もしくは目的の用途に影響が出ない程度）を意味するものである。仮に、将来的に分析技術が進歩して分子単位での検出が可能になったとしても、本願における「実質的に含有しない」とは、本願における記載に基づいて解釈すべきである。例えば、「医薬として使用できる」ヒアルロン酸類中の蛋白質含有率は、０．０５％以下であることを意味する。また、「医薬品として使用できる」ヒアルロン酸類中のエンドトキシン含有量は、例えば、ヒアルロン酸１ｍｇ中０．０５ＥＵ以下（０．０５ＥＵ／ｍｇ）、好ましくは０．０３ＥＵ／ｍｇ以下、０．０１ＥＵ／ｍｇ以下、０．００５ＥＵ／ｍｇ以下、０．００３ＥＵ／ｍｇ以下、０．００２ＥＵ／ｍｇ以下、又は０．００１ＥＵ／ｍｇ以下である。また、「関節への注射剤として使用できる」ヒアルロン酸類中のエンドトキシン含有量は、０．０１ＥＵ／ｍｇ以下、又は０．００５ＥＵ／ｍｇ以下である。また、「医薬品として使用できる」ヒアルロン酸類中の核酸含有量は、０．１％以下、もしくは検出限界以下の含有量である。 When producing hyaluronic acids that can be used as pharmaceuticals, it is desirable to further purify the above-mentioned sterilizing solution and then contact it with a packing for reverse phase chromatography. Examples of this purification treatment include removal of low-molecular compounds by dialysis treatment, removal of water-insoluble fine particles by microfiltration treatment, re-dissolution after precipitation separation by adding a water-soluble organic solvent such as alcohol, acetone, dioxane, etc. These processes can be carried out singly or in combination. Here, hyaluronic acids that can be used as pharmaceuticals are substantially free of impurities such as endotoxins, proteins, and nucleic acids. Note that “substantially free” does not mean that no single molecule of impurities is contained, but to the extent that a person skilled in the art recognizes that no impurities are contained (a level that cannot be detected by current technology). Or the extent to which the intended use is not affected. Even if analysis technology advances in the future and detection on a molecular basis becomes possible, “substantially free” in the present application should be interpreted based on the description in the present application. For example, the protein content in hyaluronic acid “can be used as a medicine” means 0.05% or less. The endotoxin content in hyaluronic acids that can be used as pharmaceuticals is, for example, 0.05 EU or less (0.05 EU / mg), preferably 0.03 EU / mg or less, 0.01 EU / mg or less in 1 mg of hyaluronic acid. 0.005 EU / mg or less, 0.003 EU / mg or less, 0.002 EU / mg or less, or 0.001 EU / mg or less. Moreover, the endotoxin content in the hyaluronic acids “can be used as an injection for joints” is 0.01 EU / mg or less, or 0.005 EU / mg or less. In addition, the nucleic acid content in hyaluronic acids that can be used as pharmaceuticals is 0.1% or less, or a content that is below the detection limit.
本実施形態において用いられる逆相クロマトグラフィー用充填剤の担体は、シリカゲル又は、ポリビニルアルコール等の合成樹脂の球状又は破砕状のものが好ましく、その平均粒径は、１μｍから約１００μｍのものが好ましく、より好ましくは１０μｍから約５０μｍのものである。当業者であれば、平均粒径が小さいほど単位長あたりのカラム理論段数は大きくなるが、カラムの圧力損失も大きくなることなどを考慮して、適した粒径を選択することができる。また、本実施形態において用いられる逆相クロマトグラフィー用充填剤は、担体に、置換又は未置換の炭化水素基を結合させたものであり、特に鎖長が炭素数８以上のものを用いることを特徴とする。その例として、オクチル基、オクタデシル基、およびこれらの末端を改変した官能基等が挙げられるが、これらに制限されるものではない。また、炭化水素基の鎖長の炭素数が大きいほど強い保持力を有するので、当業者であれば、炭化水素基の鎖長の炭素数を調節することで、固定相における保持力を調節することができる。また、官能基として、フェニル基、ジオール基、ニトリル基、アミノ基などを用いて固定相の極性を調節することもできる。 The carrier of the filler for reverse phase chromatography used in this embodiment is preferably a spherical or crushed synthetic resin such as silica gel or polyvinyl alcohol, and the average particle size is preferably 1 μm to about 100 μm. More preferably from 10 μm to about 50 μm. A person skilled in the art can select a suitable particle size in consideration of the fact that the smaller the average particle size, the larger the theoretical number of columns per unit length, but the greater the pressure loss of the column. Further, the packing material for reverse phase chromatography used in the present embodiment is obtained by bonding a substituted or unsubstituted hydrocarbon group to a support, and in particular, a chain having a chain length of 8 or more is used. Features. Examples thereof include, but are not limited to, an octyl group, an octadecyl group, and a functional group obtained by modifying these ends. In addition, since the larger the carbon number of the hydrocarbon group chain length, the stronger the holding power, those skilled in the art adjust the holding power in the stationary phase by adjusting the carbon number of the hydrocarbon group chain length. be able to. Moreover, the polarity of a stationary phase can also be adjusted using a phenyl group, a diol group, a nitrile group, an amino group, etc. as a functional group.
鎖長が炭素数8以下の置換又は未置扱の炭化水素基として、例えばトリメチル基、ブチル基、フェニル基、シアノプロピル基、アミノプロピル基等が挙げられるが、後述の実施例に示すように、これらはヒアルロン酸の精製には適さない。 Examples of the substituted or untreated hydrocarbon group having a chain length of 8 or less carbon atoms include a trimethyl group, a butyl group, a phenyl group, a cyanopropyl group, an aminopropyl group, and the like. These are not suitable for the purification of hyaluronic acid.
本実施形態に適するものとして、例えば市販されているオクチル基をシリカゲルに化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤〔YMC・GEL C8−120−S5（YMC製）〕、〔YMC・GEL C8−300−S5（YMC製）〕、オクタデシル基をシリカゲルに化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤〔YMC・GEL ODS−AM−120−S50（YMC製）〕、〔YMC・GEL ODS−A120−S30／50（YMC製）〕、〔YMC・GEL ODS−AQ60−S50（YMC製）〕、〔YMC・GEL ODS−AQ−120−S50（YMC製）〕、オクタデシル基を合成樹脂に化学的に結合させた充填剤〔TSK-GEL Octadecyl−4PW（30）（東ソー製）〕などが挙げられる。これらの充填剤は、品質が安定しており、かつ入手が容易である点で適しているが、これらに制限されるものではない。 As suitable for the present embodiment, for example, reverse phase octyl commercially available chemically bonded to the silica gel filler for chromatography [YMC · GEL C 8 -120-S5 ( manufactured by YMC)], [YMC · GEL C 8 -300-S5 (manufactured by YMC)], filler for reverse phase chromatography in which octadecyl group is chemically bonded to silica gel [YMC ・ GEL ODS-AM-120-S50 (manufactured by YMC)], [YMC・ GEL ODS-A120-S30 / 50 (YMC)], [YMC ・ GEL ODS-AQ60-S50 (YMC)], [YMC ・ GEL ODS-AQ-120-S50 (YMC)], octadecyl group Examples include a filler [TSK-GEL Octadecyl-4PW (30) (manufactured by Tosoh)] chemically bonded to a synthetic resin. These fillers are suitable in terms of stable quality and easy availability, but are not limited thereto.
逆相クロマトグラフィー用充填剤に接触させる溶媒は、水及び有機溶媒、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、アセトニトリル、酢酸エチル、ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）もしくはＤＭＳＯなどの混合溶媒系に塩を含むものが一般的に用いられる。水を用いることにより、溶媒の極性が増大することから、本実施形態においては、塩を含むヒアルロン酸類水溶液を逆相クロマトグラフィー用充填剤に接触させることが特に良い。 Solvents contacted with the packing for reverse phase chromatography include salts in water and organic solvents such as methanol, ethanol, propanol, isopropanol, acetonitrile, ethyl acetate, dioxane, tetrahydrofuran (THF) or DMSO. Is generally used. Since the polarity of the solvent is increased by using water, in this embodiment, it is particularly preferable to contact the aqueous solution of hyaluronic acid containing a salt with the packing material for reverse phase chromatography.
本実施形態では、硫安、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の塩を用いて、溶媒のｐＨを調節することができるが、これらに制限されるものではない。 In this embodiment, the pH of the solvent is adjusted using a salt such as ammonium sulfate, sodium citrate, potassium citrate, potassium phosphate, sodium phosphate, sodium sulfate, potassium sulfate, magnesium sulfate, sodium chloride, or potassium chloride. However, it is not limited to these.
溶媒の塩濃度により、保持力が変化することが知られているが、本実施形態において、ヒアルロン酸類含有液を逆相クロマトグラフィー用充填剤に接触させるに当たり、ヒアルロン酸類含有液は、水系で、塩濃度は５〜３０００ｍＭがよく、より好ましくは、１０〜１０００ｍＭがよい。 Although it is known that the holding power varies depending on the salt concentration of the solvent, in the present embodiment, when the hyaluronic acid-containing liquid is brought into contact with the filler for reverse phase chromatography, the hyaluronic acid-containing liquid is an aqueous system, The salt concentration is preferably 5 to 3000 mM, more preferably 10 to 1000 mM.
また、溶媒のｐＨを調整することにより、溶質のイオン化を制御することができるが、本実施形態のｐＨは、３〜８が好ましく、６〜８が特に好ましい。 Moreover, although ionization of a solute can be controlled by adjusting the pH of the solvent, the pH of this embodiment is preferably from 3 to 8, and more preferably from 6 to 8.
また、温度を一定にすることにより安定した成績を得ることが可能であるが、本実施形態における温度は０〜４０℃が好ましく、より好ましくは１０〜３０℃がよい。 Moreover, although it is possible to obtain a stable result by making temperature constant, 0-40 degreeC is preferable and the temperature in this embodiment has more preferable 10-30 degreeC.
また、ヒアルロン酸類の濃度を調整することにより、効率的に精製することができるが、本実施形態のヒアルロン酸類の濃度は、０．１〜５ｇ／Ｌが好ましく、より好ましくは０．５〜２ｇ／Ｌである。 Moreover, although it can refine | purify efficiently by adjusting the density | concentration of hyaluronic acid, 0.1-5 g / L is preferable as the density | concentration of the hyaluronic acid of this embodiment, More preferably, it is 0.5-2 g. / L.
逆相クロマトグラフィー用充填剤に接触させる方法としては、ヒアルロン酸類含有液に逆相クロマトグラフィー用充填剤を添加して、バッチ式で撹拌する方法と、充填塔等に充填後にヒアルロン酸類含有液を通液処理する方法、またその組合せや反復も可能であるが、通常は、処理条件の選択により、１回の処理で十分である。 As a method of contacting with a packing for reverse phase chromatography, a method for adding a packing for reverse phase chromatography to a hyaluronic acid-containing liquid and stirring it in a batch system, and a method for adding a hyaluronic acid containing liquid after packing into a packed tower, etc. Although it is possible to perform the flow-through treatment, and combinations or repetitions thereof, one treatment is usually sufficient depending on the selection of treatment conditions.
エンドトキシン、蛋白質、核酸等の不純物を除去する能力の低下した逆相クロマトグラフィー用充填剤は、通常の脱着、洗浄、再生処理で簡単に初期の性能に回復させることが出来る。アルカリ洗浄を行う場合、担体の材質としてシリカゲルを用いると、シリカゲルは塩基性条件下で溶解してしまうことから、合成樹脂を用いることが好ましい。 The filler for reversed phase chromatography having a reduced ability to remove impurities such as endotoxin, protein and nucleic acid can be easily restored to the initial performance by ordinary desorption, washing and regeneration treatment. When alkali cleaning is performed, if silica gel is used as a material for the carrier, silica gel is dissolved under basic conditions. Therefore, it is preferable to use a synthetic resin.
本実施形態の方法は、工業的規模で実施可能であるが、ここでいう「工業的規模」とは、例えば、少なくとも１００ｋｇ／年以上の規模でヒアルロン酸類を精製できることをいう。もしくは、０．１ｋｇ／時間以上の精製効率でヒアルロン酸類を精製可能であることをいう。また、コストを考慮しても、産業的に利用可能であることをいう。 Although the method of this embodiment can be implemented on an industrial scale, the “industrial scale” referred to here means that, for example, hyaluronic acids can be purified on a scale of at least 100 kg / year or more. Alternatively, it means that hyaluronic acids can be purified with a purification efficiency of 0.1 kg / hour or more. Moreover, even if cost is considered, it means that it can utilize industrially.
逆相クロマトグラフィー用充填剤に接触させたヒアルロン酸類含有液は、必要ならば、pH調整や孔径０．２〜１μｍのメンブレンフィルターを用いる精密濾過を行なった後、有機溶剤沈殿法で分離後、真空乾燥等により、乾燥品とすることができる。 The hyaluronic acid-containing liquid contacted with the reverse phase chromatography filler is subjected to pH adjustment or microfiltration using a membrane filter having a pore size of 0.2 to 1 μm, if necessary, and then separated by an organic solvent precipitation method. A dried product can be obtained by vacuum drying or the like.
以下に本実施形態の精製方法の作用効果について説明する。
本実施形態の精製方法は、ヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液を、担体に鎖長が炭素数8以上の置換又は未置換の炭化水素基を結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤に接触させるため、ヒアルロン酸及び／又はその塩が精製される。
Below, the effect of the purification method of this embodiment is demonstrated.
The purification method of the present embodiment uses a hyaluronic acid and / or salt-containing liquid as a packing for reversed-phase chromatography in which a substituted or unsubstituted hydrocarbon group having a chain length of 8 or more carbon atoms is bound to a carrier. For contacting, the hyaluronic acid and / or its salt is purified.
また、実施形態の精製方法は、ヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液が、その他の塩を含む場合であってもヒアルロン酸及び／又はその塩を精製できる。そのため、鶏の鶏冠等からの抽出物や発酵法により生産されたヒアルロン酸及び又はその塩の含有液のｐＨをその他の塩で調節することができ、効率的にヒアルロン酸及び／又はその塩を精製することができる。 In addition, the purification method of the embodiment can purify hyaluronic acid and / or its salt even when the liquid containing hyaluronic acid and / or its salt contains other salts. Therefore, it is possible to adjust the pH of the liquid containing hyaluronic acid and / or its salt produced by an extract from a chicken's crown or the like by a fermentation method, and efficiently use hyaluronic acid and / or its salt. Can be purified.
さらに、実施形態の精製方法は、エンドトキシンを含むヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液から、ヒアルロン酸及び／又はその塩を精製することができる。そのため、例えば、ヒアルロン酸及び／又はその塩の生産においてエンドトキシンが混入する場合であっても、ヒアルロン酸及び／又はその塩を精製することができる。 Furthermore, the purification method of embodiment can refine | purify hyaluronic acid and / or its salt from the liquid containing hyaluronic acid and / or its salt containing endotoxin. Therefore, for example, even when endotoxin is contaminated in the production of hyaluronic acid and / or its salt, hyaluronic acid and / or its salt can be purified.
さらに、実施形態の精製方法は、逆相クロマトグラフィー用充填剤として、担体に置換又は未置換のオクタデシル基及び／又はこれらの末端を改変した官能基を結合させたものを用いてもよい。置換又は未置換のオクタデシル基及び／又はこれらの末端を改変した官能基を結合させた担体を用いることにより、より高純度なヒアルロン酸及び／又はその塩の精製が実施可能となる。 Further, in the purification method of the embodiment, as a packing material for reverse phase chromatography, a carrier in which a substituted or unsubstituted octadecyl group and / or a functional group whose terminal is modified is bonded to a carrier may be used. By using a carrier to which a substituted or unsubstituted octadecyl group and / or a functional group whose terminal is modified is bound, purification of higher-purity hyaluronic acid and / or a salt thereof can be performed.
さらに、実施形態の精製方法は、逆相クロマトグラフィー用充填剤の担体として合成樹脂を用いてもよい。合成樹脂は幅広いｐＨの範囲で用いることができるため、ヒアルロン酸及び／又はその塩の精製において、移動相として塩基性溶媒や酸性溶媒を用いることもできる。 Furthermore, in the purification method of the embodiment, a synthetic resin may be used as a carrier for the filler for reverse phase chromatography. Since synthetic resins can be used in a wide pH range, a basic solvent or an acidic solvent can be used as a mobile phase in purification of hyaluronic acid and / or a salt thereof.
さらに、実施形態の精製方法は、医薬として使用できるヒアルロン酸を精製することもできる。本発明の精製方法は、エンドトキシン、蛋白質、核酸等を除去することができるため、ヒアルロン酸及び／又はその塩を医薬用途に用いることができる。 Furthermore, the purification method of the embodiment can also purify hyaluronic acid that can be used as a medicine. Since the purification method of the present invention can remove endotoxin, protein, nucleic acid and the like, hyaluronic acid and / or a salt thereof can be used for pharmaceutical use.
以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示に過ぎない。 As mentioned above, although embodiment of this invention was described, these are only illustrations of this invention.
以下、本発明を参考例及び実施例により更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
［参考例］
粗製ヒアルロン酸ナトリウムの製造
ストレプトコツカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄第９０２７号）を用いて培養した培養液１５Ｌを純水で５０Ｌに希釈し（ヒアルロン酸ナトリウム濃度１．１０ｇ／Ｌ）、遠心分離、ホローファイバー型限外濾過を行い、菌体と培地成分を除いた。
このヒアルロン酸類含有液５００ｍＬに食塩１５ｇを溶解、ｐＨ７に調節後、エタノール７５０ｍＬで析出、エタノール１００ｍＬで洗浄を行い、４０℃で真空乾燥し、０．５ｇの粗製ヒアルロン酸ナトリウムを得た。
分析結果を表１に示す。
Hereinafter, although a reference example and an example explain the present invention still more concretely, the present invention is not limited to these.
[Reference example]
Manufacture of crude sodium hyaluronate 15 L of a culture solution cultured using Streptococcus equii FM-100 (Microtechnical Laboratories No. 9027) was diluted to 50 L with pure water (sodium hyaluronate concentration 1.10 g / L) ), Centrifugation, and hollow fiber ultrafiltration were performed to remove cells and medium components.
15 g of sodium chloride was dissolved in 500 mL of this hyaluronic acid-containing solution, adjusted to pH 7, precipitated with 750 mL of ethanol, washed with 100 mL of ethanol, and vacuum dried at 40 ° C. to obtain 0.5 g of crude sodium hyaluronate.
The analysis results are shown in Table 1.
［実施例１］
参考例で得られた粗製ヒアルロン酸ナトリウム１ｇを、１Ｌの５０ｍＭの塩化ナトリウム溶液に溶解し、オクチル基をシリカゲルに化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤（YMC・GEL C8−120−S5、YMC製）を３０ｇ添加して３０分撹拌した。
その後、０．４５μｍの精密濾過膜で濾過処理を行なった。得られた液に食塩３０ｇを溶解し、ｐＨ７に調整後、エタノール２Ｌで析出し、エタノール３００ｍＬでの洗浄を３回行い４０℃で真空乾燥して０．９ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。
分析結果を表１に示す。
[Example 1]
1 g of crude sodium hyaluronate obtained in Reference Example was dissolved in 1 L of 50 mM sodium chloride solution, and the filler for reverse phase chromatography (YMC · GEL C 8 -120) in which octyl group was chemically bonded to silica gel -S5, manufactured by YMC) was added and stirred for 30 minutes.
Thereafter, filtration was performed with a 0.45 μm microfiltration membrane. 30 g of sodium chloride was dissolved in the obtained liquid, adjusted to pH 7, precipitated with 2 L of ethanol, washed with 300 mL of ethanol three times and vacuum dried at 40 ° C. to obtain 0.9 g of sodium hyaluronate.
The analysis results are shown in Table 1.
［実施例２］
参考例で得られた粗製ヒアルロン酸ナトリウム１ｇを、１Ｌの５０ｍＭの塩化ナトリウム溶液に溶解し、オクタデシル基をシリカゲルに化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤（YMC・GEL ODS−AQ−120−S50、YMC製）を３０ｇ添加して３０分撹拌した。その後０．４５μｍの精密濾過膜で濾過処理を行なった。
得られた液は、実施例１と同様に処理し、０．９ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表１に示す。
[Example 2]
1 g of crude sodium hyaluronate obtained in Reference Example was dissolved in 1 L of 50 mM sodium chloride solution, and octadecyl group was chemically bonded to silica gel (YMC · GEL ODS-AQ- 120-S50 (manufactured by YMC) was added and stirred for 30 minutes. Thereafter, filtration was performed with a 0.45 μm microfiltration membrane.
The obtained liquid was treated in the same manner as in Example 1 to obtain 0.9 g of sodium hyaluronate. The analysis results are shown in Table 1.
［比較例１］
参考例で得られた粗製ヒアルロン酸ナトリウム１ｇを、１Ｌの３０Ｖ／Ｖ％エタノール水溶液に溶解し、アルミナ（昭和電工製）を３０ｇ添加して３０分撹拌した。その後、０．４５μｍの精密濾過膜で濾過処理を行なった。得られた液は、実施例１と同様に処理し、０．９ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。
分析結果を表１に示す。
[Comparative Example 1]
1 g of crude sodium hyaluronate obtained in Reference Example was dissolved in 1 L of a 30 V / V% ethanol aqueous solution, 30 g of alumina (manufactured by Showa Denko) was added, and the mixture was stirred for 30 minutes. Thereafter, filtration was performed with a 0.45 μm microfiltration membrane. The obtained liquid was treated in the same manner as in Example 1 to obtain 0.9 g of sodium hyaluronate.
The analysis results are shown in Table 1.
［比較例２］
参考例で得られた粗製ヒアルロン酸ナトリウム１ｇを、１Ｌの５０ｍＭの塩化ナトリウム溶液に溶解し、ブチル基をシリカゲルに化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤（YMC・GEL C4-120-S5、YMC製）を３０ｇ添加して３０分撹拌した。
その後０．４５μｍの精密濾過膜で濾過処理を行なった。得られた液は、実施例１と同様に処理し、０．９ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。
分析結果を表１に示す。
［表１］
1 g of crude sodium hyaluronate obtained in Reference Example was dissolved in 1 L of 50 mM sodium chloride solution, and a butyl group was chemically bonded to silica gel (YMC · GEL C 4 -120 -S5, manufactured by YMC) was added and stirred for 30 minutes.
Thereafter, filtration was performed with a 0.45 μm microfiltration membrane. The obtained liquid was treated in the same manner as in Example 1 to obtain 0.9 g of sodium hyaluronate.
The analysis results are shown in Table 1.
[Table 1]
［実施例３］
参考例で得られた粗製ヒアルロン酸ナトリウム１ｇを、１Ｌの３０Ｖ／Ｖ％エタノール水溶液に溶解し、オクタデシル基をシリカゲルに化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤（YMC・GEL ODS−AQ−120−S50、YMC製）を３０ｇ添加して３０分撹拌した。その後０．４５μｍの精密濾過膜で濾過処理を行なった。
得られた液を実施例１と同様に処理し、０．９ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表２に示す。
[Example 3]
1 g of crude sodium hyaluronate obtained in Reference Example was dissolved in 1 L of 30V / V% ethanol aqueous solution, and octadecyl group was chemically bonded to silica gel (YMC · GEL ODS-AQ -120-S50 (manufactured by YMC) was added and stirred for 30 minutes. Thereafter, filtration was performed with a 0.45 μm microfiltration membrane.
The obtained liquid was treated in the same manner as in Example 1 to obtain 0.9 g of sodium hyaluronate. The analysis results are shown in Table 2.
［実施例４］
参考例で得られた粗製ヒアルロン酸ナトリウム１ｇを、１Ｌの水溶液に溶解し、オクタデシル基をシリカゲルに化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤（YMC・GEL ODS−AQ−120−S50、YMC製）を３０ｇ添加して３０分撹拌した。その後０．４５μｍの精密濾過膜で濾過処理を行なった。得られた液を実施例１と同様に処理し、０．９ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表２に示す。
[Example 4]
1 g of crude sodium hyaluronate obtained in Reference Example was dissolved in 1 L of aqueous solution, and a filler for reverse phase chromatography in which octadecyl group was chemically bonded to silica gel (YMC · GEL ODS-AQ-120-S50, 30 g of YMC) was added and stirred for 30 minutes. Thereafter, filtration was performed with a 0.45 μm microfiltration membrane. The obtained liquid was treated in the same manner as in Example 1 to obtain 0.9 g of sodium hyaluronate. The analysis results are shown in Table 2.
［実施例５］
内径０．８ｃｍ、高さ１０ｃｍのガラスカラムに、オクタデシル基をシリカゲルに化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤（YMC・GEL ODS−AQ−120−S50、YMC製）を２０ｍＬ充填し、エタノール、水、塩化ナトリウム水溶液の順に平衡化し、参考例で得られた粗製ヒアルロン酸ナトリウム１ｇを１Ｌの５００ｍＭの塩化ナトリウム溶液に溶解し、上記カラムにＳＶ＝２０（ｈ−１）で通液した。
得られた液を実施例１と同様に処理し、０．９ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表２に示す。
[Example 5]
A glass column having an inner diameter of 0.8 cm and a height of 10 cm is packed with 20 mL of a packing for reverse phase chromatography (YMC · GEL ODS-AQ-120-S50, manufactured by YMC) in which octadecyl group is chemically bonded to silica gel. , Ethanol, water, and sodium chloride aqueous solution in this order, 1 g of crude sodium hyaluronate obtained in Reference Example was dissolved in 1 L of 500 mM sodium chloride solution, and passed through the column at SV = 20 (h −1 ). did.
The obtained liquid was treated in the same manner as in Example 1 to obtain 0.9 g of sodium hyaluronate. The analysis results are shown in Table 2.
［実施例６］
内径５ｃｍ、高さ１０ｃｍのガラスカラムに、オクタデシル基をシリカゲルに化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤（YMC・GEL ODS−AQ−120−S50、YMC製）を２００ｍＬ充填し、エタノール、水、塩化ナトリウム水溶液の順に平衡化し、参考例で得られた粗製ヒアルロン酸ナトリウム１０ｇを１０Ｌの５００ｍＭの塩化ナトリウム溶液に溶解し、上記カラムにＳＶ＝２０（ｈ−１）で通液した。
得られた液に食塩３００ｇを溶解し、ｐＨ７に調整後、エタノール２０Ｌで析出し、エタノール３Ｌでの洗浄を３回行い、４０℃で真空乾燥して、９ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。
分析結果を表２に示す。
[Example 6]
A glass column with an inner diameter of 5 cm and a height of 10 cm is filled with 200 mL of a packing for reverse phase chromatography (YMC · GEL ODS-AQ-120-S50, manufactured by YMC) in which octadecyl group is chemically bonded to silica gel, and ethanol is added. Then, 10 g of crude sodium hyaluronate obtained in Reference Example was dissolved in 10 L of a 500 mM sodium chloride solution and passed through the column at SV = 20 (h −1 ).
300 g of sodium chloride was dissolved in the obtained liquid, adjusted to pH 7, precipitated with 20 L of ethanol, washed with 3 L of ethanol three times, and vacuum-dried at 40 ° C. to obtain 9 g of sodium hyaluronate.
The analysis results are shown in Table 2.
［実施例７］
内径５ｃｍ、高さ１０ｃｍのガラスカラムに、オクタデシル基を合成樹脂に化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤（TSK−GEL Octadecyl−4PW（30）、東ソー製）を２００ｍＬ充填し、３％塩化ナトリウム水溶液で平衡化し、参考例で得られた粗製ヒアルロン酸ナトリウム２０ｇを１０Ｌの５００ｍＭの塩化ナトリウム溶液に溶解し、上記カラムにＳＶ＝２５（ｈ−１）で通液した。
得られた液に食塩３００ｇを溶解し、ｐＨ７に調整後、エタノール２０Ｌで析出し、エタノール３Ｌでの洗浄を３回行い、４０℃で真空乾燥して、９ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。
分析結果を表２に示す。
[Example 7]
200 mL of a filler for reverse phase chromatography (TSK-GEL Octadecyl-4PW (30), manufactured by Tosoh Corporation) in which an octadecyl group is chemically bonded to a synthetic resin is packed in a glass column having an inner diameter of 5 cm and a height of 10 cm. A 20% aqueous solution of sodium chloride was equilibrated and 20 g of crude sodium hyaluronate obtained in the Reference Example was dissolved in 10 L of a 500 mM sodium chloride solution and passed through the column at SV = 25 (h −1 ).
300 g of sodium chloride was dissolved in the obtained liquid, adjusted to pH 7, precipitated with 20 L of ethanol, washed with 3 L of ethanol three times, and vacuum-dried at 40 ° C. to obtain 9 g of sodium hyaluronate.
The analysis results are shown in Table 2.
［実施例８］
実施例６で使用したカラムに０．４％水酸化ナトリウム溶液を通液し、同溶液に２４時間浸漬した。３％塩化ナトリウム水溶液で平衡化し、参考例で得られた粗製ヒアルロン酸ナトリウム２０ｇを１０Ｌの５００ｍＭの塩化ナトリウム溶液に溶解し、上記カラムに再度ＳＶ＝２５（ｈ−１）で通液した。
得られた液に食塩３００ｇを溶解し、ｐＨ７に調整後、エタノール２０Ｌで析出し、エタノール３Ｌでの洗浄を３回行い、４０℃で真空乾燥して、９ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。
分析結果を表２に示す。
［表２］
A 0.4% sodium hydroxide solution was passed through the column used in Example 6 and immersed in the solution for 24 hours. Equilibrated with a 3% aqueous sodium chloride solution, 20 g of crude sodium hyaluronate obtained in Reference Example was dissolved in 10 L of a 500 mM sodium chloride solution, and again passed through the column at SV = 25 (h −1 ).
300 g of sodium chloride was dissolved in the obtained liquid, adjusted to pH 7, precipitated with 20 L of ethanol, washed with 3 L of ethanol three times, and vacuum-dried at 40 ° C. to obtain 9 g of sodium hyaluronate.
The analysis results are shown in Table 2.
[Table 2]
測定法
１）蛋白質：精製ヒアルロン酸ナトリウムを０．１Ｎ水酸化ナトリウムに溶解しローリー法にて行った。
２）エンドトキシン：生化学工業社製トキシカラーシステムにより処理液を直接比色分析することにより行った。
３）核酸：０．１％ヒアルロン酸ナトリウム溶液の２６０ｎｍにおける吸光度を測定した。
Measurement method 1) Protein: Purified sodium hyaluronate was dissolved in 0.1N sodium hydroxide, and this was carried out by the Raleigh method.
2) Endotoxin: The treatment solution was directly colorimetrically analyzed with a Toxicolor system manufactured by Seikagaku Corporation.
3) Nucleic acid: The absorbance at 260 nm of 0.1% sodium hyaluronate solution was measured.
（考察）
上記実施例は、逆相クロマトグラフィーを用いることによって、医薬として利用可能なヒアルロン酸類を分離・精製することができることを示すものである。さらに、逆相クロマトグラフィーを用いることにより、粗製ヒアルロン酸類含有液からワンパスで医薬として使用できるヒアルロン酸類が得られるため、煩雑な操作を必要とせず、効率的であり、工業的規模での精製にも適している。また、逆相クロマトグラフィーを用いた精製方法は、０．１ｋｇ／時間以上でヒアルロン酸類を精製可能であり、工業的規模で実施可能であった。
(Discussion)
The above examples show that hyaluronic acids that can be used as pharmaceuticals can be separated and purified by using reverse phase chromatography. Furthermore, by using reverse-phase chromatography, hyaluronic acids that can be used as pharmaceuticals in one pass can be obtained from crude hyaluronic acid-containing liquids. Is also suitable. Moreover, the purification method using reverse phase chromatography can purify hyaluronic acids at 0.1 kg / hour or more, and can be carried out on an industrial scale.
以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。 In the above, this invention was demonstrated based on the Example. It is to be understood by those skilled in the art that this embodiment is merely an example, and that various modifications are possible and that such modifications are within the scope of the present invention.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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