JP2004292465A - Conjugate of hydroxamic acid derivative and hyaluronic acid - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a conjugate of a hydroxamic acid derivative and hyaluronic acid which has an inhibitory action against matrix metalloprotease (MMP). <P>SOLUTION: In the conjugate, a group of formula (1) (wherein R<SB>1</SB>is a hydrogen atom, a hydroxy group, an alkyl group or an alkoxy group; R<SB>2</SB>and R<SB>3</SB>are each a linear or branched alkyl group; R<SB>4</SB>is a hydrogen atom or an alkyl group; R<SB>5</SB>is -R<SB>7</SB>-R<SB>8</SB>-R<SB>9</SB>-; R<SB>6</SB>is a hydrogen atom or an alkyl group; R<SB>7</SB>is a linear or branched alkylene group; R<SB>8</SB>is a methylene group, an imino group or an oxygen atom; R<SB>9</SB>is an alkylene group optionally having 1-3 oxygen atoms; and R<SB>1</SB>and R<SB>3</SB>may optionally form a ring) is bonded to a hydroxy group in hyaluronic acid, its derivative or their salts forming a carbamate bond. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

【００１９】
（式中、
Ｒ_１は、水素原子、水酸基、炭素数１〜８の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基、炭素数１〜８の直鎖もしくは分枝鎖状のアルコキシ基、または炭素数２〜８の直鎖もしくは分枝鎖状のアルケニル基を表し；
Ｒ_２は、炭素数３〜１０のシクロアルキル基によってもしくは炭素数６〜１４のアリ−ル基によって置換されていてもよい炭素数１〜８の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基を表し；
Ｒ_３は、炭素数３〜１０のシクロアルキル基によってもしくは炭素数６〜１４のアリ−ル基によって置換されていてもよい炭素数１〜８の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基を表し；
Ｒ_４は、水素原子、または炭素数１〜４の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基を表し；
Ｒ_５は、−Ｒ_７−Ｒ_８−Ｒ_９−を表し、ここで、
Ｒ_７は、炭素数１〜８の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキレン基を表し、
Ｒ_８は、炭素数１〜４の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基で置換されていてもよいメチレン基もしくはイミノ基、または酸素原子を表し、
Ｒ_９は、１〜３個の酸素原子が挿入されていてもよい炭素数１〜１０の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキレン基を表す；
Ｒ_６は、水素原子、または炭素数１〜４の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基を表す；
また、Ｒ_１とＲ_３は環を形成してもよい。）
で表される基と、ヒアルロン酸もしくはヒアルロン酸誘導体またはそれらの塩の水酸基とが、カーバメート（ｃａｒｂａｍａｔｅ）結合により結合している結合体を提供する。
【００２０】
また、本発明は、式（８）
【００２１】
【化１１】

【００２２】
で表される化合物、カルボジイミド類、およびヒアルロン酸を反応させ、活性化ヒアルロン酸を得る工程と；その活性化ヒアルロン酸と式（９）
【００２３】
【化１２】

【００２４】
（式中、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５およびＲ_６は、請求項１における定義と同じであり、Ｒ_１４は保護基を表す。）で表されるアミン化合物とを反応させる工程と；得られた反応物のＲ_１４を脱保護する工程と；を含む、上記の結合体を製造する方法を提供する。
【００２５】
また、本発明は、上記の結合体を含む医薬を提供する。
なお、ＷＯ９９／５９６０３号公報には、ヒドロキサム酸残基がスペ−サ−を介してＨＡと結合した結合体が開示されているが、本発明における結合体については具体的な開示はない。
【００２６】
【発明の実施の形態】
本発明における「ヒドロキサム酸誘導体」には、ヒドロキサム酸骨格（Ｎ−ヒドロキシアミド）を有する物質が含まれ、具体的には、例えば、前述の一般式（１）で表される基を有する化合物などが含まれる。
【００２７】
本発明において、一般式（１）における置換基の非限定的具体例としては、特に示さない限り以下の内容を含む。
Ｒ_１の、炭素数１〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基などが挙げられるが、中でもメチル基が好ましい。
【００２８】
Ｒ_１の、炭素数１〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基、ヘプチルオキシ基、オクチルオキシ基、イソペンチルオキシ基などが挙げられが、中でもメトキシ基が好ましい。
【００２９】
Ｒ_１の、炭素数２〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基としては、ビニル基、アリル基、ｎ−ブテニル基、ｉ−ブテニル基、ｓｅｃ−ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基、ヘプテニル基、オクテニル基等が挙げられる。
【００３０】
Ｒ_１は上記のような定義を有するが、Ｒ_１としては水素原子、水酸基、メチル基、およびメトキシ基が特に好ましい。
Ｒ_２の、炭素数１〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基などが挙げられるが、中でもイソブチル基が好ましい。
【００３１】
Ｒ_２の炭素数１〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基の置換基としての炭素数３〜１０のシクロアルキル基としては、好ましくは炭素数５〜７のシクロアルキル基が挙げられ、具体的にはシクロペンチル基、シクロヘキシル基、またはシクロヘプチル基等があげられる。
【００３２】
Ｒ_２の炭素数１〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基の置換基としての炭素数６〜１４のアリ−ル基としては、水酸基、メトキシ基等の置換基を有していてもよい炭素数６〜１４のアリール基が挙げられ、具体的にはフェニル基、ｐ−ヒドロキシフェニル基、ｐ−メトキシフェニル基、またはナフチル基等が挙げられる。
【００３３】
Ｒ_２は上記のような定義を有するが、Ｒ_２としてはイソブチル基が好ましい。
Ｒ_３の、炭素数１〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基などが挙げられるが、中でもｔ−ブチル基が好ましい。
【００３４】
Ｒ_３の炭素数１〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基の置換基としての炭素数３〜１０のシクロアルキル基としては、好ましくは炭素数５〜７のシクロアルキル基が挙げられ、具体的にはシクロペンチル基、シクロヘキシル基、またはシクロヘプチル基等があげられる。
【００３５】
Ｒ_３の、炭素数１〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基の置換基としての炭素数６〜１４のアリ−ル基としては、水酸基、メトキシ基等の置換基を有していてもよい炭素数６〜１４のアリール基が挙げられ、具体的にはフェニル基、ｐ−ヒドロキシフェニル基、ｐ−メトキシフェニル基、またはナフチル基等が挙げられる。
【００３６】
Ｒ_１が水素原子、水酸基、メチル基、またはメトキシ基である場合には、Ｒ_３がｔ−ブチル基であることが好ましい。
Ｒ_３は上記のような定義を有するが、Ｒ_３としてはｔ−ブチル基が好ましい。
【００３７】
Ｒ_４の、炭素数１〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基が挙げられ、中でもメチル基が好ましい。
【００３８】
Ｒ_４としては、水素原子およびメチル基が好ましく、水素原子が特に好ましい。
Ｒ_５の−Ｒ_７−Ｒ_８−Ｒ_９−においては、Ｒ_７はＮＲ_４のＮと結合し、Ｒ_９はＮＲ_６のＮと結合している。
【００３９】
Ｒ_７の炭素数１〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキレン基としては、メチレン基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、ブタン−１，４−ジイル基、ペンタン−１，５−ジイル基、ヘキサン−１，６−ジイル基、ヘプタン−１，７−ジイル基、オクタン−１，８−ジイル基、２−メチルペンタン−１，３−ジイル基、２−メチルブタン−１，４−ジイル基、３−メチルブタン−１，４−ジイル基、３−メチルペンタン−１，５−ジイル基、３−エチルペンタン−１，５−ジイル基、３−メチルヘキサン−１，６−ジイル基、４−メチルヘキサン−１，６−ジイル基、４−メチルヘプタン−１，７−ジイル基などが挙げられる。
【００４０】
Ｒ_７としては、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、ブタン−１，４−ジイル基が好ましい。
Ｒ_８の炭素数１〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基で置換されていてもよいメチレン基もしくはイミノ基における置換基としての炭素数１〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基が挙げられる。
【００４１】
Ｒ_８としては、炭素数１〜３の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基で置換されていてもよいメチレン基、及び酸素原子が好ましく、メチレン基、及び酸素原子が特に好ましい。
【００４２】
Ｒ_９の１〜３個の酸素原子が挿入されていてもよい炭素数１〜１０の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキレン基の非限定的具体例としては、メチレン基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、ブタン−１，４−ジイル基、ペンタン−１，５−ジイル基、ヘキサン−１，６−ジイル基、ヘプタン−１，７−ジイル基、オクタン−１，８−ジイル基、ノナン−１，９−ジイル基、オクタン−１，１０−ジイル基、２−メチルペンタン−１，３−ジイル基、２−メチルブタン−１，４−ジイル基、３−メチルブタン−１，４−ジイル基、３−メチルペンタン−１，５−ジイル基、３−エチルペンタン−１，５−ジイル基、３−メチルヘキサン−１，６−ジイル基、４−メチルヘキサン−１，６−ジイル基、４−メチルヘプタン−１，７−ジイル基、１−オキサ−プロパン−１，３−ジイル基、２−オキサブタン−１，４−ジイル基、３−オキサペンタン−１，５−ジイル基、２−オキサヘキサン−１，６−ジイル基、３−オキサヘキサン−１，６−ジイル基、１，４−ジオキサヘキサン−１，６−ジイル基、３−オキサヘプタン−１，７−ジイル基、２，５−ジオキサヘプタン−１，７−ジイル基、４−オキサオクタン−１，８−ジイル基、２，６−ジオキサオクタン−１，８−ジイル基、３，６−ジオキサノナン−１，９−ジイル基、３，６−ジオキサ−４−メチルノナン−１，９−ジイル基、３，６−ジオキサ−５−エチルノナン−１，９−ジイル基、１，４，７−トリオキサオクタン−１，１０−ジイル基などが挙げられる。Ｒ_９は、好ましくはエタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、ブタン−１，４−ジイル基、３，６−ジオキサノナン−１，９−ジイル基などが挙げられる。
【００４３】
Ｒ_５の好ましい具体例としては、−（ＣＨ_２）_４−、−（ＣＨ_２）_５−、−（ＣＨ_２）_６−、−（ＣＨ_２）_７−、−（ＣＨ_２）_８−、−（ＣＨ_２）_９−、−（ＣＨ_２）_１０−、−（ＣＨ_２）_１１−、−（ＣＨ_２）_１２−、−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−（ＣＨ_２）_２−、−（ＣＨ_２）_３−Ｏ−（ＣＨ_２）_３−、−（ＣＨ_２）_４−Ｏ−（ＣＨ_２）_４−、−（ＣＨ_２）_３−Ｏ−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−（ＣＨ_２）_３−等が挙げられる。特に好適には、Ｒ_５は、−（ＣＨ_２）_３−Ｏ−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−（ＣＨ_２）_３−である。
【００４４】
Ｒ_６の炭素数１〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基が挙げられ、中でもメチル基が好ましい。
【００４５】
Ｒ_６としては、メチル基および水素原子が好ましく、水素原子が特に好ましい。
Ｒ_１とＲ_３が一緒になって環を形成する場合には、−Ｉ−Ｊ−Ｋ−Ｌ−（Ｉは酸素原子を含んでもよい炭素数１〜８のアルキレン基、ＪはＯ、Ｓ、ＮＨ、ＣＯＮＨまたはＮＨＣＯ、Ｋは存在しないかあるいは置換基を有してもよい芳香環、Ｌは炭素数１〜８のアルキレン基である）を形成することが好ましい。このとき、ＩはＲ_１側から結合し、ＬはＲ_３側から結合する。また、Ｋが芳香環を表す場合には、ＪとＬはそれぞれ芳香環の任意の位置に結合することができる。
【００４６】
ＩおよびＬの非限定的具体例としては、メチレン、エチレン、トリメチレン、テトラメチレンが挙げられ、好ましくは、Ｉとしては、例えば、トリメチレンが挙げられ、Ｌとしては、例えば、メチレンが挙げられる。Ｋは存在しないか、あるいは置換基を有してもよい芳香環を示すが、ここで芳香環としては、フェニル、トリル、キシリル、ナフチル、ビフェニル、アントリル、フェナントリル、ピリジル、インドリル、キノリル、イミダゾリル等が挙げられ、好ましくはフェニルが挙げられる。
【００４７】
−Ｉ−Ｊ−Ｋ−Ｌ−は、例えば、Ｒ_１側からの残基がハロゲン化アルキル基、好ましくはプロピルブロマイド基、Ｒ_３側からの残基が水酸基を有するアルコール誘導体またはフェノール誘導体、好ましくはパラヒドロキシベンジル基である化合物を縮合することにより得られる。
【００４８】
−Ｉ−Ｊ−Ｋ−Ｌ−の非限定的具体例としては、一般式（２）：
【００４９】
【化１３】

【００５０】
で示される基などが挙げられる。
一般式（１）で示される基は、Ｒ_２がイソブチル基であることが好ましい。
一般式（１）で示される基は、Ｒ_１が水酸基またはメトキシ基、かつ、Ｒ_３がｔ−ブチル基であることが好ましい。
【００５１】
一般式（１）で示される基は、Ｒ_１とＲ_３が一般式（２）で表される環であることが好ましい。
一般式（１）で示される基は、式（３）〜（７）の基であることが好ましい（。
【００５２】
一般式（１）の光学異性体およびそれらの任意の割合の混合物等はいずれも本発明に包含される。
本発明において、「ヒアルロン酸（ＨＡ）」とは、重量平均分子量５０，０００〜１０，０００，０００を有する、グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンとから成る二糖の重合体、並びにこれらの混合物を挙げられる。ＨＡは、粘弾性の強さの点から、重量平均分子量７００，０００〜１０，０００，０００を有するものが好ましく、重量平均分子量１，０００，０００〜１０，０００，０００であることが特に好ましい。
【００５３】
本発明において「ヒアルロン酸誘導体」とは、ヒアルロン酸から誘導されるヒアルロン酸骨格を有する全ての物質を意味する。ヒアルロン酸誘導体の非限定的具体例としては；
（１） 糖成分であるグルクロン酸及び／またはＮ−アセチルグルコサミンが還元末端を有しているヒアルロン酸誘導体；
（２） ＨＡ中の１以上のカルボキシル基がエステル化されているヒアルロン酸誘導体（例えば、ベンジルエステル化ＨＡ（Ｈｙａｆｆ、登録商標、Ｆｉｄｉａ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ））；
（３） 重量平均分子量５０，０００〜１０，０００，０００を有するグルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンとからなる二糖の重合体を、ホルムアルデヒドで架橋してさらに高分子化した誘導体（例えば、シンビスク（Ｓｙｎｖｉｓｃ、登録商標、バイオマトリックス））；並びに
（４） その他、ＨＡ中の１以上の水酸基がアセチル化されているアセチル化ＨＡや、あるいは上記したＨＡまたはＨＡ誘導体に１以上の薬効成分、例えば制癌剤（例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、アルカロイド等が挙げられる）、免疫抑制剤、抗炎症剤（ステロイド剤、非ステロイド系抗炎症剤等が挙げられる）、抗リウマチ剤、抗菌剤（β−ラクタム系抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、マクロライド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、新キノロン系抗生物質、ポリペプチド系抗生物質、サルファ剤等が挙げられる）などを、スペーサーを介してまたは介さずに結合させることによって得られる誘導体等
が含まれる。
【００５４】
ＨＡまたはＨＡ誘導体の塩の非限定的具体例としては、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、アルミニウム塩などを挙げることができる。
【００５５】
ＨＡの由来には特に制限されないが、例えば、連鎖球菌等のバクテリア、ヒト、ブタ、ニワトリ等に由来するＨＡを使用できる。
ＨＡ、ＨＡ誘導体及びそれらの塩の非限定的具体例としては、例えば、スベニール（登録商標、日本ルセル）、アルツ（登録商標、科研製薬）、オペガン（登録商標、参天製薬）、ヒアルガン（登録商標、フィーディア）、オルトビスク（登録商標、アニカセラピューティックス）、ヒアロン（登録商標、ファルマシア＆アップジョン）等を挙げることでき、また、和光純薬工業（株）等の各種試薬メーカーのカタログに記載のＨＡ、ＨＡ誘導体及びこれらの塩を挙げることもできる。
【００５６】
本発明の結合体においては、一般式（１）で表される基と、ＨＡもしくはＨＡ誘導体またはそれらの塩のＮ−アセチルグルコサミン（以下「ＧｌｃＮＡｃ」とも記す）の水酸基とが、カーバメート結合していることが好ましい。
【００５７】
また、一般式（１）で表される基の、ＨＡもしくはＨＡ誘導体またはそれらの塩中のＧｌｃＮＡｃ数に対する結合率が、０．０１〜５０％であることが好ましく、０．１〜１０％であることが特に好ましい。ここで「結合率」とは、本発明の結合体を構成するＨＡもしくはＨＡ誘導体またはそれらの塩に含まれる全ＧｌｃＮＡｃ数に対する、そのＨＡに結合した一般式（１）で表される基の総数の割合をいう。こうした結合率は、例えば、後述の実施例２に記載の方法により算出できる。
【００５８】
本発明の結合体を医薬として適用する場合、薬学的に許容できる賦形剤または安定剤などと一緒に製剤化してから使用してもよい。
本発明の結合体を含む医薬の投与形態は特に限定されず、経口投与でも非経口投与でもよく、また、全身投与でも局所投与でもよい。一般的には、本発明の医薬は非経口的に局所投与するのが好ましく、例えば、注射剤として、関節内、静脈内、筋肉内または皮下に投与することができ、あるいはスプレー剤、局所用クリーム、ローション、または軟膏として経皮的に投与することができる。
【００５９】
本発明の結合体を含む医薬は、変形性関節症、慢性関節リウマチまたは肩関節周囲炎等の関節疾患治療薬としても使用できる。こうした医薬の製造に、好ましく関節疾患治療薬の製造に使用される。
【００６０】
薬学的に有効量の本発明の結合体を有効成分として含む医薬を、関節疾患等を有する患者を治療するために投与することも好ましい。そうした場合、本発明の医薬の投与量は、患者の症状、年齢、性別などに応じて適宜選択できるが、注射剤として用いる場合は一般的には、有効成分である結合体の量として０．０１ｍｇ／体重ｋｇ／日〜１００ｍｇ／体重ｋｇ／日、好ましくは０．１ｍｇ／体重ｋｇ／日〜１０ｍｇ／体重ｋｇ／日である。前記１日当たりの投与量の医薬を、１日に数回に分けて投与してもよく、１日１回投与してもよい。あるいは、２日〜２８日に１回投与してもよい。
【００６１】
本発明の結合体の製造方法は、特に限定されないが、例えば、以下に示す方法等により、あるいは後述の合成実施例に示す方法により、またはそれを応用して製造することができる。
【００６２】
即ち、ＨＡもしくはＨＡ誘導体又はそれらの塩の水溶液にカルボジイミド類と式（８）で示される化合物とを加え、塩酸やリン酸などの酸や緩衝液を用いて反応液のｐＨを４〜６に維持しながら、０〜３５℃で１〜９６時間反応させる。反応液から透析などにより余分な低分子物質を除去し、活性化されたＨＡもしくはＨＡ誘導体又はそれらの塩を得る。続いて、こうして得られた活性化されたＨＡもしくはＨＡ誘導体又はそれらの塩の水溶液に、式（９）で示されるアミン化合物を加え、水酸化ナトリウムやトリエチルアミンなどの塩基を用いて反応液のｐＨを９〜１２に維持しながら、０〜３５℃で１〜９６時間反応させる。もし、ここで用いる式（９）で示されるアミン化合物の、水に対する溶解性が低い場合には、１〜５０％の有機溶媒（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ジオキサン、エタノ−ル、ピリジンなど）を含む水溶液を反応溶媒としてもよい。
【００６３】
反応後、反応液にエタノ−ル、アセトン等の有機溶媒を加え沈殿を生じさせ、沈殿物をアルコ−ル沈殿、ゲルろ過、透析、イオン交換クロマトグラフィ−等の手段で精製することにより、目的とする結合体を得ることができる。なお、必要に応じて、この精製過程の前や途中にＲ_１４を脱保護する操作（ｐＨ２〜６の酸性下に暴露、または、接触還元）を加えてもよい。
【００６４】
なお、カルボジイミド類としては、例えば、下記化合物
【００６５】
【化１４】

【００６６】
などが挙げられ、好ましくは
【００６７】
【化１５】

【００６８】
である。
式（９）におけるＲ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５およびＲ_６における置換基の非限定的具体例は、特に示さない限りは、上述した一般式（１）における置換基の非限定的具体例と同様である。
【００６９】
Ｒ_１４（保護基）としては、
【００７０】
【化１６】

【００７１】
などが挙げられ、好ましくは、
【００７２】
【化１７】

【００７３】
である。
以下、実施例および試験例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例および試験例になんら限定されるものではない。
【００７４】
【実施例】
（実施例１） ヒドロキサム酸誘導体の合成例
Ｎ’−（１３−アミノ−４，７，１０−トリオキサトリデカニル）−Ｎ−（３Ｓ−ヒドロキシ−４−（Ｎ−（１−メトキシ−１−メチルエトキシ）アミノ）−２Ｒ−イソブチルサクシニル）−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの合成
【００７５】
【化１８】

【００７６】
（ａ） Ｎ’−（１３−ベンジルオキシカルボニルアミノ−４，７，１０−トリオキサトリデカニル）−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの合成
【００７７】
【化１９】

【００７８】
１−アミノ−１３−ベンジルオキシカルボニルアミノ−４，７，１０−トリオキサトリデカン（７．９ｇ）、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン（５．１ｇ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾ−ル水和物（３．４ｇ）、ジクロロメタン（８０ｍｌ）およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２０ｍｌ）の混合物に、−２５℃にて１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（４．３ｇ）およびトリエチルアミン（３．２ｍｌ）を加え、−２５℃にて３０分間、５℃にて１時間、さらに室温にて７時間攪拌した。反応混合物を減圧下濃縮し、得られた残渣にジクロロメタンを加え、５％クエン酸水溶液、飽和重曹水および飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下濃縮し得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（溶出溶媒 ジクロロメタン：メタノ−ル＝１００：３）を用いて精製し表題化合物（８．２ｇ）を得た。
^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ０．８８（９Ｈ，ｓ）、１．６０（９Ｈ，ｓ）、１．５０−１．６５（４Ｈ，ｍ）、２．９２−３．５０（１６Ｈ，ｍ）、３．７６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ）、５．００（２Ｈ，ｓ）、６．３０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ）、７．１５−７．２５（１Ｈ，ｍ）、７．２５−７．４０（５Ｈ，ｍ）、７． ８０−７．９０（１Ｈ，ｍ）。
【００７９】
（ｂ）Ｎ’−（１３−ベンジルオキシカルボニルアミノ−４，７，１０−トリオキサトリデカニル）− Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの製造
【００８０】
【化２０】

【００８１】
Ｎ’−（１３−ベンジルオキシカルボニルアミノ−４，７，１０−トリオキサトリデカニル）−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド（４．２ｇ）、トリフルオロ酢酸（１２ｍｌ）およびジクロロメタン（３ｍｌ）の混合物を室温にて１時間攪拌した。反応混合物を減圧下濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（溶出溶媒 ジクロロメタン：メタノ−ル：アンモニア水＝１００：１０：１）を用いて精製し表題化合物（２．６ｇ）を得た。
^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ１．０１（９Ｈ，ｓ）、１．６５−１．８０（４Ｈ，ｍ）、１．８０−２．８０（２Ｈ，ｂｒ）、３．１０−３．６５（１７Ｈ，ｍ）、５．０８（２Ｈ，ｓ）、５．６５−５．８０（１Ｈ，ｍ）、７．２５−７．４０（５Ｈ，ｍ）、７． ５０−７．６５（１Ｈ，ｍ）。
【００８２】
（ｃ）Ｎ’−（１３−ベンジルオキシカルボニルアミノ−４，７，１０−トリオキサトリデカニル）−Ｎ−（２Ｒ−（２，２−ジメチル−４−オキソ−１，３−ジオキソラン−５Ｓ−イル）−４−メチルペンタノイル）−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの製造
【００８３】
【化２１】

【００８４】
２Ｒ−（２，２−ジメチル−４−オキソ−１，３−ジオキソラン−５Ｓ−イル）−４−メチルペンタン酸（１．８０ｇ）、Ｎ’−（１３−ベンジルオキシカルボニルアミノ−４，７，１０−トリオキサトリデカニル）−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド（３．４８ｇ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾ−ル水和物（１．２０ｇ）、ジクロロメタン（２８．８ｍｌ）およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（７．２ｍｌ）の混合物に、−１０℃にてＥＤＣ（１．５０ｇ）およびトリエチルアミン（１．０９ｍｌ）を加え、−１０℃にて３０分間、０℃にて１時間、さらに室温にて１６時間攪拌した。反応混合物を減圧下濃縮し、得られた残渣に酢酸エチルを加え、飽和重曹水および飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（溶出溶媒 ジクロロメタン：メタノ−ル＝９７：３）を用いて精製し、表題化合物（４．９０ｇ）を得た。
^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ０．８１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ）、０．８４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ）、０．９０（９Ｈ，ｓ），１．４０−１．６４（７Ｈ，ｍ）、１．４６（３Ｈ，ｓ）、１．５６（３Ｈ，ｓ）、２．９４−３．１０（５Ｈ，ｍ）、３．２５−３．５１（１２Ｈ，ｍ）、４．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ）、４．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ）、５．００（２Ｈ，ｓ）、７．１９−７．２４（１Ｈ，ｍ）、７．２７−７．４０（５Ｈ，ｍ）、７．８１−７．８７（１Ｈ，ｍ）、７．９９−８．０６（１Ｈ，ｍ）。
【００８５】
（ｄ）Ｎ’−（１３−ベンジルオキシカルボニルアミノ−４，７，１０−トリオキサトリデカニル）−Ｎ−（３Ｓ−ヒドロキシ−４−（Ｎ−ヒドロキシアミノ ）−２Ｒ−イソブチルサクシニル）−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの製造
【００８６】
【化２２】

【００８７】
塩化ヒドロキシルアンモニウム（０．４３ｇ）および１Ｎナトリウムメトキシド−メタノ−ル溶液（６ｍｌ）の混合物を室温にて２時間攪拌した。反応混合物から不溶物をろ別し、得られたろ液をＮ’−（１３−ベンジルオキシカルボニルアミノ−４，７，１０−トリオキサトリデカニル）−Ｎ−（２Ｒ−（２，２−ジメチル−４−オキソ−１，３−ジオキソラン−５Ｓ−イル）−４−メチルペンタノイル）−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド（０．９５ｇ）およびメタノ−ル（１０ｍｌ）の混合物に加え、室温にて３時間攪拌した。反応混合物を減圧下濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカルムクロマトグラフィ（溶出溶媒 ジクロロメタン：メタノ−ル＝１０：１）を用いて精製し、表題化合物（０．８４ｇ）を得た。
^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ０．７７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ）、０．８０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ）、０．９０（９Ｈ，ｓ），１．３０−１．５２（３Ｈ，ｍ）、１．５４−１．６８（４Ｈ，ｍ）、２．６５−２．７３（１Ｈ，ｍ）、３．００−３．１２（４Ｈ，ｍ）、３．２４−３．５２（１２Ｈ，ｍ）、３．７０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．３Ｈｚ）、４．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ）、５．００（２Ｈ，ｓ）、５．３０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ）、７．１８−７．２４（１Ｈ，ｍ）、７．２６−７．３９（５Ｈ，ｍ）、７．４３−７．４９（１Ｈ，ｍ）、７．８８−７．９４（１Ｈ，ｍ）、８．８６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ）、１０．５５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ）。
【００８８】
（ｅ）Ｎ’−（１３−ベンジルオキシカルボニルアミノ−４，７，１０−トリオキサトリデカニル）−Ｎ−（３Ｓ−ヒドロキシ−４−（Ｎ−（１−メトキシ− １−メチルエトキシ）アミノ）−２Ｒ−イソブチルサクシニル）−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの製造
【００８９】
【化２３】

【００９０】
Ｎ’−（１３−ベンジルオキシカルボニルアミノ−４，７，１０−トリオキサトリデカニル）−Ｎ−（３Ｓ−ヒドロキシ−４−（Ｎ−ヒドロキシアミノ）−２Ｒ−イソブチルサクシニル）−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド（０．８４ｇ）、ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム塩（２０ｍｇ）およびジクロロメタン（４０ｍｌ）の混合物に、室温にて２−メトキシプロペン（０．２４ｍｌ）を滴下し、さらに室温にて５０分間攪拌した。反応混合物を飽和重曹水および飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカルムクロマトグラフィ（溶出溶媒 ジクロロメタン：メタノ−ル＝２０：１）を用いて精製し表題化合物（０．８６ｇ）を得た。
^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ０．７７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）、０．７９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）、０．９０（９Ｈ，ｓ），０．９０−１．０６（１Ｈ，ｍ）、１．２９（３Ｈ，ｓ），１．３０（３Ｈ，ｓ），１．３０−１．６８（６Ｈ，ｍ）、２．６２−２．７６（１Ｈ，ｍ）、３．００−３．１５（４Ｈ，ｍ）、３．２２（３Ｈ，ｓ），３．２６−３．５２（１２Ｈ，ｍ）、３．８１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．３Ｈｚ）、４．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ）、５．００（２Ｈ，ｓ）、５．４１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ）、７．１９−７．２６（１Ｈ，ｍ）、７．２７−７．４２（５Ｈ，ｍ）、７．４５−７．５０（１Ｈ，ｍ）、７．８９−７．９９（１Ｈ，ｍ）、１０．４１（１Ｈ，ｓ）。
【００９１】
（ｆ）Ｎ’−（１３−アミノ−４，７，１０−トリオキサトリデカニル）−Ｎ −（３Ｓ−ヒドロキシ−４−（Ｎ−（１−メトキシ−１−メチルエトキシ）アミノ）−２Ｒ−イソブチルサクシニル）−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの製造
【００９２】
【化２４】

【００９３】
Ｎ’−（１３−ベンジルオキシカルボニルアミノ−４，７，１０−トリオキサトリデカニル）−Ｎ−（３Ｓ−ヒドロキシ−４−（Ｎ−（１−メトキシ−１−メチルエトキシ）アミノ）−２Ｒ−イソブチルサクシニル）−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド（０．８６ｇ）、１０％パラジウム−炭素（０．３０ｇ）およびメタノ−ル（５０ｍｌ）の混合物を、水素雰囲気下室温にて４時間攪拌した。反応混合物より触媒をろ別後、減圧下濃縮し表題化合物（０．６６ｇ）を得た。
^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ０．７７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）、０．８０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）、０．９０（９Ｈ，ｓ），０．９０−１．０２（１Ｈ，ｍ）、１．２９（３Ｈ，ｓ），１．３０（３Ｈ，ｓ），１．３０−１．６５（６Ｈ，ｍ）、２．５６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）、２．６３−２．７４（１Ｈ，ｍ）、３．０３−３．１４（２Ｈ，ｍ）、３．２２（３Ｈ，ｓ），３．２２−３．５３（１２Ｈ，ｍ）、３．８１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ）、４．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ）、７．４７−７．５１（１Ｈ，ｍ）、７．９２−７．９９（１Ｈ，ｍ）。
【００９４】
（実施例２） 本発明の結合体の合成例
【００９５】
【化２５】

【００９６】
ヒアルロン酸ナトリウム塩（６００ｍｇ、重量平均分子量：約２２０万）を蒸留水（６０ｍｌ）に溶解し、得られた溶液にピリジン （１．２ ｍｌ）、１Ｎ 塩酸 （１２ ｍｌ）および蒸留水（４６．８ ｍｌ）を添加したのち、さらにＮ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド（ＨＯＮＢ）（１．０６８ ｇ）、ＥＤＣ （１．１５２ ｇ）を添加し、攪拌しながら４℃で１晩放置した。反応を停止させるため、２％酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ６．０）（６０ ｍｌ）を添加した後、４℃で３０分間攪拌した。この溶液を透析膜（分子量カットオフ１２，０００〜１４，０００、三光純薬製）を用いて、イオン交換水を外液として、４℃で６時間透析を行った。透析後の溶液に、実施例１で得られたヒドロキサム酸誘導体であるＮ’−（１３−アミノ−４，７，１０−トリオキサトリデカニル）−Ｎ−（３Ｓ−ヒドロキシ−４−（Ｎ−（１−メトキシ−１−メチルエトキシ）アミノ）−２Ｒ−イソブチルサクシニル）−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの２５ ｍＭ水溶液（２０ ｍｌ）を添加した後、０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加してｐＨ９．２に調整し、４℃で２２時間攪拌した。次いで、さらに０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加してｐＨ１０．９に調整し、４℃で１日間攪拌した。この溶液に塩化ナトリウム（８．４ｇ）を添加した後、エタノ−ル（５００ ｍｌ）を滴下してエタノ−ル析出を行い、析出物を遠心分離により上清と分離した。析出物を超純水（３６０ ｍｌ）に溶解した後、塩化ナトリウム（１４ ｇ）を添加し、クリ−ンベンチ内でポアサイズ０．４５μｍのメンブランフィルタ−（ミリポア製）でろ過し、エタノ−ル９００ ｍｌを滴下してエタノ−ル析出を行った。析出物を遠心分離により分離後、再び０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液（１８０ ｍｌ）に溶解し、エタノ−ル４５０ ｍｌを滴下してエタノ−ル析出を行った。析出物を遠心分離により分離し、生理食塩水（大塚）３０ｍｌに溶解し、表題化合物（結合体）の水溶液を得た。得られた結合体の分子量を、ヒアルロン酸を標準物質とするゲルろ過法により求めたところ、約１６４万であった。結合体水溶液の濃度は１％（ｗ／ｖ）であった。また、得られた結合体を塩酸加水分解して、結合体中のｔ−Ｌｅｕ量をアミノ酸分析装置を用いて測定することにより、Ｎ’−（１３−アミノ−４，７，１０−トリオキサトリデカニル）−Ｎ−（３Ｓ−ヒドロキシ−４−（Ｎ−（１−メトキシ−１−メチルエトキシ）アミノ）−２Ｒ−イソブチルサクシニル）−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの、ヒアルロン酸ナトリウム塩中のＮ−アセチルグルコサミンに対する結合率を算出したところ、３．８％であった。^１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）：δ０．７８（ｄ）、０．８０（ｄ）、０．９２（ｓ），１．０４−１．１２（ｍ）、１．２７−１．３９（ｍ）、１．３９−１．６０（ｍ）、１．４６−１．５４（ｍ），１．６４（ｂｒ．ｓ）、１．６７−１．７６（ｍ）、１．９４（ｂｒ．ｓ）、２．７８−２．８７（ｍ）、２．９４（ｂｒ．ｓ）３．０３−３．１４（ｍ）、３．１９（ｍ）、３．２９（ｂｒ．ｓ）、３．３５（ｂｒ．ｓ）、３．４５（ｂｒ．ｓ）、３．４８（ｍ）、３．５９（ｓ）、３．６１（ｓ）、３．７８（ｂｒ．ｓ）、４．０４（ｄ）、４．１０（ｓ）、４．４０（ｂｒ．ｓ）、４．４９（ｂｒ．ｓ）、４．５８（ｂｒ．ｓ）、６．１７（ｂｒ．ｓ）、６．２１（ｂｒ．ｓ）、６．４２（ｂｒ．ｓ）。
【００９７】
上記のＮＭＲデ−タから、保護基が除去されていること、および結合体の構成成分が確認された。即ち、
（１）保護基である１−メトキシ−１−メチルエチル基由来の１．３０付近および３．２２付近のシングレットシグナルは消失しているので、保護基は除去されている。
（２）３．２９、３．４５、３．７８ｐｐｍなどのヒアルロン酸由来のシグナルと、０．７８、０．８０、０．９２、４．０４、４．１０ｐｐｍなどのヒドロキサム酸誘導体由来のシグナルに加えて、６．１７、６．２１、６．４２ｐｐｍのシグナルが観測された。これら６．１７、６．２１、６．４２ｐｐｍのシグナルは、ＨＯＮＢのオレフィン位由来のシグナルである。
（３）ＨＯＮＢのオレフィン位のシグナルは、元々等価で２プロトン分のシングレットシグナル（６．０２ｐｐｍ）として観測されるが、ここでは２本のシングレットシグナル（６．１７ｐｐｍと６．４２ｐｐｍのペア、および６．２１ｐｐｍと６．４２ｐｐｍのペア）に割れている。この様に等価なプロトンが非等価に変化したことからＨＯＮＢが開環した形で存在することが示唆された。
【００９８】
（実施例３） オリゴＨＡ（不飽和二糖）とヒドロキサム酸誘導体との結合体の取得及び解析
実施例２で得られた結合体（ＨＡとヒドロキサム酸誘導体との結合体、以下「結合体Ａ」とも記す）を、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ由来のヒアルロニダ−ゼ（生化学工業社製、商品名「ヒアルロニダ−ゼＳＤ」）を用いて、下記の条件で、オリゴＨＡ（非結合体）と、オリゴＨＡ（不飽和二糖）とヒドロキサム酸誘導体との結合体とに消化した。「ヒアルロニダ−ゼＳＤ」は、ＨＡのβ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニル（１→４）グルクロン酸結合を脱離反応的に切断して、非還元末端にΔ−４，５−グルクロン酸残基をもつ不飽和二糖を生成する酵素である。
［酵素消化条件］
４０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中。
結合体Ａの濃度：ＨＡとして０．４％（ｗ／ｖ）。
ヒアルロニダ−ゼＳＤ濃度：０．５ Ｕ／ｍｌ（１ＵはｐＨ６．２、３７℃で１分間にＨＡから１μモルの不飽和二糖を遊離する酵素量である）。
３７℃，２０時間。
【００９９】
反応停止は、反応液を熱処理（１００℃、５分間）することにより行った。得られた熱処理液をフィルタ−濾過（ポアサイズ０．４５μｍのメンブランフィルタ−、ミリポア製）して、濾液を回収した。得られた濾液を、以下の条件で逆相クロマトグラフィ−分画し、逆相カラムを素通りするオリゴＨＡ（非結合体）を除去し、アセトニトリルグラジエントにより溶出されるオリゴＨＡ（不飽和二糖）とヒドロキサム酸誘導体との結合体の画分を集めた。
［逆相クロマトグラフィ−条件］
使用装置：ＳＭＡＲＴ Ｓｙｓｔｅｍ（ファルマシア社製）。
逆相カラム：μＲＰＣ Ｃ２／Ｃ１８ ＰＣ３．２／３（ファルマシア社製）。
流速：２００μｌ／分。
溶離液組成：０分−５分 水＋０．１％ ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）。
【０１００】
５分−３０分 ０〜５０％アセトニトリル リニア グラジエント（０．１％ ＴＦＡ。）
サンプル：上記濾液 １００μｌ／クロマトグラフィ−。
検出：２０５ｎｍ。
分取回数：２回。
【０１０１】
上記逆相クロマトグラフィ−において、１５分付近で溶出した２０５ｎｍのピ−ク部分をオリゴＨＡ（不飽和二糖）とヒドロキサム酸誘導体との結合体の画分として分取し、２回分を合わせて凍結乾燥した。
【０１０２】
この凍結乾燥体を５０％メタノ−ルに溶解したものをサンプルとして、ＬＣ／ＭＳ分析を行った。ＬＣ／ＭＳ分析は、エレクトロスプレ−イオン化法（ＥＳＩ）とソニックスプレ−イオン化法（ＳＳＩ）によって、以下の条件で行った。
［ＬＣ／ＭＳ条件］
装置：日立社製 Ｍ−１２００Ｈ。
サンプル導入：フロ−インジェクション法。
【０１０３】
移動相：５０％メタノ−ル。
流速：５０μｌ／分。
イオン化法：ＥＳＩ（正イオンモ−ド）。
【０１０４】
ドリフト ３０Ｖ，霧化器温度 ２５０℃、細孔温度 １２０℃。
ＳＳＩ（正イオンモ−ド）。
窒素ガス流量 ３Ｌ／分。
【０１０５】
ＥＳＩ法にて検出された質量は、ｍ／ｚ＝１０８３であった。ＳＳＩ法にて検出された質量は ｍ／ｚ＝１１０５であった。この結果と上述のＮＭＲの測定結果から、酵素消化により生じたオリゴＨＡ（不飽和二糖）とヒドロキサム酸誘導体との結合体におけるＨＯＮＢの開環成分は、不飽和二糖のいずれかの水酸基部分と結合していることが確認された。ＥＳＩ法では１個のナトリウムイオンが付加して正イオン化された質量であり、ＳＳＩ法では１個のプロトンが脱離して２個のナトリウムイオンが付加して正イオン化された質量である。
【０１０６】
（実施例４） Ｎ−アセチルグルコサミンとヒドロキサム酸誘導体との結合体の取得及び解析
実施例２で得られた結合体Ａを、ヒツジ睾丸由来のヒアルロニダ−ゼ（シグマ社製、Ｔｙｐｅ Ｖ、ＨＡのβ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニル（１→４）グルクロン酸結合を加水分解して四糖及び六糖を生成する酵素）を用いて、以下の条件で、オリゴＨＡ（非結合体）と、オリゴＨＡとヒドロキサム酸誘導体との結合体とに消化した。
［酵素消化条件］
４０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中。
結合体Ａの濃度：ＨＡとして０．４％（ｗ／ｖ）。
ヒアルロニダ−ゼ濃度：１０，０００ Ｕ／ｍｌ（シグマ社表示活性）。
３７℃、３１時間。
【０１０７】
反応停止は、反応液を熱処理（１００℃，５分間）することにより行った。得られた熱処理液をフィルタ−濾過（ポアサイズ０．４５μｍのメンブランフィルタ−、ミリポア製）して、濾液を回収した。
【０１０８】
この濾液２５０μｌを、ＳＥＰ−ＰＡＫ Ｃ１８カ−トリッジ（Ｗａｔｅｒｓ社製）にかけ、５ｍｌの水を通液することにより、素通りするオリゴＨＡ（非結合体）を除去した。続いて２０％アセトニトリル溶液５ｍｌを通液し、溶出されるオリゴＨＡとヒドロキサム酸誘導体との結合体の画分を得た。
【０１０９】
得られた２０％アセトニトリル溶出画分を凍結乾燥し、以下の更なる酵素分解に供した。
この凍結乾燥物全量を、ウシ肝臓由来のβ−グルクロニダ−ゼ（シグマ社製、ｔｙｐｅ Ｂ−１０、β−グルクロニドを加水分解してＤ−グルクロン酸を遊離させる反応を触媒する酵素で、オリゴＨＡの非還元末端のＤ−グルクロン酸を遊離させる）を用いて、以下の条件で消化した。
［酵素消化条件］
２０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ４．６）中。
β−グルクロニダ−ゼ：２０，０００ Ｕ／ｍｌ（シグマ社表示活性）。
反応液量：４００μｌ。
３７℃、２１時間。
【０１１０】
反応停止は、反応液を熱処理（１００℃，５分間）することにより行った。得られた熱処理液をフィルタ−濾過（ポアサイズ０．４５μｍのメンブランフィルタ−、ミリポア製）して、濾液を回収した。
【０１１１】
さらに、この濾液に含まれているオリゴＨＡとヒドロキサム酸誘導体との結合体を、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｏｒ ａｕｒｅｓｃｅｎｓ由来のコンドロイチナ−ゼ（生化学工業社製、商品名「コンドロイチナ−ゼＡＣＩＩアルスロ」、コンドロイチン硫酸やヒアルロン酸のβ−１，４−ヘキソサミニド結合を脱離分解し不飽和二糖を生成する酵素）を用いて、以下の条件でオリゴＨＡ（非結合体）と、Ｎ−アセチルグルコサミンとヒドロキサム酸誘導体との結合体とに消化した。
［酵素消化条件］
４０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中。
コンドロイチナ−ゼＡＣＩＩアルスロ：５ Ｕ／ｍｌ（生化学工業社表示活性）。
上記濾液：３５０μｌ。
反応液量：４００μｌ。
３７℃、２０時間。
【０１１２】
反応停止は、反応液を熱処理（１００℃、５分間）することにより行った。得られた熱処理液をフィルタ−濾過（ポアサイズ０．４５μｍのメンブランフィルタ−、ミリポア製）し、濾液を回収した。
【０１１３】
得られた濾液を、以下の条件で逆相クロマトグラフィ−分画し、逆相カラムを素通りするオリゴＨＡ等（非結合体）を除去し、アセトニトリルグラジエントにより溶出されるＮ−アセチルグルコサミンとヒドロキサム酸誘導体との結合体の画分を集めた。
［逆相クロマトグラフィ−条件］
使用装置：ＳＭＡＲＴ Ｓｙｓｔｅｍ（ファルマシア社製）。
逆相カラム：μＲＰＣ Ｃ２／Ｃ１８ ＰＣ３．２／３（ファルマシア社製）。
流速：２００μｌ／分。
溶離液組成：０分−５分 水＋０．１％ ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）。
【０１１４】
５分−３０分 ０〜５０％アセトニトリルリニアグラジエント（０．１％ ＴＦＡ）。
サンプル：上記濾液 １００μｌ／クロマトグラフィ−。
検出：２０５ｎｍ。
分取回数：３回。
【０１１５】
上記逆相クロマトグラフィ−において、１６分付近に溶出した２０５ｎｍのピ−ク部分をＮ−アセチルグルコサミンとヒドロキサム酸誘導体との結合体の画分として分取し、３回分合わせて凍結乾燥した。
【０１１６】
この凍結乾燥体を５０％メタノ−ルに溶解したものをサンプルとして、ＬＣ／ＭＳ分析を行った。ＬＣ／ＭＳ分析は、エレクトロスプレ−イオン化法（ＥＳＩ）とソニックスプレ−イオン化法（ＳＳＩ）によって、以下の条件で行った。
［ＬＣ／ＭＳ条件］
装置：日立社製 Ｍ−１２００Ｈ。
サンプル導入：フロ−インジェクション法。
【０１１７】
移動相：５０％メタノ−ル。
流速：５０μｌ／分。
イオン化法：
ＥＳＩ（正イオンモ−ド）：ドリフト ３０Ｖ、霧化器温度 ２５０℃、細孔温度 １２０℃。
【０１１８】
ＳＳＩ（正イオンモ−ド）：窒素ガス流量 ３Ｌ／分。
ＥＳＩ法およびＳＳＩ法ともに、検出された質量は、ｍ／ｚ＝９２５であった。この結果から、酵素消化により生じたＮ−アセチルグルコサミンとヒドロキサム酸誘導体との結合体におけるＨＯＮＢの開環成分は、Ｎ−アセチルグルコサミンの水酸基部分と結合していることがわかった。ＥＳＩ法、ＳＳＩ法ともに、１個のナトリウムイオンが付加して正イオン化された質量である。
【０１１９】
（試験例１） ＭＭＰ阻害活性
上述の実施例２に記載の方法により合成された結合体Ａのゲラチナ−ゼＡとストロメリシン−１とに対する阻害活性を測定した。比較のため、ＷＯ９９／５９６０３実施例８記載の「結合体７」についても同様の測定を行った。ゲラチナ−ゼＡに対する阻害活性は、ロッシュ・ダイアグノスティック社製のゲラチナ−ゼ活性測定キットを用い、添付のプロトコ−ルに従って、同社製のゲラチナ−ゼＡ（１．２ Ｕ）を活性化後、３７℃、１時間の酵素反応に対して測定した。また、ストロメリシン−１に対する酵素阻害活性は、ヤガイ社製のストロメリシン活性測定キットを用い、添付のプロトコ−ルに従って、同社製の活性型ストロメリシン−１（０．２ Ｕ）による３７℃、３．５時間の酵素反応に対して測定した。
【０１２０】
酵素阻害活性は、結合体Ａおよび結合体７非添加時の各酵素活性を５０％抑制するのに要する各結合体の濃度（ＩＣ_５０、μｇ／ｍＬ、各結合体をヒアルロン酸として換算した濃度で表す）として表した。結果を表１に示した。結合体Ａは、結合体７と比べて５〜４０倍のＭＭＰ阻害活性を有していた。
【０１２１】
【表１】

【０１２２】
（試験例２） ウサギ関節軟骨コラ−ゲン破壊阻害活性
上述の実施例２に記載の方法により合成された結合体Ａについて、Ｓａｉｔｏらの方法［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２２， ４９−５４（１９９７）］を改変した方法を用いて試験した。比較のため、ＷＯ９９／５９６０３の実施例８記載の「結合体７」についても同様の試験を行った。
【０１２３】
５−７週齢の雄性ウサギ由来の膝関節軟骨片（約１０ ｍｇ）を、５００μＬのＤｕｌｂｅｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅａｇｌｅ’ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）を添加した培養プレ−ト上（Ｆａｌｃｏｎ社製、４８穴平底培養プレート、＃３０７８）で、３７℃のＣＯ_２インキュベ−タ−中、２４時間培養した。培養液を０．２％のラクトアルブミンを含む５００μＬのＤＭＥＭに交換後、結合体Ａまたは結合体７を添加し、インタ−ロイキン１（Ｒ＆Ｄ社製、ヒトインターロイキン−１α、＃２００−ＬＡ）（１ ｎｇ／ｍＬ）とヒトプラスミノ−ゲン（Ｓｉｇｍａ社製、＃Ｐ７３９７）（１００ μｇ／ｍＬ）の存在下、３７℃のＣＯ_２インキュベ−タ−中で、更に１０日間培養した（ｎ＝４〜６）。培養終了後、培養上清と関節片残渣を回収した。関節片残渣は、最終濃度４．５ ｍｇ／ｍＬのパパイン（Ｓｉｇｍａ社製、＃Ｐ３３７５）で６０℃、一夜消化した。培養上清とパパイン処理により得られた関節片残渣の消化液とを試料とし、それぞれに最終濃度６Ｎになるように濃塩酸を添加し、１１０℃のオ−トクレ−ブで２時間加水分解を行った。それぞれの試料にＮ_２ガスを噴霧して乾固させた後、５ ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡを含む０．１ ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液に溶解し、各試料中のハイドロキシプロリン量を比色法（５６０ ｎｍ）にて測定した（Ｂｉｏｒａｄ社製、Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ）。
【０１２４】
関節片から培養上清中に遊離したハイドロキシプロリン量と関節片残渣中のハイドロキシプロリン量から、下記の式に従って、ハイドロキシプロリンの遊離率を算出した。
【０１２５】
【数１】

【０１２６】
ウサギ関節軟骨コラ−ゲン破壊阻害活性は、結合体Ａあるいは結合体７非添加時のＩＬ−１とプラスミノ−ゲンによるハイドロキシプロリン遊離率を５０％抑制するのに要する各結合体の濃度（ＩＣ_５０、μｇ／ｍＬ、各結合体をヒアルロン酸として換算した濃度で表す）として表した。結果を表２に示した。結合体７に比べ、結合体Ａは、約５倍の強さの関節軟骨コラ−ゲン破壊阻害活性を有していた。
【０１２７】
【表２】

【０１２８】
【発明の効果】
本発明の結合体は、優れたＭＭＰ阻害作用を有するとともに、作用の限局、長期化が可能である。本発明の結合体は、関節疾患治療薬とＨＡの両方の薬物としての有用性が改善された薬剤、例えば、関節破壊抑制作用が強化された薬剤として、優れた変形性関節症、慢性関節リウマチ又は肩関節周囲炎の治療薬となることが期待される。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a conjugate of a hydroxamic acid derivative and hyaluronic acid, which has a matrix metalloprotease (hereinafter also referred to as MMP) inhibitory activity and is useful for treating joint diseases such as osteoarthritis and rheumatoid arthritis. .
[0002]
[Prior art]
Articular cartilage is composed of about 70% water, chondrocytes and cartilage matrix. The main components of the cartilage matrix are collagen and proteoglycans, and a collagen network having a network structure contains proteoglycans having a high water retention ability. The cartilage matrix is rich in viscoelasticity, reduces irritation and load on cartilage, and plays an important role in maintaining normal shape and function of articular cartilage.
[0003]
Both osteoarthritis (hereinafter, also referred to as OA) and rheumatoid arthritis (hereinafter, also referred to as RA) are typical diseases accompanied by cartilage matrix destruction. Matrix destruction in both diseases is triggered by mechanical stress associated with aging in OA, hyperproliferation of synovial lining cells, pannus formation, infiltration of inflammatory cells in RA, etc., all of which are induced through protease induction. Is believed to be Since the degradation of cartilage matrix is carried out outside of cells having a neutral pH, matrix metalloproteases that optimize the pH in this region are said to be central players in degradation [Current Opinion in Anti-Inflammatory]. & Immunomodulatory Investigational Drugs, vol. 2, 16-25, (2000)].
[0004]
Up to now, 20 types of enzymes belonging to MMP have been reported, and 4 types of in vivo proteins called tissue metalloprotease inhibitors (hereinafter also referred to as TIMPs) that bind to and inhibit the activity have been found. [J. Biol. Chem. , Vol. 274, 21491-21494, (1999)]. In recent years, at least 30 or more types of new MMP-like proteins (hereinafter, also referred to as ADAM or ADAMTS) having both a metalloprotease-like domain and a disintegrin-like domain in the molecule have been found. Some of ADAM and ADAMTS have also been shown to have MMP-like protease activity, such as ADAM17 (TNFα converting enzyme) and ADAMTS-4, -5 (aggrecanase-I, -II). [Current Opinion in Anti-Inflammation & Immunomodulatory Investigational Drugs, vol. 2, 16-25, (2000)].
[0005]
These enzymes belonging to the MMP family have various functions under physiological conditions, such as development, angiogenesis, estrous cycle, bone remodeling, and tissue repair. In order for these functions to be properly expressed, each step of enzyme production, activation and interaction with the substrate is strictly controlled by an in vivo inhibitor such as TIMP. In other words, it is considered that the destruction of the matrix in the pathological condition is caused by some disruption in the regulatory mechanism of MMP, and excessive production and activation of MMP.
[0006]
Therefore, a drug that inhibits MMP is extremely promising as a drug that suppresses cartilage matrix destruction in joint diseases such as OA and RA. Many drugs that inhibit MMP have been reported so far (Exp. Opin. Ther. Patents (1998) vol. 8, 259-282, J. Enzyme Inhibition (1998) vol. 13, 79-101, Drug) Discovery Today (1996) vol. 1, 16-26, Chem. Rev. (1999) vol. 99, 2735-2776) has been reported to be a matrix metalloprotease inhibitor because of its high inhibitory activity and high specificity for MMP. Hydroxamic acid derivatives have received the most attention (hereinafter also referred to as MMPI). Hydroxamic acid derivatives that exert an MMP inhibitory action even by oral administration have already been found, and some of them are undergoing clinical trials in cancer patients and patients with joint diseases. However, this kind of MMPI has an inhibitory effect on all MMPs to some extent, and may also suppress MMPs related to physiological functions. In fact, ongoing clinical trials of hydroxamic acid derivatives in cancer patients have reported that transient side effects such as bone myalgia occur about 30% of the time [Ann. NY Acad. Sci. , Vol. 878, 228-235, (1999)]. Recently, the development of improved products with increased specificity to specific MMPs has also been promoted. However, MMPs involved only in the disease state have not yet been identified, and unknown MMPs have been discovered one after another. Thus, the possibility of suppressing any physiological action of MMP during systemic administration has not been eliminated.
[0007]
As an attempt to solve these problems, first, local administration of MMPI into the joint cavity can be considered. However, known hydroxamic acid derivatives require frequent intra-articular injections and are extremely difficult to use for long-term use in OA and RA patients. As another attempt, a so-called drug delivery system that limits MMPI to a target site only can be considered. However, the prior art has not established a method for localizing or retaining the administered MMPI in the affected joint.
[0008]
Thus, although MMPI has an excellent pharmacological action, there are still problems to be solved for clinical application as a therapeutic agent for chronic diseases such as OA and RA.
[0009]
By the way, hyaluronic acid (hereinafter, also referred to as HA) is an in-vivo polycarboxylic acid composed of repeating units of N-acetylglucosamine and glucuronic acid. It plays an important role in maintaining load absorption and lubrication. In the cartilage matrix, it binds to cartilage proteoglycan to form a polymer called aggrecan, and plays a central role in maintaining water retention capacity and viscoelasticity.
[0010]
At present, in the case of joint diseases, particularly OA and periarthritis of the shoulder, intra-articular infusion therapy of HA and its cross-linked product (hereinafter, HA and its cross-linked product which are clinically used is also collectively referred to as HA preparation) is used. It is widely practiced clinically. Since HA is a component of the extracellular matrix, HA also has a high affinity for cartilage matrix. In addition, since it has high viscoelasticity itself, it has a feature of being localized in the joint cavity for a long time after being injected into the joint.
[0011]
Attempts to change the physical properties of hyaluronic acid itself in order to enhance the retention in the joint cavity have been reported (JP-A-6-254381, JP-A-11-130697, WO99 / 10385). Such). However, since HA preparations do not have an effect of inhibiting MMP, they cannot be expected to have an effect of sufficiently stopping joint destruction that progresses in the pathological conditions of OA and RA.
[0012]
So far, conjugates of HA and drugs have been reported (JP-A-5-85942, WO92 / 06714, JP-A-62-64802, JP27001865, WO99 / 59603). Such). These are focused on the above-mentioned local storage properties of HA, and are expected to store a drug locally for a long time and prolong the action time of the drug at a specific site.
[0013]
In particular, WO 99/59603 discloses a conjugate of a hydroxamic acid residue and HA, and discloses that the conjugate has an MMP inhibitory action and can be used as a therapeutic agent for joint diseases. . Further improvement of the MMP inhibitory activity and stability of the conjugate specifically disclosed in the publication leads to creation of a very excellent conjugate.
[0014]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a conjugate of a hydroxamic acid derivative and hyaluronic acid having an MMP inhibitory action.
[0015]
Another object of the present invention is to provide a medicament containing the above-mentioned conjugate, which is useful as a therapeutic agent for joint diseases or the like, capable of localizing an MMP inhibitory effect in a joint cavity or on joint tissue.
[0016]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, it has been found that a conjugate obtained by binding a hyaluronic acid derivative to a specific hydroxamic acid derivative is much superior to the conjugate reported so far. They have found that they have inhibitory activity and have completed the present invention.
[0017]
That is, the present invention provides the following general formula (1)
[0018]
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[0019]
(Where
R₁Is a hydrogen atom, a hydroxyl group, a linear or branched alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, a linear or branched alkoxy group having 1 to 8 carbon atoms, or a linear chain having 2 to 8 carbon atoms. Or a branched alkenyl group;
R₂Represents a linear or branched alkyl group having 1 to 8 carbon atoms which may be substituted by a cycloalkyl group having 3 to 10 carbon atoms or by an aryl group having 6 to 14 carbon atoms;
R₃Represents a linear or branched alkyl group having 1 to 8 carbon atoms which may be substituted by a cycloalkyl group having 3 to 10 carbon atoms or by an aryl group having 6 to 14 carbon atoms;
R₄Represents a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 4 carbon atoms;
R₅Is -R₇-R₈-R₉−, Where:
R₇Represents a linear or branched alkylene group having 1 to 8 carbon atoms,
R₈Represents a methylene group or an imino group which may be substituted with a linear or branched alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, or an oxygen atom;
R₉Represents a linear or branched alkylene group having 1 to 10 carbon atoms which may have 1 to 3 oxygen atoms inserted thereinto;
R₆Represents a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 4 carbon atoms;
Also, R₁And R₃May form a ring. )
And a hydroxyl group of hyaluronic acid or a hyaluronic acid derivative or a salt thereof is provided by a carbamate bond.
[0020]
Further, the present invention relates to the following formula (8).
[0021]
Embedded image

[0022]
Reacting a compound represented by the formula: carbodiimides and hyaluronic acid to obtain an activated hyaluronic acid;
[0023]
Embedded image

[0024]
(Where R₁, R₂, R₃, R₄, R₅And R₆Is the same as defined in claim 1;₁₄Represents a protecting group. Reacting with an amine compound represented by the formula:₁₄And a step of deprotecting the conjugate.
[0025]
The present invention also provides a medicament comprising the above conjugate.
WO99 / 59603 discloses a conjugate in which a hydroxamic acid residue is bound to HA via a spacer, but there is no specific disclosure of the conjugate in the present invention.
[0026]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The “hydroxamic acid derivative” in the present invention includes a substance having a hydroxamic acid skeleton (N-hydroxyamide), and specifically, for example, a compound having a group represented by the aforementioned general formula (1), etc. Is included.
[0027]
In the present invention, non-limiting specific examples of the substituent in the general formula (1) include the following contents unless otherwise specified.
R₁Examples of the linear or branched alkyl group having 1 to 8 carbon atoms include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an i-propyl group, an n-butyl group, a sec-butyl group, an isobutyl group, and t. -Butyl group, n-pentyl group, n-hexyl group, n-heptyl group, n-octyl group and the like, among which a methyl group is preferable.
[0028]
R₁Examples of the linear or branched alkoxy group having 1 to 8 carbon atoms include methoxy, ethoxy, propoxy, isopropoxy, butoxy, isobutoxy, sec-butoxy, tert-butoxy, pentyl Examples thereof include an oxy group, a hexyloxy group, a heptyloxy group, an octyloxy group, an isopentyloxy group, and among them, a methoxy group is preferable.
[0029]
R₁Examples of the linear or branched alkenyl group having 2 to 8 carbon atoms include a vinyl group, an allyl group, an n-butenyl group, an i-butenyl group, a sec-butenyl group, a pentenyl group, a hexenyl group, a heptenyl group, Octenyl group and the like.
[0030]
R₁Has the above definition, but R₁Particularly, a hydrogen atom, a hydroxyl group, a methyl group, and a methoxy group are particularly preferable.
R₂Examples of the linear or branched alkyl group having 1 to 8 carbon atoms include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an i-propyl group, an n-butyl group, a sec-butyl group, an isobutyl group, and t. -Butyl group, n-pentyl group, n-hexyl group, n-heptyl group, n-octyl group and the like, among which isobutyl group is preferable.
[0031]
R₂As the cycloalkyl group having 3 to 10 carbon atoms as a substituent of the linear or branched alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, a cycloalkyl group having 5 to 7 carbon atoms is preferable. Include a cyclopentyl group, a cyclohexyl group, and a cycloheptyl group.
[0032]
R₂Examples of the aryl group having 6 to 14 carbon atoms as a substituent of a linear or branched alkyl group having 1 to 8 carbon atoms include a carbon atom which may have a substituent such as a hydroxyl group and a methoxy group. An aryl group having the number of 6 to 14 is exemplified, and specific examples include a phenyl group, a p-hydroxyphenyl group, a p-methoxyphenyl group, and a naphthyl group.
[0033]
R₂Has the above definition, but R₂Is preferably an isobutyl group.
R₃Examples of the linear or branched alkyl group having 1 to 8 carbon atoms include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an i-propyl group, an n-butyl group, a sec-butyl group, an isobutyl group, and t. -Butyl group, n-pentyl group, n-hexyl group, n-heptyl group, n-octyl group and the like, among which t-butyl group is preferable.
[0034]
R₃As the cycloalkyl group having 3 to 10 carbon atoms as a substituent of the linear or branched alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, a cycloalkyl group having 5 to 7 carbon atoms is preferable. Include a cyclopentyl group, a cyclohexyl group, and a cycloheptyl group.
[0035]
R₃The aryl group having 6 to 14 carbon atoms as a substituent of the linear or branched alkyl group having 1 to 8 carbon atoms may have a substituent such as a hydroxyl group or a methoxy group. An aryl group having 6 to 14 carbon atoms is exemplified, and specific examples include a phenyl group, a p-hydroxyphenyl group, a p-methoxyphenyl group, and a naphthyl group.
[0036]
R₁Is a hydrogen atom, a hydroxyl group, a methyl group, or a methoxy group,₃Is preferably a t-butyl group.
R₃Has the above definition, but R₃Is preferably a t-butyl group.
[0037]
R₄Examples of the linear or branched alkyl group having 1 to 4 carbon atoms include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an i-propyl group, an n-butyl group, a sec-butyl group, an isobutyl group, and t. -Butyl group, of which a methyl group is preferred.
[0038]
R₄Are preferably a hydrogen atom and a methyl group, and particularly preferably a hydrogen atom.
R₅-R₇-R₈-R₉In-, R₇Is NR₄And R₉Is NR₆Of N.
[0039]
R₇Examples of the linear or branched alkylene group having 1 to 8 carbon atoms include methylene, ethane-1,2-diyl, propane-1,3-diyl, butane-1,4-diyl, and pentane. -1,5-diyl group, hexane-1,6-diyl group, heptane-1,7-diyl group, octane-1,8-diyl group, 2-methylpentane-1,3-diyl group, 2-methylbutane -1,4-diyl group, 3-methylbutane-1,4-diyl group, 3-methylpentane-1,5-diyl group, 3-ethylpentane-1,5-diyl group, 3-methylhexane-1, Examples thereof include a 6-diyl group, a 4-methylhexane-1,6-diyl group, and a 4-methylheptane-1,7-diyl group.
[0040]
R₇Preferred are an ethane-1,2-diyl group, a propane-1,3-diyl group and a butane-1,4-diyl group.
R₈As a linear or branched alkyl group having 1 to 4 carbon atoms as a substituent in a methylene group or an imino group which may be substituted by a linear or branched alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, , A methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an i-propyl group, an n-butyl group, a sec-butyl group and a t-butyl group.
[0041]
R₈Are preferably a methylene group which may be substituted by a linear or branched alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, and an oxygen atom, and particularly preferably a methylene group and an oxygen atom.
[0042]
R₉Non-limiting specific examples of the linear or branched alkylene group having 1 to 10 carbon atoms which may have 1 to 3 oxygen atoms inserted therein include a methylene group, an ethane-1,2-diyl group , Propane-1,3-diyl, butane-1,4-diyl, pentane-1,5-diyl, hexane-1,6-diyl, heptane-1,7-diyl, octane-1, 8-diyl group, nonane-1,9-diyl group, octane-1,10-diyl group, 2-methylpentane-1,3-diyl group, 2-methylbutane-1,4-diyl group, 3-methylbutane- 1,4-diyl group, 3-methylpentane-1,5-diyl group, 3-ethylpentane-1,5-diyl group, 3-methylhexane-1,6-diyl group, 4-methylhexane-1, 6-diyl group, 4-methylheptane-1,7 Diyl group, 1-oxa-propane-1,3-diyl group, 2-oxabutane-1,4-diyl group, 3-oxapentane-1,5-diyl group, 2-oxahexane-1,6-diyl group , 3-oxahexane-1,6-diyl group, 1,4-dioxahexane-1,6-diyl group, 3-oxaheptane-1,7-diyl group, 2,5-dioxaheptane-1, 7-diyl group, 4-oxaoctane-1,8-diyl group, 2,6-dioxaoctane-1,8-diyl group, 3,6-dioxanonane-1,9-diyl group, 3,6-dioxa -4-Methylnonane-1,9-diyl group, 3,6-dioxa-5-ethylnonane-1,9-diyl group, 1,4,7-trioxaoctane-1,10-diyl group and the like. R₉Preferably include an ethane-1,2-diyl group, a propane-1,3-diyl group, a butane-1,4-diyl group, a 3,6-dioxanonane-1,9-diyl group and the like.
[0043]
R₅Is preferably-(CH₂)₄-,-(CH₂)₅-,-(CH₂)₆-,-(CH₂)₇-,-(CH₂)₈-,-(CH₂)₉-,-(CH₂)₁₀-,-(CH₂)₁₁-,-(CH₂)₁₂-,-(CH₂)₂-O- (CH₂)₂-,-(CH₂)₃-O- (CH₂)₃-,-(CH₂)₄-O- (CH₂)₄-,-(CH₂)₃-O- (CH₂)₂-O- (CH₂)₂-O- (CH₂)₃-And the like. Particularly preferably, R₅Is-(CH₂)₃-O- (CH₂)₂-O- (CH₂)₂-O- (CH₂)₃-.
[0044]
R₆Examples of the linear or branched alkyl group having 1 to 4 carbon atoms include methyl, ethyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl, sec-butyl, isobutyl and t-. A butyl group is mentioned, and among them, a methyl group is preferable.
[0045]
R₆Is preferably a methyl group and a hydrogen atom, and particularly preferably a hydrogen atom.
R₁And R₃Together form a ring, -IJKL- (I is an alkylene group having 1 to 8 carbon atoms which may contain an oxygen atom, J is O, S, NH, CONH or NHCO and K are preferably an aromatic ring which is absent or may have a substituent, and L is an alkylene group having 1 to 8 carbon atoms. At this time, I is R₁From the side, L is R₃Combine from the side. When K represents an aromatic ring, J and L can be respectively bonded to arbitrary positions of the aromatic ring.
[0046]
Non-limiting specific examples of I and L include methylene, ethylene, trimethylene, tetramethylene, and preferably, I includes, for example, trimethylene, and L includes, for example, methylene. K represents an aromatic ring that is absent or may have a substituent. Examples of the aromatic ring include phenyl, tolyl, xylyl, naphthyl, biphenyl, anthryl, phenanthryl, pyridyl, indolyl, quinolyl, imidazolyl and the like. And preferably phenyl.
[0047]
-IJKL- is, for example, R₁The residue from the side is a halogenated alkyl group, preferably a propyl bromide group, R₃It is obtained by condensing a compound in which the residue from the side is an alcohol derivative or phenol derivative having a hydroxyl group, preferably a parahydroxybenzyl group.
[0048]
Non-limiting specific examples of -IJKL- include compounds represented by general formula (2):
[0049]
Embedded image

[0050]
And the like.
The group represented by the general formula (1) is represented by R₂Is preferably an isobutyl group.
The group represented by the general formula (1) is represented by R₁Is a hydroxyl group or a methoxy group, and R₃Is preferably a t-butyl group.
[0051]
The group represented by the general formula (1) is represented by R₁And R₃Is preferably a ring represented by the general formula (2).
The group represented by the general formula (1) is preferably a group represented by any one of the formulas (3) to (7).
[0052]
All of the optical isomers of the general formula (1) and mixtures thereof in any ratio are included in the present invention.
In the present invention, "hyaluronic acid (HA)" refers to a disaccharide polymer composed of glucuronic acid and N-acetylglucosamine having a weight average molecular weight of 50,000 to 10,000,000, and a mixture thereof. No. HA preferably has a weight average molecular weight of 700,000 to 10,000,000 from the viewpoint of viscoelasticity, and particularly preferably has a weight average molecular weight of 1,000,000 to 10,000,000. .
[0053]
In the present invention, the “hyaluronic acid derivative” means any substance having a hyaluronic acid skeleton derived from hyaluronic acid. Non-limiting specific examples of hyaluronic acid derivatives include:
(1) a hyaluronic acid derivative in which glucuronic acid and / or N-acetylglucosamine, which are sugar components, have a reducing end;
(2) a hyaluronic acid derivative in which one or more carboxyl groups in HA are esterified (for example, benzyl esterified HA (Hyaff, registered trademark, Fijia Advanced Biopolymers));
(3) A derivative obtained by crosslinking a disaccharide polymer consisting of glucuronic acid having a weight average molecular weight of 50,000 to 10,000,000 and N-acetylglucosamine with formaldehyde to further polymerize (for example, Synbisc ( Synvisc®, Biomatrix)); and
(4) In addition, one or more active ingredients such as acetylated HA in which one or more hydroxyl groups in HA are acetylated, or the above-mentioned HA or HA derivative, for example, an anticancer agent (for example, an alkylating agent, an antimetabolite, Alkaloids, etc.), immunosuppressants, anti-inflammatory agents (including steroids, non-steroidal anti-inflammatory agents, etc.), anti-rheumatic agents, antibacterials (β-lactam antibiotics, aminoglycoside antibiotics, macro Derivatives, tetracycline antibiotics, new quinolone antibiotics, polypeptide antibiotics, sulfa drugs, etc.) via a spacer or without a spacer.
Is included.
[0054]
Non-limiting specific examples of the salt of HA or the derivative of HA include sodium salt, potassium salt, magnesium salt, calcium salt, aluminum salt and the like.
[0055]
The origin of the HA is not particularly limited. For example, HA derived from bacteria such as streptococci, humans, pigs, chickens, and the like can be used.
Non-limiting specific examples of HA, HA derivatives and their salts include, for example, Svenir (registered trademark, Nippon Roussel), Alz (registered trademark, Kaken Pharmaceutical), Opegan (registered trademark, Santen Pharmaceutical), Hyalgan (registered trademark) , Fidia), Ortobisque (registered trademark, Anica Therapeutics), Hyalon (registered trademark, Pharmacia & Upjohn), etc., and in the catalogs of various reagent manufacturers such as Wako Pure Chemical Industries, Ltd. HA, HA derivatives and salts thereof described above can also be mentioned.
[0056]
In the conjugate of the present invention, the group represented by the general formula (1) and the hydroxyl group of N-acetylglucosamine of HA or an HA derivative or a salt thereof (hereinafter also referred to as “GlcNAc”) form a carbamate bond. Is preferred.
[0057]
Further, the binding ratio of the group represented by the general formula (1) to the number of GlcNAc in HA or an HA derivative or a salt thereof is preferably 0.01 to 50%, and 0.1 to 10%. It is particularly preferred that there is. Here, the “binding rate” refers to the total number of groups represented by the general formula (1) bound to HA relative to the total number of GlcNAc contained in HA or the HA derivative or a salt thereof constituting the conjugate of the present invention. Means the ratio of Such a binding ratio can be calculated, for example, by the method described in Example 2 described later.
[0058]
When the conjugate of the present invention is applied as a medicament, it may be used after being formulated together with a pharmaceutically acceptable excipient or stabilizer.
The administration form of the drug containing the conjugate of the present invention is not particularly limited, and may be oral administration, parenteral administration, systemic administration, or local administration. In general, the medicament of the present invention is preferably administered parenterally and topically. For example, it can be administered as an injection, intraarticularly, intravenously, intramuscularly or subcutaneously, or it can be sprayed or topically administered. It can be administered transdermally as a cream, lotion, or ointment.
[0059]
The medicament containing the conjugate of the present invention can also be used as a therapeutic drug for joint diseases such as osteoarthritis, rheumatoid arthritis or shoulder periarthritis. It is preferably used for producing such a medicament, preferably for producing a therapeutic drug for joint diseases.
[0060]
It is also preferable to administer a pharmaceutical containing a pharmaceutically effective amount of the conjugate of the present invention as an active ingredient to treat a patient having joint disease or the like. In such a case, the dose of the medicament of the present invention can be appropriately selected depending on the condition, age, sex, etc. of the patient. However, when used as an injection, the dose of the conjugate, which is an active ingredient, is generally 0.1%. The dose is from 01 mg / kg of body weight / day to 100 mg / kg of body weight / day, preferably from 0.1 mg / kg of body weight / day to 10 mg / kg of body weight / day. The daily dose of the medicament may be administered in several divided doses a day or once a day. Alternatively, it may be administered once every 2 to 28 days.
[0061]
The method for producing the conjugate of the present invention is not particularly limited. For example, the conjugate can be produced by the method shown below, or by the method shown in Synthesis Examples described later, or by applying the method.
[0062]
That is, a carbodiimide and a compound represented by the formula (8) are added to an aqueous solution of HA or an HA derivative or a salt thereof, and the pH of the reaction solution is adjusted to 4 to 6 using an acid such as hydrochloric acid or phosphoric acid or a buffer. The reaction is carried out at 0 to 35 ° C for 1 to 96 hours while maintaining. Excess low molecular weight substances are removed from the reaction solution by dialysis or the like to obtain activated HA or an HA derivative or a salt thereof. Subsequently, an amine compound represented by the formula (9) is added to the thus-obtained aqueous solution of activated HA or the HA derivative or a salt thereof, and the pH of the reaction solution is adjusted using a base such as sodium hydroxide or triethylamine. The reaction is carried out at 0 to 35 ° C. for 1 to 96 hours while maintaining the temperature at 9 to 12. If the solubility of the amine compound represented by the formula (9) in water used here is low, 1 to 50% of an organic solvent (for example, N, N-dimethylformamide, N-methylpyrrolidone, dioxane, An aqueous solution containing ethanol, pyridine, etc.) may be used as the reaction solvent.
[0063]
After the reaction, an organic solvent such as ethanol or acetone is added to the reaction solution to form a precipitate, and the precipitate is purified by means such as alcohol precipitation, gel filtration, dialysis, ion exchange chromatography, etc. A conjugate can be obtained. If necessary, before or during this purification step, R₁₄(Exposure under acidic conditions of pH 2 to 6 or catalytic reduction).
[0064]
In addition, as the carbodiimides, for example, the following compounds
[0065]
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[0066]
And the like, preferably
[0067]
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[0068]
It is.
R in equation (9)₁, R₂, R₃, R₄, R₅And R₆The non-limiting specific examples of the substituent in are the same as the non-limiting specific examples of the substituent in the above general formula (1) unless otherwise specified.
[0069]
R₁₄(Protecting group)
[0070]
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[0071]
And the like, preferably,
[0072]
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[0073]
It is.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples and Test Examples, but the present invention is not limited to these Examples and Test Examples.
[0074]
【Example】
(Example 1) Synthesis example of hydroxamic acid derivative
N '-(13-Amino-4,7,10-trioxatridecanyl) -N- (3S-hydroxy-4- (N- (1-methoxy-1-methylethoxy) amino) -2R-isobutylsuccinyl ) -Synthesis of L-tert-leucinamide
[0075]
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[0076]
(A) Synthesis of N ′-(13-benzyloxycarbonylamino-4,7,10-trioxatridecanyl) -N- (tert-butoxycarbonyl) -L-tert-leucinamide
[0077]
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[0078]
1-amino-13-benzyloxycarbonylamino-4,7,10-trioxatridecane (7.9 g), N- (tert-butoxycarbonyl) -L-tert-leucine (5.1 g), 1-hydroxy To a mixture of benzotriazole hydrate (3.4 g), dichloromethane (80 ml) and N, N-dimethylformamide (20 ml) was added 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) at -25 ° C. Carbodiimide hydrochloride (EDC) (4.3 g) and triethylamine (3.2 ml) were added, and the mixture was stirred at −25 ° C. for 30 minutes, at 5 ° C. for 1 hour, and further at room temperature for 7 hours. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure, dichloromethane was added to the obtained residue, and the mixture was washed with a 5% aqueous citric acid solution, a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution and a saturated saline solution, and then dried over sodium sulfate. The residue obtained by concentration under reduced pressure was purified by silica gel column chromatography (elution solvent: dichloromethane: methanol = 100: 3) to obtain the title compound (8.2 g).
¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆): Δ 0.88 (9H, s), 1.60 (9H, s), 1.50-1.65 (4H, m), 2.92-3.50 (16H, m), 3.76 ( 1H, d, J = 9.6 Hz), 5.00 (2H, s), 6.30 (1H, d, J = 9.6 Hz), 7.15-7.25 (1H, m), 7. 25-7.40 (5H, m), 7. 80-7.90 (1H, m).
[0079]
(B)N '-(13-benzyloxycarbonylamino-4,7,10-trioxatridecanyl)- Production of L-tert-leucinamide
[0080]
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[0081]
N '-(13-benzyloxycarbonylamino-4,7,10-trioxatridecanyl) -N- (tert-butoxycarbonyl) -L-tert-leucinamide (4.2 g), trifluoroacetic acid (12 ml) ) And dichloromethane (3 ml) were stirred at room temperature for 1 hour. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure, and the obtained residue was purified by silica gel column chromatography (eluent: dichloromethane: methanol: aqueous ammonia = 100: 10: 1) to give the title compound (2.6 g).
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃): Δ 1.01 (9H, s), 1.65-1.80 (4H, m), 1.80-2.80 (2H, br), 3.10-3.65 (17H, m), 5.08 (2H, s), 5.65-5.80 (1H, m), 7.25-7.40 (5H, m), 7. 50-7.65 (1H, m).
[0082]
(C)N '-(13-benzyloxycarbonylamino-4,7,10-trioxatridecanyl) -N- (2R- (2,2-dimethyl-4-oxo-1,3-dioxolan-5S-yl) Production of -4-methylpentanoyl) -L-tert-leucinamide
[0083]
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[0084]
2R- (2,2-dimethyl-4-oxo-1,3-dioxolan-5S-yl) -4-methylpentanoic acid (1.80 g), N ′-(13-benzyloxycarbonylamino-4,7, 10-trioxatridecanyl) -L-tert-leucinamide (3.48 g), 1-hydroxybenzotriazole hydrate (1.20 g), dichloromethane (28.8 ml) and N, N-dimethyl EDC (1.50 g) and triethylamine (1.09 ml) were added to a mixture of formamide (7.2 ml) at -10 ° C, and the mixture was added at -10 ° C for 30 minutes, at 0 ° C for 1 hour, and further at room temperature. Stirred for 16 hours. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure, ethyl acetate was added to the obtained residue, and the mixture was washed with saturated aqueous sodium hydrogen carbonate and saturated brine, and dried over sodium sulfate. The mixture was concentrated under reduced pressure, and the obtained residue was purified by silica gel column chromatography (elution solvent: dichloromethane: methanol = 97: 3) to give the title compound (4.90 g).
¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆): Δ 0.81 (3H, d, J = 6.3 Hz), 0.84 (3H, d, J = 6.3 Hz), 0.90 (9H, s), 1.40-1.64 (7H , M), 1.46 (3H, s), 1.56 (3H, s), 2.94-3.10 (5H, m), 3.25-3.51 (12H, m), 4. 23 (1H, d, J = 9.6 Hz), 4.42 (1H, d, J = 8.7 Hz), 5.00 (2H, s), 7.19-7.24 (1H, m), 7.27-7.40 (5H, m), 7.81-7.87 (1H, m), 7.99-8.06 (1H, m).
[0085]
(D)N '-(13-benzyloxycarbonylamino-4,7,10-trioxatridecanyl) -N- (3S-hydroxy-4- (N-hydroxyamino Preparation of) -2R-isobutylsuccinyl) -L-tert-leucinamide
[0086]
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[0087]
A mixture of hydroxylammonium chloride (0.43 g) and a 1N sodium methoxide-methanol solution (6 ml) was stirred at room temperature for 2 hours. The insolubles were filtered off from the reaction mixture, and the obtained filtrate was filtered at N '-(13-benzyloxycarbonylamino-4,7,10-trioxatridecanyl) -N- (2R- (2,2-dimethyl 4-oxo-1,3-dioxolan-5S-yl) -4-methylpentanoyl) -L-tert-leucinamide (0.95 g) and methanol (10 ml). Stirred for hours. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure, and the obtained residue was purified by silica gel carm chromatography (elution solvent: dichloromethane: methanol = 10: 1) to obtain the title compound (0.84 g).
¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆): Δ 0.77 (3H, d, J = 6.3 Hz), 0.80 (3H, d, J = 6.3 Hz), 0.90 (9H, s), 1.30-1.52 (3H , M), 1.54-1.68 (4H, m), 2.65-2.73 (1H, m), 3.00-3.12 (4H, m), 3.24-3.52. (12H, m), 3.70 (1H, t, J = 8.3 Hz), 4.19 (1H, d, J = 9.6 Hz), 5.00 (2H, s), 5.30 (1H) , D, J = 8.3 Hz), 7.18-7.24 (1H, m), 7.26-7.39 (5H, m), 7.43-7.49 (1H, m), 7 .88-7.94 (1H, m), 8.86 (1H, d, J = 1.6 Hz), 10.55 (1H, d, J = 1.6 Hz).
[0088]
(E)N '-(13-benzyloxycarbonylamino-4,7,10-trioxatridecanyl) -N- (3S-hydroxy-4- (N- (1-methoxy- Preparation of 1-methylethoxy) amino) -2R-isobutylsuccinyl) -L-tert-leucinamide
[0089]
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[0090]
N '-(13-benzyloxycarbonylamino-4,7,10-trioxatridecanyl) -N- (3S-hydroxy-4- (N-hydroxyamino) -2R-isobutylsuccinyl) -L-tert- 2-Methoxypropene (0.24 ml) was added dropwise to a mixture of leucinamide (0.84 g), pyridinium p-toluenesulfonate (20 mg) and dichloromethane (40 ml) at room temperature, and the mixture was further stirred at room temperature for 50 minutes. did. The reaction mixture was washed with saturated aqueous sodium hydrogen carbonate and saturated brine, dried over sodium sulfate, and concentrated under reduced pressure. The title compound (0.86 g) was obtained.
¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆): Δ 0.77 (3H, d, J = 6.6 Hz), 0.79 (3H, d, J = 6.6 Hz), 0.90 (9H, s), 0.90-1.06 (1H , M), 1.29 (3H, s), 1.30 (3H, s), 1.30-1.68 (6H, m), 2.62-2.76 (1H, m), 3. 3. 00-3.15 (4H, m), 3.22 (3H, s), 3.26-3.52 (12H, m), 3.81 (1H, t, J = 8.3 Hz), 19 (1H, d, J = 8.9 Hz), 5.00 (2H, s), 5.41 (1H, d, J = 8.3 Hz), 7.19-7.26 (1H, m), 7.27-7.42 (5H, m), 7.45-7.50 (1H, m), 7.89-7.99 (1H, m), 10.41 (1H, s).
[0091]
(F)N '-(13-amino-4,7,10-trioxatridecanyl) -N Production of-(3S-hydroxy-4- (N- (1-methoxy-1-methylethoxy) amino) -2R-isobutylsuccinyl) -L-tert-leucinamide
[0092]
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[0093]
N '-(13-benzyloxycarbonylamino-4,7,10-trioxatridecanyl) -N- (3S-hydroxy-4- (N- (1-methoxy-1-methylethoxy) amino) -2R A mixture of -isobutylsuccinyl) -L-tert-leucinamide (0.86 g), 10% palladium-carbon (0.30 g) and methanol (50 ml) was stirred at room temperature under a hydrogen atmosphere for 4 hours. After the catalyst was filtered off from the reaction mixture, it was concentrated under reduced pressure to obtain the title compound (0.66 g).
¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆): Δ 0.77 (3H, d, J = 6.6 Hz), 0.80 (3H, d, J = 6.6 Hz), 0.90 (9H, s), 0.90-1.02 (1H , M), 1.29 (3H, s), 1.30 (3H, s), 1.30-1.65 (6H, m), 2.56 (2H, d, J = 6.6 Hz), 2.63-2.74 (1H, m), 3.03-3.14 (2H, m), 3.22 (3H, s), 3.22-3.53 (12H, m), 3. 81 (1H, d, J = 8.3 Hz), 4.19 (1H, d, J = 9.6 Hz), 7.47-7.51 (1H, m), 7.92-7.99 (1H , M).
[0094]
(Example 2) Synthesis example of conjugate of the present invention
[0095]
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[0096]
Hyaluronic acid sodium salt (600 mg, weight average molecular weight: about 2.2 million) was dissolved in distilled water (60 ml), and pyridine (1.2 ml), 1N hydrochloric acid (12 ml) and distilled water (46. 8 ml), and N-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide (HONB) (1.068 g) and EDC (1.152 g) were further added. And left overnight. To stop the reaction, a 2% sodium acetate solution (pH 6.0) (60 ml) was added, followed by stirring at 4 ° C. for 30 minutes. This solution was dialyzed at 4 ° C. for 6 hours using a dialysis membrane (molecular weight cutoff 12,000 to 14,000, manufactured by Sanko Junyaku) using ion-exchanged water as an external solution. The solution after dialysis was added to the hydroxamic acid derivative obtained in Example 1, N '-(13-amino-4,7,10-trioxatridecanyl) -N- (3S-hydroxy-4- (N After adding a 25 mM aqueous solution (20 ml) of-(1-methoxy-1-methylethoxy) amino) -2R-isobutylsuccinyl) -L-tert-leucinamide, a 0.1N aqueous sodium hydroxide solution was added. The mixture was adjusted to pH 9.2 and stirred at 4 ° C for 22 hours. Then, the pH was adjusted to 10.9 by further adding a 0.1N aqueous sodium hydroxide solution, and the mixture was stirred at 4 ° C for 1 day. After sodium chloride (8.4 g) was added to this solution, ethanol (500 ml) was added dropwise to precipitate ethanol, and the precipitate was separated from the supernatant by centrifugation. The precipitate was dissolved in ultrapure water (360 ml), sodium chloride (14 g) was added, and the solution was filtered through a 0.45 μm membrane filter (manufactured by Millipore) in a clean bench, and ethanol 900 was added. Ethanol was precipitated by dropping ml. After the precipitate was separated by centrifugation, it was dissolved again in a 0.5 M sodium chloride solution (180 ml), and 450 ml of ethanol was added dropwise to precipitate ethanol. The precipitate was separated by centrifugation and dissolved in 30 ml of physiological saline (Otsuka) to obtain an aqueous solution of the title compound (conjugate). The molecular weight of the obtained conjugate was determined by gel filtration using hyaluronic acid as a standard substance and found to be about 1,640,000. The concentration of the aqueous conjugate solution was 1% (w / v). Further, the obtained conjugate is hydrolyzed with hydrochloric acid, and the amount of t-Leu in the conjugate is measured using an amino acid analyzer, whereby N ′-(13-amino-4,7,10-trioxalic acid is obtained. Tridecanyl) -N- (3S-hydroxy-4- (N- (1-methoxy-1-methylethoxy) amino) -2R-isobutylsuccinyl) -L-tert-leucinamide in hyaluronic acid sodium salt The calculated binding rate to N-acetylglucosamine was 3.8%.¹H-NMR (500 MHz, D₂O): δ 0.78 (d), 0.80 (d), 0.92 (s), 1.04-1.12 (m), 1.27-1.39 (m), 1.39- 1.60 (m), 1.46 to 1.54 (m), 1.64 (br.s), 1.67-1.76 (m), 1.94 (br.s), 2.78 -2.87 (m), 2.94 (br.s) 3.03-3.14 (m), 3.19 (m), 3.29 (br.s), 3.35 (br.s) ), 3.45 (br.s), 3.48 (m), 3.59 (s), 3.61 (s), 3.78 (br.s), 4.04 (d), 10 (s), 4.40 (br.s), 4.49 (br.s), 4.58 (br.s), 6.17 (br.s), 6.21 (br.s), 6.42 (br.s).
[0097]
From the above NMR data, it was confirmed that the protecting group had been removed and the constituent components of the conjugate. That is,
(1) Since the singlet signals around 1.30 and 3.22 derived from the 1-methoxy-1-methylethyl group as the protecting group disappear, the protecting group has been removed.
(2) Signals derived from hyaluronic acid such as 3.29, 3.45, 3.78 ppm, and signals derived from hydroxamic acid derivatives such as 0.78, 0.80, 0.92, 4.04, 4.10 ppm In addition, signals at 6.17, 6.21, and 6.42 ppm were observed. These signals at 6.17, 6.21, and 6.42 ppm are signals derived from the olefin position of HONB.
(3) Although the signal at the olefin position of HONB is originally observed as a singlet signal (6.02 ppm) for two protons, two singlet signals (a pair of 6.17 ppm and 6.42 ppm, and (A pair of 6.21 ppm and 6.42 ppm). Since the equivalent proton changed non-equivalently, it was suggested that HONB exists in a ring-opened form.
[0098]
(Example 3) Acquisition and analysis of a conjugate of oligo HA (unsaturated disaccharide) and a hydroxamic acid derivative
The conjugate obtained in Example 2 (conjugate of HA and a hydroxamic acid derivative, hereinafter also referred to as “conjugate A”) was prepared from a Streptococcus dysgalactiae-derived hyaluronidase (manufactured by Seikagaku Corporation, trade name: “Hialuronida- The enzyme was digested into oligo HA (unconjugated) and a conjugate of oligo HA (unsaturated disaccharide) and a hydroxamic acid derivative using the following conditions. “Hyaluronidase SD” cleaves the β-N-acetyl-D-glucosaminyl (1 → 4) glucuronic acid bond of HA in an elimination reaction, leaving Δ-4,5-glucuronic acid residue at the non-reducing end. It is an enzyme that produces an unsaturated disaccharide having a group.
[Enzyme digestion conditions]
In 40 mM phosphate buffer (pH 6.0).
Concentration of conjugate A: 0.4% (w / v) as HA.
Hyaluronidase SD concentration: 0.5 U / ml (1 U is the amount of enzyme that releases 1 μmol of unsaturated disaccharide from HA per minute at pH 6.2 and 37 ° C.).
37 ° C, 20 hours.
[0099]
The reaction was stopped by heat-treating the reaction solution (100 ° C., 5 minutes). The obtained heat-treated solution was filtered through a filter (a membrane filter having a pore size of 0.45 μm, manufactured by Millipore) to collect a filtrate. The obtained filtrate is subjected to reverse phase chromatography-fractionation under the following conditions to remove oligo HA (unbound) passing through the reverse phase column, and to remove oligo HA (unsaturated disaccharide) eluted by acetonitrile gradient. Fractions of the conjugate with the hydroxamic acid derivative were collected.
[Reverse phase chromatography conditions]
Apparatus used: SMART System (Pharmacia).
Reversed phase column: μRPC C2 / C18 PC3.2 / 3 (Pharmacia).
Flow rate: 200 μl / min.
Eluent composition: 0 min-5 min water + 0.1% TFA (trifluoroacetic acid).
[0100]
5-30 minutes 0-50% acetonitrile linear gradient (0.1% TFA.)
Sample: 100 μl of the above filtrate / chromatography.
Detection: 205 nm.
Number of fractions: 2 times.
[0101]
In the above reverse phase chromatography, the 205 nm peak portion eluted at around 15 minutes was fractionated as a fraction of a conjugate of oligo HA (unsaturated disaccharide) and a hydroxamic acid derivative, and the two portions were combined and frozen. Dried.
[0102]
LC / MS analysis was performed on a sample obtained by dissolving the lyophilized product in 50% methanol. The LC / MS analysis was performed by electrospray ionization (ESI) and sonics pre-ionization (SSI) under the following conditions.
[LC / MS conditions]
Apparatus: Hitachi M-1200H.
Sample introduction: Flow injection method.
[0103]
Mobile phase: 50% methanol.
Flow rate: 50 μl / min.
Ionization method: ESI (positive ion mode).
[0104]
Drift 30V, atomizer temperature 250 ° C, pore temperature 120 ° C.
SSI (positive ion mode).
Nitrogen gas flow rate 3 L / min.
[0105]
The mass detected by the ESI method was m / z = 1083. The mass detected by the SSI method was m / z = 1105. From this result and the above-mentioned NMR measurement result, the ring-opening component of HONB in the conjugate of oligo HA (unsaturated disaccharide) and the hydroxamic acid derivative generated by enzymatic digestion was found to be due to any of the hydroxyl groups of the unsaturated disaccharide. It was confirmed that it was bound to. In the ESI method, the mass is a positive ionized mass by adding one sodium ion, and in the SSI method, the mass is a positive ionized mass by desorbing one proton and adding two sodium ions.
[0106]
(Example 4) Acquisition and analysis of a conjugate of N-acetylglucosamine and a hydroxamic acid derivative
The conjugate A obtained in Example 2 was hydrolyzed to bind to the β-N-acetyl-D-glucosaminyl (1 → 4) glucuronic acid bond of sheep testis-derived hyaluronidase (Sigma, Type V, HA). Under the following conditions, an oligo HA (unconjugated) and a conjugate of oligo HA and a hydroxamic acid derivative were digested under the following conditions.
[Enzyme digestion conditions]
In 40 mM phosphate buffer (pH 6.0).
Concentration of conjugate A: 0.4% (w / v) as HA.
Hyaluronidase concentration: 10,000 U / ml (Sigma activity).
37 ° C., 31 hours.
[0107]
The reaction was stopped by heat-treating the reaction solution (100 ° C., 5 minutes). The obtained heat-treated solution was filtered through a filter (a membrane filter having a pore size of 0.45 μm, manufactured by Millipore) to collect a filtrate.
[0108]
250 μl of the filtrate was applied to a SEP-PAK C18 cartridge (manufactured by Waters), and 5 ml of water was passed through to remove the oligo HA (non-conjugated substance) that passed through. Subsequently, 5 ml of a 20% acetonitrile solution was passed to obtain a fraction of a conjugated oligo HA and a hydroxamic acid derivative which was eluted.
[0109]
The obtained 20% acetonitrile-eluted fraction was freeze-dried and subjected to the following further enzymatic degradation.
The whole amount of the lyophilized product was converted to oligo HA, a β-glucuronidase derived from bovine liver (manufactured by Sigma, type B-10, an enzyme that catalyzes the reaction of hydrolyzing β-glucuronide to release D-glucuronic acid). To release the non-reducing terminal D-glucuronic acid) under the following conditions.
[Enzyme digestion conditions]
In a 20 mM acetate buffer (pH 4.6).
β-glucuronidase: 20,000 U / ml (indicated activity by Sigma).
Reaction solution volume: 400 μl.
37 ° C., 21 hours.
[0110]
The reaction was stopped by heat-treating the reaction solution (100 ° C., 5 minutes). The obtained heat-treated solution was filtered through a filter (a membrane filter having a pore size of 0.45 μm, manufactured by Millipore) to collect a filtrate.
[0111]
Further, a conjugate of oligo HA and a hydroxamic acid derivative contained in the filtrate was converted to a chondroitinase derived from Arthrobacter aurescens (manufactured by Seikagaku Corporation, trade name "Chondroitinase-ACII Arturo", chondroitin sulfate, hyaluronic acid, etc.). Of an oligo HA (non-conjugated product), N-acetylglucosamine and a hydroxamic acid derivative under the following conditions using an enzyme capable of eliminating and decomposing a β-1,4-hexosaminide bond to produce an unsaturated disaccharide: Digested with conjugate.
[Enzyme digestion conditions]
In 40 mM phosphate buffer (pH 6.0).
Chondroitinase ACII Arthro: 5 U / ml (Seikagaku Corporation activity).
The above filtrate: 350 μl.
Reaction solution volume: 400 μl.
37 ° C., 20 hours.
[0112]
The reaction was stopped by heat-treating the reaction solution (100 ° C., 5 minutes). The obtained heat-treated solution was filtered through a filter (a membrane filter having a pore size of 0.45 μm, manufactured by Millipore), and the filtrate was recovered.
[0113]
The obtained filtrate is subjected to reverse phase chromatography-fractionation under the following conditions to remove oligo HA and the like (non-conjugated substance) passing through the reverse phase column, and to elute N-acetylglucosamine and hydroxamic acid derivative eluted by acetonitrile gradient. Fractions of the conjugate with were collected.
[Reverse phase chromatography conditions]
Apparatus used: SMART System (Pharmacia).
Reversed phase column: μRPC C2 / C18 PC3.2 / 3 (Pharmacia).
Flow rate: 200 μl / min.
Eluent composition: 0 min-5 min water + 0.1% TFA (trifluoroacetic acid).
[0114]
5-30 minutes 0-50% acetonitrile linear gradient (0.1% TFA).
Sample: 100 μl of the above filtrate / chromatography.
Detection: 205 nm.
Number of fractions: 3 times.
[0115]
In the above reverse phase chromatography, a 205 nm peak portion eluted at around 16 minutes was fractionated as a fraction of a conjugate of N-acetylglucosamine and a hydroxamic acid derivative, and the fraction was combined and freeze-dried.
[0116]
LC / MS analysis was performed on a sample obtained by dissolving the lyophilized product in 50% methanol. The LC / MS analysis was performed by electrospray ionization (ESI) and sonics pre-ionization (SSI) under the following conditions.
[LC / MS conditions]
Apparatus: Hitachi M-1200H.
Sample introduction: Flow injection method.
[0117]
Mobile phase: 50% methanol.
Flow rate: 50 μl / min.
Ionization method:
ESI (positive ion mode): drift 30V, atomizer temperature 250 ° C, pore temperature 120 ° C.
[0118]
SSI (positive ion mode): Nitrogen gas flow rate 3 L / min.
In both the ESI method and the SSI method, the detected mass was m / z = 925. From this result, it was found that the ring-opening component of HONB in the conjugate of N-acetylglucosamine and the hydroxamic acid derivative generated by enzymatic digestion was bonded to the hydroxyl group of N-acetylglucosamine. In both the ESI method and the SSI method, the mass is a positive ionized mass obtained by adding one sodium ion.
[0119]
(Test Example 1) MMP inhibitory activity
The inhibitory activity of conjugate A synthesized by the method described in Example 2 on gelatinase A and stromelysin-1 was measured. For comparison, the same measurement was performed for “conjugate 7” described in Example 8 of WO99 / 59603. The inhibitory activity on gelatinase A was determined by activating gelatinase A (1.2 U) by Roche Diagnostics Inc. according to the attached protocol using a kit for measuring gelatinase activity. At 37 ° C. for 1 hour. The enzyme inhibitory activity against stromelysin-1 was determined by using a stomalysin activity measuring kit (manufactured by Yagai Co., Ltd.) at 37 ° C. and 3.5 with activated stromelysin-1 (0.2 U) according to the attached protocol. The time was measured for the enzymatic reaction.
[0120]
The enzyme inhibitory activity is determined by the concentration of each conjugate required to suppress each enzyme activity by 50% when conjugate A and conjugate 7 are not added (IC₅₀, Μg / mL, expressed by the concentration of each conjugate converted into hyaluronic acid). The results are shown in Table 1. Conjugate A had 5 to 40 times the MMP inhibitory activity as compared to Conjugate 7.
[0121]
[Table 1]

[0122]
(Test Example 2) Rabbit articular cartilage collagen destruction inhibitory activity
Conjugate A synthesized by the method described in Example 2 above was prepared using the method of Saito et al. [J. Biochem. , 122, 49-54 (1997)]. For comparison, a similar test was performed on “conjugate 7” described in Example 8 of WO99 / 59603.
[0123]
A knee joint cartilage fragment (about 10 mg) derived from a 5-7 week-old male rabbit was placed on a culture plate supplemented with 500 μL of Dulbecco's modified Eagle 'Medium (DMEM) (Falcon, 48-well flat bottom culture). Plate, # 3078) at 37 ° C.₂The cells were cultured for 24 hours in an incubator. After exchanging the culture solution with 500 μL of DMEM containing 0.2% lactalbumin, conjugate A or conjugate 7 was added, and Inter-leukin 1 (manufactured by R & D, human interleukin-1α, # 200-LA) was added. (1 ng / mL) and human plasminogen (manufactured by Sigma, # P7397) (100 μg / mL) at 37 ° C.₂The cells were further cultured in an incubator for 10 days (n = 4 to 6). After completion of the culture, the culture supernatant and the joint piece residue were collected. Joint residue was digested with papain (Sigma, # P3375) at a final concentration of 4.5 mg / mL at 60 ° C. overnight. The culture supernatant and the digested solution of the joint residue obtained by papain treatment were used as samples, concentrated hydrochloric acid was added to each to a final concentration of 6N, and the mixture was hydrolyzed with an autoclave at 110 ° C for 2 hours. went. N for each sample₂After spraying the gas to dryness, it was dissolved in a 0.1 mol / L phosphate buffer containing 5 mmol / L EDTA, and the amount of hydroxyproline in each sample was measured by a colorimetric method (560 nm). It was measured (Benchmark Microplate Reader, manufactured by Biorad).
[0124]
From the amount of hydroxyproline released from the joint piece into the culture supernatant and the amount of hydroxyproline in the residue of the joint piece, the release rate of hydroxyproline was calculated according to the following formula.
[0125]
(Equation 1)

[0126]
Rabbit articular cartilage collagen destruction inhibitory activity was determined by measuring the concentration of each conjugate required to suppress the hydroxyproline release rate by 50% by IL-1 and plasminogen when conjugate A or conjugate 7 was not added (IC₅₀, Μg / mL, expressed by the concentration of each conjugate converted into hyaluronic acid). The results are shown in Table 2. Conjugate A had about five times the activity of inhibiting the destruction of articular cartilage collagen in comparison with Conjugate 7.
[0127]
[Table 2]

[0128]
【The invention's effect】
The conjugate of the present invention has an excellent MMP inhibitory action, and can limit and prolong the action. The conjugate of the present invention is an excellent osteoarthritis and rheumatoid arthritis as a drug having improved utility as both a therapeutic drug for joint disease and a drug for HA, for example, a drug having an enhanced joint destruction inhibitory action. Or it is expected to be a therapeutic agent for shoulder periarthritis.

Claims (13)

The following general formula (1)

(Where
R ₁ is a hydrogen atom, a hydroxyl group, a linear or branched alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, a linear or branched alkoxy group having 1 to 8 carbon atoms, or a 2 to 8 carbon atoms. Represents a linear or branched alkenyl group;
R ₂ represents a linear or branched alkyl group having 1 to 8 carbon atoms which may be substituted by a cycloalkyl group having 3 to 10 carbon atoms or by an aryl group having 6 to 14 carbon atoms. ;
R ₃ represents a linear or branched alkyl group having 1 to 8 carbon atoms which may be substituted by a cycloalkyl group having 3 to 10 carbon atoms or by an aryl group having 6 to 14 carbon atoms. ;
R ₄ represents a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 4 carbon atoms;
R _{5 is, -R} 7 -R 8 -R ₉ - represents the, here,
R ₇ represents a linear or branched alkylene group having 1 to 8 carbon atoms;
R ₈ represents a methylene group or an imino group which may be substituted with a linear or branched alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, or an oxygen atom;
R ₉ represents a linear or branched alkylene group having 1 to 10 carbon atoms to which 1 to 3 oxygen atoms may be inserted;
R ₆ represents a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 4 carbon atoms;
R ₁ and R ₃ may form a ring. )
And a hydroxyl group of hyaluronic acid, a hyaluronic acid derivative or a salt thereof, and a carbamate bond. The conjugate according to claim 1, wherein the group represented by the general formula (1) and a hydroxyl group of N-acetylglucosamine which is a constituent component of hyaluronic acid or a hyaluronic acid derivative or a salt thereof are carbamate-bonded. 3. The conjugate according to claim 1, wherein in the general formula (1), R ₂ is an isobutyl group. In the general formula (1), R ₁ is a hydrogen atom, a hydroxyl group, a methyl group, or a methoxy group, and R ₃ is a t-butyl group, or R ₁ and R ₃ are a group represented by the general formula (2)

The conjugate according to any one of claims 1 to 3, which forms a ring represented by the formula: The group represented by the general formula (1) is represented by the following formulas (3) to (7)

The conjugate according to any one of claims 1 to 4, wherein the conjugate is selected from the group consisting of: The binding ratio of the group represented by the general formula (1) to the number of N-acetylglucosamine in hyaluronic acid or a hyaluronic acid derivative or a salt thereof is 0.01 to 50%. The conjugate of claim 1. Equation (8)

Reacting the compound represented by the formula, carbodiimides, and hyaluronic acid to obtain activated hyaluronic acid;
The activated hyaluronic acid and formula (9)

(Wherein R ₁ , R ₂ , R ₃ , R ₄ , R ₅ and R ₆ are the same as defined in claim 1, and R ₁₄ represents a protecting group). Reacting;
The R ₁₄ in the reaction product obtained and deprotecting;
The method for producing a conjugate according to claim 1, comprising: A medicament comprising the conjugate according to any one of claims 1 to 6. The medicament according to claim 8, which is a therapeutic agent for joint diseases. The medicament according to claim 9, wherein the joint disease is osteoarthritis, rheumatoid arthritis, or shoulder periarthritis. Use of the conjugate according to any one of claims 1 to 6 for producing a medicament. Use of the conjugate according to any one of claims 1 to 6 for producing an agent for treating a joint disease. A method for treating a patient having a joint disease, comprising administering to the patient a pharmaceutically effective amount of a medicament comprising the conjugate according to any one of claims 1 to 6 as an active ingredient. Including methods.