JP4820991B2 - 酵母細胞を用いたインフルエンザウイルスゲノムの複製・転写系 - Google Patents
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Description
細胞おいて発現する系に関する。
、ゲノムをプラス鎖RNAとしてもつウイルスは、そのRNAゲノムのみで感染性をもつことがわかっている(非特許文献1参照)。よって、試験管内で合成したウイルスゲノムRNAを
細胞に導入すれば、それらウイルスゲノムから転写・複製が起こる。DNAウイルスと同様
に、プラス鎖RNAウイルスも、再構成したウイルスRNAゲノムを細胞内に導入し、ウイルス増殖過程を解析できたことから、転写・複製などの分子機構が明らかとなり、それに伴い必要な宿主因子が同定されてきている(例えば非特許文献2、3および4を参照)。
ルスにおいて、再構成したゲノムRNAを用いた細胞内での解析は他のウイルスよりも遅れ
ていた。
)。しかし、それらはウイルス性因子を標的とした解析がほとんどで、宿主因子の機能解析を行っている例は少ない。また、現在の系では機能的な宿主因子を同定することも困難である。そのため、インフルエンザウイルス増殖に関与する未知の宿主因子を同定できる新たな系の開発が望まれている。
Neumann G ら、J Gen Virol, Vol.83, p2635-2662 (2002) Kushmer D.B ら、 Proc Natl Acad Sci USA, Vol.100, p15764-15769 (2003) Panavas T ら、 Proc Natl Acad Sci USA, Vol.102, p7326-7331 (2005) Ahlquist P ら、J Virol, Vol.77, p8181-8186 (2003) Luytjes W ら、Cell, Vol.59, p1107-1113 (1989) Yamanaka K ら、Proc Natl Acad Sci USA, Vol.88, p5369-5373 (1991) Neumann G ら、Proc Natl Acad Sci USA, Vol.96, p9345-9350 (1990)
を起こさせることに初めて成功した。次に上記課題を解決するための手段として、本発明の構成を示す。
細胞に導入することにより、そのマイナス鎖RNAゲノムを該酵母細胞で複製・転写を行わ
せることを特徴としている。
前記の導入は、酵母のスフェロプラストを調製し、ポリエチレングリコールの存在下で、精製したvRNPを混合することによる。
酵母細胞に導入し、遺伝子の複製と発現を該酵母細胞内で行わせることを可能としたインフルエンザウイルスゲノム複製系の作成方法である。
スクリーニング方法である。
ス剤のスクリーニング方法も本発明に含まれる。
外来レポーター遺伝子の発現を測定することにより、インフルエンザウイルスの酵母内ゲノムの複製活性または転写活性、ウイルス因子−宿主因子の相互作用、あるいは宿主因子のウイルス増殖促進作用に影響を及ぼす抗インフルエンザウイルス候補物質の作用を調べるためのキットがある。
発明に含まれる。
本明細書で使用している用語と表現はあくまで説明上のものであって、限定的なものではない。使用される遺伝子工学上の用語、例えば「トランスフェクション、トランスフェクト」、さらに「ウイルス因子」、「宿主因子」、「プラス鎖」および「マイナス鎖」などの意味は、通常、当業者が認識している定義と同一である。
工学的に操作されたものも含む)が導入されたとき、そのゲノムの複製および転写について導入されたウイルスゲノムが活性であることをいう。
ゲノムは「感染性」であり、同様に追求が進んだ6-9。これに対してマイナス鎖RNAウイルスのゲノムRNAは感染性はなく、ビリオンから単離されたvRNP複合体が感染性を示す10。
よって、細胞内において簡易にマイナス鎖RNAゲノムからの複製を再現させることはでき
ず解析が遅れている。
っている。インフルエンザウイルスのRNAゲノムは、PB1、PB2およびPAサブユニットから
なるRNA依存性RNAポリメラーゼおよび核タンパク質(NP)(これらは「ウイルス因子」である)に結合して、ウイルスRNA-タンパク質複合体(vRNP)を形成する11。このvRNPが、ウイルスゲノムの転写および複製に必要な基本構造体である。
とを特徴としている。
ウイルスゲノムの発現によるウイルス増殖や病原性に関わる宿主細胞側の因子の同定と機能の解明などに関する研究が一層進み、これにより集積された知見を基に効率的な抗ウイルス剤の開発が促進される。
ンザウイルスは、遺伝的変容が速く、新興または再興の種が出現しやすく、現在も有効なインフルエンザワクチンの製造を困難にしている。インフルエンザワクチン、抗インフルエンザ剤の開発を支援するインフルエンザウイルスゲノムの操作技術の確立が一刻も早く求められている。
が望ましい。
を酵母細胞に導入し、遺伝子の複製と発現を該酵母細胞内で行わせることを可能としたインフルエンザウイルスゲノム複製系の作成方法、も含まれる。この方法においては、インフルエンザウイルスゲノムの遺伝子発現制御部分を残し、オープンリーディングフレーム部分をレポーター遺伝子に置き換えたモデルウイルスゲノムを酵母に導入して、このモデルウイルスゲノムの複製とレポーター遺伝子の転写と発現を行うことができる系が作成される。
遺伝子が選択される。
要素とすることもできる。これらの試薬の中には、プライマー、各種酵素類、緩衝液、洗浄液、溶解液なども含まれる。
本発明のさらなる方法として
前記の方法で作成されたマイナス鎖RNAウイルスの酵母内ゲノム複製系を用いて、マイ
ナス鎖RNAウイルスのウイルス因子と宿主因子の相互作用を探索するスクリーニング方法
がある。さらに、宿主因子とウイルス因子との相互作用を標的とする化合物を見出せば、ウイルスの複製に影響を及ぼし、抗ウイルス剤の有力な候補物質となる可能性がある。そうした化合物探索のためのスクリーニング方法も本発明に含まれる。
相補的なプラス鎖に転写し、合成されたmRNAを利用してウイルスタンパク質が作られる。ゲノムRNAを転写する酵素、ウイルスRNA依存性RNAポリメラーゼは宿主細胞には存在しな
い。その酵素はウイルスゲノムにコードされ、予め、ウイルス粒子の中でゲノムRNAに結
合して存在し、感染によりウイルスゲノムとともに細胞内に侵入し、感染直後の「転写」を行っている。一方、マイナス鎖RNAゲノムからは、完全に相補的なプラス鎖RNA(cRNA)を経由して、子孫ウイルスのマイナス鎖RNAが合成される。上記RNAポリメラーゼは、この一連の「複製」過程にも関与している。細胞の中には多種類の細胞性RNAがあるにも関らず
、感染細胞では、ウイルスRNAだけが転写され、複製されるので、ウイルスRNAポリメラーゼは、細胞のRNAと、ウイルスのRNAを区別しているに違いない。このようにウイルスゲノムの複製と転写に関わる中心的な酵素はウイルスRNA依存性RNAポリメラーゼである。しかし、それだけでは足りず、充分な複製と転写には、それらの反応の場である感染細胞の核
や、または細胞質に存在する宿主因子の助けが必要であると考えられる。
以上より、特にインフルエンザウイルスの場合、前記の方法で作成されたインフルエンザウイルスの酵母内ゲノム複製系を用いる、ウイルスゲノムの複製と転写に関わる宿主因子のスクリーニング方法が、ウイルスゲノム機能にかかわる宿主因子の探索と解明に必要である。そうした宿主因子の同定および機能の解析は、改良型抗ウイルス剤、あるいは新たな概念に基づく次世代型の抗ウイルス剤の開発に多大な貢献をすると期待される。
た外来レポーター遺伝子の発現を測定することにより、酵母内ウイルスゲノムの複製活性または転写活性、ウイルス因子−宿主因子の相互作用、あるいは宿主因子によりウイルス増殖促進作用に影響を及ぼす抗インフルエンザウイルス候補物質の作用を調べるためのキットもまた、上記スクリーニングの実施に有用である。そのために必要な材料、試薬、プロトコルなどが一セットとして含まれる。
も本発明に含まれる。そうしたマイナス鎖RNAウイルスゲノムとして、例えばインフルエ
ンザウイルスゲノムがあり、あるいは外来レポーター遺伝子が組込まれたマイナス鎖RNA
ゲノムでもよい。
・酵母株と酵母細胞中へのDNA、RNAおよびvRNPの導入
酵母株YPH499(MATa、ura3-52、lys2-801、ade2-101、trp1-63、his3-200、leu2-1)がすべての実験において使用された。SUB2欠損株は、SUB2オープンリーディングフレーム全体を、TRP1(SUB2D::TRP1フラグメント)で置換することにより取得した。酵母細胞をプラ
スミドDNAで形質転換するために、酢酸リチウム−ポリエチレングリコール法が使用され
た。RNAおよびvRNPの導入は、RNA形質転換について記載された操作に基づき、若干の変更を加えて実施された(方法2の項参照)。
酵母細胞から全RNAの抽出は、方法2の項に記載したようにして行なわれた。インフル
エンザウイルスRNA(vRNA、cRNAおよびmRNA)、細胞内mRNA(ACT1、ADH1およびSUB2)お
よびrRNA(RDN25-1)の検出のために、リバーストランスクリプターゼ(TOYOBO)および特異
的プライマーを用いて、cDNAが合成された。本研究に使用されたすべてのプライマーの配列が、表1〜3にまとめられている。cDNAは、Taq DNAポリメラーゼ(NEB)およびプライマーセットを用いるPCRにかけられた。増幅された2本鎖DNAは、7%ポリアクリルアミドゲル
電気泳動法によって分離され、臭化エチジウムにより可視化された。
酵母細胞の間接蛍光抗体法が、抗NP抗体を使用し、以前の文献に記載されたように22、実施された。DNAは、DAPI染色によって可視化された。
本明細書におけるすべてのウイルスの供給は、インフルエンザA/プエルトリコ/8/34(PR/8)ウイルスに由来する。ビリオンの精製およびそれからのvRNP複合体の単離は既に記載
されたようにして行なった23。セグメント5 vRNAを欠損するvRNPを調製するために、10 mlのvRNA (10 ml に1 mg のNPを含有する)が、5 M NaCl 0.6 ml、セグメント5 vRNAの一部に相補的なオリゴヌクレオチド(Segment 5 digestion: 表5より)100 ngの存在下で、37℃、5分間、インキュベートされた。次いで混合物は12.5 mM Tris-HCl (pH 7.9)(5 mM MgCl2および1.25 mM Dithiothreitolを含有)、40 mlを添加することにより希釈した。30 UのRNase H(TaKaRa)が添加され、反応混合物はさらに37℃、5分間インキュベートされた
。反応中のオリゴヌクレオチドは、4 UのRQ DNase I(Invitrogen)を用いて、25 U のRNase阻害剤(TOYOBO)の存在下で、37℃、10分間、完全に消化された。
T7 RNAポリメラーゼによるin vitro転写のためのDNA鋳型を構築するために、yEGFP(酵母内の遺伝子発現に最適化されたコドンに改変した緑色蛍光タンパク質)遺伝子を含むDNAフラグメント(非構造タンパク質(NS)をコードする、インフルエンザAウイルス(PR/8)セグメント8 vRNAの5'-末端配列および3'-末端配列で挟まれる)は、プライマーとして、NS-yEGFP-FOR NS-yEGFP-REV、鋳型にpRGO1(yEGFPをコードする)を用いるPCRによって
増幅された。増幅されたフラグメントはNS-yEGFP DNAと名づけた。T7プロモーター配列を付加するために、プライマーセットとして、T7 vNS-FORおよびyNS-REVあるいはT7 cNS-FORおよびcNS-REVのいずれかを用いて、鋳型にNS-yEGFP DNAフラグメントを使用し、PCRに
より伸長が実施された。vNS-yEGFPおよびcNS-yEGFP RNAは、T7 RNAポリメラーゼ(TaKaRa)および増幅DNAフラグメントを含む転写反応において合成された。
対数増殖している酵母細胞を低速度遠心分離により回収し、0.9% NaClで2回洗浄した。細胞は、Zymolyase-100T(生化学工業), 100 mg/ml を含有する緩衝液(50 mM Tris-HCl (pH 7.4)、 5 mM MgCl2、1 M Sorbitol、3 mM Dithiothreitol)に懸濁した。時折撹拌し
ながら、30℃で60分間インキュベートした。低速度遠心分離によりスフェロプラストを回収し、細胞溶解緩衝液(50 mM Tris-HCl (pH 7.4)、150 mM NaCl、0.1% NP-40、 7 M Urea)に再懸濁し、超音波処理により細胞溶解を行なった。細胞溶解液は遠心分離により残渣
を除き、7.5% SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(SDS-PAGE)、次いで抗ウイルスタ
ンパク質抗体を用いるウェスタンブロッティング法を実施した(抗体の調製方法は、方法2の項参照)。
in vitroインフルエンザウイルスRNA合成を、以前の文献の方法に従い行った13。簡単
に記すと、50 mM HEPES-NaOH (pH7.9)、 3 mM MgCl2、50 mM KCl、1.5 mM Dithiotheitol
、 ATP、CTP、UTPの各500 mM、25 mMのGTP、5 mCiの[a-32P] GTP(3,000 Ci/mmole)、4 U
のRNase阻害剤、250 mMのApGジヌクレオチド、10 ngの53ヌクレオチド長のマイナス鎖モ
デルRNA鋳型(53 merVwt: 表5より)ならびに酵素源としてvRNP(10 ng のNPを含有する
)を含有する最終容量25 mlで、37℃、60分間、RNA合成が実施された。RNA生成物は、尿
素(8 M)変性10% PAGEを通す分離にかけ、オートラジオグラフィーにより可視化された。
・酵母の株および培養条件
すべての実験で酵母株YPH499(MATa, ura3-52, lys2-801, ade2-101, trp1-63, his3-200, leu2-1)を使用した。酵母細胞はアデニンを含有する酵母抽出液−ペプトン−デキストロース培地(YPDA)において、30℃で増殖させた。ガラクトースにより誘導されるタンパク質発現のために、単一のコロニーをまず2%グルコースを含む合成限定(SD)培地へ植えた。酵母細胞は、610 nmでの光学密度(OD610)が0.6-0.8に達するまで、30℃で増殖させた。それから酵母細胞を800 x gでの遠心分離により回収し、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で2
回洗浄した。集められた酵母細胞を、2% ガラクトースを含有する合成ガラクトース培地(SG)において6-12時間培養して、タンパク質発現を誘導させた。
で置換することにより取得した(Lorenzら)。SUB2遺伝子のプロモーターおよびターミネーターのフラグメントは、プライマーとして、上流側フラグメントにSUB2 up-FORおよびSUB2 up-REV、下流側フラグメントにSUB2 down-FOR、SUB2 down-REVを用いて、PCRにより
増幅した。鋳型として酵母細胞ゲノムDNAを使用した。上流側フラグメントを、Kpn IおよびSma Iを用いて消化し、Kpn IおよびSma I消化pBluescript(pBS)プラスミドにクローニ
ングした。生成したプラスミドを、pBS-SUB2-upstreamと名づけた。下流側フラグメント
を、T4 ポリヌクレオチドキナーゼ(TOYOBO)でリン酸化し、一方、BamH Iで消化しKlenow fragment(TaKaRa)で平滑化したpBS-SUB2-upstreamプラスミドにクローニングした。形成
されたプラスミドはpBS-SUB2と名づけられ、プロモーターおよびターミネーターのフラグメント間にユニークなSma I部位を有していた。
されたTRP1遺伝子フラグメントは、Klenow fragmentにより平滑化し、Sma I消化pBS-SUB2プラスミドにクローニングした。
から切り出され、酵母株YPH499を形質転換するために使用された。TRP1形質転換体は、TRP1表現型の安定性について試験された。SUB2欠損は、RT-PCRおよびゲノムPCRにより確認
された。
プラスミドDNAで酵母細胞を形質転換するために、酢酸リチウム-ポリエチレングリコール法が使用された(Itoら)。RNAおよびvRNPの導入は、RNAの形質転換について記載され
た操作(Russellら)に基づき、若干変更して実施した。
te(pH 5.8)、 10 mM EDTA、30 mM 2-Mercaptoethanol)に再懸濁した。酵母が含まれる
懸濁液にZymolyase-100Tを125 Uとなるように加え、30℃で時折撹拌しながら保温した。
スフェロプラストを低速遠心で集め、20 mlの1 M Sorbitol溶液により洗浄し、20 mlのSTC溶液(1 M Sorbitol、10 mM Tris-HCl (pH 7.4)、10 mM CaCl2)に再懸濁した。スフェ
ロプラストは、遠心分離により集めて、2 mlのSTC溶液に再懸濁した。スフェロプラスト
にRNAまたはvRNPを導入するために、スフェロプラスト(100 ml)とvRNPまたはNS-yEGFP RNAとを混合し、室温で10分間インキュベートし、その後1 mlのPEG溶液(20% polyethylene glycol 6000、10 mM Tris-HCl (pH 7.4)、10 mM CaCl2)を加えた。静かに混ぜて、さらに室温で10分間静置し、スフェロプラストを遠心分離で集め、上清を捨て1 mlのSOS溶液(1 M Sorbitol、6.5 mM CaCl2、 50% YPDAまたは50% SD)に再懸濁した。
酵母細胞からの全RNAの抽出は、以前(Leedsら)に記載されたようにして行なった。
セグメント5 vRNA検出用のcDNAは、リバーストランスクリプターゼ(TOYOBO)により、プライマーとしてNP-FORを用いて合成された。この1本鎖cDNAは、2個の特異的プライマー、NP
444-FORおよびNP 614-REVを用いて、PCR増幅された。
ーとしてoligo-dTを用いて合成された。
酵母のACT1 mRNAについて、センスプライマーにACT1-FOR、アンチセンスプライマーにACT1-REVが、PCR増幅のために使用された。
SUB2 mRNAについて、センスプライマーにSUB2 1062-FOR、アンチセンスプライマーにSUB2-REVが、PCRのために使用された。
酵母ゲノムにあるTRP1遺伝子の検出のために、TRP1フラグメントが、プライマーとしてTRP1-FORおよびTRP1-REVを使用し、鋳型として酵母ゲノムDNAを用いてPCRにより増幅した。増幅した2本鎖DNAは7%ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけて臭化エチジウムにより可視化した。
次のプラスミドが、酵母細胞内でインフルエンザウイルスのRNAポリメラーゼサブユニ
ットおよびNPを発現させるために構築された。
は、Hind IIIおよびSpe Iによって消化し、Hind IIIおよびXba I消化pYES2プラスミドに
クローニングした。形成されたプラスミド、pYES2-CYC1 TTは、GAL-1プロモーターとCYC1-TTとの間に、ユニークなHind III、Bgl II、Sma Iおよび Bst E II部位を含んでいる。
プライマーとしてPB1-FORおよびPB1-REV2、鋳型としてpcDNA-PB1(Neumannら)を用いるPCRにより増幅された。PCR産物は、T4ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、Hind III
を用いて消化してからSma IおよびHind III消化pYES2-CYC1 TTにクローニングした。
プライマーとしてPB2-FOR1およびPB2-REV2、鋳型としてpcDNA-PB2(Neumannら)を用いるPCRにより増幅された。PCR産物は、T4ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、BamH Iを用いて消化してからSma IおよびBgl I消化pYES2-CYC1 TTにクローニングした。
ライマーとしてPA-FORおよびPA-REV、鋳型としてpcDNA-PA(Neumannら)を用いるPCRにより増幅された。PCR産物は、T4ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、BamH Iを用いて
消化してからSma IおよびBgl I消化pYES2-CYC1 TTにクローニングした。
およびXba Iを用いてpYES2-PB1-CYC1 TT、pYES2-PB2-CYC1 TTおよびpYES2-PA-CYC1 TTか
ら切り出して、pRS514、pRS317およびpRS315のXba I部位にクローニングした。
ら)を用いるPCRにより増幅された。PCR産物は、BamH IおよびEcoR Iを用いて消化してからBamH I およびEcoR I 消化pYES2プラスミドにクローニングした。
PB1、PB2およびPAに対するウサギポリクローナル抗体を、2ヶ月齢の雌ウサギ(Japan White;東京実験動物)に、フロインド完全アジュバント(Sigma)中にある、それぞれ250 mgのヘキサヒスチジン−タグ(His-)PB1フラグメント、His-PB2フラグメントおよびHis-PA
フラグメントを免疫することにより産生した。
、Klenow fragment処理)部位との間でクローニングされた。
対応するDNAフラグメントは、pcDNA-PB2から、特異的プライマーとしてPB2-FOR 2およびPB2-REV 2を用いてPCRにより増幅された。PCR産物はXho Iで消化され、Xho I消化pET-14b
プラスミドにクローニングされた。
ら;Takizawaら)。これらのプラスミドは、大腸菌BL21(DE3)の形質転換に使用された。
不溶性フラクションとして回収された組換えタンパク質は、グアニジン緩衝液(20 mM Tris-HCl (pH7.4)、6 M Guanidine hydrochoride、500 mM NaCl)を用いて可溶化された。可
溶化された組換えタンパク質は、pET System Manual(Novagen)の推奨プロトコルに従って、6 M 塩酸グアニジン存在下で、ヒスチジンタグ結合樹脂を用いて精製した。上記の動物は、2週のインターバルで、フロインド不完全アジュバント中にある150 mgの各タンパク
質を用いて3回、免疫した。いずれの抗体も、ウェスタンブロッティングにおいて、希釈
後の各抗体の力価が他のものと正確に同一となるように適切に希釈して免疫学的手法に使用した。
完全長SUB2遺伝子が、プライマーとしてSUB2-FOR(His-)およびSUB2-REV、鋳型として酵母ゲノムDNAを用いてPCRにより増幅した。PCR産物は、T4ポリヌクレオチドキナーゼで
リン酸化し、EcoR V消化pBSにクローニングした。生成プラスミドを、pBS-His-SUB2とし
て名づけた。
プラスミドが、大腸菌BL21(DE3)の形質転換に使用された。His-SUB2タンパク質がヒスチ
ジンタグ結合樹脂を用いて精製された。His-RAF-2p48/UAP56の調製が、既報(Momoseら)の通りに行なわれた。
Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K. & Kimura, A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J Bacteriol 153, 163-168 (1983).
Kawaguchi, A., Naito, T. & Nagata, K. Involvement of influenza virus PA subunit in assembly of functional RNA polymerase complexes. J Virol 79, 732-744 (2005). Leeds, P., Peltz, S. W., Jacobson, A. & Culbertson, M. R. The product of the
yeast UPF1 gene is required for rapid turnover of mRNAs containing a premature translational termination codon. Genes Dev 5, 2303-2314 (1991).
Lorenz, M. C. et al. Gene disruption with PCR products in Saccharomyces
cerevisiae. Gene 158, 113-117 (1995).
Momose, F. et al. Cellular splicing factor RAF-2p48/NPI-5/BAT1/UAP56 interacts with the influenza virus nucleoprotein and enhances viral RNA synthesis. J Virol 75, 1899-1908 (2001).
Neumann, G. et al. Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs.
Proc Natl Acad Sci U S A 96, 9345-9350 (1999).
Russell, P. J., Hambidge, S. J. & Kirkegaard, K. Direct introduction and transient expression of capped and non-capped RNA in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res 19, 4949-4953 (1991).
Takizawa, N. et al. Microbes and Infection in press.
Turan, K. et al. Nuclear MxA proteins form a complex with influenza virus NP and
inhibit the transcription of the engineered influenza virus genome. Nucleic Acids Res 32, 643-652 (2004).
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により
限定するものではない。
用いた酵母は、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)のYPH499株を使用した。酵母を50
mlの完全培地中(YPDA: yeast extract-peptone-dextrose medium containing adenine)
で細胞密度が3 x107 cells/mlになるまで30℃で培養した。その後、酵母細胞を遠心機で
集め(800 x g、2分間)、上清を捨て20 mlの0.9% NaCl溶液に懸濁した。酵母細胞を遠心機で集め(800 x g、2分間)、上清を捨て20 mlの1 M Sorbitol溶液に懸濁した。酵母細胞を遠心機で集め(800 x g、2分間)、上清を捨て20 mlのSCEM溶液(1 M Sorbitol、 0.1
M Sodium citrate (pH 5.8)、 10 mM EDTA、30 mM 2-Mercaptoethanol)に懸濁した。酵
母が含まれる懸濁液にZymolyase-100Tを125 Uとなるように加え、30℃で45分から60分間
保温した。酵母細胞の細胞壁が破壊されていることを顕微鏡で確認した後、遠心機で集め(400 x g、1分間)、上清を捨て20 mlの1 M Sorbitol溶液に懸濁した。酵母細胞を遠心
機で集め(400 x g、1分間)、上清を捨て20 mlのSTC溶液(1 M Sorbitol、10 mM Tris-HCl (pH 7.4)、10 mM CaCl2)に懸濁した。酵母細胞を遠心機で集め(400 x g、1分間)、上清を捨て2 mlのSTC溶液に懸濁した。この酵母懸濁液100 mlにvRNPを3-20 mlを加えて静かに混ぜ、室温で10分間静置した。その後、1 mlのPEG溶液(20% polyethylene glycol 6000、10 mM Tris-HCl (pH 7.4)、10 mM CaCl2)を加えて静かに混ぜ、室温で10分間静置し
た。酵母細胞を遠心機で集め(400 x g、1分間)、上清を捨て1から2 mlのSOS溶液(1 M Sorbitol、6.5 mM CaCl2、50% YPDA)に懸濁し30℃で培養した。
まず、ビリオンから精製されたvRNPが酵母細胞において感染性であるかどうか調べるために、上記のようにしてvRNPを酵母細胞に導入した。ウイルスRNA、すなわちvRNA、cRNA
(相補的RNA、つまりvRNA増幅の鋳型)およびウイルスmRNAの合成量を、RT-PCR法により
解析した(図1a)。vRNPがトランスフェクトされた酵母細胞において合成されるウイルスRNA量は、トランスフェクトされたvRNPの量に応じて増加した。このことは他のウイルスRNAセグメントについても同様である(データは示さず)。これらの結果は、ウイルスRNA
ポリメラーゼおよびNPが酵母細胞において活性であることを示している。ウイルス感染した哺乳類細胞において、最初の転写は、感染するvRNPに依存するが、ウイルスゲノムの複製には、新しく合成されるウイルスタンパク質が必要とされる4。vRNPがトランスフェク
トされた酵母細胞が、シクロヘキシミド(CHX)で処理されると、ウイルスRNAの合成レベルは激減した(図1b)。よって、酵母内のウイルスRNA合成が、新しく合成されるウイルス
タンパク質に依存していることがわかる。ウイルスmRNAの合成もまたCHX処理に感受性が
あることから、ウイルスmRNAのほとんどは、この系において、新規に合成されたvRNAを鋳型として合成していることを示唆している。さらに酵母細胞においてこのように合成されたウイルスmRNAが機能することもわかった。間接蛍光抗体法から(図1c-k)、NPがvRNPをトランスフェクトした酵母細胞では検出されたが、CHX処理した細胞では検出されなかっ
た(図1f)。トランスフェクトする前に、vRNPをRNase Aで処理すると、NPの発現は消失
した(図1i)。これは、ウイルス遺伝子の発現が、vRNP複合体に含まれるvRNAに依存していることを示す。以上より酵母細胞は、トランスフェクトされるvRNPに依存するウイルス遺伝子転写、およびウイルスゲノム複製を支えていると結論された。
a 酵母スフェロプラストは、偽トランスフェクトされる(レーン1)か、あるいはビリオンから精製されたvRNPでトランスフェクトされた(レーン2、3、4および5についてそれぞれ0.1、0.3、1および2 mgのNPを含むvRNPをトランスフェクションした)。トランスフェ
クション後(hpt)48時間で、酵母全RNAが抽出され、逆転写反応にかけられた。ACT1 mRNA
およびセグメント5のマイナス-センスRNA (vRNA)に特異的なプライマーセット、ならびにプラス-センスRNA(mRNA、cRNA)に特異的なプライマーセットを使用してPCRが行なわれた
。増幅された2本鎖DNAは、7%ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって分離され、臭化エチジウムにより可視化されている。
トされた。RT-PCRがセグメント3 RNAおよびACT1 mRNAに特異的なプライマーを用いて行なわれた。
overlay NP染色およびDAPI染色のパネル(e、h、k)の重ねあわせである。酵母細胞は、5 mg/ml CHXの非存在下(c-e、I-k)ならびに存在下(f-h)でインキュベートされた。トランスフェクションに先立ち、vRNPは、37℃で10分間、RNase Aで処理された(i-k)。
NPをコードするセグメント5 vRNAを欠いているvRNP複合体について、NP発現酵母細胞を用いて相補する実験を行なった。NPは、vRNP複合体の形成およびウイルスRNA鎖の伸長反
応に必要とされる。vRNP複合体からセグメント5 vRNAを、RNase Hを用いて、セグメント5
vRNAの一部に相補的なオリゴヌクレオチドの存在下で、除去した12(方法2の項を参照)。RNase H処理によって、セグメント5 vRNAの量は著しく減少し、消化後に、いくつかの
切断されたバンドが出現した(図2a)。次に、セグメント5 vRNAを欠いているvRNP複合体(以後、欠損vRNPと記す)ならびに偽消化vRNP複合体が酵母細胞に導入された。pYES2ま
たはpYES2-PB2を用いて形質転換された酵母細胞において、欠損vRNPはcRNA合成をもたら
さなかった(図2b、レーン3および9)。対照的にpYES2-NPで形質転換された酵母細胞では、cRNA合成を検出できた(図2b、レーン6)。NPおよびPB2の発現が図2cで確認できる。これらの結果から、欠損vRNPを使用し、そのためにNPの発現を欠いている系をプラスミドより発現させたNPが相補することが示された。さらに酵母細胞におけるそうした複製過程はNPに依存することもわかった。
a セグメント5 vRNAの消化
vRNP(3 mgのNPを含有する)を、0.4 M NaCl存在下で、セグメント5 vRNAの一部(方法1;Seg 5 digestion)に相当するオリゴヌクレオチド300 ngと37℃、5分間、混合した。
次に37℃、5分間、30 UのRNase Hで処理(レーン1)または偽処理(レーン2)した。精製RNAを、7.7 M尿素を含む3.2%ポリアクリルアミドゲルにかけて銀染色により可視化した。
*印は、消化されたフラグメントにおそらく相当するバンドを指示している。
vRNPおよびセグメント5 vRNAを欠いているvRNP (RNase H消化)が、pYES2(レーン1-3)、pYES2-NP(レーン4-6)、ならびにpYES2-PB2(レーン7-9)で形質転換された酵母細胞
にトランスフェクトされた。酵母細胞は、ガラクトース含有培地に24時間インキュベートされた。RT-PCR解析が、セグメント3 cRNAおよびADH1 mRNAに特異的なプライマーを用い
て行なわれた。
コントロール(レーン1および2)、NP(レーン3および4)、PB2(レーン5および6)
次に、vRNP複合体を構成しているウイルス性因子全部を、プラスミドより発現させ置換することの試みがなされた。GAL-1プロモーターによる調節の下で、PB1、PB2、PAおよびNPを発現するプラスミドを構築した(方法2の項を参照)。ガラクトースによる誘導後、これらのプラスミドを一緒に用いて形質転換された酵母細胞において各ウイルスタンパク質が合成された(図3y)。T7 RNAポリメラーゼによるin vitro転写系を用いて1,2、マイナ
ス鎖モデルウイルスRNAおよびプラス鎖モデルウイルスRNA、すなわちモデルvRNAおよびモデルcRNA(yEGFPコード領域は、NSをコードするセグメント8 vRNAの5'-末端配列および3'-末端配列で挟まれる)を調製したが、それぞれvNS-yEGFP、vNS-yEGFPと言う。ウイルスRNAポリメラーゼおよびNPを発現している酵母細胞が、in vitroで合成されたNS-yEGFP RNAでトランスフェクトされた。ガラクトース誘導により3つのウイルスRNAポリメラーゼサブユニットとNPが発現する酵母細胞において、yEGFP発現が、両方のセンスのNS-yEGFP RNA
から検出された(図3hおよび3t)。酵母細胞の5-10%が、検出できるレベルのyEGFPの発現した(データは示さず)。全く対照的に、3つのポリメラーゼサブユニットのうちのいず
れかを欠くか、あるいはNPを欠いている酵母細胞は、yEGFPの発現を示さなかった(図3i-lおよび3u-x)。
ポリメラーゼサブユニットおよびNPを必要とすることがわかった。
a-x yEGFP遺伝子を含むモデルウイルスRNAゲノムからのyEGFP発現
ウイルスRNAポリメラーゼサブユニット(PB1、PB2およびPA)およびNPを発現している
酵母スフェロプラストは、vNS-yEGFP(マイナス-センス、a-l)あるいはcNS-yEGFP(プラス-センス、m-x)のin vitroで合成されたRNAでトランスフェクトされた。次いでSD(グ
ルコース)またはSG(ガラクトース)培地で30℃、24時間インキュベートした。DAPI染色DNA(a-fおよびm-r)ならびにyEGFP(g-lおよびs-x)が蛍光顕微鏡下で可視化された。
y 誘導発現されたウイルスタンパク質のウェスタンブロッティング解析
酵母細胞は図の上部に示すようなプラスミドで形質転換された。SD(レーン1)またはSG(レーン2-6)のいずれかで対数増殖している形質転換体から調製された溶解液をウェスタンブロッティング解析にかけた。
以前に宿主因子と同定13された、RAF-2p48のウイルスRNA合成に与える機能を上記の系
を使用し検討した。RAF-2p48は、NP-RNA複合体形成を促進し、モデルウイルスRNAからのin vitro RNA合成を促進する。RAF-2p48は、RNAスプライシング因子であるUAP56と同一で
ある。SUB2は、RAF-2p48/UAP56の推定上S. cerevisiaeオルソログ(orthologue)であるが
、これはSm snRNPと結合し、細胞機能の維持に働いている14。
でのSUB2の遺伝的解析に先行して、SUB2がin vitroでインフルエンザウイルスRNA合成を
促進するかどうかを調べた。組換え体RAF-2p48/UAP56およびSUB2タンパク質は、ともにin
vitro RNA合成を促進した(図4a)。SUB2のウイルスRNA合成促進活性は、RAF-2p48/UAP56の50%ほどであった。この結果から、SUB2が酵母細胞内のウイルスゲノム複製に対し、宿主因子として機能するかも知れない。そこで、酵母細胞におけるウイルスRNA合成に対す
るSUB2欠損の効果について調べられた。
図4b、右パネル)(方法2の項参照)、SUB2 mRNAが発現されないことが判明した(図4b、左パネル)。vRNPをトランスフェクトしたSUB2欠損株において、cRNA合成は、野生型株のそれと比べると著しく低下した(図4c、レーン4および8と比較せよ(PCRサイクル;26)
)。このことは、その欠損効果はcRNA合成の方が大きいけれども、mRNA合成の場合にも同様に当てはまる。以上のことからSUB2は、酵母細胞の宿主因子として、ウイルスRNA合成
を促進することが示唆される。vRNPをトランスフェクションした酵母を、より長くインキュベーションすると、SUB2欠損株におけるウイルスRNA合成活性は野生型株より低下して
いるがRNA合成量が蓄積し、回復してくる。(図4c、レーン3および8と比較せよ)。そこ
で酵母はSUB2機能を相補する別の宿主因子を持つのではないかと推定される。このことから、SUB2欠損株は致死的ではないと考えられる(データを示さず)。
ると示唆される。本発明の酵母系は、さらに多くの宿主因子候補を同定することが可能である。候補物質が挙がれば、脊椎動物の培養細胞の系に戻り、その候補の実証と特徴が明らかにされる。
a 組替え体RAF-2p48およびSUB2タンパク質のウイルスRNA合成促進作用
in vitro RNA合成が、組換え体RAF-2p48 (レーン2-4)、SUB2 (レーン5-7)、ウシ血清アルブミン(BSA、レーン8-10)の存在下(10 ng(レーン2、5、8)、30 ng(レーン3
、6、9)、100 ng(レーン4、7、10))、または非存在下(レーン1)で行なわれた。53塩
基モデルウイルスゲノムからのRNA産物は、矢じり形で示した。
びSUB2欠損株からそれぞれ調製)を用いて実施した。SUB2、ADH1 mRNA、TRP1遺伝子に特
異的なプライマーセットを使用した。
野生型株およびSUB2欠損株をvRNPでトランスフェクトし、9時間(レーン2および6)、12時間(レーン3および7)および15時間(レーン4および8)インキュベートしてから全RNAを抽出した。RT-PCRを、セグメント7 cRNAとRDN25-1 rRNAに特異的なプライマーセットを使用して行なった。偽トランスフェクトした酵母細胞から抽出した全RNAもまた解析した
(レーン1および5)。
系は、ウイルス因子および/またはウイルス因子と宿主因子との相互作用をターゲットと
する抗インフルエンザ薬剤のスクリーニングに適用されることは強調されてもよい。
1. Luytjes, W., Krystal, M., Enami, M., Pavin, J. D. & Palese, P. Amplification,expression, and packaging of foreign gene by influenza virus. Cell 59, 1107-1113
(1989).
2. Yamanaka, K., Ogasawara, N., Yoshikawa, H., Ishihama, A. & Nagata, K. In vivo
analysis of the promoter structure of the influenza virus RNA genome using a transfection system with an engineered RNA. Proc Natl Acad Sci U S A 88, 5369-5373
(1991).
3. Neumann, G. et al. Generation of influenza A viruses entirely from cloned
cDNAs. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 9345-9350 (1999).
4. Kawaguchi, A., Naito, T. & Nagata, K. Involvement of influenza virus PA subunit in assembly of functional RNA polymerase complexes. J Virol 79, 732-744 (2005).
5. Taubenberger, J. K. et al. Characterization of the 1918 influenza virus
polymerase genes. Nature 437, 889-893 (2005).
6. Ahlquist, P., Noueiry, A. O., Lee, W. M., Kushner, D. B. & Dye, B. T. Host
factors in positive-strand RNA virus genome replication. J Virol 77, 8181-8186
(2003).
7. Prentice, E., McAuliffe, J., Lu, X., Subbarao, K. & Denison, M. R. Identification and characterization of severe acute respiratory syndrome coronavirus replicase proteins. J Virol 78, 9977-9986 (2004).
8. Scholle, F., Girard, Y. A., Zhao, Q., Higgs, S. & Mason, P. W. trans-PackagedWest Nile virus-like particles: infectious properties in vitro and in infected
mosquito vectors. J Virol 78, 11605-11614 (2004).
9. Lindenbach, B. D. et al. Complete replication of hepatitis C virus in cell culture. Science 309, 623-626 (2005).
10. Rochovansky, O. M. & Hirst, G. K. Infectivity and marker rescue activity of influenza virus ribonucleoprotein-polymerase complexes. Virology 73, 339-349
(1976).
11. Portela, A. & Digard, P. The influenza virus nucleoprotein: a ultifunctional
RNA-binding protein pivotal to virus replication. J Gen Virol 83, 723-734 (2002).
12. Enami, M. & Enami, K. Characterization of influenza virus NS1 protein by
using a novel helper-virus-free reverse genetic system. J Virol 74, 5556-5561
(2000).
13. Momose, F. et al. Cellular splicing factor RAF-2p48/NPI-5/BAT1/UAP56 interacts with the influenza virus nucleoprotein and enhances viral RNA synthesis. J Virol 75, 1899-1908 (2001).
14. Noble, S. M. & Guthrie, C. Identification of novel genes required for yeast pre-mRNA splicing by means of cold-sensitive mutations. Genetics 143, 67-80 (1996).
15. Libri, D., Graziani, N., Saguez, C. & Boulay, J. Multiple roles for the yeast SUB2/yUAP56 gene in splicing. Genes Dev 15, 36-41 (2001).
16. Momose, F. et al. Identification of Hsp90 as a stimulatory host factor involved in influenza virus RNA synthesis. J Biol Chem 277, 45306-45314 (2002).
17. Wolff, T., O'Neill, R. E. & Palese, P. Interaction cloning of NS1-I, a humanprotein that binds to the nonstructural NS1 proteins of influenza A and B viruses. J Virol 70, 5363-5372 (1996).
18. Elton, D. et al. Interaction of the influenza virus nucleoprotein with the cellular CRM1-mediated nuclear export pathway. J Virol 75, 408-419 (2001).
19. Huarte, M., Sanz-Ezquerro, J. J., Roncal, F., Ortin, J. & Nieto, A. PA subunit from influenza virus polymerase complex interacts with a cellular protein with homology to a family of transcriptional activators. J Virol 75, 8597-8604 (2001).
20. Panavas, T., Serviene, E., Brasher, J. & Nagy, P. D. Yeast genome-wide screen reveals dissimilar sets of host genes affecting replication of RNA viruses. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 7326-7331 (2005).
21. Kushner, D. B. et al. Systematic, genome-wide identification of host genes
affecting replication of a positive-strand RNA virus. Proc Natl Acad Sci U S A
100, 15764-15769 (2003).
22. Spector, L. D. Cells: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y, 106.3-106.7 (1998).
23. Yamanaka, K., Ishihama, A. & Nagata, K. Reconstitution of influenza virus
RNA-nucleoprotein complexes structurally resembling native viral ribonucleoprotein cores. J Biol Chem 265, 11151-11155 (1990).
Claims (8)
- インフルエンザウイルス粒子より精製したウイルスRNA-ウイルスRNAポリメラーゼ-ヌクレオカプシドタンパク質複合体(vRNP)を酵母細胞に導入することにより、該酵母細胞でそのインフルエンザウイルスRNAゲノムの複製・転写を行わせることを特徴とする、インフルエンザウイルスの酵母内ゲノム複製系の作成方法。
- 前記の導入が、酵母のスフェロプラストを調製し、ポリエチレングリコールの存在下で、精製したvRNPを混合することによる、請求項1に記載の作成方法。
- 外来レポーター遺伝子を組込んだモデルインフルエンザウイルスRNAゲノムと、インフルエンザウイルスのRNAポリメラーゼおよびヌクレオカプシドタンパク質の発現用ベクターとを酵母細胞に導入することにより、当該モデルインフルエンザウイルスRNAゲノムの複製およびその遺伝子の発現を該酵母細胞内で行わせることを特徴とする、インフルエンザウイルスの酵母内ゲノム複製系の作成方法。
- 酵母細胞、インフルエンザウイルス粒子より精製したウイルスRNA-ウイルスRNAポリメラーゼ-ヌクレオカプシドタンパク質複合体(vRNP)、酵母細胞スフェロプラスト調製用の試薬類、トランスフェクション用試薬類、インフルエンザウイルスタンパク質発現用ベクターを少なくとも含む、インフルエンザウイルスゲノム複製系を作成するためのキット。
- 請求項1〜3のいずれかに記載の方法で作成されたインフルエンザウイルスの酵母内ゲノム複製系を用いる、インフルエンザウイルスRNAゲノムの複製と転写に関わる宿主因子のスクリーニング方法。
- 請求項1〜3のいずれかに記載の方法で作成されたインフルエンザウイルスの酵母内ゲノム複製系を用いる、インフルエンザウイルスRNAゲノムの複製活性または転写活性、ウイルス因子−宿主因子の相互作用、あるいは宿主因子のウイルス増殖促進作用を作用の標的とする、抗インフルエンザウイルス剤のスクリーニング方法。
- 外来レポーター遺伝子を組込んだモデルインフルエンザウイルスRNAゲノム、インフルエンザウイルスのRNAポリメラーゼおよびヌクレオカプシドタンパク質の発現用ベクター、酵母細胞、酵母細胞スフェロプラスト調製用の試薬類、トランスフェクション用試薬類を少なくとも含む、インフルエンザウイルスRNAゲノム内に組み込まれた外来レポーター遺伝子の発現を測定することにより、酵母内インフルエンザウイルスゲノムの複製活性または転写活性、ウイルス因子−宿主因子の相互作用、あるいは宿主因子のウイルス増殖促進作用に影響を及ぼす抗インフルエンザウイルス候補物質の作用を調べるためのキット。
- 請求項1〜3のいずれかに記載の酵母内ゲノム複製系の作成方法において作成された、酵母にインフルエンザウイルスRNAゲノムが導入され、形質転換された酵母形質転換体。
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