JP4811765B2 - An expression vector that can control the inducible expression of foreign genes - Google Patents
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Description
本発明は、外来遺伝子の誘導発現の制御が可能であり、かつ外来遺伝子を内因性野生型遺伝子の発現量と同程度の量で発現させることができる発現ベクター、及びそれを用いて作製したトランスジェニック細胞及び動物に関する。 The present invention provides an expression vector capable of controlling inducible expression of a foreign gene and capable of expressing the foreign gene in an amount similar to the expression level of the endogenous wild-type gene, and a trans produced using the expression vector. It relates to transgenic cells and animals.
従来のトランスジェニック動物の作製においては、前核期の受精卵を採取し、この受精卵に外来遺伝子をＤＮＡインジェクション法により注入することにより当該外来遺伝子を受精卵の染色体に導入し、外来遺伝子を導入した受精卵を代理母動物の卵管に移植して出産させるという方法が用いられている。この方法においては、外来遺伝子が動物の染色体にランダムに挿入されるため、外来遺伝子を動物の染色体の所定の部位に挿入することができない。このため、外来遺伝子は染色体上の元来の遺伝子の発現に影響を及ぼすような位置に挿入される場合が多く、また外来遺伝子が挿入された染色体上の位置により、当該挿入された外来遺伝子の発現量が異なるなどの問題点があった。従って、染色体上の元来の遺伝子の発現に影響を及ぼさずに、且つ外来遺伝子の所望の発現量をもたらすトランスジェニック動物を得るには、多数のトランスジェニック動物の系統を作製し、その中から、目的とする性質を有するトランスジェニックを選択する必要があった。このため、目的とするトランスジェニック動物系を樹立するためには、多くの実験設備と、多くの人手と多くの時間を必要とし、種々の外来遺伝子を導入した広範なトランスジェニック動物を揃えることが不可能であった。
他方、受精卵に外来遺伝子を導入するトランスジェニック動物の作製方法では、導入した外来遺伝子が胚発生の時期から発現されるため、当該外来遺伝子の導入が生体の発生及び維持に必須の遺伝子に変異を加えるようなものである場合、個体が胚致死となり、トランスジェニック動物が得られない場合がある。また、生体の発生・維持の様々な段階で多種多様な機能を有する遺伝子が存在し、外来遺伝子の導入により得ようとする目的の機能を直接解析することができない場合がある。
また、従来のトランスジェニック動物は、外来遺伝子（ここで言う外来遺伝子は、一般的には、野生型動物が本来持っていない遺伝子であるか、又は野生型動物が本来持っている野生型遺伝子に変異を導入した変異遺伝子などである）を過剰発現させることを意図して作製されたものが一般的であった。このようなトランスジェニック動物においては、野生型遺伝子の発現量と同じ量の変異遺伝子を発現させて、それらを競合させることはできなかった。
このような問題点を解決するため、薬剤依存的なリガンド依存性レセプター蛋白質の構造変化を伴う遺伝子発現誘導システムや、ホルモン依存的なリガンド依存性レセプター蛋白質の構造変化を伴う蛋白質の活性調節機構を利用することによって、コンディショナル・トランスジェニック動物（外的な条件の調節により、導入した外来遺伝子の発現を調節することができる）の作成が試みられている。
しかしながら、例えば、前者のトランスジェニック動物を作製するためには、テトラサイクリン系薬剤をリガンドとするレセプターに転写調節因子を融合させた転写活性化因子を発現する外来遺伝子、レセプターに転写調節因子を融合させた転写抑制化因子を発現する外来遺伝子、及び上記レセプターのための標的配列を転写調節領域に含み目的遺伝子を発現させる外来遺伝子の３種類の遺伝子を１動物に導入したトランスジェニック動物を作製する必要があり、その際に、転写活性化因子と転写抑制因子との発現のバランスとして、転写活性化因子に比べて転写抑制因子の発現を高くする必要がある。
このためには、上記それぞれの外来遺伝子を導入した３種類のトランスジェニック動物を作製し、次にこれらを交配して３種類の外来遺伝子を含むトランスジェニック動物を取得する必要がある。しかしながら、このためには多大の時間と労力を必要とするのみならず、目的とするトランスジェニック動物が得られる成功率は極めて低く、実用性に乏しい。
また、従来の上記したようなテトラサイクリンシステムを利用したトランスジェニック動物においては、外来遺伝子を過剰発現させた場合の結果しか観察することができず、野生型遺伝子の発現量と同じ量の外来遺伝子を発現させて、それらを競合させた結果を観察することはできなかった。さらに、上記のテトラサイクリンシステムを利用したトランスジェニック動物においては、薬剤（ドキシサイクリンなど）の有無によって外来遺伝子の発現をオン又はオフにすることは可能であったが、薬剤の濃度に依存した様式で外来遺伝子の発現量を変化させることはできなかった。In the production of a conventional transgenic animal, a pronuclear fertilized egg is collected, and the foreign gene is introduced into the fertilized egg chromosome by injecting the foreign gene into the fertilized egg by the DNA injection method. A method is used in which the introduced fertilized egg is transplanted into the oviduct of a surrogate mother animal to give birth. In this method, since the foreign gene is randomly inserted into the animal chromosome, the foreign gene cannot be inserted into a predetermined site of the animal chromosome. For this reason, foreign genes are often inserted at positions that affect the expression of the original gene on the chromosome, and the position of the inserted foreign gene depends on the position on the chromosome where the foreign gene is inserted. There were problems such as different expression levels. Therefore, in order to obtain a transgenic animal that does not affect the expression of the original gene on the chromosome and provides the desired expression level of the foreign gene, a large number of transgenic animal strains are prepared, from among them. It was necessary to select a transgenic having the desired properties. For this reason, in order to establish the target transgenic animal system, it requires a lot of experimental facilities, a lot of manpower and a lot of time, and it is possible to prepare a wide range of transgenic animals introduced with various foreign genes. It was impossible.
On the other hand, in the method for producing a transgenic animal in which a foreign gene is introduced into a fertilized egg, the introduced foreign gene is expressed from the time of embryogenesis, so the introduction of the foreign gene is mutated into a gene essential for the development and maintenance of the living body. In some cases, the individual becomes embryonic lethal and a transgenic animal cannot be obtained. In addition, there are cases where genes having various functions exist in various stages of generation and maintenance of living organisms, and the target function to be obtained by introduction of foreign genes cannot be directly analyzed.
In addition, a conventional transgenic animal has a foreign gene (the foreign gene referred to here is generally a gene that a wild type animal does not originally have, or a wild type gene that a wild type animal originally has. In general, the gene was produced with the intention of overexpressing a mutant gene into which a mutation was introduced. In such a transgenic animal, it was not possible to express a mutant gene in the same amount as that of the wild-type gene and compete with them.
In order to solve these problems, a gene expression induction system with a structural change of a drug-dependent ligand-dependent receptor protein and a protein activity regulation mechanism with a structural change of a hormone-dependent ligand-dependent receptor protein By using this, it has been attempted to create a conditional transgenic animal (the expression of the introduced foreign gene can be regulated by adjusting external conditions).
However, for example, in order to produce the former transgenic animal, a transcriptional regulatory factor is fused to a foreign gene expressing a transcriptional activator in which a transcriptional regulatory factor is fused to a receptor having a tetracycline drug as a ligand, and the receptor is fused. It is necessary to produce a transgenic animal in which three genes, a foreign gene that expresses a transcriptional repressor and a foreign gene that contains a target sequence for the receptor in the transcriptional regulatory region and expresses the target gene, are introduced into one animal. In this case, it is necessary to make the expression of the transcriptional repressing factor higher than that of the transcriptional activator as the balance of the expression of the transcriptional activator and the transcriptional repressing factor.
For this purpose, it is necessary to prepare three types of transgenic animals into which the respective foreign genes are introduced, and then cross them to obtain transgenic animals containing the three types of foreign genes. However, this requires not only a great deal of time and labor, but also the success rate for obtaining the target transgenic animal is extremely low and the practicality is poor.
In addition, in the conventional transgenic animals using the tetracycline system as described above, only the result of overexpression of the foreign gene can be observed, and the same amount of the foreign gene as that of the wild-type gene is expressed. It was not possible to observe the result of expressing and competing them. Furthermore, in the transgenic animals using the above tetracycline system, it was possible to turn on or off the expression of a foreign gene depending on the presence or absence of a drug (such as doxycycline), but in a manner depending on the concentration of the drug. The expression level of the gene could not be changed.
従って、本発明の第一の目的は、目的の外来遺伝子を時期特異的に発現することができるトランスジェニック動物を提供することである。本発明の第二の目的は、外来遺伝子の発現がオンになった際にその発現量を制御することができるトランスジェニック動物を提供することである。本発明の第三の目的は、野生型遺伝子の発現量と同程度のレベルで外来遺伝子を発現させることができるトランスジェニック動物を提供することである。本発明の第四の目的は、目的の外来遺伝子が動物のゲノムの所定の部位に導入されており、その発現が元来の遺伝子の発現に影響を及ぼさないようなトランスジェニック動物、およびそのようなトランスジェニック動物を効率よく作製して、多様な目的遺伝子を導入したトランスジェニック動物の品揃えを行うことができる手段を提供することである。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、テトラサイクリン系薬剤をリガンドとするレセプターに転写調節因子を融合させた転写活性化因子を発現する外来遺伝子、レセプターに転写調節因子を融合させた転写抑制化因子を発現する外来遺伝子、及び上記レセプターのための標的配列を転写調節領域に含み目的遺伝子を発現させる外来遺伝子をインスレーターにより相互に分離した状態で１個のベクターに組み込み、このベクターを動物のゲノムに導入し、この際に、テトラサイクリン系薬剤をリガンドとするレセプターに転写調節因子を融合させた転写活性化因子を発現する外来遺伝子のプロモーターと、レセプターに転写調節因子を融合させた転写抑制化因子を発現する外来遺伝子のプロモーターを適当に選択することにより、上記第一から第三の目的を解決できることを見出した。より具体的には、本発明においては、テトラサイクリン系薬剤をリガンドとするレセプターに転写調節因子を融合させた転写活性化因子を発現する外来遺伝子のプロモーター中に含まれるエンハンサーと同じエンハンサーを、レセプターに転写調節因子を融合させた転写抑制化因子を発現する外来遺伝子のプロモーター中に含めることによって、上記目的を解決している。
さらに、例えば、上記のベクターにおいて、目的の外来遺伝子の発現のための制御配列の顆粒にｌｏｘＰ配列を挿入しておき、そのベクターを、例えば無作為に動物のゲノムに導入して種々のトランスジェニック動物を作製し、その中から、元来の遺伝子の発現に影響を与えない部位に前記ベクターが挿入されているトランスジェニック動物を選択し、この動物のゲノム中に挿入されている前記ｌｏｘＰ部位に、ｌｏｘＰ配列に連結した任意の目的遺伝子を環状のＤＮＡを導入することにより、上記第四の目的を解決できることを見出した。
本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１） （ｉ）第一のプロモーターと、テトラサイクリン系薬剤をリガンドとするレセプターに正の転写調節因子を連結して成る転写活性化因子とを含む発現ユニット；（ｉｉ）第二のプロモーターと、テトラサイクリン系薬剤をリガンドとするレセプターに負の転写調節因子を連結して成る転写抑制因子とを含む発現ユニット；及び（ｉｉｉ）前記レセプターのための標的配列を含む転写調節領域を伴う第三のプロモーターを含む、目的遺伝子を発現させるための発現ユニットを含み、上記（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の発現ユニットが相互にインスレーターにより隔離されている、発現ベクター。
（２） 前記の第一のプロモーター、第二のプロモーター及び第三のプロモーターが相互に異なるプロモーターである、（１）に記載の発現ベクター。
（３） 前記第一のプロモーターが組織特異的プロモーターであり、前記第二のプロモーターが組織非特異的プロモーターである、（１）又は（２）に記載の発現ベクター。
（４） 前記第一のプロモーターと前記第二のプロモーターがそれぞれ同一のエンハンサーを含んでいる、（１）から（３）の何れかに記載の発現ベクター。
（５） 前記第一のプロモーターがＣＭＶエンハンサーとＣＭＶプロモーターとを含んでなるプロモーターであり、前記第二のプロモーターがＣＭＶエンハンサーとアクチンプロモーターとを含んでなるプロモーターである、（１）から（４）の何れかに記載の発現ベクター。
（６） 前記正の転写調節因子が、ＶＰ１６（単純ヘルペスウィルス転写活性化因子）である、（１）から（５）の何れかに記載の発現ベクター。
（７） 前記負の転写調節因子が、ｎ１ｓＫＲＡＢ（Ｋｒｕｐｐｅｌ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｂｏｘ）である、（１）から（６）の何れかに記載の発現ベクター。
（８） 前記インスレーターが、ニワトリβ−グロブリンインスレーターである、（１）から（７）の何れかに記載の発現入ベクター。
（９） 前記第三のプロモーターの下流にｌｏｘｐ配列が挿入されている、（１）から（８）の何れかに記載の発現ベクター。
（１０） トランスジェニック細胞又はトランスジェニック動物を作製するための、（１）から（９）の何れかに記載の発現ベクター。
（１１） （１）から（１０）の何れかに記載の発現ベクターを有するトランスジェニック細胞。
（１２） （１）から（１０）の何れかに記載の発現ベクターがゲノムに挿入されている、目的遺伝子を導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製するためのトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（１３） マウスである、（１２）に記載の非ヒト哺乳動物。
（１４） （１２）又は（１３）に記載の動物の生殖細胞に、ｌｏｘＰ配列に連結された目的遺伝子を含む環状ＤＮＡを投与して、前記第三のプロモーターの下流に設けられているｌｏｘＰ配列に前記目的遺伝子を繋ぎこみ、当該生殖細胞から動物を再生することを特徴とする、目的遺伝子を導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法。
（１５） （１４）に記載の方法により作製される、トランスジェニック非ヒト哺乳動物又はその一部。Accordingly, a first object of the present invention is to provide a transgenic animal capable of expressing a target foreign gene in a time-specific manner. The second object of the present invention is to provide a transgenic animal that can control the expression level when the expression of a foreign gene is turned on. The third object of the present invention is to provide a transgenic animal capable of expressing a foreign gene at a level comparable to the expression level of a wild type gene. A fourth object of the present invention is a transgenic animal in which the target foreign gene has been introduced into a predetermined site in the genome of the animal, and its expression does not affect the expression of the original gene, and It is to provide means for efficiently producing a variety of transgenic animals and assorting transgenic animals into which various target genes have been introduced.
As a result of diligent studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have found that a transcriptional activator is a foreign gene that expresses a transcriptional activator by fusing a transcriptional regulatory factor to a receptor having a tetracycline-based drug as a ligand. A foreign gene that expresses the fused transcriptional repressing factor and a foreign gene that contains the target sequence for the receptor in the transcriptional regulatory region and expresses the target gene are incorporated into a single vector in a state separated from each other by an insulator. This vector was introduced into the genome of an animal. At this time, a promoter of a foreign gene expressing a transcriptional activator in which a transcriptional regulatory factor was fused to a receptor having a tetracycline drug as a ligand, and a transcriptional regulatory factor at the receptor were introduced. Appropriate selection of a promoter for a foreign gene that expresses the fused transcriptional repressor By and can solve the third object from the first. More specifically, in the present invention, the same enhancer as the enhancer contained in the promoter of a foreign gene that expresses a transcriptional activator in which a transcriptional regulatory factor is fused to a receptor having a tetracycline drug as a ligand is used as a receptor. The above object is solved by including in a promoter of a foreign gene that expresses a transcription repressing factor fused with a transcriptional regulatory factor.
Further, for example, in the above-mentioned vector, a loxP sequence is inserted into a granule of a control sequence for expression of a target foreign gene, and the vector is randomly introduced into the genome of an animal, for example, to produce various transgenics. An animal is produced, and a transgenic animal in which the vector is inserted into a site that does not affect the expression of the original gene is selected from the animals, and the loxP site inserted in the genome of the animal is selected. The present inventors have found that the fourth object can be solved by introducing circular DNA into any gene of interest linked to the loxP sequence.
The present invention has been completed based on these findings.
That is, according to the present invention, the following inventions are provided.
(1) an expression unit comprising (i) a first promoter and a transcriptional activator formed by linking a positive transcriptional regulator to a receptor having a tetracycline drug as a ligand; (ii) a second promoter; An expression unit comprising a transcriptional repressor formed by linking a negative transcriptional regulator to a receptor having a tetracycline drug as a ligand; and (iii) a third promoter with a transcriptional regulatory region comprising a target sequence for the receptor An expression vector comprising an expression unit for expressing a target gene, wherein the expression units (i), (ii) and (iii) are isolated from each other by an insulator.
(2) The expression vector according to (1), wherein the first promoter, the second promoter, and the third promoter are different from each other.
(3) The expression vector according to (1) or (2), wherein the first promoter is a tissue-specific promoter and the second promoter is a tissue-nonspecific promoter.
(4) The expression vector according to any one of (1) to (3), wherein the first promoter and the second promoter each contain the same enhancer.
(5) The first promoter is a promoter comprising a CMV enhancer and a CMV promoter, and the second promoter is a promoter comprising a CMV enhancer and an actin promoter (1) to (4) The expression vector according to any one of the above.
(6) The expression vector according to any one of (1) to (5), wherein the positive transcriptional regulatory factor is VP16 (herpes simplex virus transcriptional activator).
(7) The expression vector according to any one of (1) to (6), wherein the negative transcriptional regulatory factor is n1sKRAB (Kruppel associated box).
(8) The expression vector according to any one of (1) to (7), wherein the insulator is a chicken β-globulin insulator.
(9) The expression vector according to any one of (1) to (8), wherein a loxp sequence is inserted downstream of the third promoter.
(10) The expression vector according to any one of (1) to (9), for producing a transgenic cell or a transgenic animal.
(11) A transgenic cell having the expression vector according to any one of (1) to (10).
(12) A transgenic non-human mammal for producing a transgenic non-human mammal into which a target gene is introduced, wherein the expression vector according to any one of (1) to (10) is inserted into a genome.
(13) The non-human mammal according to (12), which is a mouse.
(14) A loxP sequence provided downstream of the third promoter by administering a circular DNA containing a gene of interest linked to a loxP sequence to the germ cells of the animal according to (12) or (13) A method for producing a transgenic non-human mammal having a gene of interest introduced therein, wherein the gene of interest is ligated to the cell and the animal is regenerated from the germ cells.
(15) A transgenic non-human mammal or a part thereof produced by the method according to (14).
図１は、Ｔｅｔ ｓｙｓｔｅｍ−Ｒｅｐ．Ｔｇ（＋）の作製の概要を示す。
図２は、Ｔｅｔ ｓｙｓｔｅｍ−Ｒｅｐ Ｔｇ ＡＤ（＋）の作製の概要（前半）を示す。
図３は、Ｔｅｔ ｓｙｓｔｅｍ−Ｒｅｐ Ｔｇ ＡＤ（＋）の作製の概要（後半）を示す。
図４は、Ｔｅｔ ｓｙｓｔｅｍ−ｌｏｘＰ Ｔｇ ＡＤ（＋）の作製の概要を示す。
図５は、組換えターゲット配列（ｌｏｘＰ配列）を含有したテトラサイクリンシステム完全長（一本化）プラスミドベクターの作製の概要を示す。
図６は、Ｔｅｔ ｓｙｓｔｅｍ−Ｒｅｐ．Ｔｇ（＋）の概要を示す。
図７は、Ｔｅｔ ｓｙｓｔｅｍ−Ｒｅｐ．Ｔｇ（−）の概要を示す。
図８は、Ｔｅｔ ｓｙｓｔｅｍ−Ｒｅｐ．Ｔｇ ＡＤ（＋）の概要を示す。
図９は、Ｔｅｔ ｓｙｓｔｅｍ− ｍｅｖ−１ Ｔｇ ＡＤ（＋）の概要を示す。
図１０は、Ｔｅｔ ｓｙｓｔｅｍ−ｌｏｘＰ Ｔｇ ＡＤの概要を示す。
図１１は、Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｅｔ ｏｎ−ｏｆｆ ｓｙｓｔｅｍ）Ｔｒａｎｓｇｅｎｅの概要を示す。
図１２は、ルシフェラーゼアッセイとβ−ガラクトシダーゼアッセイの測定結果を示す。
図１３は、Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｅｔ ｏｎ−ｏｆｆ ｓｙｓｔｅｍ）の遺伝子発現制御の様式を示す。
図１４は、Ｃｒｅ−ｌｏｘｐシステムの概要を示す。FIG. 1 shows Tet system-Rep. An outline of production of Tg (+) is shown.
FIG. 2 shows an outline (first half) of preparation of Tet system-Rep Tg AD (+).
FIG. 3 shows an outline (second half) of preparation of Tet system-Rep Tg AD (+).
FIG. 4 shows an overview of the preparation of Tet system-loxP Tg AD (+).
FIG. 5 outlines the construction of a tetracycline system full-length (single) plasmid vector containing a recombination target sequence (loxP sequence).
FIG. 6 shows Tet system-Rep. An outline of Tg (+) is shown.
FIG. 7 shows Tet system-Rep. An outline of Tg (-) is shown.
FIG. 8 shows Tet system-Rep. An outline of Tg AD (+) is shown.
FIG. 9 shows an overview of Tet system- mev-1 Tg AD (+).
FIG. 10 shows an overview of Tet system-loxP Tg AD.
FIG. 11 shows an outline of a Tetraccycle system (Tet on-off system) Transgene.
FIG. 12 shows the measurement results of the luciferase assay and β-galactosidase assay.
FIG. 13 shows the mode of gene expression control of the tetracycline system (Tet on-off system).
FIG. 14 shows an overview of the Cre-loxp system.
以下、本発明の実施の形態について説明する。
（１）本発明の発現ベクター
本発明の発現ベクターは、（ｉ）第一のプロモーターと、テトラサイクリン系薬剤をリガンドとするレセプターに正の転写調節因子を連結して成る転写活性化因子とを含む発現ユニット；（ｉｉ）第二のプロモーターと、テトラサイクリン系薬剤をリガンドとするレセプターに負の転写調節因子を連結して成る転写抑制因子とを含む発現ユニット；及び（ｉｉｉ）前記レセプターのための標的配列を含む転写調節領域を伴う第三のプロモーターを含む、目的遺伝子を発現させるための発現ユニットを含み、上記（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の発現ユニットが相互にインスレーターにより隔離されていることを特徴とするベクターである。
前記の第一のプロモーター、第二のプロモーター及び第三のプロモーターは相互に異なるプロモーターであることが好ましく、前記第一のプロモーターは組織特異的プロモーターであり、前記第二のプロモーターが組織非特異的プロモーターであることが好ましい。プロモーターの具体例としては、例えば、ウイルス（例、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）、モロニー白血病ウィルス、ＪＣウィルス、乳癌ウィルスなど）由来遺伝子プロモーター、各種哺乳動物（例、ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）および鳥類（例、ニワトリなど）由来のプロモーターなどが挙げられる。
本発明において好ましくは、前記第一のプロモーターと前記第二のプロモーターはそれぞれ同一のエンハンサーを含んでいる。このように第一のプロモーターと第二のプロモーターにおいて同一のエンハンサーを用いることにより、転写因子の競合を起こさせることができ、これにより目的遺伝子の発現の制御が容易になる。前記第一のプロモーターの具体例としては、ＣＭＶエンハンサーとＣＭＶプロモーターとを含んでなるプロモーターが挙げられ、前記第二のプロモーターの具体例としてはＣＭＶエンハンサーとアクチンプロモーターとを含んでなるプロモーターが挙げられる。
本発明では、テトラサイクリン系薬剤をリガンドとするレセプターに正の転写調節因子を連結して成る転写活性化因子と、テトラサイクリン系薬剤をリガンドとするレセプターに負の転写調節因子を連結して成る転写抑制因子を使用する。正の転写調節因子の具体例としては、ＶＰ１６（単純ヘルペスウィルス転写活性化因子）（Ｂｅｒｇｅｒ ＳＬ，他、Ｃｅｌｌ．１９９０ Ｊｕｎ２９；６１（７）：１１９９−２０８； Ｆｒｉｅｄｍａｎ ＡＤ，他、Ｎａｔｕｒｅ．１９８８ Ｓｅｐ ２９；３３５（６１８９）：４５２−４；及び、Ｔｒｉｅｚｅｎｂｅｒｇ ＳＪ，他、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１９８８ Ｊｕｎ；２（６）：７１８−２９．）などが挙げられる。
負の転写調節因子としては、Ｚｎフィンガーモチーフを有するタンパク質のうち負の転写調節活性を有するタンパク質を使用することができ、例えば、ｎ１ｓＫＲＡＢ（Ｋｒｕｐｐｅｌ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｂｏｘ）などが挙げられる（Ｄａｔｅ Ｓ，他、Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２００４ Ｍａｙ；１３（５）：６３７−４２；Ｓｈｉｍｏｊｏ Ｍ，他、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．２００４ Ｍａｒ １９；７４（１８）：２２１３−２５．Ｒｅｖｉｅｗ；Ｓｅｋｉｍａｔａ Ｍ，他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００４ Ｊａｎ ２９；３２（２）：５９０−７．Ｐｒｉｎｔ ２００４；Ｇｏｕ Ｄ，他、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．２００４ Ｊａｎ ２０；１６７６（２）：２０３−９；Ｌｏｏｍａｎ Ｃ，他、Ｍａｍｍ Ｇｅｎｏｍｅ．２００４ Ｊａｎ；１５（１）：３５−４０；Ｓｎｏｗｄｅｎ ＡＷ，他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００３ Ｄｅｃ １５；６３（２４）：８９６８−７６；Ｈｏｆｍａｎ Ｋ，他、Ｊ Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２００３ Ｄｅｃ；３１（３）：５８３−９６；Ｔａｎ Ｗ，他、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００４ Ｆｅｂ ２０；２７９（８）：６５７６−８７．Ｅｐｕｂ ２００３ Ｄｅｃ ０２；Ｓｅｒｔｉｌ Ｏ，他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００３ Ｏｃｔ １５；３１（２０）：５８３１−７；Ｕｒｒｕｔｉａ Ｒ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．２００３；４（１０）：２３１．Ｅｐｕｂ ２００３ Ｓｅｐ ２３；Ｙｕｎ Ｊ，他、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００３ Ｏｃｔ；２３（２０）：７３０５−１４；Ｋｉｍ．ＹＳ，他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００３ Ｏｃｔ １；３１（１９）：５５１３−２５；Ｒｕｔｔｅｒ ＪＬ，他、Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ．２００３ Ａｕｇ；２２（２）：１２１−８；Ｗａｃｋｅｒ Ｉ，他、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．２００３ Ａｕｇ；１３０（１６）：３７９５−８０５；Ｓｕｎ Ｙ，他、ＩＵＢＭＢ Ｌｉｆｅ．２００３ Ｍａｒ；５５（３）：１２７−３１；Ｋａｗａｔａ Ｈ，他、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２００３ Ａｕｇ １；３７３（Ｐｔ ３）：７４７−５７；Ｌａｋｏｗｓｋｉ Ｂ，他、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．２００３ Ｍａｙ；１３０（１０）：２１１７−２８；Ｙａｍａｄａ Ｋ，他、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２００３ Ｊｕｌ １；３７３（Ｐｔ １）：１６７−７８；Ｔｕｒｎｅｒ Ｊ，他、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００３ Ａｐｒ １１；２７８（１５）：１２７８６−９５．Ｅｐｕｂ ２００３ Ｊａｎ ２９；Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｌａｍｕｎｏ Ｄ，他、Ｐｅｄｉａｔｒ Ｐａｔｈｏｌ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２００２ Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；２１（６）：５３１−４０；Ｍｅｄｕｇｎｏ Ｌ，他、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２００３ Ｊａｎ １６；５３４（１−３）：９３−１００；Ｌｏｏｍａｎ Ｃ，他、Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｅｖｏｌ．２００２ Ｄｅｃ；１９（１２）：２１１８−３０；Ｐａｒｋ Ｈ，他、Ｂｌｏｏｄ．２００３ Ｆｅｂ １；１０１（３）：８９４−９０２．Ｅｐｕｂ ２００２ Ｓｅｐ １９；Ｊｉａｏ Ｋ，他、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００２ Ｎｏｖ；２２（２１）：７６３３−４４；Ｌｅｅ ＴＨ，他、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００２ Ｎｏｖ ２２；２７７（４７）：４４８２６−３７．Ｅｐｕｂ ２００２ Ｓｅｐ １７；Ｋｉｍ ＹＳ，他、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００２ Ａｕｇ ２３；２７７（３４）：３０９０１−１３．Ｅｐｕｂ ２００２ Ｍａｙ ３１；Ｚｈａｎｇ ＪＳ，他、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００１ Ａｕｇ；２１（１５）：５０４１−９；Ｌｏｒｅｎｚ Ｐ，他、Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００１ Ａｐｒ；３８２（４）：６３７−４４；Ｙｏｃｈｕｍ ＧＳ，他、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００１ Ｊｕｌ；２１（１３）：４１１０−８；Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｔ，他、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００１ Ｊｕｎ；２１（１１）：３６０９−１５．Ｙａｎｏ Ｋ，他、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２０００ Ａｐｒ １；６５（１）：７５−８０；Ｗｉｅｃｚｏｒｅｋ Ｅ，他、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０００ Ａｐｒ ２８；２７５（１７）：１２８７９−８８；Ｔｅｋｋｉ−Ｋｅｓｓａｒｉｓ Ｎ，他、Ｇｅｎｅ．１９９９ Ｎｏｖ １５；２４０（１）：１３−２２；Ｓｔｏｎｅ ＤＭ，他、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１９９９ Ｄｅｃ；１１２（Ｐｔ ２３）：４４３７−４８；Ｈｕａｎｇ Ｚ，他、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９９ Ｍａｒ １９；２７４（１２）：７６４０−８；Ｄｅｎｇ Ｚ，他、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．１９９８ Ｏｃｔ １；５３（１）：９７−１０３；Ｅｌｓｅｒ Ｂ，他、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９７ Ｏｃｔ ３１；２７２（４４）：２７９０８−１２；Ｋｉｍ ＳＳ，他、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９９６ Ｄｅｃ ２４；９３（２６）：１５２９９−３０４；Ｍｏｏｓｍａｎｎ Ｐ，他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９６ Ｄｅｃ １５；２４（２４）：４８５９−６７；Ｗｉｔｚｇａｌｌ Ｒ，他、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９９４ Ｍａｙ １０；９１（１０）：４５１４−８；Ｍａｒｇｏｌｉｎ ＪＦ，他、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９９４ Ｍａｙ １０；９１（１０）：４５０９−１３；及びＳａｕｅｒ Ｆ，他、Ｎａｔｕｒｅ．１９９３ Ｊｕｌ ２９；３６４（６４３６）：４５４−７）。
本発明で言うテトラサイクリン系薬剤としては、毒性が低い薬剤を使用することが好ましく、例えば、ドキシサイクリンなどが挙げられる。
本発明で用いるインスレーターの具体例としては、マウス、ハムスター、モルモット、ラット、ウサギ等のげっ歯類、又はニワトリ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ブタ、サル、ヒト等の動物由来のβ−グロブリンインスレーターを挙げることができ、特に好ましくは、ニワトリβ−グロブリンインスレーター（アクセッション番号Ｕ７８７７５，Ｃｈｕｎｇ，Ｊ．Ｈ．他、Ｃｅｌｌ ７４（３）５０５−５１４（１９９３））などが挙げられる。
本発明の発現ベクターにおいて、第三のプロモーターの下流には、ｌｏｘｐ配列を挿入することができる。ｌｏｘｐ配列は、Ｃｒｅリコンビナーゼによって認識されるＤＮＡ配列である。ここでＣｒｅリコンビナーゼは、ｌｏｘｐ配列に挟まれたＤＮＡ配列を欠失させる組み換え酵素である。本発明の発現ベクター中にｌｏｘｐ配列を挿入することにより、上記第三のプロモーターの下流に、発現させるべき所望の遺伝子を導入することが可能になる。Ｃｒｅ−ｌｏｘｐシステムの概要を図１４に示す。例えば、本発明の発現ベクターを有するトランスジェニック動物（例えば、マウスなど）の子宮、卵巣又は精巣に、Ｃｒｅリコンビナーゼ、及びｌｏｘｐ配列と目的外来遺伝子を連結させた環状ＤＮＡを投与することによって、本発明の発現ベクターの上記第三のプロモーターの下流に、発現させるべき目的外来遺伝子を導入することができる。
上記した各々の配列要素をコードするＤＮＡはＰＣＲ法などを含む当業者に公知の遺伝子クローニング技術により取得することができ、各ＤＮＡ断片を適当なベクター中に順番に挿入することにより、本発明の発現ベクターを構築することができる。本発明の発現ベクターの構築は、ＰＣＲ、制限酵素処理、及びライゲーション等を含む通常の遺伝子組み換え技術により行うことができる。
（２）本発明のトランスジェニック細胞
本発明のトランスジェニック細胞は、上記（１）に記載した本発明の発現ベクターを細胞に導入することによって作製することができる。
細胞は、大腸菌などの細菌細胞、又は動物細胞、植物細胞、昆虫細胞又は酵母などの真核細胞の何れでもよいが、好ましくは動物細胞である。本発明で用いることができる動物細胞の種類は、特に限定されず、マウス、ハムスター、モルモット、ラット、ウサギ等のげっ歯類由来の細胞、又はニワトリ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ブタ、サル、ヒト等に由来する細胞を使用することができる。
動物細胞としては、例えば、内皮細胞、上皮細胞、島細胞、ニューロンその他の神経組織由来の細胞、中皮細胞、骨細胞、リンパ球、軟骨細胞、造血細胞、免疫細胞、各種の臓器（例えば、肝臓、肺、心臓、胃、膵臓、腎臓および皮膚など）の細胞、筋肉細胞（骨格筋、平滑筋および心筋由来の細胞を含む）、外分泌または内分泌細胞、線維芽細胞、ならびに胚その他の分化全能性または多分化能性幹細胞を使用することができ、また樹立されている各種の細胞株（例えば、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ−１細胞、ＣＯＳ−７細胞、Ｈｅｌａ細胞、チャイニーズハムスター（ＣＨＯ）細胞等）を使用することができる。
本発明の発現ベクターの動物細胞への導入は、当業者に公知の通常の遺伝子導入法により行うことができる。遺伝子導入法の具体例としては、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法（リポフェクトアミン試薬を使用する方法等を含む）等を挙げることができる。
上記のようにして作製した本発明のトランスジェニック細胞においては、テトラサイクリン系薬剤が存在する場合には目的遺伝子の発現が誘導され、テトラサイクリン系薬剤が存在しない場合には目的遺伝子の発現がゼロになる。
（３）本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物
本発明によれば、上記（１）に記載した発現ベクターがゲノムに挿入されている、目的遺伝子を導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製するためのトランスジェニック非ヒト哺乳動物が提供される。
トランスジェニック動物を作製するための方法は当業者に公知である。例えば、Ｈｏｇａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８６などを参照することができる。外来の発現ベクターを哺乳動物の生殖細胞に導入する技術は最初はマウスにおいて開発された（Ｇｏｒｄｏｎ，ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，７７：７３８０−８４（１９８０）；Ｇｏｒｄｏｎ ａｎｄ Ｒｕｄｄｌｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１４：１２４４−４６（１９８１）；Ｐａｌｍｉｔｅｒ ａｎｄ Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，Ｃｅｌｌ，４１：３４３−４５（１９８５）；Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，８２：４４３８−４２（１９８５）など）。本発明においても、これらの方法に準じて、上記（１）に記載した発現ベクターがゲノムに挿入されているトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製することができる。上記トランスジェニック非ヒト哺乳動物は、目的遺伝子を導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製するために有用である。
本発明の発現ベクターがゲノムに挿入されているトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製は、例えば、上記の発現ベクターを受精卵などに導入することにより作製することができる。
本発明の発現ベクターがゲノムに挿入されているトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、例えば、非ヒト哺乳動物の受精卵に上記の発現ベクターを導入し、当該受精卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物に移植し、当該非ヒト哺乳動物から発現ベクターが導入された非ヒト哺乳動物を分娩させることにより作製することができる。
非ヒト哺乳動物としては、例えば、マウス、ハムスター、モルモット、ラット、ウサギ等のげっ歯類の他、ニワトリ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ブタ、サル等を使用することができるが、作製、育成及び使用の簡便さなどの観点から見て、マウス、ハムスター、モルモット、ラット、ウサギ等のげっ歯類が好ましく、そのなかでもマウスが最も好ましい。
本発明で用いるトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、胚芽細胞と、生殖細胞あるいは体細胞とが、非ヒト哺乳動物またはこの動物の先祖に胚発生の段階（好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）において外来性の本発明の発現ベクターを導入することによって作出される。
受精卵細胞段階における発現ベクターの導入は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように維持されるように行う。遺伝子導入後の作出動物の胚芽細胞において、発現ベクターが存在することは、作出動物の後代がすべてその胚芽細胞および体細胞のすべてに発現ベクターが存在することを意味する。遺伝子を受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてのゲノム上に発現ベクターを有する。
本発明のトランスジェニック動物は、交配により遺伝子を安定に保持することを確認して、当該遺伝子保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することができる。導入遺伝子（即ち、本発明の発現ベクター）を相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該遺伝子を過剰に有するように繁殖継代することができる。発現ベクターにコードされるタンパク質の発現部位を同定するためには当該発現ベクターの発現を個体、臓器、組織、細胞の各レベルで観察することができる。また、発現ベクターにコードされる各タンパク質の抗体を用いた酵素免疫検定法によりその発現の程度を測定することも可能である。
以下、トランスジェニック非ヒト哺乳動物がトランスジェニックマウスの場合を例に挙げて具体的に説明する。本発明の発現ベクターをマウス受精卵の雄性前核にマイクロインジェクションし、得られた卵細胞を培養した後、偽妊娠雌性マウスの輸卵管に移植し、その後被移植動物を飼育し、産まれた仔マウスから前記発現ベクターを有する仔マウスを選択することによりトランスジェニックマウスを作製することができる。上記マウスの受精卵としては、例えば、１２９／ｓｖ、Ｃ５７ＢＬ／６、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ３Ｈ、ＳＪＬ／Ｗｔ等に由来するマウスの交配により得られるものなら任意のものを使用できる。
また、注入する発現ベクターの数は受精卵１個当たり１００〜３０００分子が適当である。そしてまた、発現ベクターを有する仔マウスの選択は、マウスの尻尾等よりＤＮＡを抽出し、導入した発現ベクターをプローブとするドットハイブリダイゼーション法や、特異的プライマーを用いたＰＣＲ法等により行うことができる。
さらに本発明においては、上記した本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の生殖細胞（例えば、卵母細胞、精原細胞など）に、ｌｏｘＰ配列に連結された目的遺伝子を含む環状ＤＮＡを投与して、前記第三のプロモーターの下流に設けられているｌｏｘＰ配列に前記目的遺伝子を繋ぎこみ、当該生殖細胞から動物を再生することによって、目的遺伝子を導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製することができる。上記方法によって作製されるトランスジェニック非ヒト哺乳動物又はその一部も本発明の範囲内である。
上記した本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の一部としては、非ヒト哺乳動物の細胞、細胞内小器官、組織および臓器のほか、頭部、指、手、足、腹部、尾などが挙げられ、これらも全て本発明の範囲内に属する。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。Embodiments of the present invention will be described below.
(1) Expression vector of the present invention The expression vector of the present invention comprises (i) a first promoter and a transcriptional activator formed by linking a positive transcriptional regulator to a receptor having a tetracycline drug as a ligand. An expression unit comprising: (ii) a second promoter and a transcriptional repressor formed by linking a negative transcriptional regulator to a receptor having a tetracycline drug as a ligand; and (iii) a target for the receptor An expression unit for expressing a target gene, comprising a third promoter with a transcriptional regulatory region containing a sequence, wherein the expression units of (i), (ii) and (iii) are isolated from each other by an insulator It is the vector characterized by having.
The first promoter, the second promoter, and the third promoter are preferably different from each other, the first promoter is a tissue-specific promoter, and the second promoter is tissue-nonspecific. A promoter is preferred. Specific examples of the promoter include gene promoters derived from viruses (eg, cytomegalovirus (CMV), Moloney leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, etc.), various mammals (eg, human, rabbit, dog, cat, guinea pig) , Hamsters, rats, mice, etc.) and birds (eg, chickens, etc.).
In the present invention, preferably, the first promoter and the second promoter each contain the same enhancer. Thus, by using the same enhancer in the first promoter and the second promoter, it is possible to cause transcription factor competition, thereby facilitating control of expression of the target gene. Specific examples of the first promoter include a promoter comprising a CMV enhancer and a CMV promoter, and specific examples of the second promoter include a promoter comprising a CMV enhancer and an actin promoter. .
In the present invention, a transcriptional activator comprising a receptor having a tetracycline drug as a ligand and a positive transcriptional regulator, and a transcriptional repressor comprising a receptor having a tetracycline drug as a ligand and a negative transcriptional regulator. Use factors. Specific examples of positive transcriptional regulators include VP16 (herpes simplex virus transcriptional activator) (Berger SL, et al., Cell. 1990 Jun 29; 61 (7): 1199-208; Friedman AD, et al., Nature. 1988 Sep. 29; 335 (6189): 452-4; and Triezenberg SJ, et al., Genes Dev. 1988 Jun; 2 (6): 718-29.).
As a negative transcriptional regulator, a protein having a negative transcriptional regulatory activity among proteins having a Zn finger motif can be used, and examples thereof include n1sKRAB (Kruppel associated box) (Date S, et al., Int J Mol Med. 2004 May; 13 (5): 637-42; Shimojo M, et al., Life Sci.2004 Mar 19; 74 (18): 2213-25.Review; Sekikata M, et al., Nucleic Acids Res. 29; 32 (2): 590-7.Print 2004; Gou D, et al., Biochim Biophys Acta.2004 Jan 20; 1676 (2): 203-9; Looman C, et al., Mamm Geno e. 2004 Jan; 15 (1): 35-40; Snowden AW, et al., Cancer Res.2003 Dec 15; 63 (24): 8968-76; Hofman K, et al., J Mol Endocrinol.2003 Dec; 31 (3 ): 583-96; Tan W, et al., J Biol Chem. 2004 Feb 20; 279 (8): 6576-87.Epub 2003 Dec 02; Sertil O, et al., Nucleic Acids Res. 2003 Oct 15; 31 (20) : Rurgenia R. Genome Biol. 2003; 4 (10): 231.Epub 2003 Sep 23; Yun J, et al., Mol Cell Biol.2003 Oct; 23 (20): 7305-14; Kim.YS, Other, N cleic Acids Res.2003 Oct 1; 31 (19): 5513-25; Rutter JL, et al., Hum Mutat.2003 Aug; 22 (2): 121-8; Wacker I, et al., Development.2003 Aug; 130 (16 ): 3795-805; Sun Y, et al., IUBMB Life. 2003 Mar; 55 (3): 127-31; Kawata H, et al., Biochem J. 2003
As the tetracycline drug referred to in the present invention, a drug having low toxicity is preferably used, and examples thereof include doxycycline.
Specific examples of the insulator used in the present invention include rodents such as mice, hamsters, guinea pigs, rats, and rabbits, or animals such as chickens, dogs, cats, goats, sheep, cows, pigs, monkeys, and humans. β-globulin insulators can be mentioned, and particularly preferred are chicken β-globulin insulators (accession number U78775, Chung, JH et al., Cell 74 (3) 505-514 (1993)). It is done.
In the expression vector of the present invention, a loxp sequence can be inserted downstream of the third promoter. A loxp sequence is a DNA sequence recognized by Cre recombinase. Here, Cre recombinase is a recombinant enzyme that deletes a DNA sequence sandwiched between loxp sequences. By inserting a loxp sequence into the expression vector of the present invention, a desired gene to be expressed can be introduced downstream of the third promoter. An overview of the Cre-loxp system is shown in FIG. For example, the present invention can be achieved by administering Cre recombinase and a circular DNA in which a loxp sequence and a target foreign gene are linked to the uterus, ovary, or testis of a transgenic animal (eg, a mouse) having the expression vector of the present invention. The target foreign gene to be expressed can be introduced downstream of the third promoter of the expression vector.
DNA encoding each of the above-described sequence elements can be obtained by gene cloning techniques known to those skilled in the art, including PCR, and by inserting each DNA fragment into an appropriate vector in order, An expression vector can be constructed. The expression vector of the present invention can be constructed by ordinary gene recombination techniques including PCR, restriction enzyme treatment, ligation and the like.
(2) Transgenic cell of the present invention The transgenic cell of the present invention can be prepared by introducing the expression vector of the present invention described in (1) above into a cell.
The cell may be a bacterial cell such as E. coli or an eukaryotic cell such as an animal cell, plant cell, insect cell or yeast, but is preferably an animal cell. The types of animal cells that can be used in the present invention are not particularly limited, and cells derived from rodents such as mice, hamsters, guinea pigs, rats, rabbits, or chickens, dogs, cats, goats, sheep, cows, pigs Cells derived from monkeys, humans, etc. can be used.
Examples of animal cells include endothelial cells, epithelial cells, islet cells, neurons and other neural tissue-derived cells, mesothelial cells, bone cells, lymphocytes, chondrocytes, hematopoietic cells, immune cells, various organs (for example, Cells of liver, lung, heart, stomach, pancreas, kidney and skin), muscle cells (including cells from skeletal muscle, smooth muscle and heart muscle), exocrine or endocrine cells, fibroblasts, and embryos and other totipotency Sexual or multipotent stem cells can be used, and various established cell lines (eg, NIH3T3 cells, HEK293 cells, COS-1 cells, COS-7 cells, Hela cells, Chinese hamsters (CHO)) Cell etc.) can be used.
Introduction of the expression vector of the present invention into animal cells can be carried out by conventional gene transfer methods known to those skilled in the art. Specific examples of the gene transfer method include, for example, an electroporation method, a calcium phosphate method, a lipofection method (including a method using a lipofectamine reagent) and the like.
In the transgenic cell of the present invention prepared as described above, the expression of the target gene is induced when the tetracycline drug is present, and the expression of the target gene becomes zero when the tetracycline drug is not present. .
(3) Transgenic non-human mammal of the present invention According to the present invention, a transgenic non-human mammal into which a target gene is introduced, in which the expression vector described in (1) above is inserted into the genome, is produced. Of transgenic non-human mammals are provided.
Methods for producing transgenic animals are known to those skilled in the art. For example, Hogan, et al. , Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1986, and the like. Techniques for introducing foreign expression vectors into mammalian germ cells were first developed in mice (Gordon, et al., PNAS, 77: 7380-84 (1980); Gordon and Ruddle, Science, 214: 1244- 46 (1981); Palmiter and Brinster, Cell, 41: 343-45 (1985); Brinster, et al., PNAS, 82: 4438-42 (1985)). Also in the present invention, a transgenic non-human mammal in which the expression vector described in (1) above is inserted into the genome can be produced according to these methods. The transgenic non-human mammal is useful for producing a transgenic non-human mammal introduced with a target gene.
The transgenic non-human mammal in which the expression vector of the present invention is inserted into the genome can be prepared, for example, by introducing the above expression vector into a fertilized egg or the like.
A transgenic non-human mammal in which the expression vector of the present invention is inserted into the genome is introduced into the fertilized egg of the non-human mammal, for example, and the fertilized egg is transferred to a pseudopregnant female non-human mammal. It can be produced by transplanting and delivering a non-human mammal introduced with an expression vector from the non-human mammal.
Examples of non-human mammals include rodents such as mice, hamsters, guinea pigs, rats, rabbits, chickens, dogs, cats, goats, sheep, cows, pigs, monkeys, etc. Rodents such as mice, hamsters, guinea pigs, rats, rabbits and the like are preferable from the viewpoint of production, rearing, and ease of use, and mice are most preferable.
The transgenic non-human mammal used in the present invention is an embryonic cell and a germ cell or somatic cell in the stage of embryogenesis (preferably at the stage of a single cell or a fertilized egg cell) in the non-human mammal or an ancestor of this animal. Generally, it is created by introducing an exogenous expression vector of the present invention in the 8-cell stage).
The introduction of the expression vector at the fertilized egg cell stage is performed so as to be maintained in all of the germ cells and somatic cells of the target mammal. The presence of the expression vector in the embryo cell of the produced animal after the gene transfer means that all the progeny of the produced animal have the expression vector in all the germ cells and somatic cells. The offspring of this type of animal that inherited the gene has expression vectors on all germ and somatic genomes.
The transgenic animal of the present invention can be subcultured in a normal breeding environment as the gene-bearing animal after confirming that the gene is stably retained by mating. A homozygous animal having a transgene (that is, the expression vector of the present invention) in both homologous chromosomes is obtained, and by breeding the male and female animals, all the offspring are bred to have the gene in excess. be able to. In order to identify the expression site of the protein encoded by the expression vector, the expression of the expression vector can be observed at the individual, organ, tissue, and cell levels. It is also possible to measure the degree of expression by enzyme immunoassay using an antibody for each protein encoded by the expression vector.
Hereinafter, the case where the transgenic non-human mammal is a transgenic mouse will be described in detail. After microinjecting the expression vector of the present invention into the male pronucleus of a mouse fertilized egg, culturing the resulting egg cell, transplanting it to the oviduct of a pseudopregnant female mouse, then raising the recipient animal, A transgenic mouse can be produced by selecting a pup mouse having the expression vector. As the fertilized egg of the mouse, any mouse can be used as long as it can be obtained by mating mice derived from 129 / sv, C57BL / 6, BALB / c, C3H, SJL / Wt, and the like.
Further, the number of expression vectors to be injected is suitably 100 to 3000 molecules per fertilized egg. In addition, selection of a pup mouse having an expression vector can be performed by extracting a DNA from the tail of a mouse, etc., and performing a dot hybridization method using the introduced expression vector as a probe, a PCR method using a specific primer, or the like. it can.
Furthermore, in the present invention, circular DNA containing the target gene linked to the loxP sequence is administered to the germ cells (for example, oocytes, spermatogonia, etc.) of the above-described transgenic non-human mammal of the present invention. Producing a transgenic non-human mammal introduced with the gene of interest by ligating the gene of interest to the loxP sequence provided downstream of the third promoter and regenerating the animal from the germ cells. it can. A transgenic non-human mammal or part thereof produced by the above method is also within the scope of the present invention.
Examples of the above-described transgenic non-human mammal of the present invention include non-human mammal cells, intracellular organelles, tissues and organs, as well as the head, fingers, hands, feet, abdomen, tail, and the like. All of which fall within the scope of the present invention.
The following examples further illustrate the present invention, but the present invention is not limited to the examples.
実施例１：遺伝子導入用の発現ベクターの構築
（１）ＰＣＲ法を用いたサイトメガロウィルスプロモーター（ＰｈＣＭＶ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）のＤＮＡ断片の増幅・単離
ＰＣＲ法を用い、ＰｈＣＭＶ ｐｒｏｍｏｔｅｒの両端に新規制限酵素認識サイトを挿入する（これをＧｅｎｅ．１とする）。ＰＣＲで使用した鋳型は、ＰｈＣＭＶ ｐｒｏｍｏｔｅｒを含有するｐｃＤＮＡ３プラスミドベクターである。ＰＣＲで使用したプライマーは、５’ｐｒｉｍｅｒ Ｏｌｉｇｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇｇｇ ｇｇｔ ａｃｃ ａａｔ ａｔｔ ｇｃｔ ａｇｃ ｇａｇ ｃｔｔ ｇｇｃ ｃｃａ ｔｔｇ ｃａｔ ａｃｇ ｔｔｇ（配列番号６）、及び３’ｐｒｉｍｅｒ Ｏｌｉｇｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇｇｇ ｃｔｃ ｇａｇ ｃａｃ ｇｔｇ ａａｇ ｃｔｔ ｃｇｇ ａｔｃ ｃｇａ ａｔｔ ｃｇｃ ｔａｇ ｃｇｇ ｇｇｃ ｃｇｃ ｇｇａ ｇｇｃ ｔｇｇ ａｔｃ（配列番号７）である。
ｐｃＤＮＡ３プラスミドベクターをＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素処理および平滑末端処理し、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識サイトを排除した（これをＶｅｃｔｏｒ．１とする）。
Ｖｅｃｔｏｒ．１をＫｐｎＩ−ＸｈｏＩ制限酵素処理し、同様に処理したＧｅｎｅ．１を挿入して、Ｖｅｃｔｏｒ．２を作製した。
（２）ポリアデニル酸シグナル（ｐｏｌｙＡ）の付加
ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素処理したＳＶ４０ ｐｏｌｙＡを、同様に処理したプラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．２へ挿入して、Ｖｅｃｔｏｒ．３を作製した。
（３）テトラサイクリン依存性転写活性化因子（ｒＴｅｔＲ−ＶＰ１６）の付加
ｐＵＨＤ１７プラスミドベクター（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）をＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ制限酵素処理し、ｒＴｅｔＲ−ＶＰ１６を取得し、同様の制限酵素処理したプラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．３へ挿入して、Ｖｅｃｔｏｒ．４を作製した。
（４）ＰＣＲ法を用いたＳＶ４０ ｐｏｌｙＡのＤＮＡ断片の増幅・単離
ＰＣＲ法を用い、ＳＶ４０ ｐｏｌｙＡの両端に新規制限酵素認識サイトを挿入した（これを、Ｇｅｎｅ．２とする）。ＰＣＲで使用した鋳型は、ＳＶ４０ ｐｏｌｙＡを含有するｐｃＤＮＡ３又はｐＴＲＥプラスミドベクターである。ＰＣＲで用いたプライマーは、５’ｐｒｉｍｅｒ Ｏｌｉｇｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇｇｇ ｇｇａ ｔｃｃ ａｇａ ｃａｔ ｇａｔ ａａｇ（配列番号８）、及び３’ｐｒｉｍｅｒ Ｏｌｉｇｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇｇｇ ｇｇｔ ａｃｃ ｇｇｇ ｃｃｃ ａｇａ ｔｃｔ ｇｇｔ ｃｇａ ｇｃｔ ｇａｔ ａｃｔ ｔｃｃ（配列番号９）である。ｐｃＤＮＡ３プラスミドベクターをＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ制限酵素処理し、同様に処理したＧｅｎｅ．２を挿入して、Ｖｅｃｔｏｒ．５を作製した。
（５）テトラサイクリン依存性転写抑制因子発現ベクターの作製
Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ １０；Ｋｏｘｌ ｇｅｎｅ（Ｘ５２３３２）の転写抑制ドメイン（ＫＲＡＢ）をＰＣＲ法により増幅・単離した（これをＧｅｎｅ．３とする）。ＰＣＲで使用した鋳型は、ＨｅＬａ細胞より抽出合成したｃＤＮＡである。ＰＣＲで用いたプライマーは、５’ｐｒｉｍｅｒ Ｏｌｉｇｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇｇｇ ｇａａ ｔｔｃ ａａｇ ｃｔｔ ｇｇｃ ｇｇｔ ｇｇｔ ｇｃｔ ｔｔｇ ｔｃｔ（配列番号１０）、及び３’ｐｒｉｍｅｒ Ｏｌｉｇｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇｇｇ ｇｇａ ｔｃｃ ｔｔａ ａａｃ ｔｇａ ｔｇａ ｔｔｔ ｇａｔ ｔｔｃ ａａａ ｔｇｃ ａｇｔ ｃ（配列番号１１）である。
Ｇｅｎｅ．３をＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素処理し、同様に処理したテトラサイクリン依存性レセプター（ＴｅｔＲ）を含有したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩへ挿入し、ＴｅｔＲ−ＫＲＡＢを作製した（これをＶｅｃｔｏｒ．６とする）。プラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．６をＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ制限酵素処理し、同様に処理したＰｈＣＭＶ ｐｒｏ．を含有したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩへ挿入し、ＰｈＣＭＶ ｐｒｏ．−ＴｅｔＲ−ＫＲＡＢを作製した（これをＶｅｃｔｏｒ．７とする）。プラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．７をＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ制限酵素処理し、同様に処理したプラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．５へ挿入して、Ｖｅｃｔｏｒ．８を作製した。
（６）テトラサイクリン依存性転写因子（ＰｈＣＭＶ ｐｒｏ．−ｒＴｅｔＲ−ＶＰ１６，ＰｈＣＭＶ ｐｒｏ．−ＴｅｔＲ−ＫＲＡＢ（Ｋｏｘ１））の連結
プラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．４及び８をそれぞれＸｈｏＩ− ＡｐａＩ制限酵素処理し、テトラサイクリン依存性転写活性化因子発現プラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．４へ、テトラサイクリン依存性転写抑制因子発現遺伝子を連結して、Ｖｅｃｔｏｒ．９を作製した。
（７）電子伝達阻害型＝活性酸素過剰発生型遺伝子変異を挿入した（ｍｅｖ−１型）ｃｙｔ−１遺伝子の作製（これをＧｅｎｅ．４とする）
ｍｉｃｅ ＩＣＲ ｌｉｖｅｒ（ＩＣＲ系統のマウス肝臓由来）ｃＤＮＡを鋳型に、ＰＣＲ法によりチトクロームｂ大サブユニット（ｃｙｔ−１）のクローニングした。ＰＣＲで用いたプライマーは、５’ｐｒｉｍｅｒ Ｏｌｉｇｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇｇｇ ｇａａ ｔｔｃ ｇｃｃ ｇｃｃ ａｃｃ ａｔｇ ｇｃｔ ｇｃｇ ｔｔｃ ｔｔｇ ｃｔｇ ａｇａ ｃａｔ ｇｔｃ ａｇｃ（配列番号１２）、及び３’ｐｒｉｍｅｒ Ｏｌｉｇｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇｇｇ ａａｇ ｃｔｔ ｔｃｔ ａｇａ ａａａ ｔｃａ ｃａｇ ｇｇｃ ｇｇｃ ｃａｇ ｃｃｃ（配列番号１３）である。上記により得られた、チトクロームｂ大サブユニットの増幅ＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ−ｐｌａｓｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒのＭＣＳ（ｍｕｌｔｉ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ：制限酵素領域）ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩへ導入した。大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセルを作製し、そこへ上記プラスミドベクターの形質導入を行い目的遺伝子のＰＣＲ増幅断片の単離（サブクローニング）を行った。
電子伝達阻害型＝活性酸素過剰発生型遺伝子変異を挿入した（ｍｅｖ−１型）ｃｙｔ−１遺伝子の作製は、プライマーとして、５’ｐｒｉｍｅｒ Ｏｌｉｇｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇｇｇ ｇａａ ｔｔｃ ｃｔｃ ｔｔｃ ｃｃａ ｔｇｇ ｃａｃ ｔｇｔ ｃｃｇ ａａｔ ｇｃｃ（配列番号１４）、及び３’ｐｒｉｍｅｒ Ｏｌｉｇｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇｇｇ ａａｇ ｃｔｔ ｔｃｔ ａｇａ ａａａ ｔｃａ ｃａｇ ｇｇｃ ｇｇｃ ｃａｇ ｃｃｃ（配列番号１５）を使用し、上記と同様にして、ＰＣＲおよび形質導入を行い、ｍｅｖ−１型ｃｙｔ−１遺伝子の３’領域のサブクローニングを行った。
上記で作製した野生型ｃｙｔ−１遺伝子全長サブクローニング用プラスミドベクターへ、ＥａｒＩ−ＸｂａＩ制限酵素を用いて、ｍｅｖ−１型ｃｙｔ−１遺伝子の３’領域を挿入して、ｍｅｖ−１型ｃｙｔ−１遺伝子全長を作製した。
（８）テトラサイクリン系遺伝子発現制御システム（ＴＲＥ）を用いた目的遺伝子（ｍｅｖ−１型ｃｙｔ−１遺伝子）発現用プラスミドベクターの作製
ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ制限酵素処理したｐＴＲＥプラスミドベクター（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）へｍｅｖ−１型ｃｙｔ−１遺伝子：Ｇｅｎｅ．４を挿入して、Ｖｅｃｔｏｒ．１０を作製した。
ｐｃＤＮＡ３プラスミドベクターをＮｒｕＩ−ＥｃｏＲＩ制限酵素処理し、サイトメガロウィルスプロモター（ＣＭＶ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）を排除したｐｃＤＮＡ３ ΔＣＭＶ ｐｒｏ．プラスミドベクターを作製（再度生じるＥｃｏＲＩサイトも破壊する）した（これを、Ｖｅｃｔｏｒ．１１とする）。
Ｖｅｃｔｏｒ．１０をＸｈｏＩ−ＸｂａＩ制限酵素処理し、Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ（ＴＲＥ）−ｍｅｖ−１型ｃｙｔ−１遺伝子を取得した。これを、同様にしてＸｈｏＩ−ＸｂａＩ制限酵素処理したＶｅｃｔｏｒ．１１へ挿入して、Ｖｅｃｔｏｒ．１２を作製した。
（９）プロモーター、転写調節領域内に存在するシスエレメントの効果を外部より絶縁するための働きをする遺伝子（ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ ｉｎｓｕｌａｔｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）の挿入（パート１）。
ＰＣＲ法によるｉｎｓｕｌａｔｏｒＤＮＡ断片の増幅・単離した（これをＧｅｎｅ．５とする）。ＰＣＲで使用した鋳型は、ニワトリｃＤＮＡライブラリーである。ＰＣＲで使用したプライマーは、５’ｐｒｉｍｅｒ Ｏｌｉｇｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇｇｇ ｇａｔ ａｔｃ ｇｇｇ ａｃａ ｇｃｃ ｃｃｃ ｃｃｃ ｃａａ ａｇ（配列番号１６）、及び、３’ｐｒｉｍｅｒ Ｏｌｉｇｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇｇｇ ｇａｔ ａｔｃ ｃｔｃ ａｃｔ ｇａｃ ｔｃｃ ｇｔｃ ｃｔｇ ｇ（配列番号１７）である。
上記で増幅したＤＮＡ断片：Ｇｅｎｅ．５をＥｃｏＲＶ制限酵素処理し、同様にＥｃｏＲＶ制限酵素処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ−プラスミドベクターへ挿入して、Ｖｅｃｔｏｒ．１３を作製した。上記プラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．１３をＥｃｏＲＶ制限酵素処理し取得したｉｎｓｕｌａｔｏｒを、ＰｖｕＩＩ制限酵素処理したプラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．１２へ挿入して、Ｖｅｃｔｏｒ．１４を作製した。
（１０）Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ（ＴＲＥ）を利用したテトラサイクリン遺伝子発現制御システム全長の作製
テトラサイクリン依存性転写因子（活性化因子、抑制因子）発現プラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．９、およびテトラサイクリン系遺伝子発現制御システム（ＴＲＥ）を用いた目的遺伝子（ｍｅｖ−１型ｃｙｔ−１遺伝子）発現用プラスミドベクターをそれぞれＳｓｐＩ−ＢｇｌＩＩ制限酵素処理し、連結して、Ｖｅｃｔｏｒ．１５を作製した。
（１１）プロモーター、転写調節領域内に存在するシスエレメントの効果を外部より絶縁するための働きをする遺伝子（ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）の挿入（パート２）
ｉｎｓｕｌａｔｏｒ含有ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ−プラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．１３をＥｃｏＲＶ制限酵素処理し取得したｉｎｓｕｌａｔｏｒを、ＳｓｐＩ制限酵素処理したプラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．１５へ挿入して、Ｖｅｃｔｏｒ．１６を作製した。
（１２）プロモーター、転写調節領域内に存在するシスエレメントの効果を外部より絶縁するための働きをする遺伝子（ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）の挿入（パート３）
ｉｎｓｕｌａｔｏｒ含有ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ−プラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．１３をＥｃｏＲＶ制限酵素処理し取得したｉｎｓｕｌａｔｏｒを、ＰｍｌＩ制限酵素処理したプラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．１６へ挿入して、Ｖｅｃｔｏｒ．１７を作製した。
（１３）プロモーター、転写調節領域内に存在するシスエレメントの効果を外部より絶縁するための働きをする遺伝子（ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）の挿入（パート４）
ｉｎｓｕｌａｔｏｒ含有ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ−プラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．１３をＥｃｏＲＶ制限酵素処理し取得したｉｎｓｕｌａｔｏｒを、ＥｃｏＲＶ制限酵素処理したプラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．１７へ挿入して、テトラサイクリンシステム完全長（一本化）プラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．１８を作製した。このＶｅｃｔｏｒ．１８が、電子伝達阻害型＝活性酸素過剰発生型；ｍｅｖ−１動物作製のための導入遺伝子である。
（１４）レポーター蛋白質（核移行緑色蛍光蛋白質：ｎ１ｓＧＦＰ）遺伝子の挿入
ＰＣＲ法によりｎ１ｓＧＦＰ ＤＮＡ断片を増幅・単離した（これをＧｅｎｅ．６とする）。ＰＣＲで使用した鋳型は、ＧＦＰを含有するｐＥＧＦＰ−Ｃ１プラスミドベクターである。ＰＣＲで使用したプライマーは、５’ｐｒｉｍｅｒ Ｏｌｉｇｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ： ｇｇｇ ｔｃｔ ａｇａ ａａｔ ａｔｔ ａａｇ ｃｔｔ ｔｇｃ ｇｇｃ ｃｇｃ ａｔｇ ｃｃｃ ａａｇ ａａｇ ａａｇ ｃｇｃ ａａｇ ｇｔｇ ｇａｇ ｇａｃ ｇｃｃ ａｔｇ ｇｔｇ ａｇｃ ａａｇ ｇｇｃ ｇａｇ（配列番号１８）、及び３’ｐｒｉｍｅｒ Ｏｌｉｇｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇｇｇ ｇｇｔ ａｃｃ ｇｇｇ ｃｃｃ ｃｇｇ ａｔｃ ｃｃｔ ｔｇｔ ａｃａ ｇｃｔ ｃｇｔ ｃｃａ ｔｇｃ（配列番号１９）である。上記で増幅・単離したｎ１ｓＧＦＰ遺伝子：Ｇｅｎｅ．６をＡｐａＩ−ＸｂａＩ制限酵素処理し、同様に制限酵素処理したテトラサイクリンシステム完全長（一本化）プラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．１８へ挿入して、Ｖｅｃｔｏｒ．１９を作製した。
（１５）レポーター蛋白質（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）遺伝子の挿入
ＰＣＲ法によりＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ ＤＮＡ断片を増幅・単離した（これを、Ｇｅｎｅ．７とする）。ＰＣＲで使用した鋳型は、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを含有したｐＣＨ１１０あるいはｐＭＣ１８７１プラスミドベクターである。ＰＣＲで使用したプライマーは、５’ｐｒｉｍｅｒ Ｏｌｉｇｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇｇｇ ｇｇａ ｔｃｃ ａｔｇ ｇａａ ｇａｃ ｇｃｃ ａａａ ａａｃ（配列番号２０）、及び３’ｐｒｉｍｅｒ Ｏｌｉｇｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇｇｇ ｇｇｔ ａｃｃ ｇｇｇ ｃｃｃ ｔｔａ ｃａａ ｔｔｔ ｇｇａ ｃｔｔ ｔｃｃ ｇｃ（配列番号２１）である。上記で増幅・単離したＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子：Ｇｅｎｅ．７をＡｐａＩ−ＢａｍＨＩ制限酵素処理し、同様に制限酵素処理したテトラサイクリンシステム完全長（一本化）プラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．１９へ挿入してＶｅｃｔｏｒ．２０を作製した。
（１６）一種類のプロモーターより二種類のｍＲＮＡを発現することを可能にする遺伝子配列（ＩＲＥＳ）の挿入する
ＩＲＥＳ含有のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ−プラスミドベクターをＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ制限酵素処理し、ＩＲＥＳを取得した。これを、同様にしてＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ制限酵素処理したテトラサイクリンシステム完全長（一本化）プラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．２０へ挿入して、Ｖｅｃｔｏｒ．２１を作製した。Ｖｅｃｔｏｒ．２１は、テトラサイクリンシステムがｉｎｓｕｌａｔｏｒの効果により目的遺伝子の誘導発現が厳密に行えることを証明するための導入遺伝子（Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｓｙｓｔｅｍ Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ（Ｉｎｓｕｌａｔｏｒ（＋））：Ｔｅｔ ｓｙｓｔｅｍ−Ｒｅｐ．Ｔｇ（＋））（構造を図６に示す。塩基配列を配列番号１に示す）である。Ｔｅｔ ｓｙｓｔｅｍ−Ｒｅｐ．Ｔｇ（＋）の作製の概要を図１に示す。また、Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｓｙｓｔｅｍ Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ（Ｉｎｓｕｌａｔｏｒ（−））：Ｔｅｔ ｓｙｓｔｅｍ−Ｒｅｐ．Ｔｇ（−））（構造を図７に示す。塩基配列を配列番号２に示す）となるプラスミドベクターは、（９）、（１１）〜（１３）の工程を除いたものである。
（１７）テトラサイクリン依存性転写活性化因子（ｒＴｅｔＲ−ＶＰ１６）の発現がＰｈＣＭＶプロモーターによって制御されるプラスミドベクターの作製
ＰＣＲ法を用いて、ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ遺伝子イントロン２、エキソン３領域（ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ ｓｐｌｉｃｅ Ａ／Ｄ）遺伝子を増幅・単離した（これをＧｅｎｅ．８とする）。ＰＣＲで使用した鋳型は、マウスｃＤＮＡライブラリーである。ＰＣＲで使用したプライマーは、５’ｐｒｉｍｅｒ Ｏｌｉｇｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇｇｇ ｔｃｔ ａｇａ ｇｃｃ ｔｃｔ ｇｃｔ ａａｃ ｃａｔ ｇｔｔ ｃａｔ ｇ（配列番号２２）、及び３’ｐｒｉｍｅｒ Ｏｌｉｇｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇｇｇ ｇａａ ｔｃｃ ｇａａ ｔｔｃ ｔｔｔ ｇｃｃ ａａａ ａｔｇ ａｔｇ ａｇａ ｃａｇ ｃａｃ（配列番号２３）である。上記で増幅・単離したｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ ｓｐｌｉｃｅ Ａ／Ｄ遺伝子：Ｇｅｎｅ．８をＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ制限酵素処理し、またＥｃｏＲＩ−ＮｈｅＩ制限酵素処理したテトラサイクリン依存性転写活性化因子発現プラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．４へ挿入して、Ｖｅｃｔｏｒ．２２を作製した。
（１８）テトラサイクリン依存性転写抑制因子（ＴｅｔＲ−ＫＲＡＢ）の発現がＰｈＣＭＶエンハンサー −アクチンプロモーターによって制御されるプラスミドベクターの作製
ＰＣＲ法を用いたｂｅｔａ−ａｃｔｉｎプロモーター領域（ｂｅｔａ−ａｃｔｉｎ ｐｒｏ．）遺伝子を増幅、単離した（これをＧｅｎｅ．９とする）。ＰＣＲで使用した鋳型は、マウスｃＤＮＡライブラリーである。ＰＣＲで使用したプライマーは、５’ｐｒｉｍｅｒ Ｏｌｉｇｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇｇｇ ｇｇａ ｔｃｃ ｔａｃ ｇｔａ ｔｃｇ ａｇｇ ｔｇａ ｇｃｃ ｃｃａ ｃｇｔ ｔｃ（配列番号２４）、及び３’ｐｒｉｍｅｒ Ｏｌｉｇｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇｇｇ ｇａａ ｔｔｃ ｔｃｔ ａｇａ ｇｃｃ ｇｃｃ ｇｇｔ ｃａｃ ｇｃｃ ａｇａ ａｇ（配列番号２５）である。上記で増幅・単離したｂｅｔａ−ａｃｔｉｎ ｐｒｏ．遺伝子：Ｇｅｎｅ．９をＳｎａＢＩ−ＸｂａＩ制限酵素処理し、同様に制限酵素処理したｐｃＤＮＡ３プラスミドベクターへ挿入して、Ｖｅｃｔｏｒ．２３を作製した。
ＣＭＶ ｅｎｈａｎｃｅｒにｂｅｔａ−ａｃｔｉｎ ｐｒｏ．を連結した（ＣＭＶ ｅｎｈａｎｃｅｒ−ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ ｐｒｏ．）。即ち、ｐｃＤＮＡ３プラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．２３、およびｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ遺伝子イントロン２、エキソン３領域（ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ ｓｐｌｉｃｅ Ａ／Ｄ）遺伝子断片：Ｇｅｎｅ．８をＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ制限酵素処理し、Ｖｅｃｔｏｒ．２３へｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ ｓｐｌｉｃｅ Ａ／Ｄを挿入して、Ｖｅｃｔｏｒ．２４を作製した。
テトラサイクリン依存性転写抑制因子プラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．８をＮｒｕＩ−ＫｐｎＩ制限酵素処理し、Ｖｅｃｔｏｒ．８内に存在するｐｃＤＮＡ３プラスミドベクターのＣＭＶ ｐｒｏ．を排除した（これをＶｅｃｔｏｒ．２５とする）。ＣＭＶ ｅｎｈａｎｃｅｒ−ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ ｐｒｏ．にｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ ｓｐｌｉｃｅ Ａ／Ｄを連結した（ＣＭＶ ｅｎｈａｎｃｅｒ− ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ ｐｒｏ．−ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ ｓｐｌｉｃｅ Ａ／Ｄ）ｐｃＤＮＡ３プラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．２４をＥｃｏＲＩ−ＳｐｅＩ制限酵素処理し、同様に制限酵素処理した上記Ｖｅｃｔｏｒ．２５へＣＭＶ ｅｎｈａｎｃｅｒ−ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ ｐｒｏ．−ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ ｓｐｌｉｃｅ Ａ／Ｄを挿入した（これをＶｅｃｔｏｒ．２６とする）。
（１９）テトラサイクリン系薬剤による遺伝子誘導発現制御を厳密に行うテトラサイクリンシステム完全長（一本化）プラスミドベクターの作製
テトラサイクリン依存性転写活性化因子（ｒＴｅｔＲ−ＶＰ１６）の発現がＰｈＣＭＶプロモーターによって制御されるプラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．２２、およびテトラサイクリン依存性転写抑制因子（ＴｅｔＲ−ＫＲＡＢ）の発現がＰｈＣＭＶ ｅｎｈａｎｃｅｒ−ａｃｔｉｎプロモーターによって制御されるプラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．２６をＡｐａＩ−ＸｈｏＩ制限酵素処理しＶｅｃｔｏｒ．２２へＶｅｃｔｏｒ．２６を連結して、Ｖｅｃｔｏｒ．２７を作製した。
上記プラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．２７のＰｍｌＩ制限酵素サイトへ、平滑末端（ＥｃｏＲＶ制限酵素処理された）のｉｎｓｕｌａｔｏｒを挿入して、Ｖｅｃｔｏｒ．２８を作製した。上記プラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．２８をＮｈｅＩ−ＮｒｕＩ制限酵素処理し、同様にして制限酵素処理されたテトラサイクリンシステム完全長（一本化）プラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．２１へ挿入して、Ｖｅｃｔｏｒ．２９を作製した。Ｖｅｃｔｏｒ．２９は、２段階での転写調節因子の競合（ＣＭＶ ｅｎｈａｎｃｅｒへの転写因子の結合競合およびＴＲＥへのテトラサイクリン依存性転写調節因子の結合競合）によりテトラサイクリン系遺伝子誘導発現を厳密に制御することを可能とした本発明の導入遺伝子（Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｓｙｓｔｅｍ Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ：Ｔｅｔ ｓｙｓｔｅｍ−Ｒｅｐ Ｔｇ ＡＤ（＋））である（構造を図８に示す）。Ｔｅｔ ｓｙｓｔｅｍ−Ｒｅｐ Ｔｇ ＡＤ（＋）の作製の概要を図２および図３に示す。Ｔｅｔ ｓｙｓｔｅｍ−Ｒｅｐ Ｔｇ ＡＤ（＋）の塩基配列を配列番号３に示す。
また、ｍｅｖ−１マウス作製には、このＴｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｓｙｓｔｅｍ Ｔｒａｎｓｇｅｎｅへｍｅｖ−１型ｃｙｔ−１遺伝子を導入したもの（Ｔｅｔ ｓｙｓｔｅｍ−ｍｅｖ−１ Ｔｇ ＡＤ（＋））（構造を図９に示す。塩基配列を配列番号４に示す）を使用できる。Ｔｅｔ ｓｙｓｔｅｍ− ｍｅｖ−１ Ｔｇ ＡＤ（＋）の作製の概要を図４に示す。
実施例２：遺伝子導入用の発現ベクターの構築
（１）Ｏｌｉｇｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ合成法を用いた、ｌｏｘＰ配列２本鎖ＤＮＡ断片の合成
下記に部分例を示すｌｏｘＰ配列のＯｌｉｇｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅを合成した。
５’Ｏｌｉｇｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇｇａ ｔａａ ｃｔｔ ｃｇｔ ａｔａ ｇｔａ ｔａｃ ａｔｔ ａｔａ ｃｇａ ａｃｇ ｇｔａ ｇ（配列番号２６）
３’Ｏｌｉｇｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇａｔ ｃｃｔ ａｃｃ ｇｔｔ ｃｇｔ ａｔａ ａｔｇ ｔａｔ ａｃｔ ａｔａ ｃｇａ ａｇｔ ｔａｔ ｃｃｇ ｃ（配列番号２７）
５’Ｏｌｉｇｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇｇａ ｔａａ ｃｔｔ ｃｇｔ ａｔａ ｇｔａ ｔａｃ ａｔｔ ａｔａ ｇｃａ ａｔｇ ｇｔａ ｇ（配列番号２８）
３’Ｏｌｉｇｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇａｔ ｃｃｔ ａｃｃ ａｔｔ ｇｃｔ ａｔａ ａｔｇ ｔａｔ ａｃｔ ａｔａ ｃｇａ ａｇｔ ｔａｔ ｃｃｇ ｃ（配列番号２９）
５’Ｏｌｉｇｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇｇａ ｔａａ ｃｔｔ ｃｇｔ ａｔａ ｇｇａ ｔａｃ ｔｔｔ ａｔａ ｃｇａ ａｃｇ ｇｔａ ｇ（配列番号３０）
３’Ｏｌｉｇｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇａｔ ｃｃｔ ａｃｃ ｇｔｔ ｃｇｔ ａｔａ ａａｇ ｔａｔ ｃｃｔ ａｔａ ｃｇａ ａｇｔ ｔａｔ ｃｃｇ ｃ（配列番号３１）
５’Ｏｌｉｇｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇｇａ ｔａａ ｃｔｔ ｃｇｔ ａｔａ ｇｇａ ｔａｃ ｔｔｔ ａｔａ ｇｃａ ａｔｇ ｇｔａ ｇ（配列番号３２）
３’Ｏｌｉｇｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇａｔ ｃｃｔ ａｃｃ ａｔｔ ｇｃｔ ａｔａ ａａｇ ｔａｔ ｃｃｔ ａｔａ ｃｇａ ａｇｔ ｔａｔ ｃｃｇ ｃ（配列番号３３）
５’Ｏｌｉｇｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇｇａ ｔａａ ｃｔｔ ｃｇｔ ａｔａ ｇｔａ ｔａｃ ａｔｔ ａｔａ ｃｇａ ａｇｔ ｔａｔ ｇ（配列番号３４）
３’Ｏｌｉｇｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇａｔ ｃｃａ ｔａａ ｃｔｔ ｃｇｔ ａｔａ ａｔｇ ｔａｔ ａｃｔ ａｔａ ｃｇａ ａｇｔ ｔａｔ ｃｃｇ ｃ（配列番号３５）
５’Ｏｌｉｇｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇｇｔ ａｃｃ ｇｔｔ ｃｇｔ ａｔａ ｇｔａ ｔａｃ ａｔｔ ａｔａ ｇｃａ ａｇｔ ｔａｔ ｇ（配列番号３６）
３’Ｏｌｉｇｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇａｔ ｃｃａ ｔａａ ｃｔｔ ｃｇｔ ａｔａ ａｔｇ ｔａｔ ａｃｔ ａｔａ ｃｇａ ａｃｇ ｇｔａ ｃｃｇ ｃ（配列番号３７）
５’Ｏｌｉｇｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇｇａ ａｔｔ ａｔｔ ｃｇｔ ａｔａ ｇｔａ ｔａｃ ａｔｔ ａｔａ ｃｇａ ａｇｔ ｔａｔ ｇ（配列番号３８）
３’Ｏｌｉｇｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇａｔ ｃｃａ ｔａａ ｃｔｔ ｃｇｔ ａｔａ ａｔｇ ｔａｔ ａｃｔ ａｔａ ｃｇａ ａｔａ ａｔｔ ｃｃｇ ｃ（配列番号３９）
５’Ｏｌｉｇｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇｇａ ａｔｔ ａｔｔ ｃｇｔ ａｔａ ｇｇａ ｔａｃ ｔｔｔ ａｔａ ｃｇａ ａｇｔ ｔａｔ ｇ（配列番号４０）
３’Ｏｌｉｇｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｇａｔ ｃｃａ ｔａａ ｃｔｔ ｃｇｔ ａｔａ ａａｇ ｔａｔ ｃｃｔ ａｔａ ｃｇａ ａｔａ ａｔｔ ｃｃｇ ｃ（配列番号４１）
上記５’及び３’のＯｌｉｇｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅそれぞれの組み合わせをＰｏｌｙ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（ＰＮＫ）処理後、２本鎖ＤＮＡ断片とし、ｌｏｘＰ ＤＮＡ配列断片を合成した（これをＧｅｎｅ．１とする）。
（２）ｌｏｘＰ配列２本鎖ＤＮＡ断片と赤色蛍光蛋白質（ＤｓＲｅｄ）発現遺伝子の連結
上記で作製したｌｏｘＰ配列２本鎖ＤＮＡ断片を、ＳａｃＩＩ−ＢａｍＨＩ制限酵素処理したｐＤｓＲｅｄ１−Ｎ１プラスミドベクターへ挿入して、Ｖｅｃｔｏｒ．１を作製した。
（３）テトラサイクリン系遺伝子発現制御システム（ＴＲＥ）を用いた目的遺伝子（ｌｏｘＰ−ＤｓＲｅｄ）発現用プラスミドベクターの作製
ｌｏｘＰ配列２本鎖ＤＮＡ断片とＤｓＲｅｄが連結されたプラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．１をＳａｃＩＩ−ＮｏｔＩ制限酵素処理し、 同様に制限酵素処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ−プラスミドベクターへ挿入してＶｅｃｔｏｒ．２を作製した。上記プラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．２をＳａｃＩＩ−ＸｂａＩ制限酵素処理し、同様に制限酵素処理したｐＴＲＥプラスミドベクターへ挿入してＶｅｃｔｏｒ．３を作製した。
（４）組換えターゲット配列（ｌｏｘＰ配列）を含有したテトラサイクリンシステム完全長（一本化）プラスミドベクターの作製
上記、ｐＴＲＥ−ｌｏｘＰ−ＤｓＲｅｄプラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．３をＸｂａＩ−ＸｈｏＩ制限酵素処理し、同様に制限酵素処理したｐｃＤＮＡ３プラスミドベクターへ挿入してＶｅｃｔｏｒ．４を作製した。上記、プラスミドベクター：Ｖｅｃｔｏｒ．４をＡｐａＩ−ＥｃｏＲＶ制限酵素処理し、同様に制限酵素処理したテトラサイクリンシステム完全長（一本化）プラスミドベクターへ：Ｖｅｃｔｏｒ．２９へ挿入して、Ｖｅｃｔｏｒ．５を作製した。Ｖｅｃｔｏｒ．５が、本発明の最終目的であるＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムとテトラサイクリン系遺伝子誘導発現システムを併用するための導入遺伝子（Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｓｙｓｔｅｍ−ｌｏｘＰ ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）である。
組換えターゲット配列（ｌｏｘＰ配列）を含有したテトラサイクリンシステム完全長（一本化）プラスミドベクターの作製の概要を図５に示す。作製したＴｅｔ ｓｙｓｔｅｍ−ｌｏｘＰ Ｔｇ ＡＤ（＋）の構造を図１０に示し、その塩基配列を配列番号５に示す。
実施例３：遺伝子導入と発現アッセイ
ＮＩＨ３Ｔ３細胞株を６ｗｅｌｌプレートに（１×１０５〜ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）培養した。１２時間の培養後、無血清培地へ培地交換を行い、遺伝子導入を行った。遺伝子導入はリポフェクトアミン試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ｐｌｕｓ ｒｅｇｅｎｔ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｉｎｃ．）を用いて行った。ＤＮＡ濃度は以下の通りである。
（１）（図１１）
Ａｃｔｉｖａｔｏｒ（ｒＴｅｔＲ−ＶＰ１６：Ｖｅｃｔｏｒ．５）…５００ｎｇ／ｗｅｌｌ
Ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ（ＴｅｔＲ−ＫＲＡＢ：Ｖｅｃｔｏｒ．７）…５００ｎｇ／ｗｅｌｌ
ｐＴＲＥ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ…５００ｎｇ／ｗｅｌｌ
ｐＣＭＶ−Ｂ−ｇａｌ…５０ｎｇ／ｗｅｌｌ
（２）（図７）
Ｔｅｔ ｓｙｓｔｅｍ−Ｒｅｐ．Ｔｇ（−）…１５００ｎｇ／ｗｅｌｌ
ｐＣＭＶ−Ｂ−ｇａｌ…５０ｎｇ／ｗｅｌｌ
（３）（図６）
Ｔｅｔ ｓｙｓｔｅｍ−Ｒｅｐ．Ｔｇ（＋）（Ｖｅｃｔｏｒ．２１）…２０００ｎｇ／ｗｅｌｌ
ｐＣＭＶ−Ｂ−ｇａｌ…５０ｎｇ／ｗｅｌｌ
（４）（図８）
Ｔｅｔ ｓｙｓｔｅｍ−Ｒｅｐ．Ｔｇ ＡＤ（＋）（Ｖｅｃｔｏｒ．２９）…２０００ｎｇ／ｗｅｌｌ
ｐＣＭＶ−Ｂ−ｇａｌ…５０ｎｇ／ｗｅｌｌ
遺伝子導入後、５時間培養し、１０％ＦＢＳ培地を加え、培地中の最終血清（ＦＢＳ）濃度が５％になるようにした。遺伝子導入から２４時間した後、５％ＦＢＳ培地へ培地交換し、さらに４８時間培養した。この際、テトラサイクリン系薬剤であるドキシサイクリン（Ｄｏｘｃｙｃｌｉｎ）添加培地には、Ｄｏｘｃｙｃｌｉｎを最終濃度１μｇ／ｍｌ培地となるように添加した。
上記の通り遺伝子導入を行った６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに１００〜１５０μｌのｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（組成は下記に示す）を加え、３０分間反応後、細胞溶出液を回収し、ルシフェラーゼアッセイとβ−ガラクトシダーゼアッセイを下記の通り行った。
ルシフェラーゼアッセイでは、細胞溶出液２０ｍｉｃｒｏ１を用い、１００μｌのＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ（組成は下記に示す）を加え、ルシフェラーゼによる発光強度をＡＢ−２２００ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒ−ＰＳＮ（ＡＴＴＯ Ｉｎｃ．）で測定した。β−ガラクトシダーゼアッセイでは、細胞溶出液５０μｌを用い、１００μｌのβ−Ｇａｌ ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ（組成は下記に示す）を加え比色定量法によるβ−ガラクトシダーゼ活性を４２０ｎｍ波長でＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ２５０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）により測定した。遺伝子導入効率の補正として、β−ガラクトシダーゼ活性を測定しており、ルシフェラーゼ活性の数値をβ−ガラクトシダーゼ活性の数値で割った値が、実際の遺伝子発現産物量となる。測定結果を図１２に示す。本発明の遺伝子導入用の発現ベクターを用いた場合、ドキシサイクリンの有無により目的遺伝子の発現を制御できることが分かる。また、本発明による遺伝子発現制御の様式を図１３に示す。
試薬組成
(1) Amplification / isolation of DNA fragment of cytomegalovirus promoter (PhCMV promoter) using PCR method
Using a PCR method, new restriction enzyme recognition sites are inserted at both ends of the PhCMV promoter (referred to as Gene.1). The template used in PCR is a pcDNA3 plasmid vector containing PhCMV promoter. Primers used in PCR were 5 'primer Oligo nucleotide: ggg ggt acc aat att gct agc gag ctt ggc ccat ttg cat acg g tg c g cga att cgc tag cgg ggc cgc gga ggc tgg atc (SEQ ID NO: 7).
The pcDNA3 plasmid vector was subjected to HindIII restriction enzyme treatment and blunt end treatment to eliminate the HindIII restriction enzyme recognition site (this is referred to as Vector.1).
Vector. 1 was treated with KpnI-XhoI restriction enzyme and treated in the same manner as Gene. 1 and Vector. 2 was produced.
(2) Addition of polyadenylic acid signal (polyA)
Plasmid vector treated in the same manner with SV40 polyA treated with BamHI-HindIII restriction enzyme: Vector. 2 and Vector. 3 was produced.
(3) Addition of tetracycline-dependent transcriptional activator (rTetR-VP16)
pUHD17 plasmid vector (Clonetech) was treated with BamHI-EcoRI restriction enzyme to obtain rTetR-VP16, and the same restriction enzyme-treated plasmid vector: Vector. 3 into the Vector. 4 was produced.
(4) Amplification and isolation of DNA fragment of SV40 polyA using PCR method
A novel restriction enzyme recognition site was inserted into both ends of SV40 polyA using the PCR method (this is referred to as Gene.2). The template used in PCR is pcDNA3 or pTRE plasmid vector containing SV40 polyA. Primers used in the PCR were 5 'primer Oligo nucleotide: ggg gga tcc aga cat cat aag (SEQ ID NO: 8), and 3' primer Oligo nucleotide catch g cc c gt c gt c ). The pcDNA3 plasmid vector was treated with BamHI-KpnI restriction enzyme and treated in the same manner as Gene. 2 and Vector. 5 was produced.
(5) Preparation of tetracycline-dependent transcription repressor expression vector
Homo sapiens
Gene. 3 was treated with a BamHI-HindIII restriction enzyme and inserted into pBluescript II containing the similarly treated tetracycline-dependent receptor (TetR) to prepare TetR-KRAB (this is referred to as Vector.6). Plasmid vector: Vector. 6 was treated with BamHI-EcoRI restriction enzyme and similarly treated with PhCMV pro. Into pBluescript II containing -TetR-KRAB was prepared (this is referred to as Vector.7). Plasmid vector: Vector. 7 was treated with XhoI-BamHI restriction enzyme and similarly treated plasmid vector: Vector. 5 into the Vector. 8 was produced.
(6) Ligation of tetracycline-dependent transcription factor (PhCMV pro.-rTetR-VP16, PhCMV pro.-TetR-KRAB (Kox1))
Plasmid vector: Vector. 4 and 8 were each treated with XhoI-ApaI restriction enzyme, and a tetracycline-dependent transcriptional activator expression plasmid vector: Vector. 4, a tetracycline-dependent transcriptional repressor expression gene is ligated, and Vector. 9 was produced.
(7) Electron transfer inhibition type = production of an active oxygen excess gene mutation (mev-1 type) cyt-1 gene (this is referred to as Gene.4)
Using the ICR liver (derived from ICR strain mouse liver) cDNA as a template, cytochrome b large subunit (cyt-1) was cloned by PCR. Primers used in PCR were 5 'primer Oligo nucleotide: ggg gaa ttt gcc gcc acc atg gct gcg tt ttt ctg aga cat gtc agc (SEQ ID NO: 12) ggc ggc cag ccc (SEQ ID NO: 13). The amplified DNA fragment of the cytochrome b large subunit obtained as described above was introduced into MCS (multi cloning site) EcoRI-XbaI of pBluescript II SK-plasmid vector. A competent cell of E. coli DH5α was prepared, and the above plasmid vector was transduced therein to isolate a PCR amplified fragment of the target gene (subcloning).
Electron transfer inhibition type = active-oxygen excess gene mutation type (mev-1 type) cyt-1 gene was prepared by using 5 ′ primer Oligo nucleotide: ggg ga ttt c tct tcc c tca g tac ccg aat gcc (SEQ ID NO: 14), and 3'primer Oligo nucleotide: ggg aag ctt tct aga aaa tca cag ggc ggg cag ccc (SEQ ID NO: 15), PCR and transduction were performed in the same manner as above, and mev-1 Subcloning of the 3 ′ region of the type cyt-1 gene was performed.
Using the EarI-XbaI restriction enzyme, the 3 ′ region of the mev-1 type cyt-1 gene was inserted into the wild-type cyt-1 gene full-length subcloning plasmid vector prepared above, and the mev-1 type cyt-1 The full length gene was made.
(8) Preparation of plasmid vector for expression of target gene (mev-1 type cyt-1 gene) using tetracycline gene expression control system (TRE)
To pTRE plasmid vector (Clonetech) treated with EcoRI-XbaI restriction enzyme, mev-1 type cyt-1 gene: Gene. 4 is inserted, and Vector. 10 was produced.
pcDNA3 plasmid vector was treated with NruI-EcoRI restriction enzyme to eliminate cytomegalovirus promoter (CMV promoter) pcDNA3 ΔCMV pro. A plasmid vector was prepared (and the regenerated EcoRI site was also destroyed) (this is referred to as Vector.11).
Vector. 10 was treated with a restriction enzyme XhoI-XbaI to obtain a tetracycline receptor responding element (TRE) -mev-1 type cyt-1 gene. This was treated in the same way with Vector.XhoI-XbaI restriction enzyme-treated. 11 and Vector. 12 was produced.
(9) Insertion of a gene (beta-globulin insulator sequence: insulator) that functions to insulate the effect of a cis element existing in the promoter and transcriptional regulatory region from the outside (part 1).
Insulator DNA fragment was amplified and isolated by PCR (this is referred to as Gene.5). The template used for PCR is a chicken cDNA library. Primers used in the PCR were 5 ′ primer Oligo nucleotide: ggg gat atc ggg aca gcc ccc ccc caa ag (SEQ ID NO: 16), and 3 ′ primer Oligo nucleotide g t cct g t c t g 17).
DNA fragment amplified above: Gene. 5 was inserted into a pBluescript II SK-plasmid vector treated with EcoRV restriction enzyme and treated with EcoRV restriction enzyme in the same manner. 13 was produced. The above plasmid vector: Vector. 13 was treated with EcoRV restriction enzyme and the obtained plasmid was treated with PvuII restriction enzyme. Plasmid vector: Vector. 12 into the Vector. 14 was produced.
(10) Production of full-length tetracycline gene expression control system using Tetracycline receptor Responsive element (TRE)
Tetracycline-dependent transcription factor (activator, repressor) expression plasmid vector: Vector. 9 and plasmid vectors for expression of the target gene (mev-1 type cyt-1 gene) using the tetracycline gene expression control system (TRE) were treated with SspI-BglII restriction enzyme, ligated, and Vector. 15 was produced.
(11) Insertion of a gene (insulator) that acts to insulate the effect of cis elements existing in the promoter and transcriptional regulatory region from the outside (Part 2)
Insulator-containing pBluescript II SK-plasmid vector: Vector. 13 was subjected to EcoRV restriction enzyme treatment, and the obtained insulator vector was treated with SspI restriction enzyme plasmid vector: Vector. 15 into the Vector. 16 was produced.
(12) Insertion of a gene (insulator) that functions to insulate the effects of cis elements existing in the promoter and transcriptional regulatory region from the outside (Part 3)
Insulator-containing pBluescript II SK-plasmid vector: Vector. 13 was treated with EcoRV restriction enzyme and the obtained plasmid was treated with PmlI restriction enzyme plasmid vector: Vector. 16 and Vector. 17 was produced.
(13) Insertion of a gene (insulator) that functions to insulate the effect of a cis element existing in the promoter and transcriptional regulatory region from the outside (Part 4)
Insulator-containing pBluescript II SK-plasmid vector: Vector. 13 was treated with EcoRV restriction enzyme, and the obtained plasmid was treated with EcoRV restriction enzyme plasmid vector: Vector. 17, the tetracycline system full length (single) plasmid vector: Vector. 18 was produced. This Vector. 18 is an electron transfer inhibition type = active oxygen excess generation type; a transgene for production of mev-1 animals.
(14) Insertion of reporter protein (nuclear translocation green fluorescent protein: n1sGFP) gene
The n1sGFP DNA fragment was amplified and isolated by PCR (this is referred to as Gene.6). The template used in PCR is a pEGFP-C1 plasmid vector containing GFP. Primers used in PCR were 5 'primer Oligo nucleotide: ggg tct aga aat att aag ctt tgc ggg cgc atg ccc aag aag ag c gc g ag g t Oligo nucleotide: ggg ggt acc ggg ccc cgg atc cct tgt aca gct cgt cca tgc (SEQ ID NO: 19). N1sGFP gene amplified and isolated above: Gene. 6 was treated with ApaI-XbaI restriction enzyme and similarly treated with the restriction enzyme tetracycline system full-length (single) plasmid vector: Vector. 18 into the Vector. 19 was produced.
(15) Insertion of a reporter protein (Luciferase) gene
The Luciferase DNA fragment was amplified and isolated by PCR (this is referred to as Gene.7). The template used in PCR is pCH110 or pMC1871 plasmid vector containing Luciferase. Primers used in the PCR were 5 'primer Oligo nucleotide: ggg gga tcc atg gaa gac gcc aaa aac (SEQ ID NO: 20), and 3' primer Oligo cact g tcc at g t 21). Luciferase gene amplified and isolated as described above: Gene. 7 was treated with ApaI-BamHI restriction enzyme and similarly treated with restriction enzyme tetracycline system full length (single) plasmid vector: Vector. 19 into Vector. 20 was produced.
(16) Inserting a gene sequence (IRES) that allows two types of mRNA to be expressed from one type of promoter
A pBluescriptII SK-plasmid vector containing IRES was treated with HindIII-NotI restriction enzyme to obtain IRES. This was similarly treated with HindIII-NotI restriction enzyme tetracycline system full-length (single) plasmid vector: Vector. 20 into the Vector. 21 was produced. Vector. 21 is a transgene (Tetracline system Transgene (Insulator (+)): Tet system-Rep. Tg (+)) for demonstrating that the tetracycline system can strictly induce expression of the target gene by the effect of the insulator. Is shown in Fig. 6. The nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 1.) Tet system-Rep. An outline of the production of Tg (+) is shown in FIG. In addition, Tetracylline system Transgene (Insulator (-)): Tet system-Rep. Tg (−)) (the structure is shown in FIG. 7; the base sequence is shown in SEQ ID NO: 2) is a plasmid vector excluding the steps (9) and (11) to (13).
(17) Preparation of plasmid vector in which expression of tetracycline-dependent transcriptional activator (rTetR-VP16) is controlled by PhCMV promoter
Using the PCR method, the beta-
(18) Preparation of a plasmid vector in which the expression of a tetracycline-dependent transcription repressor (TetR-KRAB) is controlled by the PhCMV enhancer-actin promoter
The beta-actin promoter region (beta-actin pro.) Gene using PCR was amplified and isolated (this is referred to as Gene.9). The template used for PCR is a mouse cDNA library. Primers used in PCR were 5 'primer Oligo nucleotide: ggg gga tcc tac gta tcg agg tga gcc cca cgt tc (SEQ ID NO: 24), and 3' primer Oligo ccc gagged ctag (SEQ ID NO: 25). The beta-actin pro. Gene: Gene. 9 was treated with a SnaBI-XbaI restriction enzyme, inserted into a pcDNA3 plasmid vector treated with the same restriction enzyme, and Vector. 23 was produced.
In CMV enhancer, beta-actin pro. Was ligated (CMV enhancer-beta-globin pro.). That is, pcDNA3 plasmid vector: Vector. 23, and beta-
Tetracycline-dependent transcription repressor plasmid vector: Vector. 8 was treated with NruI-KpnI restriction enzyme, and Vector. CMV pro. Of the pcDNA3 plasmid vector present in (This is referred to as Vector.25). CMV enhancer-beta-globin pro. Beta-globin splice A / D was ligated to (CMV enhancer-beta-globin pro.-beta-globin splice A / D) pcDNA3 plasmid vector: Vector. 24 was treated with EcoRI-SpeI restriction enzyme and similarly treated with the above-mentioned Vector. 25 CMV enhancer-beta-globin pro. -Beta-globine splice A / D was inserted (this is referred to as Vector.26).
(19) Preparation of a tetracycline system full-length (single) plasmid vector that strictly controls gene-induced expression by tetracycline drugs
Plasmid vector in which expression of tetracycline-dependent transcriptional activator (rTetR-VP16) is controlled by the PhCMV promoter: Vector. 22, and a plasmid vector in which expression of a tetracycline-dependent transcription repressor (TetR-KRAB) is controlled by the PhCMV enhancer-actin promoter: Vector. 26 was treated with ApaI-XhoI restriction enzyme and treated with Vector. 22 to Vector. 26 is connected to the Vector. 27 was produced.
The above plasmid vector: Vector. A blunt-end (EcoRV restriction enzyme-treated) insulator was inserted into 27 PmlI restriction enzyme sites, and Vector. 28 was produced. The above plasmid vector: Vector. 28 was treated with NheI-NruI restriction enzyme and similarly treated with the restriction enzyme tetracycline system full length (single) plasmid vector: Vector. 21 and insert into Vector. 29 was produced. Vector. 29 is capable of tightly controlling tetracycline gene-induced expression by competition of transcriptional regulators in two stages (competition of transcription factor binding to CMV enhancer and competition of tetracycline-dependent transcriptional regulator to TRE). The transgene of the present invention (Tetracylline system Transgene: Tet system-Rep Tg AD (+)) (the structure is shown in FIG. 8). An outline of the preparation of Tet system-Rep Tg AD (+) is shown in FIGS. The base sequence of Tet system-Rep Tg AD (+) is shown in SEQ ID NO: 3.
Further, for the production of mev-1 mice, a mev-1 type cyt-1 gene introduced into this Tetracycline system Transgene (Tet system-mev-1 Tg AD (+)) (structure is shown in FIG. 9). Can be used as shown in SEQ ID NO: 4. An outline of the production of Tet system- mev-1 Tg AD (+) is shown in FIG.
Example 2: Construction of an expression vector for gene transfer
(1) Synthesis of double-stranded DNA fragment of loxP sequence using Oligo nucleotide synthesis method
Oligo nucleotides of the loxP sequence shown below as partial examples were synthesized.
5'Oligo nucleotide: gga taa ctt cgt ata gta tac att ata cga acg gtag (SEQ ID NO: 26)
3'Oligo nucleotide: gaat cct acc gtt cgt atat att tat atta cga agt tat ccg c (SEQ ID NO: 27)
5'Oligo nucleotide: gga taa ctt cgt ata gta tac att at gca atg gta g (SEQ ID NO: 28)
3′Oligo nucleotide: gaat cct acc att gct ata atg tat atta ata cga agt tat ccc c (SEQ ID NO: 29)
5′Oligo nucleotide: gga taa ctt cgt ata gga tac ttt ata cga acg gtag (SEQ ID NO: 30)
3'Oligo nucleotide: gaat cct acc gtt cgt ata ag tat cct ata cga ag tat ccg c (SEQ ID NO: 31)
5'Oligo nucleotide: gga taa ctt cgt ata gga tac ttt atta gca atg gta g (SEQ ID NO: 32)
3'Oligo nucleotide: gaat cct acc att gct ata ag tat cct ata cga ag tat ccg c (SEQ ID NO: 33)
5'Oligo nucleotide: gga taa ctt cgt ata gta tatt atta cga agt tat g (SEQ ID NO: 34)
3'Oligo nucleotide: gat cta taa ctt cgt ata tat tat tata cga ag tat ccg c (SEQ ID NO: 35)
5'Oligo nucleotide: ggt acc gtt cgt ata gta tac att at gca agt tat g (SEQ ID NO: 36)
3'Oligo nucleotide: gat cta taa ctt cgt ata tat tata tata cga acg gta ccg c (SEQ ID NO: 37)
5 'Oligo nucleotide: gga att att cgt ata gta tac att ata cga ag tatt g (SEQ ID NO: 38)
3'Oligo nucleotide: gaat cata taa tct cgt ata atg tat act ata cga atat ccg c (SEQ ID NO: 39)
5'Oligo nucleotide: gga att att cgt ata gga tac tatt ata cga ag tatt g (SEQ ID NO: 40)
3'Oligo nucleotide: gat cata taa ttt cgt ata ag tat cct ata cga ata att ccc c (SEQ ID NO: 41)
The combination of each of the 5 ′ and 3 ′ Oligo nucleotides was treated with Poly Nucleotide Kinase (PNK) to form a double-stranded DNA fragment, and a loxP DNA sequence fragment was synthesized (referred to as Gene.1).
(2) Linkage between loxP double-stranded DNA fragment and red fluorescent protein (DsRed) expression gene
The loxP double-stranded DNA fragment prepared above was inserted into a pDsRed1-N1 plasmid vector treated with SacII-BamHI restriction enzyme, and Vector. 1 was produced.
(3) Preparation of plasmid vector for expression of target gene (loxP-DsRed) using tetracycline gene expression control system (TRE)
A plasmid vector in which a double-stranded DNA fragment of a loxP sequence and DsRed are ligated: Vector. 1 was treated with a SacII-NotI restriction enzyme and inserted into a pBluescriptII SK-plasmid vector treated with the same restriction enzyme. 2 was produced. The above plasmid vector: Vector. 2 was treated with a SacII-XbaI restriction enzyme and inserted into a pTRE plasmid vector treated with the same restriction enzyme. 3 was produced.
(4) Preparation of tetracycline system full length (single) plasmid vector containing recombination target sequence (loxP sequence)
PTRE-loxP-DsRed plasmid vector: Vector. 3 was treated with a restriction enzyme XbaI-XhoI, inserted into a pcDNA3 plasmid vector treated with the same restriction enzyme, and Vector. 4 was produced. The above plasmid vector: Vector. 4 was treated with ApaI-EcoRV restriction enzyme and similarly treated with the restriction enzyme Tetracycline system full length (single) plasmid vector: Vector. 29 and insert into Vector. 5 was produced. Vector. 5 is a transgene (Tetracycline system-loxP sequence Transgene) for the combined use of the Cre-loxP system, which is the final object of the present invention, and the tetracycline gene-induced expression system.
An outline of the production of a tetracycline system full-length (single) plasmid vector containing a recombination target sequence (loxP sequence) is shown in FIG. The structure of the produced Tet system-loxP Tg AD (+) is shown in FIG. 10, and its base sequence is shown in SEQ ID NO: 5.
Example 3: Gene transfer and expression assay
NIH3T3 cell line on 6-well plate (1 × 10 5 -Cells / well). After culturing for 12 hours, the medium was changed to a serum-free medium, and gene transfer was performed. Gene transfer was performed using Lipofectamine plus reagent (Invitrogen Inc.). The DNA concentration is as follows.
(1) (Fig. 11)
Activator (rTetR-VP16: Vector.5) ... 500 ng / well
Repressor (TetR-KRAB: Vector.7) ... 500 ng / well
pTRE-Luciferase ... 500 ng / well
pCMV-B-gal ... 50 ng / well
(2) (Figure 7)
Tet system-Rep. Tg (-) ... 1500 ng / well
pCMV-B-gal ... 50 ng / well
(3) (Fig. 6)
Tet system-Rep. Tg (+) (Vector.21) ... 2000 ng / well
pCMV-B-gal ... 50 ng / well
(4) (Fig. 8)
Tet system-Rep. Tg AD (+) (Vector. 29) ... 2000 ng / well
pCMV-B-gal ... 50 ng / well
After the gene introduction, the cells were cultured for 5 hours, and 10% FBS medium was added so that the final serum (FBS) concentration in the medium was 5%. After 24 hours from gene transfer, the medium was changed to 5% FBS medium, followed by further culturing for 48 hours. At this time, Doxcyclin was added to a medium supplemented with doxycycline (Doxcycline), which is a tetracycline-based drug, to a final concentration of 1 μg / ml.
100-150 μl of lysis buffer (composition is shown below) was added to the 6-well plate into which the gene was introduced as described above, and after 30 minutes of reaction, the cell eluate was recovered, and the luciferase assay and β-galactosidase assay were performed as follows. went.
In the luciferase assay, the cell eluate 20micro1 was used, 100 μl of Luciferase assay Buffer (the composition is shown below) was added, and the luminescence intensity by luciferase was measured with AB-2200 Luminescence-PSN (ATTO Inc.). In the β-galactosidase assay, 50 μl of cell eluate was used, 100 μl of β-Gal assay Buffer (composition is shown below) was added, and β-galactosidase activity by colorimetry was measured with SpectraMax 250 (Molecular Devices) at a wavelength of 420 nm. did. As a correction for gene transfer efficiency, β-galactosidase activity is measured, and the value obtained by dividing the numerical value of luciferase activity by the numerical value of β-galactosidase activity is the actual gene expression product amount. The measurement results are shown in FIG. It can be seen that when the expression vector for gene transfer of the present invention is used, the expression of the target gene can be controlled by the presence or absence of doxycycline. Moreover, the mode of gene expression control by this invention is shown in FIG.
Reagent composition
本発明による発現ベクターにおいては、（ｉ）第一のプロモーターと、テトラサイクリン系薬剤をリガンドとするレセプターに正の転写調節因子を連結して成る転写活性化因子とを含む発現ユニット；（ｉｉ）第二のプロモーターと、テトラサイクリン系薬剤をリガンドとするレセプターに負の転写調節因子を連結して成る転写抑制因子とを含む発現ユニット；及び（ｉｉｉ）前記レセプターのための標的配列を含む転写調節領域を伴う第三のプロモーターを含む、目的遺伝子を発現させるための発現ユニットが一つのベクターに組み込まれているので、このベクターを使用することにより、上記３種類の発現ベクター系を含むトランスジェニック動物を極めて効率的に作製することができる。
また、上記３種類の発現系のために相互に異なるプロモーターが使用され、且つそれらの発現系がインスレーターにより相互に分離されているので、隣り合った発現系のエンハンサーの効力が相互に絶縁され、転写活性化因子と転写抑制因子の発現量を相互に独立に容易に制御することができる。更に、転写活性化因子の発現のためのプロモーターに比べて転写抑制因子の発現のために強力なプロモーターを使用することにより、転写活性化因子に比べて転写抑制因子を多く発現させて、リガンドであるテトラサイクリン系薬物による目的外来遺伝子の発現のレベルを、本来の野生型遺伝子の発現レベルにおいて容易に制御することができる。また、本発明の好ましい態様によれば、前記第一のプロモーターと前記第二のプロモーターには、それぞれ同一のエンハンサーを含めることができる。
また、本発明においては、上記した発現ベクターにおいて、目的の外来遺伝子を発現させるための制御領域の下流にｌｏｘＰ配列を挿入しておき（目的の外来遺伝子自体は挿入されていない）、この発現ベクターを動物のゲノム上にランダムに導入することができる。これにより、動物のゲノムの種々の部位に外来遺伝子系が挿入された種々のトランスジェニック動物がえられ、それらのトランスジェニック動物には、元来の遺伝子の発現が悪影響を受けるものや、導入した外来遺伝子の発現制御が容易でないものも含まれるが、元来の遺伝子の発現が影響を受けず、且つ導入した外来遺伝子の発現のオンとオフの制御を厳密に行うと同時にその発現量を容易にコントロールすることができるトランスジェニック動物を得ることができる。
そして、このようなトランスジェニック動物を一旦得ることができれば、目的とする外来遺伝子をｌｏｘＰ配列に連結した環状の遺伝子構成物を別途用意し、この目的外来遺伝子を、目的遺伝子の発現のための制御領域の下流に、ｌｏｘＰ配列の組み換えを介して導入することができる。この場合、上記のトランスジェニック動物においては、外来遺伝子が、元来の遺伝子の発現が影響を受けない位置に導入されており、しかもｌｏｘＰの組み換えによる目的外来遺伝子の導入は、例えば、個体の子宮、卵巣又は精巣レベルにおいて容易に行うことができるので、元来の遺伝子の発現に影響することなく、且つ導入した目的外来遺伝子の発現を容易に制御することができ、かつ広範な種類の目的外来遺伝子のいずれかを導入したトランスジェニック動物の品揃えを容易に行うことができる。上記の通り、本発明においては、Ｃｒｅリコンビナーゼを用いて目的外来遺伝子を含む環状ＤＮＡを個体に導入した場合、目的外来遺伝子は本発明の発現ベクターの配列中の目的遺伝子の発現のための制御領域の下流に、ｌｏｘＰ配列の組み換えを介して挿入されるので、元来の染色体上の遺伝子には影響を及ぼすことがないという利点を有している。また、このように目的外来遺伝子を導入した動物個体に、Ｃｒｅリコンビナーゼのみを導入すると、導入した目的外来遺伝子を除去することも可能である。そして、このように目的外来遺伝子を除去した動物個体には再度、別の目的外来遺伝子を上記と同様に導入することが可能であり、遺伝子導入を繰り返し行うことができるという利点を有している。さらに、本発明においては、マイクロインジェクションを行うことなく目的の外来遺伝子を導入したトランスジェニック動物を作製することができるという利点がある。
上記の通り、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムを用いた環状ＤＮＡ導入の利点としては以下のものが挙げられる。
（１）染色体上への環状ＤＮＡの導入効率は、直鎖状ＤＮＡの導入効率に比べはるかに低いことから、無作為な染色体上への導入を防ぐ効果が期待される。これにより、ｌｏｘＰ配列を有する環状ＤＮＡの導入は、無作為な染色体上への導入を防ぎ、染色体上の所定の位置（ｌｏｘＰ配列）への導入が期待できる。
（２）Ｔｅｔ ｓｙｓｔｅｍ−ｌｏｘＰ Ｔｇ ＡＤトランスジェニックマウスへの目的遺伝子の導入は、テトラサイクリン系薬剤の投与によりその遺伝子発現量を抑制することが可能となる。即ち、ｌｏｘＰ配列への導入が可能なことで、無作為導入による新たな遺伝子欠損を招く危険性を回避し、さらに導入した遺伝子の発現はテトラサイクリン系薬剤に依存的で、目的に応じた発現量を制御することが可能である。In the expression vector according to the present invention, an expression unit comprising (i) a first promoter and a transcriptional activator formed by linking a positive transcriptional regulator to a receptor having a tetracycline drug as a ligand; An expression unit comprising two promoters and a transcriptional repressing factor formed by linking a negative transcriptional regulatory factor to a receptor having a tetracycline-based drug as a ligand; and (iii) a transcriptional regulatory region comprising a target sequence for the receptor Since the expression unit for expressing the target gene, including the accompanying third promoter, is incorporated into one vector, the transgenic animal containing the above three types of expression vector systems can be obtained by using this vector. It can be produced efficiently.
In addition, since different promoters are used for the above three types of expression systems, and the expression systems are separated from each other by an insulator, the efficacy of enhancers of adjacent expression systems is insulated from each other. In addition, the expression levels of the transcriptional activator and the transcriptional repressor can be easily controlled independently of each other. Furthermore, by using a strong promoter for the expression of transcriptional repressor compared to the promoter for expressing the transcriptional activator, a greater amount of transcriptional repressor can be expressed compared to the transcriptional activator. The expression level of the target foreign gene by a certain tetracycline drug can be easily controlled at the original expression level of the wild type gene. According to a preferred embodiment of the present invention, the first enhancer and the second promoter can each contain the same enhancer.
In the present invention, in the above-described expression vector, a loxP sequence is inserted downstream of the control region for expressing the target foreign gene (the target foreign gene itself is not inserted). Can be randomly introduced onto the genome of the animal. As a result, various transgenic animals in which a foreign gene system is inserted into various parts of the genome of the animal are obtained, and those transgenic animals whose expression of the original gene is adversely affected or introduced are introduced. Although the expression of foreign genes is not easy to control, the expression of the original gene is not affected, and the expression level of the introduced foreign gene is strictly controlled at the same time as it is strictly controlled. Thus, transgenic animals that can be controlled can be obtained.
Once such a transgenic animal can be obtained, a circular gene construct in which the target foreign gene is linked to the loxP sequence is prepared separately, and the target foreign gene is controlled for expression of the target gene. It can be introduced downstream of the region via recombination of loxP sequences. In this case, in the transgenic animal, the foreign gene is introduced at a position where the expression of the original gene is not affected, and the introduction of the target foreign gene by loxP recombination is performed, for example, in the uterus of the individual. Since it can be easily performed at the ovary or testis level, the expression of the introduced target foreign gene can be easily controlled without affecting the expression of the original gene, and a wide variety of types of target foreign An assortment of transgenic animals into which any of the genes has been introduced can be easily obtained. As described above, in the present invention, when a circular DNA containing a target foreign gene is introduced into an individual using Cre recombinase, the target foreign gene is a control region for expression of the target gene in the sequence of the expression vector of the present invention. Since it is inserted downstream of the gene via recombination of loxP sequences, the gene on the original chromosome is not affected. In addition, when only the Cre recombinase is introduced into an animal individual into which the target foreign gene has been introduced in this way, it is also possible to remove the introduced target foreign gene. And, it is possible to introduce another target foreign gene into the animal individual from which the target foreign gene has been removed in the same manner as described above, and has the advantage that the gene transfer can be repeated. . Furthermore, the present invention has an advantage that a transgenic animal into which a target foreign gene has been introduced can be produced without performing microinjection.
As described above, advantages of circular DNA introduction using the Cre-loxP system include the following.
(1) Since the efficiency of introducing circular DNA onto a chromosome is much lower than the efficiency of introducing linear DNA, an effect of preventing random introduction onto a chromosome is expected. Thereby, introduction | transduction of circular DNA which has a loxP sequence prevents introduction | transduction on a random chromosome, and can anticipate introduction | transduction to the predetermined position (loxP arrangement | sequence) on a chromosome.
(2) Introducing a target gene into a Tet system-loxP Tg AD transgenic mouse can suppress the gene expression level by administration of a tetracycline drug. In other words, it can be introduced into loxP sequences, avoiding the risk of new gene deletion due to random introduction, and the expression of the introduced gene depends on the tetracycline drug, and the expression level according to the purpose Can be controlled.
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