JP4807903B2 - 空胞型（ｈ＋）−ａｔｐアーゼ抑制化合物、組成物、およびそれらの使用 - Google Patents

Description

【０００１】
（技術分野）
本発明は、空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ抑制ラクトン、組成物、およびそれらの使用方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
空胞（あるいは空胞型、あるいはＶ−タイプ）（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼは、“真核細胞の万能プロトンポンプ”と呼ばれてきた(Finbour and Harrison、Biochem. J.、324、697-712 (1997))。空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼは、人体の多くの組織および細胞に存在する。細胞内の空胞（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ活性は、特定の器官に存在し、そしてそれらの内部の酸性度を維持する役割を果たす。この維持は、膜および器官のタンパク質の分離；プロインスリン転換；神経伝達物質の取り込み；細胞の減成プロセス；および、受容体サイクルなどといった、様々な生理学的な機能にとって必須である。Mellman et al.、Ann. Rev. Biochem.、55、663-699 (1986); Forgac、Physiological Rev.、69、765-796 (1989); Stevens and Forgac、Annu. Rev. Cell. Dev. Biol.、13、779-808 (1997); Nelson、TIPS、12、71-75 (1991)を参照されたい。
【０００３】
空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ活性は特定の原形質膜にも存在する。重要な例は、腎臓介在細胞の原形質膜、溶骨細胞および精子細胞中の空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ活性を含む。Stone and Xie、Kindney Int.、33、767-774 (1988); Vaananen et al、J. Cell、Biol.、111、1305-1311、(1990); Blair et al.、Science、245、855-857、(1987); Wang and Gluck、J. Biol. Chem.、265、21957-21965 (1990); Hall and Chambers、Inflamm. Res.、45、1-9 (1996); Hall and Schaueblin、Bone and Mineral、27、159-166 (1994); David and Baron、Exp. Opin. Invest. Drugs、4、725-740 (1995); Wassarman、Science、235、553-560 (1987); Nelson、TIPS、12、71-75 (1991)を参照されたい。
【０００４】
多くの生理学的な機能の維持における空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ活性の重要性のために、空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼを抑制する化合物は、様々な異なる状況における有用な薬学上の応用を有するであろう。Nelsonによる総説、TIPS、12、71-74 (1991)、Keeling et al.、Ann. New York Acad. Sci.、834、600-608 (1997)、およびそれらの引用文献を参照されたい。例えば、一定の空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ抑制剤は、一つまたはそれ以上の病状あるいは生理学的な機能に対して有用性を有し得、それらにおいては、器官内の、酸性化、神経伝達物質の集積、受容体代謝、リソソームの貯蔵等といった、空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ媒介プロセスを抑制することが望ましい。Mellman et al.、Ann. Rev. Biochem.、55、663-699 (1986); Forgac、Physiological Rev.、69、765-796 (1989); Stevens and Forgac、Annu. Rev. Cell. Dev. Biol.、13、779-808 (1997); Nelson、TIPS、12、71-75 (1991)を参照されたい。同様に、一定の空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ抑制化合物は、一つまたは複数の病状あるいは生理学的な機能に対して有用であり、それらにおいては、尿の酸性化、骨吸収、あるいは受精に要する先体酸分泌といった原形質膜空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ媒介プロセスを修飾することが望ましい。Stone and Xie、Kidney Int.、33、767-774 (1988); Vaananen et al、J. Cell. Biol.、111、1305-1311 (1990); Blair et al.、Science、245、855-857 (1987); Wang and Gluck、J. Biol. Chem.、265、21957-21965 (1990); Hall and Chambers、Inflamm. Res.、45、1-9 (1996); Hall and Schaueblin、Bone and Mineral、27、159-166 (1994); David and Baron、Exp. Opin. Invest. Drugs、4、725-740 (1995); Wassarman、Science、235、553-560 (1987); Nelson、TIPS、12、71-75、(1991)を参照されたい。
【０００５】
空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼを抑制する化合物は、癌治療の補助薬としての重要な有用性も有するであろう。例えば、細胞の増殖、血管形成、腫瘍細胞浸潤、転移、および耐薬性に関するプロセスにおける空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼの関わりを示す書証がある(例えば、Akifusa et. al.、Exp. Cell Res.、238、82-89 (1998); Altan et al.、J. Exp. Med.、187、1583-1598 (1998); Gerard et al.、J. Exp. Biol.、201、21-31 (1998); Ishii et al.、J. Antibiot.、48、12-20 (1995); Moriyama et al.、J. Biochem.、115、213-218 (1994); Ohkuma et al.、In Vitro Cell Devel. Biol.、29A、862-866 (1993); Perona et al.、Nature、334、438-440 (1988); Montcourrier et al.、J. Cell sci.、107、2381-2391 (1994); Montcourrier et al.、Clin. Exp. Metastatis、15、382-392 (1997); Martinez-Zaguilan et al.、Ann. NY Acad. Sci.、671、478-480 (1992); Martinez-Zaguilan et al.、Am. J. Physiol.、265、C1015-C1029 (1993); Martinez-Zaguilan et al.、J. Cell. Physiol.、176、196-205 (1998); Nishihara et al.、Biochem. Biophys. Res. Commun.、212、255-262 (1995); Manabe et al.、J. Cell Physiol.、157、445-452 (1993); Kinoshita et al.、FEBS Lett.、337、221-225 (1994); Kinoshita et al.、FEBS Lett.、398、61-66 (1996); Ohta et al.、Brit. J. Cancer、73、1511-1517 (1996); Ohta et al.、J. Pathol.、185、324-330 (1998); Marquardt et al.、J. Natl. Cancer Inst.、83、1098-1102 (1991); and Banderra et al.、Int. J. Oncol.、12、711-715 (1998)を参照されたい)。それ故、これらの現象を抑制する化合物は、癌の化学療法の有用な補助薬になろう。
【０００６】
薬化学の研究が直面した多くの試みの中でも、新たな空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ−抑制剤を同定する試みは、医学的治療への適応可能性をもたらす。新たな空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ−抑制剤の同定に向けた純粋な合成によるアプローチは、典型的に不首尾に終わっており、一部は、研究室合成における固有の技術的および人的限界によるものであった。生物学的代謝産物は、新規な構造的に異なる化合物の広範な原料を供給し、それらの幾つかは生物学的活性を示したが、空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼの抑制による治療の機会に利用できる薬剤はこれまでほとんどなかった。例えば、コンカナマイシンは、これまでに報告された、少数の強力な空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼの抑制剤の一つである。しかし、それらは構造的に複雑で、しかも、空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ抑制剤を合成し得る単純で、合成上実用的な良いテンプレートを供給しない。
【０００７】
それ故、新たな空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ抑制剤、医薬組成物、およびそれらの化合物を使用する方法が未だ必要とされている。本発明はそのような化合物、組成物、および方法を提供する。本発明のこれらおよび他の利点は、本発明のさらなる特徴とともに、本明細書に提示する発明の説明から明らかになろう。
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼの抑制により治療可能な状態の予防または治療の方法を提供する。本発明の方法は、空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼを抑制する有効量の少なくとも一つの次式の化合物；
【０００９】
【化１１】

【００１０】
［式中、Ｒ¹およびＲ²は同一あるいは異なっており、それぞれはＨ、直鎖または分枝の飽和または不飽和アルキル、アリール、Ｒ⁶ＣＨ₂−、Ｒ⁶ＣＯ−、あるいはＲ⁶ＳＯ₂−（式中、Ｒ⁶はＨ、直鎖または分枝の飽和または不飽和アルキル、あるいはアリールである）であり；Ｒ³はＨ、直鎖または分枝の飽和または不飽和アルキル、アリール、オキシム、あるいはオキシムメチルエーテルであり；Ｒ¹−Ｒ³およびＲ⁶において定義される飽和アルキル、不飽和アルキル、およびアリールは、未置換であるかあるいは置換されており；式（Ｉ）の芳香環は未置換であるか、あるいはハロゲン、ニトロ、アミノ、ヒドロキシル、チオ、アシル、アルキル、およびシアノからなる群から選ばれた少なくとも一つの置換基で置換されており；Ｚは、ＯＲ¹とメタ位の関係にある式（Ｉ）の芳香環の炭素で始まり、ラクトンのアルキル酸素に直接結合する炭素で終わる５原子（両炭素はリンカーＺの両端に共有結合する）と共に、一体として５−１７員環を形成する、０から１２原子（ヘテロ原子を含む）の鎖を有する連続的なリンカーである］あるいは医薬上許容されるそれらの塩、エステル、あるいはプロドラッグを投与することを含む。本発明に従って使用する化合物は、単独で、あるいは、治療上有効な量の、本発明の化合物以外の、少なくとも一つの付加的な空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ抑制剤と組み合わせて投与され得る。
【００１１】
（発明の詳細な説明）
本発明の化合物によって共有される主要構成成分は、図２において強調される（点線で囲まれた領域）。驚くべきことに、そして予想外にも、図２において強調された主要構成成分を有する化合物は空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ抑制活性を有するものであることが見出された。図２で表される主要構成成分は、構造的に異なるが合成的に利用可能な非常に多くの空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ抑制剤を製造するために用いられ得る実用的なテンプレートを供給する。
【００１２】
したがって、本発明は、空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ抑制化合物、それらの組成物、および一つまたはそれ以上のこのような化合物あるいは組成物、好ましくは図２において強調される主要構成成分を含む化合物あるいは組成物を用いて空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼを抑制する方法を提供する。本発明の空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼを抑制する方法は、様々な治療上および非治療上の応用、例えば、診断キットのコントロール、バイオアッセイ等として利用され得る。しかし好ましくは、空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼの抑制によって治療し得る状態（例えば異常状態あるいは病気）の治療あるいは予防に適用される。それ故、好ましい実施態様においては、本発明は、空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼの抑制によって治療可能な状態あるいは病気の治療または予防の方法であって、空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ抑制有効量の、図２で強調される構成部分を含む化合物を投与することを含む方法を提供する。さらに好ましくは、本発明の空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼの抑制によって治療可能な状態の治療または予防の方法は、空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ抑制有効量の、少なくとも一つの次式で表される化合物：
【００１３】
【化１２】

【００１４】
［式中、Ｒ¹およびＲ²は同一あるいは異なっており、それぞれはＨ、直鎖または分枝の飽和または不飽和アルキル、アリール、Ｒ⁶ＣＨ₂−、Ｒ⁶ＣＯ−、あるいはＲ⁶ＳＯ₂−（式中、Ｒ⁶はＨ、直鎖または分枝の飽和または不飽和アルキルあるいはアリールである）であり；Ｒ³はＨ、直鎖または分枝の飽和または不飽和アルキル、アリール、オキシム、オキシムメチルエーテルであり；Ｒ¹−Ｒ³およびＲ⁶中で定義される飽和アルキル、不飽和アルキルおよびアリールは、未置換であっても、あるいはハロゲン、ニトロ、アミノ、ヒドロキシル、チオ、アシル、アルキル、およびシアノからなる群から選ばれた少なくとも一つの置換基で置換されていてもよく；式（Ｉ）中の芳香環は未置換であるか、あるいはハロゲン、ニトロ、アミノ、ヒドロキシル、チオ、アシル、アルキル、およびシアノからなる群から選ばれた置換基で置換され；Ｚは、ＯＲ¹とメタ位の関係にある式（Ｉ）の芳香環の炭素で始まり、ラクトンのアルキル酸素に直接結合する炭素で終わる５原子（両炭素はリンカーＺの両端に共有結合する）と共に、一体として５−１７員環を形成する、０から１２原子（ヘテロ原子を含む）の鎖を有する連続的なリンカーである］あるいは医薬上許容されるそれらの塩、エステル、あるいはプロドラッグを投与することを含む。本発明の化合物は単独で、あるいは、治療上有効量の、本発明の化合物以外の少なくとも一つの付加的な化合物と組み合わせて投与され得る。
【００１５】
本発明の化合物は、当業者によって、天然原料からの単離により；周知のかつ容易に利用可能な化学反応、試薬、および手順を用いた化学合成；半合成により；等によって得ることができる。
【００１６】
１つの実施態様において、本発明は空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼの抑制により治療可能な状態を治療または予防する方法を提供し、その方法は、空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ抑制有効量の式（Ｉ）の化合物を投与することを含む、ここで、Ｚは、一体として１２−１７員環を形成する７−１２の原子（ヘテロ原子を含む）の鎖を有する隣接リンカーである。それらの化合物の例は、次式の化合物：
【００１７】
【化１３】

【００１８】
［式中、Ｒ¹およびＲ²は同一あるいは異なっており、それぞれはＨ、直鎖または分枝の飽和または不飽和アルキル、アリール、Ｒ⁶ＣＨ₂−、Ｒ⁶ＣＯ−、あるいはＲ⁶ＳＯ₂−（式中、Ｒ⁶はＨ、直鎖または分枝の飽和または不飽和アルキルあるいはアリールであり得る）であり；Ｒ³はＨ、直鎖または分枝の飽和または不飽和アルキル、アリール、オキシム、あるいはオキシムメチルエーテルであり；Ｒ⁴はＨ、アルキル、あるいはＲ⁷ＣＨ₂−（式中、Ｒ⁷はＲ⁶Ｏ−、Ｒ⁶ＣＯ₂−、あるいはＲ⁶ＳＯ₃−である）であり；Ｒ⁵、Ｒ⁵’およびＲ⁵”は同一あるいは異なっており、それぞれはＨ、直鎖または分枝の飽和または不飽和アルキル、アリール、グリコシド、Ｒ⁶ＣＨ₂−、Ｒ⁶ＣＯ−、あるいはＲ⁶ＳＯ₂−であり；Ｒ¹−Ｒ³、Ｒ⁵、Ｒ⁵’、Ｒ⁵’’およびＲ⁶中で定義される飽和アルキル、不飽和アルキルおよびアリール、およびＲ⁴中で定義されるアルキルは、未置換であるか、あるいはハロゲン、ニトロ、アミノ、ヒドロキシル、チオ、アシル、アルキル、あるいはシアノからなる群から選ばれた少なくとも一つの置換基で置換されている；式（Ｉ）の芳香環は、未置換であるか、あるいはハロゲン、ニトロ、アミノ、ヒドロキシル、チオ、アシル、アルキル、およびシアノからなる群から選ばれた少なくとも一つの置換基で置換されている］；医薬上許容されるそれらの塩、エステル、およびプロドラッグを含む。
【００１９】
“飽和アルキル”の語は、直鎖または分枝鎖であって、他で明示しない限り、約１から約２０の炭素原子、好ましくは約１から約１０の炭素原子、さらに好ましくは約１から約８の炭素原子、そして最も好ましくは約１から約６の炭素原子を有する飽和アルキルを意味する。飽和アルキルの例には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソアミル、ヘキシル、オクチル、ドデカニル等が挙げられる。飽和アルキル置換基は未置換であっても、あるいは、例えば、ハロゲン、ニトロ、アミノ、ヒドロキシル、チオ、アシル、アルキル、およびシアノからなる群から選ばれた少なくとも一つの置換基で置換されていてもよい。
【００２０】
“不飽和アルキル”の語は、本明細書中で定義された、飽和アルキル（直鎖または分枝鎖）であって、その一つまたはそれ以上の炭素−炭素単結合が、例えば二重結合あるいは三重結合といった多重結合に置き換わった飽和アルキルを意味する。それ故、不飽和アルキルには、アルケニルおよびアルキニル置換基、ならびに二重結合および三重結合を組み合わせて有する置換基が挙げられる。“アルケニル”の語は、一つまたはそれ以上の二重結合を有する直鎖または分枝鎖アルケニルを意味する。他で明示しない限り、アルケニルは、約２から約２０の炭素原子、好ましくは約２から約１０の炭素原子、さらに好ましくは約２から約８の炭素原子、そして最も好ましくは約２から約６の炭素原子を有し得る。アルケニルの例には、ビニル、アリル、１，４−ブタジエニル、イソプロペニル等が挙げられる。“アルキニル”の語は、一つまたはそれ以上の三重結合を有する直鎖または分枝鎖アルキニル基（ｒａｄｉｃａｌ）を意味する。他で明示しない限り、アルキニルは、約２から約２０の炭素原子、好ましくは約２から約１０の炭素原子、さらに好ましくは約２から約８の炭素原子、そして最も好ましくは約２から約６の炭素原子を有し得る。アルキニルの例には、エチニル、プロピニル（プロパルギル）、ブチニル等が挙げられる。不飽和アルキル置換基は未置換であっても、例えば、ハロゲン、ニトロ、アミノ、ヒドロキシル、チオ、アシル、アルキル、およびシアノからなる群から選ばれた少なくとも一つの置換基で置換されていてもよい。
【００２１】
他で明示しない限り、不飽和アルキルは、本明細書で定義されるように、約２から約２０の炭素原子、好ましくは約２から約１０の炭素原子、さらに好ましくは約２から約８の炭素原子、そして最も好ましくは約２から約６の炭素原子を有し得る。不飽和アルキル置換基は未置換であっても、例えば、ハロゲン、ニトロ、アミノ、ヒドロキシル、チオ、アシル、アルキル、およびシアノからなる群から選ばれた少なくとも一つの置換基で置換されていてもよい。
【００２２】
“アリール”の語は、当該技術分野において共通に理解されるように、芳香族炭素環基（ｒａｄｉｃａｌ）を意味し、そして、例えば、フェニルおよびナフチル環といった、単環式および多環式芳香族を含む。好ましくは、アリールは、一つまたはそれ以上の六員環を有し、例えば、フェニル、ナフチル、およびビフェニルが挙げられる。アリール置換基は未置換であっても、例えば、ハロゲン、ニトロ、アミノ、ヒドロキシル、チオ、アシル、アルキル、およびシアノからなる群から選ばれた少なくとも一つの置換基で置換されていてもよい。
【００２３】
“グリコシド”の語は、例えばグルコース、ガラクトース、アミノ糖（例えば、Ｄ−グルコサミンおよびＮ−アセチル−β−グルコサミン）等、糖の加水分解物をもたらす置換基を意味する。
【００２４】
式（ＩＡ）および式（ＩＢ）の化合物は、それらの例は米国特許出願第６０／１２２，９５３号に開示され、それぞれ慣用名サリシリハラミドおよびロバタミドと命名されている。式（ＩＡ）あるいは式（ＩＢ）の空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ抑制化合物の例には、次式の化合物が挙げられる：
【００２５】
【化１４】

【００２６】
サリシリハラミドＡの構造および絶対的な立体化学構造は図４に記載されている。
【００２７】
式（ＩＣ）−（ＩＥ）の空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ抑制化合物の例には、次式の化合物が挙げられる：
【００２８】
【化１５】

【００２９】
ＣＪ−１２，９５０およびＣＪ−１３，３５７として称された化合物は、Dekker et al.、J. Antibiotics、51、14-20 (1998)に記載されている。オキシミジン１および２はKim et al.、J. Org. Chem.、64、153-155 (1999)に記載されている。
【００３０】
式（ＩＦ）の空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ抑制化合物の例には、次式の化合物が挙げられる：
【００３１】
【化１６】

【００３２】
アピクラレンＡおよびＢは、Kunze et al.、J. Antibiotics、51、1075-1080 (1998)に記載されている。
【００３３】
別の実施態様において、本発明は、空胞−型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼの抑制により治療し得る状態の治療または予防の方法を提供し、この方法は、空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ抑制有効量の少なくとも一つの式（Ｉ）の化合物［式中、Ｒ¹−Ｒ³およびＲ⁶は、本明細書で定義された通りであり、Ｚは、ＯＲ¹とメタ位の関係にある式（Ｉ）の芳香環の炭素で始まり、ラクトンのアルキル酸素に直接結合する炭素で終わる５原子（両炭素はリンカーＺの両端に共有結合する）と共に、一体として５−１１員環を形成する、０から６原子（ヘテロ原子を含む）の鎖を有する連続的なリンカーである］；あるいは医薬上許容されるそれらの塩、エステル、あるいはプロドラッグを投与することを含む。
【００３４】
Ｚが０から６原子の鎖を有する隣接リンカーであるとき、本発明において好ましく使用される化合物は、次式からなる群から選ばれる：
【００３５】
【化１７】

【００３６】
［式中、Ｒ¹−Ｒ³は本明細書で定義された通りであり；Ａは共有結合であるか、あるいは、未置換あるいはハロゲン、ニトロ、アミノ、ヒドロキシル、チオ、アシル、アルキル、およびシアノからなる群から選ばれた一つまたはそれ以上の置換基で置換された、Ｃ₁−Ｃ₆の直鎖の飽和または不飽和アルキルリンカーであり；Ｘは共有結合であるか、あるいは、未置換であるか、あるいはハロゲン、ニトロ、アミノ、ヒドロキシル、チオ、アシル、アルキル、およびシアノからなる群から選ばれた一つまたはそれ以上の置換基で置換された、Ｃ₁−Ｃ₅の直鎖の飽和または不飽和アルキルリンカーであり；ＷはＯ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｓ）、Ｓ（Ｏ）_nあるいはＮ−Ｒ⁴（Ｒ⁴はＨ、直鎖または分枝の飽和または不飽和アルキル、アリール、Ｒ⁶ＣＨ₂−、Ｒ⁶ＣＯ−、あるいはＲ⁶ＳＯ₂−（式中、Ｒ⁶は本明細書で定義された通りである）である）であり、ｎは０−２の整数である］あるいは医薬上許容されるそれらの塩、エステル、あるいはプロドラッグを含む。
【００３７】
式（ＩＧ）あるいは（ＩＨ）の化合物は例えば、次式の化合物：
【００３８】
【化１８】

【００３９】
［式中、Ｒ¹−Ｒ³は本明細書で定義された通りである］医薬上許容されるそれらの塩、エステル、およびプロドラッグを含む。
【００４０】
上で示されたように、本発明の化合物は全て、図２において強調される主要構成成分を共有する。本発明の化合物は、広範囲の環サイズ、置換パターン、および構造的なバリエーション等にわたって、空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ抑制活性を有すると期待される。実際、ロバタミドＡ−ＦおよびサリシリハラミドＡおよびＢといった化合物は、図２において強調される主要構成成分を含み、そして、所定の範囲の環サイズにわたり（例えば、１２−１５員環にわたり）そして、所定の範囲の構造的なバリエーションにわたり（例えば、サリシリハラミドＡからロバタミドＡに至るリンカーＺの構造的なバリエーションにわたり）空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ抑制活性能力を維持する化合物の例証である。
【００４１】
本発明の空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ抑制化合物および組成物は、生物学的現象（例えば、細胞内器官の器官内酸性化；尿の酸性化；骨吸収；受精；血管形成；細胞浸潤（例えば、腫瘍細胞浸潤）；転移；および腫瘍細胞における薬剤耐性の増大、が挙げられるが、これらに限定されない）を調節するために医学的に使用され得る。それ故、本発明の化合物は、空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼの抑制により制御し得る疾患の治療に有用である。それらの疾患には、例えば、骨粗しょう症（例えば、Keeling et al.、Ann. New York Acad. Sci.、834、600-608 (1997)を参照されたい）、アルツハイマー病、緑内障、および尿の異常酸性化（例えば、Nelson、TIPS、12、71-75 (1991)を参照されたい）が挙げられる。さらに、本発明の空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ抑制剤は、酸が促進する細胞浸透機構を利用する疾患の治療あるいは予防に用いられ得る。例えば、本発明の化合物は、細菌（例えば、バクロ細菌およびレトロ細菌）の侵入、あるいはタンパク毒素（例えば、ジフテリア毒素）の細胞内への侵入、を抑制するために用いられ得る（例えば、Mellman et al.、Ann. Rev. Biochem.、55、663-699 (1986)を参照されたい）。本発明の化合物は、動物（例えば人間）の受精を抑制するため（例えば、Wassarman、Science、235、553-560 (1987)を参照されたい）、あるいは腫瘍細胞の浸潤あるいは転移を抑制するため、あるいは薬剤耐性を強める癌細胞の能力を抑制することにより癌の薬剤への感受性を高めて、それにより癌の化学療法を容易に、および／または可能にするため（例えば、Marquardt and Center、J. Natl. Cancer Inst.、83、1098-1102 (1991)を参照されたい)にも、用いられ得る。
【００４２】
本発明の空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ抑制化合物は、組成物（例えば医薬組成物）に含まれ得る。組成物は、一つまたはそれ以上の本発明の化合物と好適な医薬上許容される担体とを組み合わせることにより製造され得、そして好適な製剤に処方され得る。好適な製剤は、例えば、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、座薬、注射、吸入剤、およびエアロゾル、といった固体製剤、半固体、液体または気体状、およびそれぞれの投与経路のための当該分野で公知の他の形態の製剤を含む。医薬上の投与形態では、本発明の化合物は、単独で、あるいは、本明細書中で述べたような他の空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ抑制化合物を含む、他の医薬上活性な化合物と組み合わせて、適切な集合体で使用され得る。
【００４３】
いかなる好適な担体も利用することができる。好適な担体には、医薬上あるいは生理学上許容される担体を含む。以下の方法および担体は、単なる例示であって、制限ではない。経口製剤の場合には、本発明の化合物は、単独で、あるいは治療上有効量の少なくとも一つの他の化合物と組み合わせて投与され得る。本発明で用いられる組成物は、さらに、本発明の化合物以外の、少なくとも一つの付加的な化合物、例えば、付加的な空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ抑制剤（例えば、コンカナマイシンあるいはバフィロマイシン）あるいは抗癌剤でさえも含み得る。所望の場合には、錠剤、粉末、顆粒、カプセル等を製造するための適切な賦形剤とともに活性な成分を組み入れることができる。
【００４４】
好適な賦形剤には、例えば、ラクトース、マンニトール、コーンスターチあるいはポテトスターチといった、通常の賦形剤が挙げられる。好適な賦形剤には、バインダー（例えば、結晶セルロース、セルロース誘導体、アカシア、コーンスターチ、あるいはゼラチン）；崩壊剤（例えば、コーンスターチ、ポテトスターチあるいはカルボキシメチルセルロースナトリウム）が；ステアリン酸タルクあるいはマグネシウム等の潤滑剤とともに挙げられ得る。所望の場合には、例えば、希釈剤、薬剤緩衝剤、薬剤湿潤剤、防腐剤、および／または香料等といった他の賦形剤が組成物に含まれ得る。
【００４５】
本発明に従って使用される化合物は、水あるいは植物油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸エステル、あるいはプロピレングリコールといった非水溶媒中で（所望の場合には、可溶化剤、等張剤、懸濁剤、乳化剤、安定剤、および防腐剤といった通常の賦形剤とともに）、溶解液、懸濁液、エマルジョンとなって注射用製剤に形成され得る。本発明の化合物は、吸入によって投与するためのエアロゾル製剤に作製され得る。そういったエアロゾル製剤は、ジクロロジフロオロメタン、プロパン、窒素等といった許容される推進剤に圧入され得る。
【００４６】
本発明の化合物は、乳化基材あるいは水溶性基材といった様々な基材と混合されて座薬に形成され得る。座薬製剤は直腸投与され得、そしてココアバター、カーボワックス、ポリエチレングリコールといったビヒクル（それらは体温で溶けるが、室温では固体である）を含み得る。
【００４７】
シロップ、エリキシル剤、および懸濁液といった、経口あるいは直腸投与のための単位剤型が提供され得、ここで、各形態（例えば、ティースプーン用、テーブルスプーン用、錠剤、あるいは座薬）は、本発明の化合物を含む組成物を規定量で含む。同様に、注射、あるいは静脈内投与のための単位剤型は無菌水、通常の食塩水、あるいは他の医薬上許容される担体中の溶液としての組成物を構成し得る。
【００４８】
本明細書で用いられる“単位剤型”の語は、人間および動物にとって一回投与に適した物理的に分かれた単位であって、各単位は、規定量の少なくとも一つの本発明の化合物を含んでいる（単独、あるいは所望の場合には、他の治療薬剤とともに）。単位剤型は、当該分野で公知の方法、例えば、医薬上許容される担体とともに、望ましい効果をもたらすのに十分な活性成分の量を計算することによって決定され得る。本発明に従って使用される単位剤型の特定は、達するべき特定の効果および各ホストにおける化合物に関連する特定の薬力学に依存する。
【００４９】
医薬上許容される担体（例えば、ビヒクル、補助剤、賦形剤、あるいは希釈剤）は当業者にとって利用可能であり、そして市販により入手可能である。当業者は、用いられる組成物の正確な処方のための相応の投与方法を容易に決定し得る。治療される状態の性質あるいは重篤性を検討するために、投与におけるいかなる必要な調整も、熟練した専門家によって、容易になされ得る。投与における調整は、例えば、個々の患者の総合的な身体的健康、性別、年齢、病歴等といった他の要因に基づいてもなされ得る。
【００５０】
一実施態様においては、本発明の方法は、治療上有効量の少なくとも本発明の化合物を、本発明の化合物以外の治療上有効量の少なくとも一つの付加的な化合物と組み合わせて共投与することを含む。例えば、本発明の化合物は、付加的な空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ抑制剤（例えば、コンカナマイシン、あるいはバフィロマイシン）とともに、あるいは抗癌剤（例えば、癌細胞の抗癌剤への耐性の増大の抑制のために）とともに共投与され得る。
【００５１】
本発明の化合物は、例えば、経口投与、筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与等を含む、任意の適した経路で投与され得る。例えば、一つまたはそれ以上の本発明の空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ抑制剤（あるいはその組成物）は、静脈注射あるいは注入に適した溶液、錠剤、カプセル等、あるいは他の適した組成物あるいは本明細書中で記載された製剤として投与され得る。
【００５２】
空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼの“抑制に有効な量”は、個々の患者における活性化合物の空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼの“抑制に有効なレベル”を達成するのに必要な投与量である。空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ抑制に有効な量は、例えば、望ましい医学的治療を達成するために、本発明の化合物の空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ抑制の実質的な血中レベル、組織レベル、および／または細胞内レベルが有効なレベルに達するために個々の患者に投与するのに必要な量によって規定され得る。
【００５３】
有効レベルが投与の好ましい終点として用いられるとき、実際の用量およびスケジュールは、例えば、薬物動態学における個体間での差異、薬剤の分布、代謝等によって変わり得る。有効レベルも、一つまたはそれ以上の本発明の化合物が他の治療薬剤、例えば、一つまたはそれ以上の付加的な空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ抑制剤、抗癌化合物、あるいはそれらの組合せ、と組み合わせて用いられるときには、変わり得る。さらに、有効レベルは治療を望む疾患によって変わり得る。例えば、骨粗しょう症の治療にとっての有効レベルは、異常な尿酸性化の治療、あるいは受精の抑制に要する有効レベルとは異なり得る。
【００５４】
いくつかの本発明の化合物、例えば、特定の１２から１５員環の化学種は、強力な抗腫瘍活性を有することが知られている(例えば、McKee et al.、J. Org. Chem.、63、7805-7810 (1998)、and International Publication No. WO 99/05136を参照されたい)。本発明に従って使用される化合物が抗癌活性を有する場合には、有効血中レベルは、抗癌活性に基づく有効血中レベルのアナロジーによって決まり得る。有効レベルは、例えば、スクリーニングアッセイにおいて抑制腫瘍細胞の増殖を抑制するのに有効なレベル（例えば、本明細書の実施例４から、１０^-11−１０^-7Ｍ）として選択され得る。同様に、有効レベルは、例えば、抗癌活性を臨床的に予想するアッセイにおいて、人間の癌の成長を有効に抑制する治療薬剤の濃度に相当する、患者の血液あるいは組織レベルに基づいて決定され得る。さらに、有効レベルは、例えば、ある患者の血液における癌のマーカーが癌を抑制する特定の化合物により抑制された濃度に基づいて決定され得る。あるいは、有効レベルは、例えば、患者の癌の成長を減速あるいは停止させるのに、患者の癌を退行あるいは消滅させるのに、患者に特定の癌の自覚症状をなくさせるのに、あるいは癌患者の感覚を改善するのに有効な濃度に基づいて決定され得る。抗癌に有効なレベルは、空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ抑制が血液、組織、および／または細胞内の望みの医学的治療を達成するのに有効なレベルに達するのに臨床的に必要なレベルを見積もり（例えば、補外法によって）、あるいは決定するためにさえ用いられ得る。空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ活性を有効に抑制するのに臨床上必要な治療上の有効量の決定は、本明細書中で議論したように、有効レベルに影響を与え得る他の変数を考慮することが必要とされることが理解されるであろう。定まった有効量が投与の好ましい終点として用いられるときには、薬物投与のための実際の用量および投与スケジュールは、例えば、薬物動態学の個人間の差異、薬の分布、代謝、他の薬と組み合わせて用いられるか否か、あるいは本明細書中で述べた有効レベルに影響を与える他の要因、を含む要因に依存して、個々の患者により異なり得る。
【００５５】
当業者は、個々の患者において望ましい有効レベルを達成するため、ふさわしい用量、スケジュール、あるいは特定の製剤の投与方法を容易に決定し得る。当業者はまた、本発明の化合物の有効レベルの相応の指示薬を容易に決定し、そして使用し得る。例えば、有効レベルは、直接分析（例えば、分析化学）によって、あるいは適切な患者サンプル（例えば、血液および／または組織）の間接分析（例えば、臨床的化学指示薬で）によって、決定され得る。有効レベルはまた、例えば、尿の酸性度、骨密度の変化、眼圧の低下、といった直接的あるいは間接的な観察により、あるいは癌患者における腫瘍の成長の縮小あるいは抑制によって（例えば、問題の化合物が抗癌活性を有する場合）決定され得る。当該技術分野においては、それらを必要とする患者への活性化合物の投与において使用されるプロトコルを記載する、多くの参照文献がある。例えば、患者への抗癌剤の投与において使用されるプロトコルは、J.B. Collinsによる“Cancer Chemotherapy: Principles and Practice” ed.、Chabner and Collins、J.B. Lippincott、1990（特にchapter 2）に記載されている。
【００５６】
本発明の方法は、本発明の化合物とともに、例えば、他の空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ抑制剤（例えば、コンカナマイシンおよび／またはバフィロマイシン）といった他の化合物の投与で、より効果的になされ得る。本発明の化合物はまた、抗癌剤とともに投与され得、その場合には、望ましい有効レベルは、抗癌剤への癌の耐性の増大能力を抑制するのに必要なレベルである。適した抗癌化合物には、例えば、米国で販売が認められている、および将来において認められるであろう全ての公知の抗癌化合物が挙げられ、それらへの薬剤耐性は、空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼの抑制により制御され得る。
【００５７】
本発明の化合物の唯一の空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ抑制活性は、当該技術分野において公知の任意の適した方法（例えば、アッセイ方法）を用いることにより決定され得る。空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ抑制活性の測定のためにふさわしいアッセイ方法は、例えば、Chanet al.、Anal. Biochem.、157、375-380 (1986)に記載されている。
【００５８】
あるいは、本発明の化合物の独特の空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ抑制活性は、米国国立癌研究所（ＮＣＩ）の６０細胞株、ヒトの腫瘍、疾患指向性のスクリーニングを用いて決定され得、そしてそれらは正確に化学化合物の抗癌活性を予測できる。重要なことに、ＮＣＩ６０細胞株スクリーニングは、抗癌活性のみならず、他のタイプの生物学的活性を予測するのに用いられ得る強力なツールでもある。とりわけ、ＮＣＩ６０細胞株スクリーニングは、空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ抑制活性を正確に予想するのに使用され得る（米国特許出願第６０／１２２，９５３号を参照されたい）。ＮＣＩ６０細胞株ヒト腫瘍スクリーニング、および本明細書中に開示された化合物に関する抗癌活性の決定におけるその応用は、国際特許出願第ＷＯ９９／０５１３６号に記載されている。
【００５９】
生物学的活性の予想は、公知の活性を有する化合物によって生じるＮＣＩスクリーニングにおける活性パターンとの相関に基づく。相関において比較された化合物は、ＮＣＩスクリーニングにおける相関にとって適した活性パターンを表示するために、特に抗癌活性能力を有する必要はない。興味深いことに、化合物は、ＮＣＩスクリーニングにおいて相関するためには、構造的に類似する必要はない。かりに、二つの構造的に非類似な化合物が、ＮＣＩスクリーニングにおいて互いに強く相関したとしても、それらは、癌への用途以外を含む任意の用途において事実上同様の生物学的活性を有すると正確に予想され得る。ＮＣＩ６０細胞株スクリーニングの適切な総説は、Boyd、In: Current Therapy in Oncology (Niederhuber、ed.)、Philadelphia: B.C. Decker、Inc.、1993、pp. 11-22; Boyd and Paull、Drug Dev. Res.、34、91-109 (1995); Grever and Chabner、In: Cancer Principles and Practice of Oncology、5th Ed. (DeVita et al.、eds.)、Philadelphia: Lippincott-Raven、1977、pp. 385-394; Paull et al.、In: Cancer Chemotherapeutic Agents (Foye、ed.)、Washington、D.C.: American Chemical Society Books、1995、pp. 9-45; and Weinstein et al.、Science、275、343-349 (1997)を参照されたい。
【００６０】
ＮＣＩ６０細胞株ヒト腫瘍スクリーンは、化合物が選択的に人間の様々な癌を殺すあるいは成長を抑制する能力を測定する。一般に、ＮＣＩスクリーニングでは、本発明の化合物は特定の型のヒトの固有腫瘍（例えば、非小細胞肺癌、腎癌、およびメラノーマ）に対する強力な活性、およびそれらの耐性株を示す。これらの観察によって、および他の腫瘍細胞応答プロファイルの詳しい分析から、本発明の化合物は、独特で特徴的な生物活性プロファイルを有することが示され得る。
【００６１】
ＮＣＩ６０細胞株ヒト腫瘍の主要なスクリーニングは、化合物の天然原料を同定する方法も提供する。ＮＣＩスクリーニングは、幾つかの国際的に設立された高名な域外の（非ＮＣＩ）支援およびレビューグループ（NCI Division of Cancer Treatment's Board of Scientific Counselors、Ad Hoc Expert Review-Committee thereof、the National Cancer Advisory Board、および the President's Cancer Panel (Boyd、In: AntiCancer Drug Development Guide: Preclinical Screening、Clinical Trials、and Approval (Teicher、B.A.、ed.)、Totowa、NJ: Humana Press、Inc.、pp. 23-42、1997を参照されたい)を含む）の指揮、詳細な調査、および監督のもとに、１９８５−１９９０年に設計され提供された。ＮＣＩスクリーニング発展の起動力は、世界中で商業的に入手し得る抗癌薬のほとんどが、ヒトの癌のほとんどの形態に対し本質的には非活性であるか、あるいは一時的にのみ有効であるという国際的な認識であった。総説が、例えば、Boyd、In: Cancer: Principles and Practice of Oncology Updates (DeVita、V.T.、Jr.、et al.、eds)、Philadelphia: Lippincott、1989、pp. 11-22; and Boyd、In: Current Therapy in Oncology (Niederhuber、J.E.、ed.)、Philadelphia: BC Decker、1993、pp. 11-22に開示されている。このＮＣＩスクリーニングは１９９０年以降のみ使用可能であったが、既に人間の癌患者における重要な新しい抗癌薬の発見、開発、および臨床使用のきっかけとなっていた。例えば、Weinstein et al.、Science、275、343-349 (1997); Grever and Chabner、In: Cancer: Principles and Practice of Oncology、5th Ed. (DeVita、V.T.、et al.、eds.)、Philadelphia: Lippincott-Raven、1977、pp. 385-394; and Sausville、In: AntiCancer Drug Development Guide: Preclinical Screening、Clinical Trials、and Approval (Teicher、B.A.、ed.)、Totowa、NJ: Humana Press、Inc.、1997、pp. 217-226を参照されたい。
【００６２】
ＮＣＩスクリーニングは、各細胞株に対し成長抑制あるいは細胞毒性規定の相対的な度合いを決定するために、規定された濃度範囲にわたって化合物が試験される、６０の異なるヒトの腫瘍細胞株のパネルからなる。スクリーニングの設計と操作は、被験化合物に対し、スクリーニングを構成する各々の細胞株に対する絶対および相対感受性の両方が十分に再現可能であるようなものであるので、細胞の特徴的な応答プロファイル、あるいは“フィンガープリント”が生成する。ＮＣＩスクリーニングにおいて活性のある化合物は、６０細胞株パネルからなる様々な細胞株に対し、著しく特異な腫瘍成長抑制および／または細胞毒性効果を示す。最大と最小の感受性のライン間の示差的な応答の度合いは、通常、比較的小さい（例えば、２−１０倍）か、あるいは時には３−４桁の大きさである。さらに、細胞株は、所定の化合物への応答において広範に異なりうるか、あるいは、平均よりずっと大きいかまたは小さい感受性を示す比較的少ない株だけを有しており、比較的均一であり得る。細胞株パネルの応答における差異の大きさまたは不均一の程度に関わらず、本明細書に含まれる有用な情報にとって重要なことは、応答“フィンガープリント”の再現可能性である。
【００６３】
スクリーニングアッセイの詳細な開示は、例えば、Monks et al.、J. Natl. Cancer Inst.、83、757-766 (1991); Skehan et al.、J. Natl. Cancer Inst.、82、1107-1112 (1990); and Boyd and Paull、Drug Dev. Res.、34、484-488 (1995)にて出版されている。同定、原料、誘導、形態学的および免疫細胞化学的性質、およびＮＣＩ６０細胞株パネルを構成する細胞株の維持方法は、例えば、Boyd、In: Cancer: Principles and Practice of Oncology Updates (DeVita、V.T.、Jr.、et al.、eds)、Philadelphia: Lippincott、1989、pp. 1-12; Monks et al.、J. Natl. Cancer Inst.、83、757-766 (1991); Stinson et al.、AntiCancer Res.、12、1034-1035 (1992); and Boyd and Paull、Drug. Dev. Res.、34、91-109 (1995)などに詳細に記載されてきた。
【００６４】
スクリーニングアッセイにおいて、各薬剤はパネル中の各細胞株に対し、広い濃度領域で試験される。全てのラインは第０日目に、一連の標準９６ウェルマイクロタイタープレート上に接種され、続いて、被験化合物なしで２４時間培養された。接種密度は個々の細胞株およびその成長特性による。使用される接種密度は、Monks et al.、J. Natl. Cancer Inst.、83、757-766 (1991); and Boyd and Paull、Drug Dev. Res.、34、91-109 (1995)に記載されている。被験化合物は、５つの１０倍希釈物で評価される。被験化合物とともに４８時間培養した後、細胞は、Skehan et al.、J. Natl. Cancer Inst.、82、1107-1112 (1990); Monks et al.、J. Natl. Cancer Inst.、83、757-766 (1991); and Rubinstein et al.、J. Natl. Cancer Inst.、82、1113-1118 (1990)に記載の、スルホローダミンＢ処理によってアッセイされる。光学密度は自動プレート読取機で測定され、その後、コンピュータ化されたデータの収集、処理、記憶、および表示および分析のアベイラビリティーが測定される。
【００６５】
化合物のそれぞれの成功した試験は、６０の用量応答カーブを生成し、そのカーブはＮＣＩスクリーニングデータレポートに、腫瘍型サブパネルを構成する一連の組成物としてプリントされる。品質管理基準に不合格の個々の細胞株のデータ、あるいはうまく試験できなかった欠陥を有する細胞株は、その後の分析から除去されそしてスクリーニングレポートから削除される。
【００６６】
“パーセンテージグロース”（ＰＧ）の語、および＋５０、０および−５０応答参照線の意味、計算された応答パラメーター、ＧＩ₅₀、ＴＧＩ、およびＬＣ₅₀、“平均グラフ”およびＣＯＭＰＡＲＥパターン認識アルゴリズムの構築および使用を、以下に短く要約する。５０％成長抑制パラメーター（ＧＩ₅₀）は、１００ｘ（Ｔ−Ｔ_o）／（Ｃ−Ｔ_o）＝５０＝ＰＧである場合の被験薬の濃度である。４８時間被薬後の試験ウェルの光学密度はＴ；時間０での光学密度はＴ₀；そしてコントロール光学密度はＣである。ＰＧは、Ｔ／Ｃ様の＋１００から−１００をとりうるパラメーターである。ＧＩ₅₀が効果の成長抑制レベルとして考えられ得るとき、ＴＧＩは効果の“トータル成長抑制”あるいは細胞活動抑止レベルを示す。ＴＧＩは、１００ｘ（Ｔ−Ｔ_o）／（Ｃ−Ｔ）＝０＝ＰＧである場合の薬物の濃度である。ＬＣ₅₀は致死濃度、“正味の細胞致死”、あるいは細胞毒性パラメーターである。それは、１００ｘ（Ｔ−Ｔ_o）／Ｔ_o＝−５０＝ＰＧである場合の濃度である。制御光学密度はＬＣ₅₀の計算には用いられない。“パーセンテージグロース”（ＰＧ）の語、および＋５０、０および−５０応答参照線の意味、計算された応答パラメーター、ＧＩ₅₀、ＴＧＩ、およびＬＣ₅₀、“平均グラフ”およびＣＯＭＰＡＲＥパターン認識アルゴリズムの構築および使用の詳細な説明については、Boyd et al.、In: Cytotoxic Anticancer Drugs: Models and Concepts for Drug Discovery and Development (Valeriote、F.A.、et al.、eds.)、Amsterdam: Kluwer Academic Publishers、1992、pp. 11-34; Monks et al.、J. Natl. Cancer Inst.、83、757-766 (1991); and Boyd and Paull、Drug Dev. Res.、34、91-109 (1995)を参照されたい。
【００６７】
平均グラフは正および負の値のプロットにより形成されたパターンであって、“デルタ”と称され、ＮＣＩインビトロスクリーンの各細胞株に対して試験された化合物から得られるＧＩ₅₀、ＴＧＩ、あるいはＬＣ₅₀濃度の組から生成されている。デルタは、３ステップにより、ＧＩ₅₀、ＴＧＩ、あるいはＬＣ₅₀データから得られる。例えば、所定の化合物に対して試験が成功した各細胞株についてのＧＩ₅₀値は、そのｌｏｇ₁₀ ＧＩ₅₀値に変換される。平均パネルｌｏｇ₁₀ ＧＩ₅₀値は、各ｌｏｇ₁₀ ＧＩ₅₀値を平均して得られる。次いで、各ｌｏｇ₁₀ ＧＩ₅₀値は、パネル平均から減じられて、対応するデルタが算出される。
【００６８】
平均グラフの構築のために、デルタは、算出された平均パネルＧＩ₅₀を表す垂直線に対し平行にプロットされる。負のデルタは平均参照線の右にプロットされ、そして計算された平均よりも変動しやすい細胞株を比例的に表す。逆に、正のデルタは、所定の薬剤に対してより変動の小さい細胞株を表すよう、参照線の左にプロットされる。それ故、例えば、ＧＩ₅₀平均グラフにおいて、垂直の参照線の右に３ユニット突出しているバーは、この細胞株のＧＩ₅₀濃度が、パネル平均ＧＩ₅₀濃度より１０００倍小さいことを示す。ＴＧＩおよびＬＣ₅₀平均グラフは同様に作成され、解釈される。
【００６９】
三つの付加的な数字が３つのそれぞれの平均グラフの基線にプリントされる。これらの数字はＭＧ−ＭＩＤ、Ｄｅｌｔａ（個々の細胞株についての“デルタ”と混同されてはならない）、およびＲａｎｇｅである。ＭＧ−ＭＩＤは、計算された平均パネルＧＩ₅₀、ＴＧＩ、あるいはＬＣ₅₀である。Ｄｅｌｔａは、ｌｏｇ₁₀の単位の数であり、パネルの最も変動が大きい株のデルタは対応するＭＧ−ＭＩＤとは異なる。同様に、Ｒａｎｇｅはｌｏｇ₁₀の単位の数であり、パネルの最も変動が大きい株のデルタは最も変動が小さい株のデルタとは異なる。
【００７０】
ＣＯＭＰＡＲＥは、ＮＣＩスクリーニングによって生成したデータの評価および利用において用いられる、コンピュータ化されたパターン認識アルゴリズムである。要するに、ＣＯＭＰＡＲＥは、同一あるいは異なる化合物から得られた平均グラフプロファイルの同様性、あるいはその欠如を決定し表示する方法である。スクリーニングの開発中にこのようなツールを構築する初期の起動力は、標準化およびスクリ−ニングの信頼性および時間に対する再現性を確立しモニターする必要性であった。これは、細胞株の同じパネルに対し繰り返しスクリーニングしたときに同じか非常に似たプロファイルを生成すると期待される標準化合物の標準試験によって達成された。
【００７１】
ＮＣＩスクリーニングは繰り返してキャリブレーションされる。スクリーニングの標準化の過程において、ＮＣＩは標準化合物として、非常に多くの前臨床および／または臨床的な抗癌特性および作用の機構についての情報が入手可能な約１７０の薬剤を選んだ。これらの化合物は、市販の抗癌剤、開発中の抗癌剤、および別の癌関連の試験システムにおける活性に基づいて、前臨床的開発がなされているか、あるいはなされていた他の抗癌剤を含んだ。これらプロトタイプ“標準薬剤”の繰り返しの周期的なスクリーニング（それらの結果の累積編集は“標準薬剤データベース”を形成する）は、依然としてスクリーニングのキャリブレーションおよび標準化についての基礎である。
【００７２】
重要なことに、ＮＣＩの標準薬剤データベースは、多くの有用な新たな薬剤の応用の発見の手がかりも提供する。例えば、選択された標準薬剤の特徴的な応答プロファイル“フィンガープリント”は、任意の他の入手可能な平均グラフデータベースを、それらに含まれた密接にマッチしたプロファイルがあるか否かを確かめるために精査するための“種”として用いられ得る。同様に、任意の入手可能な平均グラフデータベースから選ばれたプロファイルは、“標準薬剤データベース”を、密接にマッチした標準薬剤プロファイルがあるか否かを決定するために精査するために用いられ得る。そういった研究に用いられる付加的なデータベースは、所望のように構築あるいは定義され得、そして、比較的小さく（例えば、単一の化合物、あるいは選ばれた同種の一連の化合物からなる）、あるいは非常に大きい（例えば、今までにＮＣＩスクリーニングで試験された純粋な化合物、混合物、画分物、および抽出物の全てのデータベース）可能性がある。
【００７３】
ＣＯＭＰＡＲＥを用いた初期のＮＣＩの研究は、平均グラフパターンにマッチする化合物は関連する化学構造をしばしば有することを示した。しかし、この現象のより詳細な試験により、ある種の非関連の構造の化合物が平均グラフパターンのマッチングを有し、そして、作用の同一あるいは関連した生化学的機構を共有することが明らかになった。例えば、Boyd、In: Current Therapy in Oncology (Niederhuber、J.E.、ed.)、Philadelphia: BC Decker、1993、pp. 11-22; and Paull et al.、In: Cancer Therapeutic Agents、Washington、D.C.: Am. Chem. Soc. Books、pp. 9-45 (1995); およびそれらの参照文献を参照されたい。
【００７４】
ＣＯＭＰＡＲＥ分析は、ＧＩ₅₀、ＴＧＩ、あるいはＬＣ₅₀のいずれかから計算される平均グラフデルタを用いて行われ得る。選択された特定の平均グラフプロファイルあるいは“種”が、所定のデータベースを精査するために用いられるときには、各細胞株についての適切なデルタ値は、特定のデータベースセットに入っている全ての平均グラフの同じ細胞株に対応するデルタ値と比較される。もし、いずれかのデルタ値がいずれかの細胞株を失う（例えば、試験の不合格あるいは品質管理削除のせいで）ならば、そのときは、その細胞株はその特定の種／平均グラフとデータベース／平均グラフとのペアについての計算から完全に除外される。それ故、特定されたデータベースにおける各平均グラフにとって、デルタ値のペアのセット（最大値６０）が得られる。商業的に入手し得るＳＡＳ統計プログラムが、各デルタ値ペアのセットのためのピアソンプロダクトモーメント補正係数（０．０−１．０）の計算のために用いられる。特定されたデータベースにおける全ての化合物の平均グラフは、種平均グラフに対する類似性についてランク付けされ得る。ＮＣＩの“標準薬剤データベース”ならびにＣＯＭＰＡＲＥを含む様々なＮＣＩスクリーニングデータディスプレイおよび分析ツールへの公的アクセスは、インターネット（ｈｔｔｐ：／／ｄｔｐ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）により世界中の研究者にとって利用可能である。
【００７５】
ＣＯＭＰＡＲＥの通常の応用により、標準薬剤データベースから選択されたプロトタイプ種化合物を用いて、ＮＣＩは今までのデータから生じた全ての歴史的なスクリーニングデータベースの調査を維持してきた。このようにして、公知のまたは公知と推定される作用の機構を有する標準薬剤にマッチするスクリーニングフィンガープリントを有する化合物が同定され得る。ＮＣＩは、作用機構が以前は知られていなかった化合物のデータベース分類を、目的とする多くの既知の機構分類に関連させそして次第に確定することを可能ならしめてきた。例えば、新たなメンバーが、チューブリン相互作用性抗有糸多重度物質、代謝拮抗物質、アルキル化剤、トポイソメラーゼ抑制剤、ＤＮＡバインダー等の総合的な機構のカテゴリーに分類されてきた。この種のデータベース予想から生じるこれらおよび多くの他の例が、例えば、Paull et al.、Cancer Res.、52、3892-3900 (1992)、およびその参照文献; and Paull et al.、In: Cancer Chemotherapeutic Agents、Washington、D.C.: Am. Chem. Soc. Books、1995、pp. 9-45、およびその参照文献において、出版されてきた。
【００７６】
ＮＣＩの継続した薬剤のスクリーニングの取り組みの一部として、コンカナマイシンＡ（図１２Ａ−１２Ｃ）およびバフィロマイシンＡ₁の特徴的なスクリーニング“フィンガープリント”がＮＣＩスクリーニングにおいて決定された。コンカナマイシンおよびバフィロマイシンの“フィンガープリント”の間には高い相関があった。
【００７７】
きわめて驚くべきことに、出願人が分析した幾万もの平均グラフ“フィンガープリント”の中でも特に、本発明の特定の１２および１５員環化合物の特徴的なスクリーニング“フィンガープリント”がコンカナマイシンＡ（これまでに知られた最も強力な空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ抑制剤）とほとんど完全に相関することが見出されてきた。本発明の特定の１２および１５員環化合物に対する相関は非常に正確であるので、偶然の一致という可能性は実質的には除かれている。それゆえ、本発明の化合物であって、ＮＣＩスクリーニングにおけるその平均グラフフィンガープリントがコンカナマイシンＡのそれと相関する化合物は、空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼの抑制剤であると結論される。事実、特定の空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼのバイオアッセイにより、ＮＣＩ６０細胞株スクリーニングにおけるフィンガープリントがコンカナマイシンＡのそれと相関する本発明の化合物は、強力な空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ抑制活性を有することがさらに確認されてきた。それ故、ＮＣＩ６０細胞株スクリーニングは、任意の選択された本発明の化合物が、空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼの抑制剤であることを証明するのに用いられ得る。
【００７８】
ＮＣＩ６０細胞株スクリーニングにより生成した、平均グラフ“フィンガープリント”が互いに高く相関する化合物は、たとえ化合物が構造的に非常に異なっているとしても、共通の分子ターゲットあるいは生物学的作用機構を共有すると期待され得る。例えば、約０．８から０．９あるいはそれ以上のＣＯＭＰＡＲＥ相関係数によって、高い相関が確立され得る。Boyd、In: Current Therapy in Oncology (Niederhuber、J.E.、ed) Philadelphia: B.C. Decker、1993、pp. 11-22; Boyd and Paull、Drug Dev. Res.、34、91-109、1995; Paull et al.、In: Cancer Therapeutic Agents、Washington、D.C.: Am. Chem. Soc. Books、1995、pp. 9-45を参照されたい。それ故、コンカナマイシン、バフィロマイシン、サリシリハラミドおよびロバタミドは、例えば、それら相互のＮＣＩ６０細胞株スクリーニング相関係数が高く、全て、同一の分子ターゲット、空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼを共有することが示され得る。この性質の詳細な記載は実施例５で与えられる。
【００７９】
当業者は、細胞内器官の別の種類あるいは位置、原形質膜の別の種類あるいは位置、あるいは細胞組織の別の種類あるいは位置において、全ての空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ抑制剤が同様に空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ活性を抑制するわけではないことを理解するであろう。いいかえると、ある所定の空胞型（Ｈ＋）−抑制化合物は、細胞内器官、原形質膜、細胞あるいは組織の一つまたはそれ以上の種類あるいは位置において、空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ活性を優先的に抑制し得る。それ故、熟練した専門家は、所望する治療上の使用のために特定の空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ抑制化合物を典型的に選択するであろう。化合物の選択は、空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼが化合物によって優先的に抑制される、細胞内器官あるいは原形質膜の特定の種類あるいは位置に基づいてなされ得る。実際、一つまたはそれ以上の種類の空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼの優先的な抑制に基づいた特定の応用のためにこの化合物が選択され得ることを示す、文献における明らかな先例がある。例えば、Gagliardi et al.、J. Med. Chem.、41、1568-1573、(1998)は、ヒトの腎皮質の空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ活性に比べ、ヒトの溶骨細胞空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ活性を選択的に抑制する化合物を同定した；それ故、そういった化合物は、骨粗しょう症の治療において特に有用であることが期待される。
【００８０】
哺乳動物の空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ活性の抑制剤の薬学上の有用性に加え、薬学上の有用性はまた、非哺乳動物の空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ活性の抑制によっても得られうる。例えば、既知の空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ抑制剤であるバフィロマイシンＡ₁およびコンカナマイシンＡは、真菌および哺乳動物の空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ活性を強力に抑制し、そしてそれらの化合物は強い抗真菌活性を有する。Bowman et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、85、7972-7976 (1988); Droese et al.、Biochemistry、32、3902-3906 (1993); Droese and Altendorf、J. Exp. Biol.、200、1-8 (1997)を参照されたい。注目すべきことに、本発明のある種の化合物は、哺乳動物（非哺乳動物に対し）の空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼを選択的に抑制することが見出されてきており、このことは、これらの化合物がいかなる既知の抑制剤とも異なる機構によって、酵素を抑制することを示す。
【００８１】
腫瘍細胞の増殖、および引き続くそれらの浸潤および転移において、空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼが重要な役割をはたすという証拠もある。Montcourrier et al.、J. Cell Sci.、107、2381-2391 (1994); Martinez-Zaguilan et al.、Am. J. Physiol.、265、C1015-C1-29 (1993); Martinez-Zaguilan et al.、J. Cell Physiol.、176、196-205 (1998); Nishihara et al.、Biochem. Biophys. Res. Commun.、212、255-262 (1995); Manabe、et al.、J. Cell Physiol.、157、445-452 (1993)を参照されたい。さらに、細胞内器官の酸性化は、通常の抗癌剤の除去および細胞流出に寄与し得る。Marquardt and Center、J. Natl. Cancer Inst.、83、1098-1102 (1991); Benderra et al.、Intl. J. Oncol.、12、711-715 (1998); Mariyama et al.、J. Biochem.、115、213-218 (1994)を参照されたい。それ故、本発明の空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ抑制化合物は、腫瘍細胞の増殖、およびそれに続くそれらの浸潤および転移の抑制に用いられ得る。さらに、本発明の化合物は、通常の抗癌剤に対する腫瘍細胞の薬剤耐性の抑制のために用いられ得る。
【００８２】
本発明に従って用いられる特定の化合物あるいは組成物は、空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ抑制の所望される種類あるいは部位、および／または、当業者にとって周知の他の薬理学上、中毒学上、医薬上の、あるいは他の適切な検討に基づいて選択され得る。本発明の化合物および組成物の抑制活性の、様々な組織、細胞、器官および他の製剤における、空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ活性に対する特定のバイオアッセイ、定量および比較のための常套の方法は文献に詳細に記載されている（例えば、Bowman et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、85、7972-7976 (1988); Gagliardi et al.、J. Med. Chem.、41、1883-1893 (1998); Gagliardi et al.、J. Med. Chem.、41、1568-1573 (1998);およびそれらの参考文献を参照されたい）。
【００８３】
本発明の化合物は、構造的に独特である。そのうえ、本発明の特定の化合物のＧＩ₅₀およびＴＧＩの平均グラフスクリーニングプロファイルのＣＯＭＰＡＲＥ分析は、互いに関して高度の共通性を密接に示す（例えば、少なくとも０．６−０．８、あるいはそれ以上のＧＩ₅₀およびＴＧＩのＣＯＭＰＡＲＥピアソン相関係数）が、いかなる既知標準薬剤ともそういった相関を示さない。同様に、本発明の化合物を含むことが示され得る天然有機体の抽出物は、本発明の化合物と同様に高いＧＩ₅₀およびＴＧＩ−ＣＯＭＰＡＲＥピアソン相関（例えば、典型的には０．６−０．７あるいはそれ以上）を有するＧＩ₅₀およびＴＧＩの平均グラフスクリーニングフィンガープリントを典型的に与える。このことは、当業者が、それらの製造上の原料有機体およびその抽出物を容易に同定することを可能ならしめており、それらから、当業者は本発明の化合物あるいはそれらの前駆体を容易に得ることおよび使用することができる。本発明の化合物の同定および／または特徴付けは、特定の特徴的なＮＭＲシグナルの存在によってさらに容易になる。そういった特徴的なＮＭＲシグナルは、それらの天然有機体からの粗抽出物および部分的に精製された画分、あるいはこれらの化合物を含む合成または半合成反応生成物を含む、化合物の混合物の同定および選択をさらに確実にし得る。これを以下にさらに記述する。
【００８４】
図１は、水素原子（Ｈ¹−Ｈ¹⁰）として描写されていて、本発明の好ましい化合物によって共有されている１０のプロトンの構造的な位置を示している。本発明の化合物のプロトンＮＭＲ分光法（５００ＭＨｚ）は、これら１０のプロトンが、一緒になって本発明の化合物に非常に特徴的な化学シフト値を有する共鳴をもたらすことを示す。これらの特徴的なＮＭＲピーク（それらは、特定の化合物に依存して多重度が異なり得る）は、以下の化学シフト値の範囲に強く集中している集まる（ＣＤ₃ＯＤ中で残留メタノールを標準として記録したとき）：H¹, 6.60-6.70; H², 7.10-7.20; H³, 6.65-6.75; H⁴, 5.30-5.70; H^{5, 6}, 2.30-2.60; H⁷, 5.00-5.45; H⁸, 6.70-6.90; H⁹, 5.60-6.30; H¹⁰, 6.40-7.20。例えば、代表的な本発明の化合物、サリシリハラミドＡおよびＢ、およびロバタミドＡおよびＢ、のＨ¹−Ｈ¹⁰（ＣＤ₃ＯＤ中）の¹Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）化学シフトおよび共鳴の多重度は、下記の表１に記載されている。
【００８５】
【表１】

【００８６】
表１に記載の本発明の化合物の少なくとも六つの特徴的な共鳴（具体的には、Ｈ₁−Ｈ₃およびＨ₈−Ｈ₁₀で表した）は、それらを含む天然有機物の粗製の抽出物において容易に区別される。それ故、抽出物が、特徴的な平均グラフスクリーニングプロファイルを示し、そして、前記の特徴的なＨ¹−Ｈ³およびＨ⁸−Ｈ¹⁰の共鳴を有するプロトンＮＭＲスペクトルを示すときには、本発明の化合物は、天然有機体の抽出物からさらに同定され得る。特徴的な平均グラフスクリーニングプロファイルを有する抽出物は、例えば、本発明の典型的な純粋な化合物のスクリーニングプロファイルに対応する０．６−０．７より大きいか同等のＧＩ₅₀および／またはＴＧＩ−ＣＯＭＰＡＲＥ相関を示すものを含む。このような抽出物がひとたび選ばれれば、当該技術分野における専門家は、本明細書で与えられた記載に従って、本発明の化合物を得ることができる。一つのこのようなアプローチは実施例１に例示される。
【００８７】
本発明の特定の１２−１５員環の化合物は、海綿動物および被嚢動物の溶媒抽出物を含む天然原料から、例えば、Ｈａｌｉｃｌｏｎａ属由来の海綿動物およびＡｐｌｉｄｉｕｍ属由来の被嚢動物種の水あるいは有機溶媒抽出物から容易に得ることができる。Ｈａｌｉｃｌｏｎａ海綿動物あるいはＡｐｌｉｄｉｕｍ被嚢動物の抽出物は、任意の適した溶媒、例えば有機溶媒、水、およびそれらの混合物から調製され得る。新鮮な海綿動物あるいは被嚢動物が用いられ得るが、もっと一般的にはそれらは回収後直ちに冷凍され、そして直ちに用いられるか、あるいは抽出が行われる前に凍結乾燥される。本発明の化合物を得るための原料として海綿動物が用いられるときは、Ｈａｌｉｃｌｏｎａ属由来であるのが好ましいが、さらに好ましくはＨａｌｉｃｌｏｎａ種由来であり、そして最も好ましくはウェスタンオーストラリアのＲｏｔｔｎｅｓｔ島付近で採られるＨａｌｉｃｌｏｎａ種である（実施例１を参照されたい）。
【００８８】
本発明の化合物を得るための原料として被嚢動物が用いられるときは、Ａｐｌｉｄｉｕｍ属由来であるのが好ましい。さらに好ましくは、被嚢動物はＡｐｌｉｄｉｕｍ種であり、さらにより好ましくはＡｐｌｉｄｉｕｍ ｌｏｂａｔｕｍで、最も好ましくはＨｉｌｌａｒｙ Ｂｏａｔ Ｈａｒｂｏｒの真西のオーストラリアの南西海岸で採られたＡｐｌｉｄｉｕｍ ｌｏｂａｔｕｍである（実施例１を参照されたい）。本発明の化合物を含むＨａｌｉｃｌｏｎａおよびＡｐｌｉｄｉｕｍ種の特定の抽出物は、ＮＣＩ６０細胞ヒト腫瘍スクリーニングにおいてそれらが生成する抗癌スクリーニングプロファイルに基づいて同定され選択され得る。本発明の化合物を含むこのような抽出物はまた、本発明の化合物（実施例１をまた参照されたい）に共有される主要構成成分（図２）に特徴的な主要なプロトンＮＭＲシグナル（表１）に基づいても同定および選択され得る。
【００８９】
前記の選択された抽出物から本発明の化合物を単離および精製するために、種々の方法が用いられ得る。単離および精製の各工程において、前記の特徴的な抗癌スクリーニングプロファイルあるいは適切なバイオアッセイ、ならびに前記の特徴的なプロトンＮＭＲシグナルは、部分的に精製されたおよび精製された化合物ならびに中間体画分について得ることができ、所望の本発明の化合物の単離が確実になる。
【００９０】
天然材料から本発明の特定の化合物を得る好ましい方法は、以下の工程を含む：
（ａ）一つまたはそれ以上の本発明の化合物あるいはそれらの前駆体を含む新鮮なあるいは冷凍した海綿動物あるいは被嚢動物（あるいは他の適した天然原料）のサンプルを得る工程、
（ｂ）当該化合物あるいは前駆体を溶解する水または有機溶媒を用いて、当該サンプルから当該化合物あるいはそれらの前駆体を抽出し、水あるいは有機溶媒の抽出物を形成する工程、
（ｃ）必要に応じて、当該抽出物をエタノールを用いて処理し、高分子量タンパク質および硫酸化多糖を沈殿させ除去する工程、
（ｄ）当該抽出物を非極性有機溶媒と水性溶媒との間で分配して、所望の化合物あるいはそれらの前駆体を含む、分配された水性、非極性あるいは極性有機抽出物を得る工程、
（ｅ）当該分配された抽出物を、例えば、吸着、分画、あるいはサイズ排除マトリクスによるクロマトグラフィーにかけて、画分を形成する工程、および
（ｆ）本発明の化合物あるいはそれらの前駆体を含む画分から、それらを単離する工程。
【００９１】
工程（ｂ）において、溶媒は、適切な非極性有機溶媒および適切な極性有機溶媒の混合物を含み得る。適切な非極性有機溶媒には、例えば、ＣＨ₂Ｃｌ₂、ＣＨＣｌ₃、トルエン、およびヘキサンが挙げられる。適切な極性有機溶媒には、例えば、ＭｅＯＨ、ＥｔＯＨ、イソプロピルアルコール、およびアセトンが挙げられる。工程（ｄ）において、適切な有機非極性溶媒には、ＣＨ₂Ｃｌ₂、ヘキサン、ＣＣｌ₄、ＣＨＣｌ₃、ＭｅＯｔＢｕ、および酢酸エチルが挙げられる；そして典型的な水性溶媒は、水およびアルコールの混合物である。分配工程において用いられ得る溶媒混合物の非限定的な例には：（１）ＣＨ₂Ｃｌ₂対１９：１Ｈ₂Ｏ−ＭｅＯＨ、（２）ヘキサン対９：１ＭｅＯＨ−Ｈ₂Ｏ、（３）ＣＣｌ₄対８：２ＭｅＯＨ−Ｈ₂Ｏ、（４）ＣＨ₂Ｃｌ₂対７：３ＭｅＯＨ−Ｈ₂Ｏ、および（５）ＥｔＯＡｃ対Ｈ₂Ｏが挙げられる。工程（ｄ）において、好ましいクロマトグラフィーは、カラムクロマトグラフィーである。カラムクロマトグラフィーが用いられるとき、好ましいクロマトグラフィーマトリックスは吸着型、分配型、サイズ排除型、あるいはそれらの適した組合せである。溶媒およびマトリックスは、単離される化合物が特に酸に安定でないときは、過度に酸性でないことが好ましい。Ｓｅｐｈａｄｅｘ^TMＬＨ−２０は、本発明の特定の型の化合物の単離にとって特に好ましいマトリックスであり、前述の三つのマトリックスタイプの全てを併せ持ち、そして、穏やかな処理および良好な復元性によって特徴付けられている。単離工程（ｆ）は、例えば、溶媒の単純な蒸発あるいは再結晶のいずれかによって行われ得る。
【００９２】
一つのアプローチにおいては、冷凍Ｈａｌｉｃｌｏｎａ種海綿動物の選択されたサンプルを、ドライアイスを用いて粉砕する。ドライアイスを昇華させ、蒸留水を加え、そして解凍された材料を３℃にて３時間攪拌し、そして遠心分離する。残渣を、凍結乾燥させ、ＣＨ₂Ｃｌ₂−ＭｅＯＨ（１：１ｖ／ｖ）の混合物を用いて室温（例えば、２０−２５°Ｃ）にて一晩で抽出する。溶媒を抜き取り、残渣をＭｅＯＨですすぐ。あわせた有機抽出物を蒸発乾固させる。粗製の有機抽出物をＤｉｏｌ−６０カラムの数バッチの真空液体クロマトグラフィー（連続的にヘキサン、ＣＨ₂Ｃｌ₂−ＭｅＯＨ、ＥｔＯＡｃ、アセトン、およびＭｅＯＨで溶出する）にかける。ＥｔＯＡｃの画分を、ＣＨ₂Ｃｌ₂−ＭｅＯＨ（１：１）のＳｅｐｈａｄｅｘ^TMＬＨ−２０のカラムに通し、本発明の化合物に特徴的な生物活性プロファイルおよびＮＭＲシグナルを持つ画分を得る。第２のＳｅｐｈａｄｅｘ^TMＬＨ−２０カラムを、ヘキサン−トルエン−ＭｅＯＨ（３：２：２）で溶出し、実質的に精製された本発明の化合物を得る。サリシリハラミドＡ（図３Ａ）およびそのΔ¹⁷−シス−異性体（サリシリハラミドＢ）（図３Ｃ）は、Ｃ−１８逆相ＨＰＬＣ（７０％から１００％の直線勾配のＭｅＯＨを用いる）により純粋な形態に単離される。本発明の代表的な化合物の単離のより詳細な例示は、実施例１に与えられる。
【００９３】
単離された化合物の構造の明確な証拠は、予備的な分光分析（例えば、高分解能ＮＭＲおよび質量スペクトル分析、赤外およびＵＶ分光法）を含む方法、分光学的および物理化学的性質の関連する文献の先例との比較、およびＸ線結晶学的分析による方法の組合せによって得ることができる。これらは、本明細書の実施例２でさらに例示される。
【００９４】
【実施例】
以下の実施例は、本発明をさらに例示するが、もちろん、いかなる方法でもその範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【００９５】
（実施例１）
本実施例は、海綿動物および被嚢動物から、本発明の特定の化合物を得るための手順を例示する。
【００９６】
本実施例における検討のために、ＮＣＩ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、Ｍａｒｙｌａｎｄから選ばれたＨａｌｉｃｌｏｎａ ｓｐ．海綿動物の特定の抽出物は、サリシリハラミドＡあるいはロバタミドＡと高い相関（０．７より大きいかあるいは同等のＴＧＩ−ＣＯＭＰＡＲＥピアソン相関係数）を持つ、ＮＣＩ６０−細胞スクリーニング平均グラフ（ＴＧＩ）フィンガープリントを示した。抽出物はまた、ＣＤ₃ＯＤ中で残留メタノールを標準として、化学シフト値(および多重度)６．６５（ｄ）、７．１２（ｔ）、６．７２（ｄ）、６．８０（ｄ）、５．６８（ｄ）、および６．８７（ｄｔ）のプロトンＮＭＲ（５００ＭＨｚ）共鳴も示した。選択された抽出物は、Ｐ．Ｍｕｒｐｈｙによって、サウスウェスタンオーストラリア、Ｒｏｔｔｎｅｓｔ島から０．７海里離れて１５メートルの深さで、１９８９年３月に採取されたＨａｌｉｃｌｏｎａ ｓｐ．海綿動物由来であった。海綿動物は、報告によれば、無定形の葉を有する緑色の塊として発見され岩石の多いオーバーハングの下側で成長しておりこれは、Ｊａｍｅｓ Ｃｏｏｋ大学のＰ．Ｊａｎｅ Ｆｒｏｍｏｎｔによって同定された。この特定の海綿動物採集の証明標本（シリアルナンバーＱ６６Ｃ２６７０と記載されている）は、Ｓｍｉｔｈｓｏｎｉａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ Ｔａｘｏｎｏｍｙ ａｎｄ Ｓｏｒｔｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓｕｉｔｌａｎｄ、ＭＤ．に寄託されている。
【００９７】
サリシリハラミドＡおよびＢを以下のように単離した。約４５０ｇの冷凍湿潤重量の海綿動物をドライアイスを用いて粉砕した。ドライアイスを昇華させ、蒸留水を加え、解凍された材料を３℃にて３時間攪拌し、次いで遠心分離した。残渣を凍結乾燥し、ＣＨ₂Ｃｌ₂−ＭｅＯＨ（１：１ｖ／ｖ）の混合物から室温にて一晩で抽出した。溶媒をろ過によって除去し、残渣をＭｅＯＨですすいだ。合わせた有機抽出物を蒸発させて約３．５ｇの粗製の抽出物を得た。
【００９８】
活性成分を単離するための初期の試みにより、重水素化クロロホルムの存在下で、粗製の抽出物およびそれらのクロマトグラフィー画分から生物活性が失われていることが明らかになった。例えば、部分的に精製した画分のＣＤＣｌ₃溶液を一晩貯蔵することにより、抗癌スクリーニングにおいて不活性なタール状の不溶残渣を形成する結果に終わった。それ故、単離におけるその後の全ての試みでは、クロロホルムの使用あるいはＣＤＣｌ₃へのサンプルの曝露を避けた。そうすると、分解あるいは生物活性の喪失に関するさらなる問題は起こらなかった。そのうえ、利用されるその他の通常の有機溶媒中、水中あるいは生物学的媒体中のいずれにおいても、純粋な単離化合物の不安定さを示す兆候はなかった。
【００９９】
選択された粗製抽出物からの、サリシリハラミドの典型的な単離および精製は、以下の如くである。抽出物のアリコート（３３０ｍｇ）を、２．１ｇのジオール結合相上にコーティングし、引き続き１００ｍｌのヘキサン、ＣＨ₂Ｃｌ₂、ＥｔＯＡｃ、アセトン、およびＭｅＯＨでバッチ溶出した。細胞毒性のＣＨ₂Ｃｌ₂およびＥｔＯＡｃの溶出物を合わせて（１０７ｍｇ）、そしてヘキサン−トルエン−ＭｅＯＨ（３：２：２ｖ／ｖ、１．５ｘ４５ｃｍカラム）を用いて、Ｓｅｐｈａｄｅｘ^TMＬＨ−２０を通過させ、４つの画分を得た。その２番目（８．４ｍｇ）がサリシリハラミドＡに対応するＮＭＲシグナルを示した。ワイドポアＣ−１８（Ｒａｉｎｉｎ^TM１ｘ２５ｃｍ）上のＨＰＬＣ（７０％から１００％の直線勾配のＭｅＯＨを用いる）に２０分かけて、５．５ｍｇの純粋なサリシリハラミドＡ（保持時間１３分）および少量の（約０．５ｍｇ）サリシリハラミドＢ(保持時間１４．５分)を得た。
【０１００】
サリシリハラミドＡについての物理化学的および分光分析学的データは以下の通りであった：無定形固体； [α]_D -35° (c = 0.7、MeOH); λ_max (MeOH) 280 nm (ε =34_,000); ν_max (film) 3288、2964、1697、1651、1606、1588、1520、1464、1293、1268、1247、1214、1123、1068、972、869、735 cm^-1;¹Ｈおよび¹³Ｃ ＮＭＲについては、実施例２、表２(下記)を参照されたい; EIMS m/z 439 [M⁺] (43)、421 (1)、410 (5)、409 (2)、392 (2)、330 (7)、315 (8)、313 (3)、312 (3)、296 (10)、288 (12)、278 (4)、231 (12)、191 (40)、149 (17)、125 (18)、124 (6)、109 (100)、108 (19)、107 (16)、96 (63)、91 (10)、83 (31)、82 (50)、81 (87)、79 (35)、56 (27)、55 (24)、43 (14)、18 (19); HREIMS m/z 439.2354 (M⁺、calcd for C₂₆H₃₃NO₅、439.2350)。
【０１０１】
サリシリハラミドＢについての物理化学的および分光学的データは以下の通りであった：無定形固体； [α]_D -73° (c = 0.3、MeOH); λ_max (MeOH) 280 nm (ε=38,000); ν_max (film) 3356、2964、2923、1690、1651、1588、1503、1463、1294、1246、1212、1121、1032、972 cm^-1; ¹H NMR (C₆D₆) δ 0.77 (3H、t、7.3)、0.83 (3H、d、6.8)、1.22 (dd、15.2、8.8)、1.32 (br s)、1.50 (br q、6.8)、1.73 (br m)、1.74 (dd、15.2、10.5)、1.89 (ddd、15.2、7.8、7.4)、1.95 (2H、quintet、7.3)、2.05 (ddd、14.7、6.8、6.4)、2.08 (br m)、3.25 (br d、16.5)、3.27 (br d、8.8)、3.56 (dd、16.5、4.9)、4.52 (dt、10.2、8.8、8.8)、5.08 (ddd、15.6、7.3、6.4)、5.17 (very br m)、5.20 (very br m)、5.48 (d、11.2)、5.62 (dt、10.7、7.8、7.3)、6.45 (dd、8.3、3.9)、6.62 (dd、11.2、10.8)、6.95 (m)、7.29 (t、10.3)、7.66 (br d、10.2)、7.93 (t、10.8)、11.58 (br s); ¹³C NMR (C₆D₆) δ 13.8、14.0、20.8、31.5、36.2、38.0、38.4、39.4、70.9、76.1、103.3、117.2、119.5、123.7、124.9、125.4、126.8、132.8、134.6、137.4、141.9、163.0、172.0 (四重線の炭素のうち３つは観測されなかった); HREIMS m/z 439.2351 (M⁺、calcd for C₂₆H₃₃NO₅、439.2350)。
【０１０２】
本実施例における調査のために、ＮＣＩ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、から選択されたＡｐｌｉｄｉｕｍ ｌｏｂａｔｕｍの抽出物は、サリシリハラミドＡあるいはロバタミドＡと高く相関（ＴＧＩ−ＣＯＭＰＡＲＥピアソン相関係数が０．７より大きいか同等）を有するＮＣＩ６０−細胞スクリーニング平均グラフ（ＴＧＩ）フィンガープリントを示す。抽出物はまた、ＣＤ₃ＯＤ中で記録され残留メタノールを標準として、化学シフト値(および多重度) 6.63(d)、7.14(t)、6.68(d)、6.82(d)、6.04(d)、および 6.45(dd)のプロトンＮＭＲ（５００ＭＨｚ）共鳴も示した。選択された抽出物は、Ｐ．Ｍｕｒｐｈｙによって、Ｈｉｌｌａｒｙ Ｂｏａｔ Ｈａｒｂｏｒの真西のオーストラリアの南西海岸で６メートルの深さで採集されたＡｐｌｉｄｉｕｍ ｌｏｂａｔｕｍ由来であった。分類はＱｕｅｅｎｓｌａｎｄ ＭｕｓｅｕｍのＰａｔｒｉｃｉａ Ｋｏｔｔによりなされた。この特定の被嚢動物収集の証明標本（シリアルナンバーＱ６６Ｃ２７８０と記載されている）は、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍａｒｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅおよびｔｈｅ Ｓｍｉｔｈｓｏｎｉａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの両方に寄託されている。ロバタミドＡおよびＢは次のように単離した。
【０１０３】
Ａ．ｌｏｂａｔｕｍ（湿潤重量６４２ｇ）を採集後直ちに、抽出まで冷凍した。水抽出物（１３．８ｇ）をまず、以下のように、ＥｔＯＨを用いて沈澱処理を施し、高分子量タンパク質および硫酸化多糖を以下のように除去した。抽出物を、５ｇのアリコートに分割し、それらの各々を水（４０ｍｌ）に溶解し、続いてＥｔＯＨ（４０ｍｌ）を添加した。溶液を、一晩、−２０°Ｃにて静置し、その後、遠心分離によって沈殿をペレット化し、そして上澄みをデカンテーションしそして合わせた。合わせた沈殿をＨ₂Ｏ−ＥｔＯＨ（１：１、４０ｍｌ）で洗浄し、再び遠心分離によりペレット化した。洗液をデカントし、合わせた上澄みに添加した。ＥｔＯＨをロータリーエバポレーションにより合わせた上澄みから除去し、残ったＨ₂Ｏを凍結乾燥により除去した。凍結乾燥した上澄みを、ＥｔＯＡｃとＨ₂Ｏに分配し、前述の特徴的なＮＣＩ６０細胞株スクリーニングプロファイルおよびプロトンＮＭＲ化学シフトの両方により決定されるように、目的の化合物中で濃縮された細胞毒性のＥｔＯＨに可溶な物質を得た。このＥｔＯＡｃに可溶な物質を、続いてゲル浸透（Ｓｅｐｈａｄｅｘ^TMＬＨ−２０、１：１ ＭｅＯＨ−ＭｅＣＮ）、続いてＶＬＣ（アミノ結合相、ＣＨ₂Ｃｌ₂−ＭｅＯＨ勾配１００−９０％ＣＨ₂Ｃｌ₂）、ＳａｎｋｉＣＰＣ（５：７：４ ＣＨＣｌ₃−ＭｅＯＨ−Ｈ₂Ｏ、アセンドモード、１．７ｍｌ／ｍｉｎ）、および最後にＨＰＬＣ（Ｃ₁₈、３：７ ＭｅＣＮ−Ｈ₂Ｏ）を用いるクロマトグラフにかけて、ロバタミドＡ（湿潤重量１．１ｍｇ、８．０ｘ１０^-3％）およびロバタミドＢ（湿潤重量１．４ｍｇ、０．０１％）を得た。
【０１０４】
ロバタミドＡについて得られた物理化学的および分光学的データは以下の通りであった：[α]_D-7.9° (c 0.24、MeOH); UV (MeOH) λ_max 273 nm (logε 4.22); IR (film) ν_max 3590-3128 (br)、2974、2933、1739、1656、1523、1461、1451、1374、1266、1215、1169、1113、1042 cm^-1; HRFABMS (noba) MH⁺ m/z 513.2257 for C₂₇H₃₃N₂O₈ Δ+2.0 mmu; FABMS (magic bullet) m/z 535 (M + Na⁺、8%) 513 (MH⁺、16)、495 (15)、460 (20)、289 (65)、239 (22)、176 (30)、154 (100)、138 (100)、105 (83)。
【０１０５】
ＦＡＢ質量スペクトルは、ＪＥＯＬ^TMＳＸ１０２スペクトロメーターで、１０ｋＶキセノン銃を用いてサンプルをｍａｇｉｃ ｂｕｌｌｅｔマトリックス（５：１ ＤＴＴ−ＤＴＥ）から脱離させて得た。スペクトルは正および負のイオン化条件下で実行した。フラグメンテーションは、親イオンとフラグメンテーションイオンのＢ／Ｅリンクしたスキャンによって行った。必要に応じて、ヘリウムコリジョンガスを用いて、第一フリー領域においてこのフラグメンテーションを活性化した。交換スペクトルを化学イオン化（ＣＩ）条件下で、ダイレクトエクスポージャープローブを用いて、Ｆｉｎｎｉｇａｎ ４５００スペクトロメーターで測定した。交換は、試薬ガスとしてのＮＤ₃をＮＨ₃由来のガスとともに用いて得られたスペクトルの比較によって決定された。構造的に重要なフラグメントのＨＲＦＡＢＭＳデータは、以下の通りであった： II: 495.2115 for C₂₇H₃₁N₂O₇、calcd 495.2131; 3 交換可能プロトン; III: 239.1021 for C₁₁H₁₅N₂O₄、calcd 239.1032; ２つの交換可能プロトン; V: 112.0402 for C₅H₆NO₂、calcd 112.0399; VI:CI中のみ観測された;３つの交換可能プロトン; VII: 257.1129 for C₁₆H₁₇O₃、calcd 257.1137;２つの交換可能プロトン; VIII: 291.1231 for C₁₆H₁₉O₅、calcd 291.1231; IX: 273.1118 for C₁₆H₁₇O₄、calcd 273.1127; X: 219.0650 for C₁₂H₁₁O₄、calcd 219.0657。
【０１０６】
ロバタミドＢについて得られた物理化学的および分光学的データは以下の通りであった：[α]_D-15° (c 0.03、MeOH); UV (MeOH) λ_max 288 nm (log ε 4.55); IR (film) ν_max 3580-3118 (br)、3056、2974、2933、1733、1651、1605、1584、1528、1467、1451、1267、1221、1175、1113、1046 cm^-1; HRFABMS (magic bullet) MH⁺ m/z 513.2244 for C₂₇H₃₃N₂O₈ D +0.7 mmu; FABMS (glyc) m/z 513 (MH⁺、10%)、495 (10)、461 (8)、279 (55)、239 (23)、177 (25)、153 (100)、135 (100)。
【０１０７】
（実施例２）
本実施例は、本発明の特定の化合物の構造解析を記述する。
【０１０８】
実施例１において得られ、分光分析学的に特徴付けされたようなサリシリハラミドＡは、ＨＲＥＩＭＳによりＣ₂₆Ｈ₃₃ＮＯ₅であると確認された分子式をもつ無定形固体である。¹³ＣおよびＤＥＰＴ ＮＭＲスペクトル（表２）は、２６の独特の共鳴を示した：５つの四重線、１４のメチン、５つのメチレン、および２つのメチル炭素。化学シフト値はさらに、２つのエステルあるいはアミドカルボニル、１４のオレフィン性あるいは芳香族炭素、および二つの酸素化メチンを特徴付けした。３つの交換可能なプロトンはプロトン数を充足した。ＩＲスペクトルは、ＯＨおよび／またはＮＨ（３２８８ｃｍ^-1）基を確認し、そしてアミド（１６５１ｃｍ^-1）および分子内水素結合した共役エステル（１６９７ｃｍ^-1）の両方の存在を示唆した。Ｃ₆Ｄ₆およびＣＤ₃ＯＤにおけるサリシリハラミドＡについての¹³Ｃ（１２５ＭＨｚ）および¹Ｈ（５００ＭＨｚ）ＮＭＲデータを以下の表２に例示する。
【０１０９】
【表２】

【０１１０】
サリシリハラミドＡのＣＤＣｌ₃への感受性により、全てのＮＭＲ分光実験は、Ｃ₆Ｄ₆あるいはＣＤ₃ＯＤ中で行った。第一の溶媒中では、はっきりしなかった、あるいは解析できなかったシグナルは、第二溶媒中では容易に認識可能であった。結果として、¹Ｈ−¹Ｈ ＣＯＳＹ、ＨＭＱＣ、およびＨＭＢＣ ＮＭＲデータは、両方の溶媒中で収集した。サリシリハラミドＡのＣ₆Ｄ₆中での¹Ｈ−¹Ｈ ＣＯＳＹスペクトルにより、以下のような相関が明らかになった (H/H): 4/6、5/6、8a/8b、8a/9、8a/10、8a/11b、8b/9、9/10、10/11a、10/llb、11a/11b、11a/12、11b/12、12/13、12/26、13/14a、13/14b、14a/14b、14a/15、14b/15、15/16a、15/16b、16a/16b、16a/17、16a/18、16b/17、16b/18、17/18、18/NH、20/21、20/22、20/23、21/22、21/23、22/23、22/24、23/24、24/25。ＨＭＱＣ（表２）およびＣＯＳＹスペクトルデータの組合せから、図５Ａ−５Ｃに示した部分構造が得られた。
【０１１１】
セグメントＣ（図４Ｃ）中のエナミド官能基は、隣接オレフィン性およびアミドのＮ−Ｈプロトンの間の１０．８Ｈｚカップリングを通じて同定された；後者は可変化学シフト値によって特徴付けされた。２６個の炭素全ては図４Ａ、４Ｂ、４Ｃにそれぞれ対応する部分構造Ａ、Ｂ、およびＣに帰属された。ＨＭＢＣスペクトル（表２）において、ヘキサジエン部分構造Ｂ（図４Ｂ）の二つのビニル水素［Ｃ₆Ｄ₆中でのδが５．１７（Ｈ−２０）および６．６２（Ｈ−２１）；ＣＤ₃ＯＤ中でのδが５．６８および６．８７］と、部分構造Ｃ（図４Ｃ）のアミドカルボニル（δは、Ｃ₆Ｄ₆中では１６２．９そして、ＣＤ₃ＯＤ中では１６５．９）との間のカップリングにより、このアミドカルボニル炭素を介したＢのＣへの結合が確認された。このことは、Ｃ₆Ｄ₆中における、アミドプロトンとカルボニルの間のＨＭＢＣ相関、および質量スペクトルにおけるベースピーク（ｍ／ｚ１０９、Ｃ₇Ｈ₉Ｏ）によって確認された。エステルカルボニルが共役しかつ分子内で水素結合（１６９７ｃｍ^-1）しているというＩＲスペクトルの証拠は、フェノールのＯＨ（δ１１．４６、Ｃ₆Ｄ₆）の低磁場（ｌｏｗ−ｆｉｅｌｄ）の化学シフトによって支持された。このことは、エステルカルボニルが部分構造Ａ（図４Ａ）のフェノールのＯＨに対してオルト配位していることを示した。従って、残りの空いている芳香族の位置は、部分Ｃ（図４Ｃ）のアリル炭素で占められるべきであり、サリシリハラミドＡの構造を与えた。
【０１１２】
芳香族の置換のパターンの確認を、８．３Ｈｚカップリングに最適化されたＨＭＢＣ相関によって行った。ＣＤ₃ＯＤ中で、フェノールの炭素およびアミドカルボニルの炭素は、三つの芳香族プロトン全ておよび六つの芳香族炭素全てと同様に解析された。そのうえ、後者は、溶媒の共鳴により不明確になることもなかった。ＣＤ₃ＯＤ中で、δが７．１２（Ｈ−５）の芳香族プロトンは、δが１５７．１（Ｃ−３）の酸素を有するフェノールの炭素および１４０．７（Ｃ−７）の第４の芳香性炭素の両方に対する相関を示した。¹Ｈ ＮＭＲスペクトルにおいて、このδが７．１２のプロトンは３重線（Ｊ＝７．３Ｈｚ）であるので、これが相関する二つの第４の芳香性炭素は、これに対してメタ位であった。δが６．６５（Ｈ−６）の芳香性水素は、二つの異なる芳香性炭素、δが１１５．３（Ｃ−４）のメチンおよびδが１２３．０（Ｃ−２）の第４の炭素に対して相関を示した。さらに、δが６．６５のプロトンは、δが３８．８（Ｃ−８）における側鎖脂肪族炭素と相関し、必然的にこの側鎖の配置は、δが６．６５の水素に対しオルト位であった。オルト置換基を配慮し、その化学シフトを考慮するために、このδが６．６５の水素は、フェノールのＯＨに対してパラ位であるべきであった。この帰属の確認は、側鎖のベンジルのプロトン（Ｈ−８、δ３．５６）ならびにδが１４０．７（Ｃ−７）の第４の芳香性炭素およびδが６．６５の水素を有するδが１２２．５（Ｃ−６）の芳香性炭素の両方との間に観測された相関であった。エステルカルボニルが結合するための唯一残った芳香族の部位は、サリシリハラミドＡの構造に示される通り、フェノールのＯＨ（δが１２３．０）に対してオルト位であった。付加的なＨＭＢＣ相関を表２に示す。
【０１１３】
サリシリハラミドＡの相対的な立体化学は、¹Ｈ−¹Ｈカップリング定数とｎＯｅスペクトルの違いとの組合せから推定される。図５は、重要なｎＯｅの相互作用を記述する；最も注目すべきは、エステルメチン（Ｈ−１５）を有するアルコールメチン（Ｈ−１３）、メチルが結合しているメチン（Ｈ−１２）、およびオレフィン性水素（Ｈ−１０）の相互作用であった。４つのこれらのプロトンは全て、分子の同一面にあるはずであり、図３に描写される相対的な立体化学を導く。エステルメチン（Ｈ−１５）とＨ−１４ａの二面角は、これら二つのビシナルな水素の間に結合が観察されなかったので、約９０度であるはずである。それらのカップリング定数（１０．３Ｈｚ）およびそれらの間に測定可能なｎＯｅがないことと適合するためには、Ｈ−１５とＨ−１４ｂの間の二面角はほぼ１８０度でなければならない。同様に、Ｈ−１４ｂおよびアルコールメチン（Ｈ−１３）は、測定可能なカップリングを示さず、そのことは、その二面角が約９０度であることを示している。一方、Ｈ−１４ａとＨ−１３の間の大きな二面角は、定量可能なカップリング（８．８Ｈｚ）と適合する必要がある。逆に、Ｈ−１３は、３．５ＨｚのＪ値および、Ｈ−１２について実質的なｎＯｅを示し、このことはこれら二つのプロトン間の二面角が約６０度であることを示唆している。分子モデルの研究、上述のｎＯｅの束縛をもった最小エネルギー構造をつくる研究は、実際の実験値の１−１．５Ｈｚ以内に適合する予想されたＪ値をもたらした。図６は、コンピュータで生成されたサリシリハラミドＡのこのようなモデルのうちの一つを示す。熱力学的モデリング計算は、Macromodel v3.0 [Mohamadi et al.、J. Computat. Chem.、11、440-467 (1990)]を用いて、ＶＡＸ６６２０コンピュータにより行われた。Ｄｒｅｉｄｉｎｇモデルにより構築された相対的な立体化学を持つ平坦なマクロライド構造をもった入力モデルは、手で描かれた。距離の束縛を順次当てはめ、エネルギー最小化は各ステップで行った。観測された顕著なトランスアニュラーのｎＯｅに対応する束縛を当てはめた後、その束縛を除去し、束縛なしで構造を最小化し最終モデルを作り出した。描画（図６）は、構造をダウンロードし、Ｃｈｅｍ３Ｄプログラムからプリントして得られたものである。
【０１１４】
絶対的な立体化学の問題は、Ｍｏｓｈｅｒエステルの使用により検討した。Ohtani et al.、J. Org. Chem.、56、1296-1297 (1991); Dale et al.、J. Am. Chem. Soc.、95、512-519 (1973); Oh et al.、J. Org. Chem.、54、4499-4503 (1989); Leclercq et al.、Tetrahedron Lett.、50、8465-8488 (1994); and Kaneko et al.、Tetrahedron Lett.、35、4107-4110 (1994)を参照されたい。サリシリハラミドＡの（Ｒ）−および（Ｓ）−メトキシトリフルオロメチルフェニル酢酸（ＭＴＰＡ）ジエステルの両方が作られ、¹Ｈ ＮＭＲ分析に供された（表３）。少量のトリス−ＭＴＰＡ誘導体（ジエステルイミド）をそれぞれの場合で形成し、ＮＭＲ分析の前の分取ＴＬＣにより除去した。Ｃ₆Ｄ₆におけるサリシリハラミドＡのＭｏｓｈｅｒエステルの分析を下記表３に記述する。
【０１１５】
【表３】

【０１１６】
ＭＴＰＡエステルの調製は、以下のように行った。セプタムで密封したバイアル中の１０μｌの無水ＣＨ₂Ｃｌ₂および１５μｌの無水ピリジン中の０．５ｍｇのサリシリハラミドの混合物に、１．２μｌの鏡像異性的に純粋なα−メトキシ−α−トリフルオロメチルフェニルアセチルクロライドを加えた。反応混合物を２５°Ｃで１６時間置いて、Ｈ₂ＯおよびＣＨ₂Ｃｌ₂を加え、ＣＨ₂Ｃｌ₂の層をＨ₂Ｏで数回洗い、そして無水Ｎａ₂ＳＯ₄の短いカラムに通し、Ｎ₂下でエバポレートして乾燥した。残渣をＭｅＯＨを用いて逆相ＴＬＣ（Ｃ１８）にかけ、ジ−およびトリ−ＭＴＰＡ誘導体を得た。質量スペクトルデータは以下の通りであった：(ジエステル)HRFABMS m/z 872.324 [(R)-誘導体]; 872.323 [(S)-誘導体] (MH+、calcd for C₄₆H₄₈F₆NO₉、872.322); (ジエステルイミド) HRFABMS m/z 1088.361 [(R)-誘導体]; 1088.362[(S)-誘導体] (MH⁺、calcd for C₅₆H₅₅F₉NO₁₁、1088.362)。
【０１１７】
ＭｏｓｈｅｒエステルのＮＭＲデータの分析は以下の通りであった。Ｃ₆Ｄ₆中で、（Ｒ）−誘導体のＣ−１２メチルの水素（Ｈ−２６）およびＨ−１０は、（Ｓ）−誘導体のそれの高磁場側に現れた。同様に、Ｃ₆Ｄ₆中で、（Ｒ）−誘導体のＨ−１４ａ、Ｈ−１５、およびＨ−１７は、（Ｓ）−誘導体に対し低磁場側に現れた（それぞれ図７Ａおよび７Ｂ）。Ｍｏｓｈｅｒエステル部位としての分子面と同一面のＨ−１７は、Ｈ−１７とエステルメチン、Ｈ−１５との間の強いｎＯｅから明らかになった。同様の結果が、ＣＤ₃ＯＤ中で測定したＮＭＲスペクトルにおいて観察された。これらのデータから、Ｃ−１３における絶対コンフィグレーションはＳであると特定することができた。７Ａおよび７Ｂに示す部分構造図は、観測された化学シフトの違いを説明するＮｅｗｍａｎ投影図を記載する。（Ｒ、Ｓ）−ジアステレオマーにおいて、Ｈ−１０およびＭｅ−２６の水素はフェニル基からの遮蔽を受ける一方、（Ｓ、Ｓ）−ジアステレオマーにおけるＨ−１４ａ、Ｈ−１５、およびＨ−１７がフェニル基からの遮蔽を受ける。仮にＣ−１３が（Ｒ）−コンフィグレーションであるなら、ちょうど反対の遮蔽効果が得られるであろう。三つのキラル中心全ての相対的な立体化学が決定されたので、Ｃ−１３における（Ｓ）−コンフィグレーションの特定は、Ｃ−１２およびＣ−１５における（Ｒ）−コンフィグレーションを与える。それ故、絶対的なコンフィグレーションは、図３において、サリシリハラミドＡについて描写される通りである。
【０１１８】
海綿動物抽出物中の付随的なサリシリハラミドＡは、その分光データがほとんどサリシリハラミドＡと等しい微量成分である。その構造は、Ｃ₆Ｄ₆およびＣＤ₃ＯＤの両方における¹Ｈ、¹³Ｃ、および¹Ｈ−¹Ｈ ＣＯＳＹ ＮＭＲデータとサリシリハラミドＡのそれらとの注意深い比較によって決定された。プロトン−炭素結合の順序は、サリシリハラミドＡのそれと同等であった。サリシリハラミドＡとその異性体、サリシリハラミドＢ、との間の唯一の重要な違いはカップリング定数であり、サリシリハラミドＡについては１４．６Ｈｚであったのに対し、Ｈ−１７およびＨ−１８については１０．２Ｈｚであった。それ故、サリシリハラミドＢは、サリシリハラミドＡの１７−Ｚ異性体であった。
【０１１９】
実施例１において得られ分光分析学的に特徴付けされたようなロバタミドＡは、ＨＲＦＡＢＭＳ（ｎｏｂａ、ｍ／ｚ ５１３．２２５７、ＭＨ⁺、ｃａｌｃｄ ５１３．２２３７）により決定される分子式Ｃ₂₇Ｈ₃₃Ｎ₂Ｏ₈を有した。３つの交換可能なプロトンの存在は、イオン化試薬としてＮＤ₃を用いたＣＩＭＳの重水素置換実験によって示された。ロバタミドＡの¹³Ｃ ＮＭＲスペクトル（表４）は、二つのエステルカルボニル（δ１７１．９、１７０．０）、一つのアミドカルボニル（δ１６４．２）、１５個のｓｐ²炭素（そのうちの１４個は１つのフェニル環および４つのオレフィンに相当した）、３つの酸素化メチン炭素（δ７３．８、７３．３、７３．０）、３つのメチレン（δ３３．１、３５．６、３８．９）、および３つのメチル基（δ６２．７（ＯＣＨ₃）、２０．２、１９．６）を含む、２７個の炭素全てについてのシグナルを含んだ。ロバタミドＡおよびロバタミドＢの¹Ｈおよび¹³Ｃ ＮＭＲ データは、下記表４に記載される。スペクトルは全て、ＣＤ₃ＯＤ中、残留メタノールを標準として測定された。
【０１２０】
【表４】

【０１２１】
ＣＯＳＹ、差ｎＯｅ、ＨＭＱＣおよびＨＭＢＣを含む一連のＮＭＲ実験は、図８において、強調された結合（図８においてＡ−Ｅと称される）により、５つの部分構造を構築するのに用いられた。フラグメントＡ（図８）は、三つの隣接する芳香族のプロトン（δ_C１１４．４、δ_H６．６８、ｄ、Ｊ＝７．８Ｈｚ；δ_C１３１．８、δ_H７．１４、ｔ、Ｊ＝７．８Ｈｚ；δ_C１２０．８、δ_H６．６３、ｄ、Ｊ＝７．８Ｈｚ）からなっていた。フラグメントＢ（図８）は、メチレン基（δ_C３３．１、δ_H２．９３、ｄｄ、Ｊ＝１７．１、８．３Ｈｚおよびδ_H３．２１、ｄ、Ｊ＝１７．１Ｈｚ）および三置換オレフィンのオレフィン性プロトン（δ_C１２５．６、δ_H５．１７、ｍ；δ_C１３９．４）からなっていた。ＨＭＢＣ実験は、１重線のメチル基（δ_C２１．８、δ_H１．７９）が、１３９．４ｐｐｍのオレフィン性炭素上の置換基であることを示し、これはまた５．１７ｐｐｍのオレフィン性プロトンとも相関した。このオレフィンのＺ形は、メチル基（δ１．７９）およびδが５．１７のプロトンの間で観察されたｎＯｅから決定された。フラグメントＣ（図８）は、オレフィン性プロトン間で観察された１５．１Ｈｚのカップリングに基づいて、トランス（Ｅ）であると示されたオレフィン（δ_C１３５．０、δ_H５．６６およびδ_C１３２．７、δ_H５．５０）にカップリングした酸素化メチン（δ_C７３．３、δ_H４．７８）からなっていた。５．５０ｐｐｍのプロトンはさらに、別の酸素化した炭素（δ_C７３．８、δ_H５．２３）にあるプロトンにカップリングしていて、それは、続いて順に、δ_H１．３５（δ_C２０．２）で共鳴する二重線のメチルにカップリングしていた。フラグメントＤ（図８）は、酸素化メチン（δ_C７３．０、δ_H５．５３）にカップリングしたジアステレオピックなメチレン［δ_C３８．９、δ_H２．６７＆２．５９（Ｊ＝１６．６Ｈｚ）］で始まっていた。メチンは、メチレン（δ_C３５．６、δ_H２．４８）にカップリングしており、続いて、第二のトランスオレフィン（δ_C１０９．９、δ_H５．３４；δ_C１２６．９、δ_H６．８２；Ｊ＝１４．２Ｈｚ）とカップリングした。図８においてフラグメントＥであるとラベルされた残りのスピン系は、３つのオレフィン性プロトン（δ_C１２６．１、δ_H６．０４；δ_C１３５．６、δ_H６．４５；およびδ_C１４８．７、δ_H８．９５）からなっていた。これらプロトンのうち二つ（Ｈ２４およびＨ２５につき、それぞれ、δ_H６．０４およびδ_H６．４５）は、１１．７ＨｚのＪ₂₄、₂₅およびプロトン間で観察されたｎＯｅに基づくシスオレフィンを形成した。１４８．７ｐｐｍの炭素の化学シフトおよびそのプロトンの８．９５ｐｐｍへの低磁場シフトの両方は、この炭素が残りの窒素原子とイミン型結合で結合していることを示唆した。さらに、このプロトンは、既にフラグメントＥの一部として同定された隣接するオレフィン以外のいかなる炭素とも相関がなかった。１４８．７の炭素の化学シフトは、オキシムの存在と一致した(Gordon et al.、J. Org. Chem.、49、97-100 (1984))、そしてそういった官能基は、分子式に要する残りの窒素および酸素原子に相当した。Ｈ２５−Ｈ２６のカップリング定数が１１Ｈｚに近いことに加えて、これら二つのプロトン間で観測されたｎＯｅ相関は、オレフィンおよびオキシムがｓ−シスの関係にあることを示唆した。これらの部分構造は、ロバタミドＡのメトキシル基以外の構造的な要素の全てを説明する。メトキシル置換基は、結局、その炭素の化学シフト（δ_C６２．７）に基づいてＮ２７でオキシム上に位置しており、このことは、他のオキシムメチルエーテルとも一致し、３．９１ｐｐｍのメトキシルシグナルおよび８．９５ｐｐｍのプロトン（Ｈ２６）間で観察された弱いｎＯｅにより裏付けられた。観測された、オキシムの炭素およびプロトンのｎＯｅおよび化学シフトは、オキシム二重結合のＥ（ｓｙｎ）のジオメトリーを裏付けた(Gordon et al.、J. Org. Chem.、49、97-100 (1984); Wolkowski et al.、Tetrahedron Lett.、565-568 (1972))。オキシムメチルエーテルの存在は、ＭＳデータ（下記参照）によっても裏付けられた。
【０１２２】
フラグメントＡ（図９）のフェニル環のまわりの置換パターンは、８．３および５．５Ｈｚのカップリングについて最適化されたＨＭＢＣ実験に基づいて決定された。δ７．１４の芳香族プロトン（Ｈ５）は、二つのオルト位のプロトンにカップリングしており、そしてδ１５６．７のフェノール炭素、およびδ１４１．２の第２、第４の炭素の両方に相関していて、このプロトンに対し共にメタ位であることを示唆している。δ１４１．２の炭素は、さらにＣ８のメチレンプロトンにも相関していて、それ故、この炭素はＣ７であると同定され、そのメチレンのこの炭素への結合を要する。Ｈ６（δ６．６３）への相関は、δ１１４．４（Ｃ４）、１２２．３（Ｃ２）および側鎖の末端の炭素（δ３３．１）から観測され、当該側鎖はＣ６に対してオルト位になるようＣ７に位置している。このことにより、Ｃ２（δ１２２．３）がδ１７０．０（Ｃ１）のエステルカルボニルへの唯一の結合点として残された。
【０１２３】
フラグメントＡおよびＢ（図８）は、δ７．１４（Ｈ５）、δ６．６３（Ｈ６）、およびδ３．２１（Ｈ８ａ）で炭素のプロトンへのＨＭＢＣ相関に基づいて、Ｃ７を介して結合されていた。この結合を裏付ける付加的な相関は、Ｈ６とＣ８、Ｈ８とＣ２、およびＨ８とＣ６との間の相関であった。Ｃ１０からＨ１１およびＨ１２への相関は、Ｈ２９からＣ９、Ｃ１０、およびＣ１１で観測される相関と共に、フラグメントＢとＣとの間の結合を与えた（図８）。δ１７１．９（Ｃ１６）におけるＨ１４とエステルカルボニルの相関（これはＣ１７（δ２．５９、２．６７）およびＨ１８のプロトンとも相関する）は、フラグメントＣとＤとの間の結合を与えた（図８）。Ｈ１８（δ５．５８）は、さらにδ１７０．０（Ｃ１）の第二のエステルカルボニルと相関し、これはＣ２において既にフラグメントＡにリンクしていた。最後に、フラグメントＤおよびＥ（図８）は、δ１６４．２のカルボニルとＨ２１、Ｈ２４、およびＨ２５のプロトンとの間において観察された相関に基づくアミド結合を介して結合していた。それ故、ＨＭＢＣ実験はロバタミドＡの全体構造を導く最終的なデータを提供した。
【０１２４】
加えて、ロバタミドＡの構造についての重要な裏付けが、質量スペクトル分析により提供された（実施例１の方法およびデータを参照されたい）。重水素交換実験は、３つの交換可能なプロトンを有する構造と一致する結果を提供した。ロバタミドＡは断片化して幾つかの構造的に重要なイオンを与え（図９）、その配列はフラグメントイオンのリンクスキャン分析によって決定された。正イオンモードでは、水分子の脱離が重量領域を占めて、ｍ／ｚ４９５（ＩＩ）にピークを与えた。このイオンにとって描写可能な１つ以上の構造があるが、ＩＩは一連のフラグメンテーションおよび重水素交換データに基づいている。第二のエステル結合の開裂により、分子の上半分の特徴的な主要なイオンがｍ／ｚ２３９（ＩＩＩ）に生じた。これはさらにフラグメント化してｍ／ｚ１２８（ＩＶ）およびｍ／ｚ１１２（Ｖ）にイオンを生じた。この後者のフラグメント（Ｖ、ｍ／ｚ１１２）は、オキシム上のメトキシルの位置を強く裏づけた。他のエステル結合における最初のフラグメンテーションにより、フラグメントイオンがｍ／ｚ２７５（ＶＩ）に、次いでｍ／ｚ２５７（ＶＩＩ）に生じた。負イオンモードにおいては、フラグメンテーションは、両エステル結合における開裂によって占められ、ｍ／ｚ２９１（ＶＩＩＩ）、ｍ／ｚ２７３（ＩＸ）、およびｍ／ｚ２１９（Ｘ）においてイオンを生じ、さらに大環式環を特徴付けた。アセチル化の際に、ロバタミドＡは、ｍ／ｚ５９６のジアセテートを生じ、それは、正イオンモードにおけるフラグメンテーションにおいて、ロバタミドＡの構造をさらに裏付けた（ＩＩ、ＶＩ、およびＶＩＩと比較可能なフラグメントイオンは二つのアセチル化を示した一方、類似の構造ＩＩＩ、ＩＶ、およびＶは変化を示さなかった）。
【０１２５】
ロバタミドＢはロバタミドＡの異性体であった。実際、ロバタミドＢの¹Ｈ ＮＭＲスペクトルにおける唯一の重要な違いは、Ｈ２５の７．０４ｐｐｍへの低磁場シフト（ロバタミドＡでは６．４５ｐｐｍに対し）およびＨ２６の８．３６ｐｐｍへの高磁場シフト（ロバタミドＡでは８．９５ｐｐｍに対し）であった。このプロトンの高磁場シフトは、オキシム結合の周りのＺ（アンチ）ジオメトリーに一致する。プロトンスペクトルにおけるこれらのシフトは、対応する炭素のシグナルにおいて、δ１２７．５に現れているＣ２５はロバタミドＡでの１３５．６ｐｐｍから高磁場化シフトしており、Ｃ２６は１４４．４ｐｐｍへと高磁場シフトしている（ロバタミドＡにおけるδ１４８．７に対して）という同様の変化を伴っていた。これらの違いは、ロバタミドＢにおいてオキシムメチルエーテルのジオメトリーが、Ｚに変化したことを示した。オキシムのＯＭｅとＨ２６との間で、ロバタミドＡについて見られたような、ｎＯｅは観察されなかった。ロバタミドＢの質量スペクトルは、ロバタミドＡにおいて見られたのと実質的に同じフラグメンテーションを示し、さらに、ロバタミドＢにおいてオキシムのジオメトリーのみが変わったことを裏付けた。
【０１２６】
（実施例３）
本実施例は、本発明の特定の化合物であるロバタミドＣ−Ｆの単離および構造を例示する。
【０１２７】
ロバタミドＣ−Ｆを、Ａｐｌｉｄｉｕｍ ｌｏｂａｔｕｍから単離し、そしてその構造を、実施例１および２においてロバタミドＡおよびＢについて記載した処理と同様の処理によって解明した。ロバタミドＣは、ＨＲＦＡＢＭＳによってロバタミドＡおよびＢの異性体、すなわちＣ₂₇Ｈ₃₂Ｎ₂Ｏ₈であることが示された。後者の化合物と同様に、ＮＤ₃をイオン化試薬として用いたＣＩＭＳ重水素置換実験によって、三つの交換可能なプロトンの存在が示された。三つの化合物間の構造上の類似性は、¹³Ｃおよび¹Ｈ ＮＭＲスペクトル（表４−６）から明瞭に確かめられた。ロバタミドＣの¹³Ｃ ＮＭＲスペクトルは、二つのエステルカルボニル（δ１７１．７、１６９．９）；一つのアミドカルボニル（δ１６４．１）；１５のｓｐ²炭素（それらのうちの１４個は、フェニル環および４つのオレフィンに帰属した）；三つの、酸素化メチン炭素（δ７３．７、７３．２、７２．９）；三つのメチレン（δ３３．０、３５．５、３８．８）；および三つのメチル基（δ６２．７（ＯＣＨ₃）、２０．２、１９．５）を含む、２７の炭素全てについてのシグナルを含んだ。
【０１２８】
標準的な一連の１次元および２次元のＮＭＲ実験（ＨＭＱＣおよびＨＭＢＣを含む、）に基づき、ロバタミドＡについて図８に記載された５つのスピン系（Ａ−Ｅ領域としてラベルされた）はまた、ロバタミドＣでも同定され得た。定義された５つのスピン系のうち、一つの系のみ（図８、Ｅ領域）が、ロバタミドＡおよびＢにおいて見出されたものと異なっていた。この系は、Ｈ２４とＨ２５との間のカップリング定数１５．１Ｈｚに基づくトランスオレフィンを含んだ。このカップリング定数は、ロバタミドＡおよびＢの両方について、１１．７Ｈｚであった。ロバタミドＣについては、オキシムメチルエーテルのコンフィグレーションは、それぞれδ_C１４９．３と１３５．５におけるＣ２６およびＣ２５についての炭素の化学シフトに基づいて、Ｅとして帰属された；加えて、Ｃ２６の一つの結合Ｊ_CHは１７５Ｈｚであった。
【０１２９】
フラグメントＡおよびＢ（図８、それぞれＡおよびＢ領域）は、Ｃ７を介して結合しており、δ７．１４（Ｈ５）およびδ３．２１（Ｈ８ａ）におけるその炭素のプロトンへのＨＭＢＣ相関に基づいていた。この結合を支持する付加的な相関は、Ｈ６とＣ８、およびＨ８とＣ２との間のそれであった。Ｃ１０からＨ１１とＨ１２への相関は、Ｈ２９からＣ９、Ｃ１０およびＣ１１に観測される相関と共に、フラグメントＢとＣ（図８、それぞれＢおよびＣ領域）の間の結合を提供した。Ｈ１４とδ１７１．７（Ｃ１６）のエステルカルボニルとの間の相関は、δ１７１．７（Ｃ１６）のエステルカルボニルは、Ｃ１７の両プロトン（δ２．６０、２６８）およびＨ１８ともさらに相関しており、フラグメントＣとＤ（図８、それぞれＣおよびＤ領域）の間の結合を提供した。Ｈ１８（δ５．６０）は、δ１６９．９（Ｃ１）の第二のエステルカルボニル（これはＣ２においてフラグメントＡと既にリンクしている）ともさらに相関した。最後に、フラグメントＤとＥ（図８、それぞれＤおよびＥ領域）は、アミノ結合を介して結合しており、δ１６４．１（Ｃ２３）のカルボニルとＨ２４およびＨ２５との間に観察された相関に基づいていた。Ｈ２１とＣ２３の間にはＨＭＢＣ実験における相関は観察されなかった；しかし、アミド結合の存在は、¹Ｈおよび¹³Ｃ ＮＭＲスペクトルの類似性により裏付けられた。それ故、ＨＭＢＣ実験は、ロバタミドＣの全構造を導き；さらに、ロバタミドＡおよびＢについてと同様に、ロバタミドＣの推定構造は、リンクスキャン質量スペクトル分析によって確認された。これら三つのケース全てにおいて、同一分子式の同定および同一フラグメンテーション（図８を参照されたい）の観察は、これら三つの構造が幾何学的異性体であることを裏付けた。
【０１３０】
これら三つの付加的な単離化合物、ロバタミドＤ−Ｆは全て、Ｃ₂₇Ｈ₃₂Ｎ₂Ｏ₉の分子式を有し、ロバタミドＡ−Ｃより酸素が一つ多く存在することを示した。重水素置換ＣＩＭＳ実験により、この別の酸素は、後者の４つの化合物における付加的なヒドロキシル基によって説明され得ることが確認された。¹³Ｃおよび¹Ｈ ＮＭＲデータ（それぞれ、表５および６）は、ロバタミドＤ−Ｆの構造をさらに明らかにした。
【０１３１】
ロバタミドＤについて、１次元および２次元のＮＭＲ実験の標準的なセットが得られ、５つのスピン系の存在が同定された；これらのうち、４つ（図８に記載されたＡ−ＣおよびＥ領域）は、ロバタミドＡのそれと同様である。しかし、フラグメントＤ（図８のＤ領域に相当する）は、メチル基でなく、ヒドロキシメチレン（δ_C６４．２；δ_H３．７０、ｄｄ、Ｊ＝１２．１、７．８Ｈｚ；３．６５、ｄｄ、Ｊ＝１２．１、３．９Ｈｚ）で終わっている。ロバタミドＤのリンクスキャン質量スペクトル研究により、フラグメントイオンの幾つかは、ロバタミドＡ−Ｃのそれに対して、１６ａｍｕだけ異なっていることが示された。これらのイオンは、ＩＩ（ｍ／ｚ５１１）、ＶＩ（ｍ／ｚ２９１）、ＶＩＩ（ｍ／ｚ２７３）、ＶＩＩＩ（ｍ／ｚ３０７）、およびＩＸ（ｍ／ｚ２８９）を含んだ。加えて、フラグメントＶＩＩは、ｍ／ｚ２５５にてイオンを与える水の要素を欠き、それ故、ロバタミドＤの余分なヒドロキシル基のＣ３０の位置を確認した。炭素およびプロトンの化学シフトおよびＪ_CH値は、ロバタミドＡについて報告された値と密接に合致しており、このことは両化合物が、Δ^{24 、 25}−オレフィンとオキシムの結合において同一のジオメトリーを有することを示した。
【０１３２】
ロバタミドＤおよびＥについて得られた¹Ｈおよび¹³Ｃ ＮＭＲスペクトルの比較は、オキシムメチルエーテル官能基のジオメトリーのみが異なることを示唆した。ロバタミドＥにおけるオキシム炭素（Ｃ２６）の化学シフトは、ロバタミドＤのそれと比較して高磁場側に現れ（それぞれ、１４４．５ｐｐｍおよび１４８．７ｐｐｍ）、Ｃ２５についても同様であった（ロバタミドＥおよびＤにつき、それぞれ１２７．６および１３５．９ｐｐｍ）。炭素スペクトルにおけるこれらの違いは、Ｈ２６についてのシグナルの類似する高磁場シフト（ロバタミドＤについて８．９５ｐｐｍであったのに対し、ロバタミドＥについて８．３６ｐｐｍであった）により比較された。加えて、ロバタミドＥのＣ２６の結合異核カップリング定数は、１９０Ｈｚであった。これらのデータは、ロバタミドＢの場合と同様に、オキシムメチルエーテルはＺジオメトリーであることを示した。ロバタミドＢとＥのスペクトルデータの比較は、ロバタミドＥの構造を支持し、¹Ｈと¹³Ｃスペクトルの両方における化学シフトの密接な相関を示した。
【０１３３】
¹Ｈおよび¹³Ｃスペクトルの比較および一連のＮＭＲ実験により、ロバタミドＦの全構造が確認された。ロバタミドＣと同様、Ｃ２４−Ｃ２５オレフィンは、１５．６Ｈｚのカップリング定数に基づいたＥジオメトリーを有していた。Ｈ２５とＨ２６の間の１０Ｈｚの一致するカップリング定数およびこの二つのプロトン間で観察されたＮＯＥは、オレフィン−オキシム結合が、ｓ−ｃｉｓ関係にあることを示した。最後に、Ｃ２６（１４９．４ｐｐｍ）およびＣ２５（１３５．５ｐｐｍ）の炭素の化学シフトは、ロバタミドＡ、ＣおよびＤの化学シフトと密接に対応し、そしてロバタミドＢおよびＥのＣ２５およびＣ２６シフトの低磁場側であった。加えて、１つの結合異核カップリング定数（１７８Ｈｚ）は、オキシム結合においてＥジオメトリー配座を有する他のロバタミドのそれと一致した。
【０１３４】
ロバタミドＣ−Ｆについての付加的な物理化学的および分光学的データは以下の通りであった。ロバタミドＣ：[α]_D -15.5°(c 0.113、MeOH); UV (MeOH) λ_max 280 (log ε4.04) nm; IR (film) ν_max 3590-3108 (br)、3067、2975、2933、1733、1656、1616、1584、1467、1451、1354、1267、1215、1175、1113、1042、959、790 cm^-1; HRFABMS (magic bullet) MNa⁺ m/z 535.2065、calcd. for C₂₇H₃₃N₂O₈ 513.2255; FABMS (m-bullet) m/z 551 (MNa⁺、55 %)、535 (60)、495 (20)、257 (32)、239 (50)、193 (100)。ロバタミドＤ: [α]_D -35.0° (c 0.08、MeOH); UV (MeOH) λ_max 281 (logε4.23) IR (film) ν_max 3593-3123 (br)、2924、1738、1650、1607、1529、1464、1450、1269、1218、1168、1117、1042、964、755 cm^-1; HRFABMS (m-bullet) MH⁺ m/z 529.2164、calcd. for C₂₇H₃₃N₂O₉ 529.2186; FABMS (noba) m/z 551 (MNa⁺、100%)、529 (6)、511 (10)、239 (12)。ロバタミドＥ: [α]_D-26.7°(c 0.06、MeOH); UV (MeOH) λ_max 282 (logε4.25) IR (film) ν_max 3591-3110 (br)、2924、1734、1652、1539、1269、1046、668 cm^-1; HRFABMS (m-bullet) MH⁺ m/z (529.2184)、calcd. for C₂₇H₃₃N₂O₉ 529.2186; FABMS (glyc) m/z 551 (MNa⁺、5%)、511 (17)、239 (33)、217 (30)、112 (100). ロバタミドＦ: [α]_D-19.2° (c 0.067、MeOH); UV (MeOH) λ_max 280 (log ε4.17) IR (film) ν_max 3591-3108 (br)、2912、1737、1657、1607、1525、1481、1268、1214、1167、1114、1042、973、755、668 cm^-1; HRFABMS (noba) MNa⁺ m/z 551.2015、calcd. for C₂₇H₃₃N₂O₉ 529.2186; FABMS (magic bullet) m/z 551 (MNa⁺、50)、511 (20)、301 (40)、239 (10)、112 (100)。
【０１３５】
ロバタミドＣ−Ｆについての¹³Ｃ ＮＭＲデータ（１２５ＭＨＺ、ＣＤ₃ＯＤ）は下記の表５に記載される。ロバタミドＣ−Ｆについての¹Ｈ ＮＭＲデータ（５００ＭＨｚ、ＣＤ₃ＯＤ）は下記の表６に記載される。
【０１３６】
【表５】

【０１３７】
【表６】

【０１３８】
（実施例４）
本実施例は、ＮＣＩ６０細胞株スクリーニングを用いて本発明の化合物の活性プロファイルを得るための一般的な手順を例示する。本実施例では、サリシリハラミドＡおよびロバタミドＡを以下のように試験した。化合物は、Boyd and Paull、Drug Dev. Res.、34、91-109 (1995); and Monks et al.、J. Natl. Cancer Inst.、83、757-766 (1991)に記載されるように、ＮＣＩ６０細胞株スクリーニングを用いて試験した。簡潔には、最初に、化合物のストック溶液をジメチルスルホキシド中で、所望の最終的な最高試験濃度の４００倍に調製し、用時まで−７０°Ｃで保管した。本実施例で検討された最終的な最高試験濃度は、１０^-5および１０^-8モル濃度の間で変動した。スクリーニング時には、解凍ストックのアリコートを、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含む完全培地で希釈して、最終的な最高試験濃度の２倍の濃度を与えた。次いで、四回の付加的な一連の１０倍希釈を行い、４つのｌｏｇ₁₀の濃度領域にわたる全部で五つの濃度を与えた。中間希釈物のうちの１００μｌのアリコートをただちに適切なマイクロタイターウェルに加え（各々は１００μｌの培地中に適切な数および型の細胞を予め含んでいた）、所望の五つの最終濃度を与えた。
【０１３９】
用いた６０細胞株および各接種密度は、Boyd and Paull、Drug Dev. Res.、34、91-109 (1995)、および Monks et al.、J. Natl. Cancer Inst.、83、757-766 (1991)に記載の通りであった。化合物の添加の後、プレートを５％ＣＯ₂／空気雰囲気および湿度１００％下、３７°Ｃにて４８時間にわたって培養した。次いで、付着細胞（白血病以外の全ての株）を、冷トリクロル酢酸（５０％ｗ／ｖの５０μｌ）を緩やかに添加することによってインサイチュで固定し、４°Ｃにて６０分にわたって培養した。上澄みを捨て、プレートを脱イオン水で５回洗浄し風乾した。スルホローダミンＢ溶液（ＳＲＢ；１％酢酸中０．４％ｗ／ｖの１００μｌ）を各プレートに加え、その後さらに１０分間室温で培養した。次いで、過剰の未結合染料を１％酢酸で５回の洗浄により除去し、その後風乾した。各ウェルの結合した染料を、１０ｍＭ未緩衝トリス塩基を１００μｌ添加して可溶化した；その後、自動プレート読取機で光学密度（５１５ｎｍ）を測定した。懸濁細胞培地液（白血病）については、薬物の培養期間の終わりに、定着させた細胞を、５０μｌの８０％トリクロル酢酸を緩やかに添加することによってマイクロタイターウェルの底にインサイチュで固定したこと以外は同じ方法であった。適切なコントロールウェルはプレートフォーマットに含まれ(Monks et al.、J. Natl. Cancer Inst.、83、757-766 (1991))、バックグラウンドの光学密度のサブトラクション、薬物−ブランク補正、および０時間（化合物が添加された時間）での細胞密度の測定が可能になった。
【０１４０】
ＮＣＩ６０細胞株スクリーニングにおける純粋なサリシリハラミドＡの４回の試験により、以下の平均の各々のサブパネルおよび細胞株認識子で示された特定の負のｌｏｇ₁₀ ＧＩ₅₀値が得られた: (白血病) CCRF-CEM (7.89)、HL-60-TB (9.04)、K-562 (8.41)、MOLT-4 (7.96)、RPMI-8226 (7.89)、SR (8.44); (肺) A549/ATCC (8.54)、EKVX (7.52)、HOP-62 (8.38)、HOP-92 (7.77)、NCI-H226 (8.80)、NCI-H23 (6.55)、NCI-H322M (6.72)、NCI-H460 (9.01)、NCI-H522 (7.26); [結腸] COLO 205 (8.07)、HCC-2998 (6.74)、HCT-116 (8.74)、HCT-15 (8.44)、HT29 (8.54)、KM12 (8.30)、SW-620 (7.54); (脳) SF-268 (7.55)、SF-295 (8.96)、SF-539 (7.89)、SNB-19 (6.47)、SNB-75 (6.21)、U251 (7.57); (メラノーマ) LOX-IMVI (9.11)、MALME-3M (7.62)、M14 (8.92)、SK-MEL-2 (7.47)、SK-MEL-28 (7.00)、SK-MEL-5 (9.00)、UACC-257 (8.47)、UACC-62 (8.38); (卵巣) IGROV1 (7.89)、OVCAR-3 (7.03)、OVCAR-4 (5.30)、OVCAR-5 (8.11)、OVCAR-8 (8.43)、SK-OV-3 (5.54); (腎臓) 786-0 (7.92)、A498 (6.55)、ACHN (8.01)、CAKI-1 (8.96)、RXF-393 (9.07)、SN-12C (7.77)、TK-10 (5.74)、UO-31 (8.31); (前立腺) PC-3 (7.51)、DU-145 (8.26); [乳房] MCF-7 (7.12)、MCF-7-ADR-RES (8.07)、MDA-MB-231/ATCC (6.92)、HS-578T (5.85)、MDA-MB-435 (7.82)、MDA-N (8.00)、BT-549 (9.30)、T-47D (8.34)。
【０１４１】
サリシリハラミドＡのスクリーニングから得られた、完全なデータセットのＧＩ₅₀およびＴＧＩ−ＣＯＭＰＡＲＥ分析は、この化合物が、本発明の特定の化合物に特徴的である（例えば、ロバタミドＡおよびＢでの０．７−０．８より大きいか同等のピアソン相関係数）が、いかなる公知の通常の抗癌剤クラスとも異なる、ＮＣＩ６０細胞株スクリーニングにおける各毒性の際立ったパターンを与える事を明らかにした。サリシリハラミドＡの平均グラフプロファイルのＣＯＭＰＡＲＥパターン認識分析は、ＮＣＩの標準薬剤データベースに含まれる公知の抗癌剤化合物のプロファイルに対しいかなる重要な相関をも示さなかった。サリシリハラミドＡの平均パネルＧＩ₅₀濃度は約１５ｎＭであり、ＮＣＩパネルを構成する６０細胞株間の各感度の幅は、１０³と同等またはそれ以上であった。
【０１４２】
同様に、ＮＣＩ６０細胞株スクリーニングにおけるロバタミドＡ（図１０Ａ−１０Ｃ）およびロバタミドＢの三回の試験により、互いに高く相関（例えば、ＴＧＩ−ＣＯＭＰＡＲＥピアソン相関係数が０．９と同等かそれ以上）し、本発明の特定の化合物に非常に特徴的な（例えば、０．７−０．８と同等かそれ以上のサリシリハラミドＡのＴＧＩ−ＣＯＭＰＡＲＥピアソン相関係数）と相関する平均グラフプロファイルが得られた。ロバタミドＤ、ロバタミドＥ、およびロバタミドＦもまた本実施例に従って試験された。
【０１４３】
これらのデータは、平均グラフ“フィンガープリント”の生成に用いられ得、これは特定の化合物あるいは化合物クラスについての分子ターゲットを同定するのに用いられ得る。特定の化合物についての分子ターゲット（および、それ故、生物学的活性）は、実施例５においてさらに示されるように、問題の化合物の平均グラフ“フィンガープリント”と、プロトタイプ（“種”）化合物のそれとの相関により決定され得る。
【０１４４】
ロバタミドＡとＤについて、ＮＣＩ６０細胞株スクリーニングから得られる、代表的な平均グラフ“フィンガープリント”が生成される。ロバタミドＡについての、ＮＣＩ６０細胞株スクリーニングから得られる、平均グラフ“フィンガープリント”は、図１０Ａ−１０Ｃにおいて図示される。図１０Ａは、ロバタミドＡについてのＧＩ₅₀平均グラフ“フィンガープリント”を図示する。図１０Ｂは、ロバタミドＡについてのＴＧＩ平均グラフ“フィンガープリント”を図示する。図１０Ｃは、ロバタミドＡについてのＬＣ₅₀平均グラフ“フィンガープリント”を図示する。
【０１４５】
（実施例５）
本実施例は、本発明の特定の化合物の空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ抑制活性を記述する。この方法は、ＮＣＩ６０細胞株インビトロスクリーンを用いて、所望の機械的に決定されたプロトタイプ化合物の平均グラフ“フィンガープリント”を得、次いで、ＣＯＭＰＡＲＥと呼ばれるコンピュータに基づくサーチアルゴリズムを用いて、構造的に非関連の化合物の平均グラフ“フィンガープリント”のデータベースを調べて、それにより、非常に類似したフィンガープリントをもつ化合物を同定し、区別できない場合には、選択されたプロトタイプ（あるいは“種”）から同定する。類似の程度は、ＣＯＭＰＡＲＥ相関係数の計算によって決定され、これは最小値ゼロ（これは相関なしを示す）から最大値１（これは完全な相関を示す）まで変化し得る。異なる化合物の平均グラフ“フィンガープリント”の間の、高いＣＯＭＰＡＲＥ相関（すなわち、類似性の高さを示す）は、化合物が同一あるいは同様の分子ターゲットに対して作用すること、それ故、実質的に同一あるいは類似の生物学的活性の機構を共有することを示す。実際には、約０．９あるいはそれ以上のＣＯＭＰＡＲＥ相関係数は、スクリーニングプロセスの実験誤差の範囲内で、比較化合物の平均グラフ“フィンガープリント”は、実質的に同等かあるいは区別できないほどであり、それ故、その化合物は同一の分子ターゲットに対して作用することを示唆する。ＮＣＩ６０細胞株スクリーニングの適切なバックグラウンドおよびＣＯＭＰＡＲＥの方法と応用は、Boyd、In: Current Therapy in Oncology (Niederhuber、J.E.、ed) Philadelphia: B.C. Decker、1993、pp. 11-22; Boyd and Paull、Drug Dev. Res.、34、91-109、1995; Paull et al.、In: Cancer Chemotherapeutic Agents、Washington、D.C.: Am. Chem. Soc. Books、1995、pp. 11-45を参照されたい。
【０１４６】
最も強力な既知の空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ抑制剤であるコンカナマイシンＡ（図１１Ａを参照されたい）を、本実施例の目的のためのＣＯＭＰＡＲＥ分析において使用するために、機械的に決定されるプロトタイプとして選択した。効力はより低いが、別の公知の空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ抑制剤であるバフィロマイシンＡ₁（図１１Ｂを参照されたい）を、“ポジティブコントロール”としての使用のために選択した。コンカナマイシンおよびバフィロマイシンについての適切なバックグラウンドとしては、Bowman et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、85、7972-7976 (1988); Droese et al.、Biochemistry、32、3902-3906 (1993); Droese and Altendorf、J. Exp. Biol.、200、1-8 (1997)を参照されたい。
【０１４７】
コンカナマイシンＡおよびバフィロマイシンＡ₁の最初の選択は、独自に、ＮＣＩの歴史的なデータベースに含まれる、公知の機械的に決定されるプロトタイプ化合物（例えば、コンカナマイシンＡ）の“フィンガープリント”を有する偶然以上（例えば、ＣＯＭＰＡＲＥ相関係数が０．５）の、ＮＣＩデータベースの調査に基づいた(例えば、Boyd and Paull、Drug Dev. Res. 34、91-109、1995を参照されたい)。本実施例においては、確かな、十分に特徴付けされ、かつ実証されたコンカナマイシンＡおよびバフィロマイシンＡ₁の参照サンプルを、商業上の供給者（Ｋａｍｉｙａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｔｕｋｗｉｌａ、ＷＡ）から得た。本実施例のために選択された本発明の代表的な試験化合物は、サリシリハラミドＡ、ロバタミドＡ、ロバタミドＢ、ロバタミドＣ、ロバタミドＤ、ロバタミドＥ、およびロバタミドＦを含んだ。
【０１４８】
前述の“種”化合物、ポジティブコントロール化合物、および試験化合物は、それぞれＤＭＳＯおよび完全培地中で処方し、そして得られた組成物を実施例４に記載したように、ＮＣＩ６０細胞株試験の手順に同時に供した。各化合物を、上限濃度１０^-6モル濃度、および１回のｌｏｇ₁₀希釈を用いて、四回試験した。各化合物について得られたデータを、対応する平均グラフ“フィンガープリント”を構築するのに用い、ＣＯＭＰＡＲＥ相関分析は下記にさらに記載するように実施された。
【０１４９】
図１２Ａ−１２Ｃはそれぞれ、機械的に決定されるプロトタイプ（あるいは“種”）化合物であるコンカナマイシンＡの、ＧＩ₅₀、ＴＧＩおよびＬＣ₅₀平均グラフ“フィンガープリント”を例示する。本実施例で用いられ、そして、コンカナマイシンＡ“種”を用いて調査されたデータベースは、前記の化合物（すなわち、選択された“種”化合物、ポジティブコントロールおよび試験化合物）の同時の試験から得られた平均グラフ“フィンガープリント”に加え、構造的に異なる純粋化合物の先行する試験からの８０００以上の平均グラフ“フィンガープリント”を含んだ。そのデータベースはまた、粗製の抽出物および部分的に精製されたそれらの画分から得られた平均グラフ“フィンガープリント”も含み、これは“種”化合物、本発明のポジティブコントロールあるいは試験化合物、あるいは公知である、あるいは推測される、前記の化合物のいずれかの画分を有する抽出物あるいは画分と非相関であった。
【０１５０】
この例証に適切であるので、コンカナマイシンＡ（図１２Ｂ）の同時の試験から導かれるＴＧＩ平均グラフを前記のデータベースに含まれるＴＧＩ平均グラフに対して調査するための“種”として、およびＣＯＭＰＡＲＥ係数の計算の基礎として用いた。本研究で試験された各化合物のＧＩ₅₀平均グラフは、平均パネルＧＩ₅₀値の算出のために用いられた。
【０１５１】
表７は、ＮＣＩ６０細胞株スクリーニングにおける、コンカナマイシンＡ、バフィロマイシンＡ₁、サリシリハラミドＡおよびロバタミドＡ−Ｆの試験から得られる、ＴＧＩ−ＣＯＭＰＡＲＥ相関係数および平均パネルＧＩ₅₀値を要約する。平均パネルＧＩ₅₀値もまた表７に示される。表７に示されたＣＯＭＰＡＲＥ相関は、“種”としてのコンカナマイシンＡのＴＧＩ平均グラフを用いて求めた。
【０１５２】
【表７】

【０１５３】
種化合物（コンカナマイシンＡ）それ自身の予想される完全な相関（ＣＯＭＰＡＲＥ相関係数、１．０）によって示されるように、コンピュータに基づくアルゴリズム分析は本例証のために正しくかつ正確に機能していた。そのうえ、ポジティブコントロール化合物であるバフィロマイシンＡ₁は、種化合物と約０．９６の相関を示し、このことは、この分析が、種とは構造的に異なるにもかかわらず同一の分子ターゲット（すなわち、端的には、空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ）を共有する化合物を正しく同定できることを確証した。もっとも注目すべきは、本実施例において選ばれた試験化合物全てが、“種”に対し、少なくとも０．８５あるいはそれ以上のＣＯＭＰＡＲＥ相関係数を示し、それ故、それらの分子ターゲットが同様に空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼであることを実証した。実際、注目すべきことに、本分析によって調査されたデータベースを含む、８０００を越える“フィンガープリント”を、種に対する相関が最高のものから最低のものに順序付けたとき、合致する上位七つは、ロバタミドＡ、ロバタミドＢ、ロバタミドＣ、ロバタミドＤ、ロバタミドＥ、ロバタミドＦ、およびサリシリハラミドＡであった。平均パネルＧＩ₅₀値は、本発明の化合物が、空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼに対するある範囲の絶対的な効力を示し得ることを示唆する。
【０１５４】
本例証において用いたＣＯＭＰＡＲＥ分析のさらなる繰り返しにおいて、前記のデータベースを調べるためにロバタミドＤの平均グラフ“フィンガープリント”を“種”としてかわりに用いた。ＣＯＭＰＡＲＥ分析のさらなる繰り返しの結果を以下の表８に記載する。これは、ＮＣＩ６０細胞株スクリーニングにおける、コンカナマイシンＡ、バフィロマイシンＡ₁、サリシリハラミドＡおよびロバタミドＡ−Ｄの試験による、ＴＧＩ−ＣＯＭＰＡＲＥ相関係数を示している。表８に示したＣＯＭＰＡＲＥ相関は、“種”としてのロバタミドＤのＴＧＩ平均グラフを用いて求めた。
【０１５５】
【表８】

【０１５６】
このケースでは、得られた相関係数はもっと高く、０．９０（サリシリハラミドＡ）から０．９７（ロバタミドＣおよびロバタミドＦ）にわたり、さらに、本実施例において試験された化合物は全て同一の分子ターゲットである空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼを共有することが確かめられた。それ故、試験された本発明の化合物は、これまで知られた最も強力な空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ抑制剤と少なくともほぼ同等の効力を有する。本発明の化合物は、コンカナマイシンあるいはバフィロマイシン（例えば、図１１Ａおよび１１Ｂを参照されたい）より、構造的にはるかに複雑でないことに利点があり、それによって当業者に公知の合成方法により、本発明の化合物をより容易に合成する手段を提供する。
【０１５７】
（実施例６）
本実施例は、代表的なヒト空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ抑制アッセイを用いて、サリシリハラミドＡおよびロバタミドＡの空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ抑制活性を実証する。
【０１５８】
バフィロマイシン−感受性空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ活性の抑制を、破骨細胞腫細胞（ｈＯｃ）、ヒト腎臓皮質細胞（ｈＫ）、およびマクロファージ細胞（Ｊ７７４）由来の、部分的に精製された膜小嚢製剤において測定した。小嚢は、Gagliardi et al.、J. Med. Chem.、41、1568-1573 (1998); and Gagliardi et al.、J. Med. Chem.、41、1883-1893 (1998)に記載された方法の適切な適用によって作成された。
【０１５９】
空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼアッセイは、Ｆ− およびＰ−ＡＴＰアーゼの抑制剤としてのオリゴマイシン（５μｇ／ｍｌ）およびバナジウム酸塩（１ｍＭ）のそれぞれの存在下で行った。比色法を用いて残存のバフィロマイシン感受性空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ活性を定量した(Chan et al.、Anal. Biochem.、157、375-380 (1986)を参照されたい)。このアッセイは、３０分の培養中の３７℃におけるＡＴＰからの無機リン酸塩の放出を測定する。反応は、ＭｇＳＯ₄（最終濃度５Ｍ）の添加により始まる。
【０１６０】
ヒト破骨細胞腫細胞（ｈＯｃ）、ヒト腎臓細胞（ｈＫ）、およびマクロファージ細胞（Ｊ７７４）から導出されたサリシリハラミドＡおよびロバタミドＡの、空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼに対する抑制活性を、下記の表９に示す。
【０１６１】
【表９】

【０１６２】
前述のデータは、ナノ分子からサブナノ分子の範囲内のＩＣ₅₀において、サリシリハラミドＡおよびロバタミドＡが強力な空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ抑制剤であることのさらに別の確証を提供する。
【０１６３】
そのうえ、サリシリハラミドＡおよびロバタミドＡは、“プロトタイプの”空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ抑制剤、コンカナマイシンおよびバフィロマイシンに対する際立った差異から、哺乳動物空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼの高度に選択的な抑制剤であることが分かってきた。サリシリハラミドＡおよびフォリマイシン（コンカナマイシンＡ）を（クロム塩染色の顆粒膜由来の）哺乳動物空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼおよび（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ由来の）菌性空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼに対する抑制活性について一緒に試験した。抑制データは、Bowman et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、85、7972-7976 (November 1988)に記載された、同一の手順および生物学的製剤を用いて得られた。それによって得られたデータは、フォリオマイシンは哺乳動物と菌の両方の酵素の強力な抑制剤であり、一方、サリシリハラミドＡは哺乳動物の酵素の強力な抑制剤であったが、菌の酵素に対してはほとんどあるいは全く抑制活性を有しないことが確認された。哺乳動物空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼの同様の選択性はまたロバタミドＡについても観察された。これらの結果は、本発明のサリシリハラミドおよびロバタミドは、公知の“プロトタイプの”抑制剤のそれとは著しく異なった機構によって作用することを実証する。これらの結果は、さらに、本発明のサリシリハラミドおよびロバタミドが、空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼの哺乳動物イソフォームに対して先例のない選択性を有することを実証する。
【０１６４】
本明細書中引用された、特許、特許出願、および公開公報を含む参考文献は、引用することによって本明細書全体に含まれる。
【０１６５】
本発明は、好ましい実施態様を強調して記載されてきたが、好ましい実施態様のバリエーションが用いられ得ること、および、本発明が本明細書中で特に記載された以外の形態で実施され得ることが意図されていることは、当業者に明らかであろう。したがって、本発明は、特許請求の範囲によって定義されるような本発明の精神および範囲内に包含される全ての改変を含む。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、本発明の特定の化合物の一般的表記であり、式中、Ｈ¹−Ｈ¹⁰は、特徴的なＮＭＲシグナルを生成する水素置換基（hydrogen substituents）を表す。
【図２】 図２は、本発明の化合物の構成成分を例示する。
【図３】 図３は、サリシリハラミドＡの絶対的な立体化学構造を例示する。
【図４】 図４Ａは、サリシリハラミドＡの構造分析において用いられる構成要素の部分構造を記載する。
図４Ｂは、サリシリハラミドＡの構造分析において用いられる構成要素の部分構造を記載する。
図４Ｃは、サリシリハラミドＡの構造分析において用いられる構成要素の部分構造を記載する。
【図５】 図５は、サリシリハラミドＡに関する様々なｎＯｅ関係を記載する。
【図６】 図６は、サリシリハラミドＡのコンフォメーションのコンピュータ生成モデルを示す。
【図７】 図７Ａは、サリシリハラミドＡの（Ｒ）−モシェール誘導体の部分構造を描写するニューマン投影図を記載する。
図７Ｂは、サリシリハラミドＡの（Ｓ）−モシェール誘導体の部分構造を描写するニューマン投影図を記載する。
【図８】 図８は、ロバタミドＡの構造分析に用いられる部分構造（太字で示した）を記載する。
【図９】 図９は、ロバタミドＡについての質量スペクトルのフラグメンテーション分析を記載する。
【図１０】 図１０Ａは、ＮＣＩ６０細胞株スクリーニングにおける、ロバタミドＡのＧＩ₅₀に基づく平均グラフ“フィンガープリント”を記載する。
図１０Ｂは、ＮＣＩ６０細胞株スクリーニングにおける、ロバタミドＡのＴＧＩに基づく平均グラフ“フィンガープリント”を記載する。
図１０Ｃは、ＮＣＩ６０細胞株スクリーニングにおける、ロバタミドＡのＬＣ₅₀に基づく平均グラフ“フィンガープリント”を記載する。
【図１１】 図１１Ａは、コンカナマイシンＡの構造を記載する。
図１１Ｂは、バフィロマイシンＡ₁の構造を記載する。
【図１２】 図１２Ａは、ＮＣＩ６０細胞株スクリーニングにおける、コンカナマイシンＡのＧＩ₅₀に基づく平均グラフ“フィンガープリント”を記載する。
図１２Ｂは、ＮＣＩ６０細胞株スクリーニングにおける、コンカナマイシンＡのＴＧＩに基づく平均グラフ“フィンガープリント”を記載する。
図１２Ｃは、ＮＣＩ６０細胞株スクリーニングにおける、コンカナマイシンＡのＬＣ₅₀に基づく平均グラフ“フィンガープリント”を記載する。

Claims (7)

1. 細胞内器官の器官内酸性化、尿の酸性化、骨吸収、骨粗しょう症、緑内障、若しくはアルツハイマー病を治療または予防するための、あるいは受精を抑制するための、（ｉ）医薬上許容される担体ならびに、（ｉｉ）空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ抑制有効量の次式の化合物：
   

   

   ［式中、Ｒ^１およびＲ^２は同一あるいは異なっており、それぞれは、Ｈ、直鎖または分枝の飽和または不飽和アルキルあるいはＲ^６ＣＯ−（式中、Ｒ^６は、Ｈ、直鎖または分枝の飽和または不飽和アルキル、あるいはアリールである）であり；Ｒ^３は、直鎖または分枝の飽和または不飽和アルキル、オキシム、あるいはオキシムメチルエーテルであり；Ｒ^４は、アルキルまたはＲ^７ＣＨ_２−（式中、Ｒ^７は、Ｒ^６Ｏ−である）であり；Ｒ^５およびＲ^５’は同一あるいは異なっており、それぞれはＨ、直鎖または分枝の飽和または不飽和アルキル、グリコシド、あるいはＲ^６ＣＯ−である］；あるいは医薬上許容されるそれらの塩を含有する医薬組成物。
2. Ｒ ^１ およびＲ ^２ が同一あるいは異なっており、それぞれが、ＨまたはＲ ^６ ＣＯ−（式中、Ｒ ^６ は、Ｈ、直鎖または分枝の飽和または不飽和アルキルである）であり；Ｒ ^３ が、直鎖または分枝の飽和または不飽和アルキルあるいはオキシムメチルエーテルであり；Ｒ ^４ が、アルキルまたはＲ ^７ ＣＨ _２ −（式中、Ｒ ^７ は、Ｒ ^６ Ｏ−である）であり；Ｒ ^５ およびＲ ^５’ が同一あるいは異なっており、それぞれがＨまたはＲ ^６ ＣＯ−である、請求項１に記載の医薬組成物。
3. 前記化合物が、
   

   

   

   あるいは医薬上許容されるそれらの塩からなる群から選ばれる、請求項１または２に記載の医薬組成物。
4. 細胞内器官の器官内酸性化、尿の酸性化、骨吸収、骨粗しょう症、緑内障、若しくはアルツハイマー病を治療または予防するための、あるいは受精を抑制するための、（ｉ）医薬上許容される担体ならびに、（ｉｉ）空胞型（Ｈ＋）−ＡＴＰアーゼ抑制有効量の次式の化合物：
   

   

   ［式中、Ｒ ^１ およびＲ ^２ は同一あるいは異なっており、それぞれは、Ｈ、直鎖または分枝の飽和または不飽和アルキルあるいはＲ ^６ ＣＯ−（式中、Ｒ ^６ は、Ｈ、直鎖または分枝の飽和または不飽和アルキル、あるいはアリールである）であり；Ｒ ^３ は、Ｈ、直鎖または分枝の飽和または不飽和アルキル、オキシム、あるいはオキシムメチルエーテルであり；Ｒ^５’’は、Ｈ、直鎖または分枝の飽和または不飽和アルキル、グリコシド、あるいはＲ^６ＣＯ−である］を含有する医薬組成物。
5. 前記化合物が、
   

   

   ［式中、Ｒ^５’’はＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミンである］からなる群から選ばれる請求項４に記載の医薬組成物。
6. 治療上の有効量の、請求項１−５のいずれかにおいて定義された化合物以外の少なくとも一つの付加的な化合物をさらに含有する請求項１−５のいずれかに記載の医薬組成物。
7. 前記付加的な化合物が、バフィロマイシンおよびコンカナマイシンからなる群から選ばれる、請求項６に記載の医薬組成物。

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