JP4781399B2 - Pufaポリケチドシンターゼ系およびそれらの使用方法 - Google Patents
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Description
本発明は、スラウストキトリド(Thraustochytrid)微生物のような真核生物を含む微生物由来の高度不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid:PUFA)ポリケチドシンターゼ(polyketide synthase:PKS)系に関する。より詳細に述べると、本発明は、非細菌のPUFA PKS系をコードする核酸、非細菌のPUFA PKS系、非細菌のPUFA PKS系を含む遺伝的に改変された生物、並びに本明細書に説明された非細菌のPUFA PKS系を作成および使用する方法に関する。本発明は更に、PUFA PKS系を含む、細菌および非細菌の微生物を同定する方法にも関する。
ポリケチドシンターゼ(PKS)系は一般に、脂肪酸シンターゼ(FAS)系に由来する酵素複合体として当技術分野において知られているが、これは典型的には脂肪酸にほとんど類似性を示さない特定化された生成物を生成するように高度に改変されることが多い。研究者らは、典型的にはII型、I型およびモジュラーと称される、3種の基本的型のひとつに含まれるような、文献において説明されているポリケチドシンターゼ(PKS)系を調べようとした。II型系は、分離可能なタンパク質を特徴とし、これらは各々個別の酵素反応を行う。この系の最終生成物および個々の個別の酵素を生成することに呼応して、これらの酵素の作業は、最終生成物の生成におけるいくつかの時点に関与している。この系の型は、植物および細菌において認められる脂肪酸シンターゼ(FAS)系に類似した方法で機能する。I型PKS系は、酵素が最終生成物を生成するために反復様式で使用される点で、II型系に類似している。I型は、酵素活性が、個別のタンパク質に関連している代わりに、より大きいタンパク質のドメインとして生じる点が、II型と異なる。この系は、動物および真菌において認められるI型FAS系と類似している。
本発明のひとつの態様は、(a)配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6およびそれらの生物活性断片からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする核酸配列;(b)配列番号:8、配列番号:10、配列番号:13、配列番号:18、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:24、配列番号:26、配列番号:28、配列番号:30、配列番号:32、およびそれらの生物活性断片からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする核酸配列;(c)前記(a)のアミノ酸配列の少なくとも500個の連続したアミノ酸と少なくとも約60%同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列であって、このアミノ酸配列は、高度不飽和脂肪酸(PUFA)プロケチドシンターゼ(PKS)系の少なくとも1個のドメインの生物活性を有する核酸配列;(d)前記(b)のアミノ酸配列と少なくとも約60%同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列であって、アミノ酸配列は、高度不飽和脂肪酸(PUFA)ポリケチドシンターゼ(PKS)系の少なくとも1個のドメインの生物活性を有する核酸配列;並びに(e)前記(a)、(b)、(c)、または(d)の核酸配列と完全に相補的である核酸配列からなる群より選択される核酸配列を含む、単離核酸分子に関する。別の局面において、核酸配列は、(1)配列番号:2、配列番号:4、および配列番号:6からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも500個の連続したアミノ酸;および/または、(2)配列番号:8、配列番号:10、配列番号:13、配列番号:18、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:24、配列番号:26、配列番号:28、配列番号:30、および配列番号:32からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約70%同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列と、少なくとも約70%同一、少なくとも約80%同一、少なくとも約90%同一、または同一であるアミノ酸配列をコードしている。好ましい態様において、核酸配列は、配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:13、配列番号:18、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:24、配列番号:26、配列番号:28、配列番号:30、配列番号:32、および/またはそれらの生物活性断片から選択されたアミノ酸配列をコードしている。ひとつの局面において、核酸配列は、配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:12、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、配列番号:27、配列番号:29、および配列番号:31からなる群より選択される。
本発明は、一般的に、非細菌由来の高度不飽和脂肪酸(PUFA)ポリケチドシンターゼ(PKS)系、遺伝的に改変された非細菌のPUFA PKS系を含む生物、生物活性分子を含む対象となる産物の生成のためのそのような系を作製および使用する方法、ならびにそのようなPUFA PKS系を有する新規の真核生物の微生物を同定するための新規の方法に関する。本明細書で用いられる場合、PUFA PKS系は、一般的に以下の同定する性質をもつ:(1)系の天然産物としてPUFAを生成する;ならびに(2)選択されたサイクルにおけるトランス-シス異性化およびエノイル還元反応を含む、脂肪酸鎖の反復性処理と非反復性処理との両方を行う複合体へと会合した数個の多機能性タンパク質を含む(例えば、図1を参照)。
OrfAについての完全ヌクレオチド配列は、本明細書に配列番号:1として表されている。配列番号:1のヌクレオチド4677位〜8730位は、米国特許出願第09/231,899号における配列番号:69として表示されている配列のヌクレオチド390位〜4443位に対応している。それゆえに、配列番号:1のヌクレオチド1位〜4676位は、米国特許出願第09/231,899号において開示されなかった追加的な配列を表している。配列番号:1のこの新規な領域は、OrfAにおける以下のドメインをコードしている:(1)ORFA-KSドメイン;(2)ORFA-MATドメイン;および(3)少なくともACPドメイン領域の部分(例えば、少なくともACPドメイン1〜4)。米国特許出願第09/231,899号における配列番号:69のヌクレオチド1位〜389位は、本明細書に開示されている配列番号:1における4677位の上流である389個のヌクレオチドとは整合していないことを留意されたい。それゆえ、米国特許出願第09/231,899号における配列番号:69のヌクレオチド1位〜389位は、その配列のヌクレオチド390位〜4443位の隣に間違って配置されているように思われる。これらの最初の389個のヌクレオチド(約60位〜約389位)のほとんどは、本発明のOrfA(配列番号:1)の上流部分との適合であり、それゆえ、米国特許出願第09/231,899号におけるcDNA構築物のコンティグを調製する試みの中で誤りが生じたものと考えられる。米国特許出願第09/231,899号においてアラインメントエラーが生じた領域は、高度な反復配列の領域(すなわち、下記で考察されているACP領域)内にあり、おそらく、様々なcDNAクローンからのその配列の組み立てにおいていくらかの混乱を生じたのであろう。
であり、本明細書に配列番号:15として表されている。配列番号:2のアミノ酸配列に関して、9個のACPドメインのそれぞれについての活性部位セリン残基(すなわち、パンテテイン結合部位)の位置は以下の通りである:ACP1 = S1157; ACP2 = S1266; ACP3 = S1377; ACP4 = S1488; ACP5 = S1604; ACP6 = S1715; ACP7 = S1819; ACP8 = S1930; およびACP9 = S2034。ACPドメインの平均サイズが、リンカーを除いて約85個のアミノ酸、リンカーを含めて約110個のアミノ酸であり、活性部位セリンがほぼドメインの中央にあるとすれば、当業者は、OrfAにおける9個のACPドメインのそれぞれの位置を容易に決定することができる。
OrfBについての完全なヌクレオチド配列は、本明細書に配列番号:3として表されている。配列番号:3のヌクレオチド1311位〜6177位は、米国特許出願第09/231,899号において配列番号:71として表示されている配列のヌクレオチド1位〜4867位に対応する(米国特許出願第09/231,899号におけるcDNA配列は、ポリAテールを含めて、停止コドンを越えた約345個の付加的なヌクレオチドを含む)。それゆえ、配列番号:1のヌクレオチド1位〜1310位は、米国特許出願第09/231,899号に開示されなかった追加の配列を表している。配列番号:3のこの新規な領域は、OrfBによりコードされるKSドメインの大部分を含む。
OrfCについての完全なヌクレオチド配列は、本明細書に配列番号:5として表されている。配列番号:5のヌクレオチド1位〜4509位(すなわち、停止コドンを含まない、全オープンリーディングフレーム配列)は、米国特許出願第09/231,899号において配列番号:76として表示されている配列のヌクレオチド145位〜4653位に対応している(米国特許出願第09/231,899号におけるcDNA配列は、OrfCについての開始コドンの上流約144個のヌクレオチド、およびポリAテールを含む停止コドンを越えた約110個のヌクレオチドを含む)。OrfCは、1503個のアミノ酸配列をコードする4509個のヌクレオチド配列(停止コドンを含まず)であり、本明細書に配列番号:6として表されている。OrfC内には、3個のドメイン:(a)2個のFabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ(DH)ドメイン;および(b)1個のエノイルACP-レダクターゼ(ER)ドメインがある。
一致についての報酬 = 1
不一致についてのペナルティ = -2
オープンギャップ(5)および伸長ギャップ(2)ペナルティ
ギャップx_ドロップオフ(50)期待(10)ワードサイズ(11)フィルター(オン)
0 BLOSUM62行列を用いる、blastpについて:
オープンギャップ(11)および伸長ギャップ(1)ペナルティ
ギャップx_ドロップオフ(50)期待(10)ワードサイズ(3)フィルター(オン)。
低O 2 /無酸素フラスコからのデータの好気性フラスコからのデータとの比較
(1)DHA(または他のPUFA含有量)(%FAME(脂肪酸メチルエステル)として)は、低酸素培養において、好気性培養と比較して、同じくらいにまたは好ましくは増加してとどまっていたか?
(2)無酸素培養において、C14:0 + C16:0 + C16:1は、約40%TFAより大きいか?
(3)無酸素培養において、通常の酸素依存性エロンガーゼ/デサチュラーゼ経路への前駆体(C18:3n-3 + C18:2n-6 + C18:3n-6)がほとんどない(FAMEとして< 1%)または全くないか?
(4)脂肪含有量(全脂肪酸量/細胞乾燥重量として)は、低酸素培養において、好気性培養と比較して増加したか?
(5)DHA(または他のPUFA含有量)は、低酸素培養において、好気性培養と比較して、%細胞乾燥重量として増加したか?
界:有色植物界(Chromophyta)(ストラメノパイル)
門:不等毛門(Heterokonta)
目:ヤブレツボカビ(スラウストキトリアレス)
科:スラウストキトリアシエ
属:スラウストキトリウム、シゾキトリウム、ラビリンチュロイデス、またはジャポノチトリウム
KS-MAT-2xACP, KR, KS, CLF-AT, ER(HetM, HetN)HetI
シゾキトリウムPUFA-PKS OrfA、OrfBおよびOrfCにおける配列(OrfA−B−C)は以下の通りである:
KS-MAT-9xACP-KR KS-CLF-AT-ER DH-DH-ER
そのドメイン配列の一致がわかる(高いアミノ酸配列の相同性もある)。ノストクPKS系の生成物は、二重結合(シスもトランスも)を含まない長鎖ヒドロキシ脂肪酸(1つもしくは2つのヒドロキシ基をもつC26またはC28)である。シゾキトリウムPKS系の生成物は、長鎖高度不飽和脂肪酸(5つまたは6つの二重結合(すべてシス)をもつC22)である。その2つのドメインセット間の明らかな違いは、シゾキトリウムタンパク質における2つのDHドメインの存在である(まさに、DHAおよびDPAのシス二重結合の形成に関係しているドメイン(恐らく、ノストク系におけるHetMおよびHetNは、ヒドロキシル基の包含に関与しており、また、起源がPUFAにおいて見出されるそれらとは異なるDHドメインを含む))。また、シゾキトリウムOrfBおよびOrfCにおける重複したERドメインの役割は知られていない(第二のERドメインは、他の特徴付けられたPUFA PKS系において存在しない)。その2つのドメインのセット間のアミノ酸配列相同性は、進化の関連を暗示する。PUFA PKS遺伝子セットがそのDH(FabA様)ドメインの取り込みにより先祖のノストク様PKS遺伝子セットから派生している(進化的意味において)と想像できる。DHドメインの追加が、結果として、新規のPKS最終生成物構造におけるシス二重結合の導入を生じたと思われる。
実施例1
下記実施例は、シゾキトリウム由来のPKS関連配列の更なる分析を説明している。
OrfAの完全なヌクレオチド配列は、本明細書において配列番号:1として示される。OrfAは、8730個のヌクレオチド配列(停止コドンを含まず)であり、これは本明細書においては配列番号:2として示されている2910個のアミノ酸配列をコードしている。OrfAは、下記の12個のドメインがある:
(a)1個のβ-ケトアシル-ACPシンターゼ(KS)ドメイン;
(b)1個のマロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ(MAT)ドメイン;
(c)9個のアシルキャリヤータンパク質(ACP)ドメイン;
(d)1個のケトレダクターゼ(KR)ドメイン。
(1)Pfamプログラムによる解析の結果(Pfamは、タンパク質ドメインまたは保存されたタンパク質領域の複数のアラインメントのデータベースである。これらのアラインメントは、タンパク質機能について意味を持ついくつかの進化の上で保存された構造を表わしている。Pfamアラインメントから構成されたプロファイル隠れマルコフモデル(プロファイルHMM)は、新規タンパク質が、例え相同性が弱くとも、既存のタンパク質ファミリーに属することを自動的に認識するのに非常に有用でありうる。標準のペアワイズアラインメント法(例えば、BLAST、FASTA)とは異なり、Pfam HMMは、マルチドメインタンパク質を実用本位に(sensibly)取扱う。Pfamバージョンのために提供される参考文献は以下である:Bateman A、Birney E、Cerruti L、Durbin R、Etwiller L、Eddy SR、Griffiths-Jones S、Howe KL、Marshall M、Sonnhammer EL、Nucleic Acids Research、30(1):276-280(2002));および/または
(2)標準のデフォルトのパラメータでのアミノ酸検索のためにblastpを使用する、BLAST 2.0 Basic BLAST相同性検索を用いる、細菌のPUFA-PKS系(例えば、シュワネラ)との相同性比較、ここでクエリー配列は、デフォルトにより低い完全性領域についてフィルターをかけられる(Altschul, S.F.、Madden, T.L.、Schaaffer, A.A.、Zhang, J.、Zhang, Z.、Miller, W.およびLipman, D.J.、「ギャップ付きBLASTおよびPSI-BLAST:新世代のタンパク質データベース検索プログラム(Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database programs)」、Nucleic Acids Res.、25:3389-3402(1997)、これはその全体が本明細書に参照として組入れられている)。
OrfAの第一のドメインは、KSドメインであり、本明細書においてはORFA-KSとも称される。このドメインは、配列番号:1(OrfA)の約1位〜約40位の間の開始点から、配列番号:1の約1428位〜約1500位の間の終点まで広がるヌクレオチド配列内に含まれる。ORFA-KSドメインをコードしている配列を含むヌクレオチド配列は、本明細書において配列番号:7(配列番号:1の1位〜1500位)で表わされる。KSドメインを含むアミノ酸配列は、配列番号:2(ORFA)の約1位〜約14位の間の開始点から、配列番号:2の約476位〜約500位の間の終点まで広がる。ORFA-KSドメインを含むアミノ酸配列は、本明細書において配列番号:8(配列番号:2の1位〜500位)で表わされる。ORFA-KSドメインは、活性部位モチーフ:DXAC* (*アシル結合部位C215)を含むことが注目される。
OrfAの第二のドメインは、MATドメインであり、本明細書においてはORFA-MATとも称される。このドメインは、配列番号:1(OrfA)の約1723位〜約1798位の間の開始点から、配列番号:1の約2805位〜約3000位の間の終点まで広がるヌクレオチド配列内に含まれる。ORFA-MATドメインをコードしている配列を含むヌクレオチド配列は、本明細書において配列番号:9(配列番号:1の1723位〜3000位)として表わされる。MATドメインを含むアミノ酸配列は、配列番号:2(ORFA)の約575位〜約600位の間の開始点から、配列番号:2の約935位〜約1000位の間の終点まで広がる。ORFA-MATドメインを含むこのアミノ酸配列は、本明細書において配列番号:10(配列番号:2の575位〜1000位)で表わされる。ORFA-MATドメインは、活性部位モチーフ:GHS*XG(*アシル結合部位S706)を含むことが注目され、これは本明細書においては配列番号:11として表わされている。
OrfAの3〜11のドメインは、9個の縦列ACPドメインであり、本明細書においてはORFA-ACPとも称される(この配列の第一のドメインはORFA-ACP1であり、第二のドメインはORFA-ACP2であり、第三のドメインはORFA-ACP3などである)。第一のドメインORFA-ACP1は、配列番号:1(OrfA)の約3343位〜約3600位に広がるヌクレオチド配列内に含まれる。ORFA-ACP1ドメインをコードしている配列を含むヌクレオチド配列は、本明細書において配列番号:12(配列番号:1の3343位〜3600位)として表わされる。第一のACPドメインを含むアミノ酸配列は、配列番号:2の約1115位から約1200位まで広がる。ORFA-ACP1ドメインを含むこのアミノ酸配列は、本明細書において配列番号:13(配列番号:2の1115位〜1200位)で表わされる。ORFA-ACP1ドメインは、活性部位モチーフ:LGIDS*(*パンテテイン結合モチーフS1157)を含むことが注目され、これは本明細書において配列番号:14として表わされている。9個のACPドメイン全てのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、高度に保存され、従って、各ドメインの配列は、本明細書においては個々の配列の識別により説明されてはいない。しかしこの情報を基に、当業者は、他の8個のACPドメインの各々の配列を容易に決定することができる。9個のドメインの反復間隔は、配列番号:1の約110〜約330のヌクレオチドである。
があり、これは配列番号:15として表わされる。
OrfAのドメイン12は、KRドメインであり、本明細書においてはORFA-KRとも称さ
れる。このドメインは、配列番号:1の約6598位の開始点から、配列番号:1の約8730位の終点まで広がるヌクレオチド配列内に含まれる。ORFA-KRドメインをコードしている配列を含むヌクレオチド配列は、本明細書において配列番号:17(配列番号:1の6598位〜8730位)で表わされる。KRドメインを含むアミノ酸配列は、配列番号:2(ORFA)の約2200位の開始点から、配列番号:2の約2910位の終点まで広がる。ORFA-KRドメインを含むアミノ酸配列は、本明細書において配列番号:18(配列番号:2の2200位〜2910位)で表わされる。KRドメイン内に、アルデヒド-デヒドロゲナーゼ(KRはこのファミリーのメンバーである)の短い鎖と相同なコア領域がある。このコア領域は、配列番号:1の約7198位から約7500位まで広がり、これは配列番号:2のアミノ酸の2400位〜2500位に相当している。
OrfBの完全なヌクレオチド配列は、本明細書において配列番号:3として示される。OrfBは、6177個のヌクレオチド配列(停止コドンを含まず)であり、これは本明細書においては配列番号:4として示されている2059個のアミノ酸配列をコードしている。OrfBは、下記の4個のドメインがある:
(a)β-ケトアシル-ACPシンターゼ(KS)ドメイン;
(b)1個の鎖伸長因子(CLF)ドメイン;
(c)1個のアシルトランスフェラーゼ(AT)ドメイン;
(d)1個のエノイルACP-レダクターゼ(ER)ドメイン。
(1)前述の、Pfamプログラムによる解析の結果;および/または、(2)同じく前述の、BLAST 2.0 Basic BLAST相同性検索を用いる、細菌のPUFA-PKS系(例えば、シュワネラ)との相同性比較。個々のドメインについて提供された配列は、機能的ドメインをコードしている完全長配列を含むと考えられ、Orf内の追加的隣接配列を含み得る。
OrfBの第一のドメインは、KSドメインであり、本明細書においてはORFB-KSとも称される。このドメインは、配列番号:3(OrfB)の約1位〜約43位の間の開始点から、配列番号:3の約1332位〜約1350位の間の終点まで広がるヌクレオチド配列内に含まれる。ORFB-KSドメインをコードしている配列を含むこのヌクレオチド配列は、本明細書において配列番号:19(配列番号:3の1位〜1350位)で表わされる。KSドメインを含むアミノ酸配列は、配列番号:4(ORFB)の約1位〜約15位の間の開始点から、配列番号:4の約444位〜約450位の間の終点まで広がる。ORFB-KSドメインを含むアミノ酸配列は、本明細書において配列番号:20(配列番号:4の1位〜450位)で表わされる。ORFB-KSドメインは、活性部位モチーフ:DXAC*(*アシル結合部位C196)を含むことが注目される。
OrfBの第二のドメインは、CLFドメインであり、本明細書においてはORFB-CLFとも称される。このドメインは、配列番号:3(OrfB)の約1378位〜約1402位の間の開始点から、配列番号:3の約2682位〜約2700位の間の終点まで広がるヌクレオチド配列内に含まれる。ORFB-CLFドメインをコードしている配列を含むヌクレオチド配列は、本明細書において配列番号:21(配列番号:3の1378位〜2700位)として表わされる。CLFドメインを含むアミノ酸配列は、配列番号:4(ORFB)の約460位〜約468位の間の開始点から、配列番号:4の約894位〜約900位の間の終点まで広がる。ORFB-CLFドメインを含むアミノ酸配列は、本明細書において配列番号:22(配列番号:4の460位〜900位)で表わされる。ORFB-CLFドメインは、アシル結合システインを伴わないKS活性部位モチーフを含むことが注目される。
OrfBの第三のドメインは、ATドメインであり、本明細書においてはORFB-ATとも称される。このドメインは、配列番号:3(OrfB)の約2701位〜約3598位の間の開始点から、配列番号:3の約3975位〜約4200位の間の終点まで広がるヌクレオチド配列内に含まれる。ORFB-ATドメインをコードしている配列を含むヌクレオチド配列は、本明細書において配列番号:23(配列番号:3の2701位〜4200位)として表わされる。ATドメインを含むアミノ酸配列は、配列番号:4(ORFB)の約901位〜約1200位の間の開始点から、配列番号:4の約1325位〜約1400位の間の終点まで広がる。ORFB-ATドメインを含むアミノ酸配列は、本明細書において配列番号:24(配列番号:4の901位〜1400位)で表わされる。ORFB-ATドメインは、AT活性部位モチーフ:GxS*xG(*アシル結合部位C1140)を含むことが注目される。
OrfBの第四のドメインは、ERドメインであり、本明細書においてはORFB-ERとも称される。このドメインは、配列番号:3(OrfB)の約4648位の開始点から、配列番号:3の約6177位の終点まで広がるヌクレオチド配列内に含まれる。ORFB-ERドメインをコードしている配列を含むヌクレオチド配列は、本明細書において配列番号:25(配列番号:3の4648位〜6177位)として表わされる。ERドメインを含むアミノ酸配列は、配列番号:4(ORFB)の約1550位の開始点から、配列番号:4の約2059位の終点まで広がる。ORFB-ERドメインを含むこのアミノ酸配列は、本明細書において配列番号:26(配列番号:4の1550位〜2059位)で表わされる。
OrfCの完全なヌクレオチド配列は、本明細書において配列番号:5として示される。OrfCは、4509個のヌクレオチド配列(停止コドンを含まず)であり、これは本明細書においては配列番号:6として示されている1503個のアミノ酸配列をコードしている。OrfCは、下記の3個のドメインがある:
(a)2個のFabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ(DH)ドメイン;
(b)1個のエノイルACP-レダクターゼ(ER)ドメイン。
(1)前述の、Pfamプログラムによる解析の結果;および/または、(2)同じく前述の、BLAST 2.0 Basic BLAST相同性検索を用いる、細菌のPUFA-PKS系(例えば、シュワネラ)との相同性比較。個々のドメインについて提供された配列は、機能的ドメインをコードしている完全長配列を含むと考えられ、Orf内の追加的隣接配列を含み得る。
OrfCの第一のドメインは、DHドメインであり、本明細書においてはORFC-DH1とも称される。これは、OrfCの2個のDHドメインのひとつであり、従ってDH1と称される。このドメインは、配列番号:5(OrfC)の約1位〜約778位の間の開始点から、配列番号:5の約1233位〜約1350位の間の終点まで広がるヌクレオチド配列内に含まれる。ORFC-DH1ドメインをコードしている配列を含むヌクレオチド配列は、本明細書において配列番号:27(配列番号:5の1位〜1350位)で表わされる。DH1ドメインを含むアミノ酸配列は、配列番号:6(ORFC)の約1位〜約260位の間の開始点から、配列番号:6の約411位〜約450位の間の終点まで広がる。ORFC-DH1ドメインを含むこのアミノ酸配列は、本明細書において配列番号:28(配列番号:6の1位〜450位)で表わされる。
OrfCの第二のドメインは、DHドメインであり、本明細書においてはORFC-DH2とも称される。これは、OrfCの2個のDHドメインの二番目であり、従ってDH2と称される。このドメインは、配列番号:5(OrfC)の約1351位〜約2437位の間の開始点から、配列番号:5の約2607位〜約2850位の間の終点まで広がるヌクレオチド配列内に含まれる。ORFC-DH2ドメインをコードしている配列を含むヌクレオチド配列は、本明細書において配列番号:29(配列番号:5の1351位〜2850位)で表わされる。DH2ドメインを含むアミノ酸配列は、配列番号:6(ORFC)の約451位〜約813位の間の開始点から、配列番号:6の約869位〜約950位の間の終点まで広がる。ORFC-DH2ドメインを含むこのアミノ酸配列は、本明細書において配列番号:30(配列番号:6の451位〜950位)で表わされる。
OrfCの第三のドメインは、ERドメインであり、本明細書においてはORFC-ERとも称される。このドメインは、配列番号:5(OrfC)の約2998位の開始点から、配列番号:5の約4509位の終点まで広がるヌクレオチド配列内に含まれる。ORFC-ERドメインをコードしている配列を含むこのヌクレオチド配列は、本明細書において配列番号:31(配列番号:5の2998位〜4509位)で表わされる。ERドメインを含むアミノ酸配列は、配列番号:6(ORFC)の約1000位の開始点から、配列番号:6の約1502位の終点まで広がる。ORFC-ERドメインを含むこのアミノ酸配列は、本明細書において配列番号:32(配列番号:6の1000位〜1502位)で表わされる。
下記実施例は、本発明のPUFA PKS系を含む3種の他の非細菌の生物を同定するための、本発明のスクリーニング法の使用を説明している。
試験される菌株/微生物の2mLの培養物を、培養培地50mLと共に、250mLのバッフル付き振盪フラスコに入れ(好気的処理)、別の同じ菌株の培養物2mLを、培養培地200mLと共に、250mLのバッフル無し振盪フラスコに入れた(嫌気的条件)。両方のフラスコを、200rpmの振盪台上に配置する。培養時間48〜72時間後、これらの培養物を、遠心により収集し、かつ細胞を、ガスクロマトグラフィーにより、脂肪酸メチルエステルについて分析し、各培養物について下記のデータを測定した:(1)脂肪酸プロファイル;(2)PUFA含量;(3)脂肪含量(総脂肪酸量として算出(TEA))。
選択基準:低O 2 /嫌気性フラスコ、対、好気性フラスコ(はい/いいえ)
(1)DHA(または他のPUFA含量)(%FAMEとして)は、低酸素培養において、好気性培養と比べ、ほぼ同じであるか、または好ましくは増加したか?
(2)嫌気性培養において、C14:0+C16:0+C16:1は、約40%TFAより大きいかどうか?
(3)嫌気性培養において、通常の酸素依存型エロンガーゼ/デサチュラーゼ経路への前駆体(C18:3n-3+C18:2n-6+C18:3n-6)は、非常にわずかに(FAMEとして>1%)存在するか、または存在しないか?
(4)脂肪含量(総脂肪酸量/細胞乾燥質量として)は、低酸素培養において、好気性培養と比べ、増加したか?
(5)DHA(または他のPUFA含量)は細胞乾燥質量%として、低酸素培養において、好気性培養と比べ、増加したか?
脱イオン水 1000mL、
Reef Crystals(登録商標)海水塩 40g/l
グルコース 20g/l、
グルタミン酸一ナトリウム(MSG) 20g/l、
酵母抽出物 1g/l、
PII金属* 5ml/l、
ビタミン混合物* 1ml/l、
pH 7.0
*PII金属混合物およびビタミン混合物は、米国特許第5,130,742号に開示したものと同じであり、これはその全体が本明細書に参照として組入れられている。
%FAMEとしてのDHAは増大したか? はい(38->44%)
C14:0+C16:0+C16:1は、約40%TFAよりも大きいか? はい(44%)
C18:3(n-3)またはC18:3(n-6)は存在しないか? はい(0%)
脂肪含量は増加したか? はい(2倍増加)
DHA(または他のHUFA含量)は増加したか? はい(2.3倍増加)
下記実施例は、シゾキトリウムにおけるDHAおよびDPA合成が、他の真核生物において説明されたもののような膜-結合したデサチュラーゼまたは脂肪酸伸長酵素には関連していないことを示している(Parker-Barnesら、2000、前掲;Shanklinら、1998、前掲)。
Claims (30)
- 下記からなる群より選択される単離核酸分子:
(a)配列番号:20のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、核酸分子;
(b)配列番号:20と少なくとも90%同一であり、かつKS活性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、核酸分子;
(c)配列番号:20のアミノ酸配列をコードする核酸配列からなる核酸分子;および
(d)配列番号:19の核酸配列からなる核酸分子。 - 少なくとも1個の転写制御配列に機能的に連結した、請求項1記載の核酸分子を含む組換え核酸分子。
- 請求項2記載の組換え核酸分子でトランスフェクションされた組換え細胞。
- 請求項1記載の核酸分子と完全に相補性である核酸配列からなる、単離核酸分子。
- PUFA PKS系を内因性に発現する遺伝的に改変された微生物であって、
該遺伝的改変が、β-ケトアシル-ACPシンターゼ(KS)の生物活性を有する該PUFA PKS系の少なくとも1個のドメインをコードする内因性核酸配列内にあり、かつ
該遺伝的改変が、
(a)配列番号:20のアミノ酸配列;および
(b)配列番号:20のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする核酸配列内にあり、かつ
該遺伝的改変が該アミノ酸配列の生物活性を変更する、微生物。 - 前記微生物が、スラウストキトリドである、請求項5記載の遺伝的に改変された微生物。
- 前記スラウストキトリドが、シゾキトリウムおよびスラウストキトリウムからなる群より選択される属に由来する、請求項6記載の遺伝的に改変された微生物。
- 前記遺伝的改変が、内因性PUFA PKS系の少なくとも1個のドメインをコードする核酸配列に関して、非細菌のPUFA PKS系、細菌のPUFA PKS系、I型PKS系、II型PKS系、およびモジュラーPKS系からなる群より選択されるPKS系由来のドメインの置換を含む、請求項5記載の遺伝的に改変された微生物。
- 前記微生物が、PUFA PKS系の少なくとも1個の生物活性ドメインをコードする少なくとも1個の核酸分子を組換え的に発現するようにさらに改変されている、請求項5記載の遺伝的に改変された微生物。
- 前記微生物が、請求項1記載の単離核酸分子を組換え的に発現するようにさらに改変されている、請求項9記載の遺伝的に改変された微生物。
- 前記微生物が、細菌のPUFA PKS系、I型PKS系、II型PKS系、およびモジュラーPKS系からなる群より選択されるPKS系由来の少なくとも1個の生物活性ドメインをコードする少なくとも1種の核酸分子を組換え的に発現するように遺伝的にさらに改変されている、請求項5記載の遺伝的に改変された微生物。
- 前記微生物が、少なくとも1個の転写制御配列に機能的に連結した、請求項1記載の核酸分子を含む組換え核酸分子によるトランスフェクションにより遺伝的に改変されている、遺伝的に改変された微生物。
- 前記微生物が、PUFA PKS系を内因性にさらに発現する、請求項12記載の遺伝的に改変された微生物。
- 前記微生物が、スラウストキトリドである、請求項13記載の遺伝的に改変された微生物。
- 前記スラウストキトリドが、シゾキトリウムおよびスラウストキトリウムからなる群より選択される属に由来する、請求項14記載の遺伝的に改変された微生物。
- 前記微生物が、細菌のPUFA PKS系、I型PKS系、II型PKS系、およびモジュラーPKS系からなる群より選択されるPKS系由来の少なくとも1個の生物活性ドメインをコードする組換え核酸分子によりさらにトランスフェクションされている、請求項12記載の遺伝的に改変された微生物。
- 前記微生物が、ホスホパンテテイントランスフェラーゼをコードする組換え核酸分子を組換え的に発現するように遺伝的にさらに改変されている、請求項5〜16のいずれか1項記載の遺伝的に改変された微生物。
- 前記微生物が、野生型微生物と比べて、増加した量の少なくとも1種のPUFAを生成する、請求項5〜17のいずれか1項記載の遺伝的に改変された微生物。
- 少なくとも1個の転写制御配列に機能的に連結した、請求項1記載の核酸分子を組換え的に発現するように遺伝的に改変されている、遺伝的に改変された植物。
- 前記植物が、細菌のPUFA PKS系、I型PKS系、II型PKS系由来のPKS系、およびモジュラーPKS系由来のPKS系からなる群より選択されるPKS系由来の少なくとも1個の生物活性ドメインをコードする少なくとも1種の核酸分子を組換え的に発現するように遺伝的にさらに改変されている、請求項19記載の遺伝的に改変された植物。
- 前記植物が、野生型植物と比べて、増加した量の少なくとも1種のPUFAを生成する、請求項19または20記載の遺伝的に改変された植物。
- ポリケチドシンターゼ系により生成される高度不飽和脂肪酸(PUFA)を生成する方法であって、請求項5〜21のいずれか1項記載の遺伝的に改変された生物を高度不飽和脂肪酸(PUFA)の生成に有効な条件下で培養する工程を含む方法。
- 野生型生物と比較して、前記遺伝的改変が、前記生物により生成された少なくとも1種の高度不飽和脂肪酸(PUFA)の産生を増大する、請求項22記載の方法。
- 前記生物が、遺伝的改変を伴わない天然の生物とは異なる高度不飽和脂肪酸(PUFA)プロファイルを生じる、請求項22記載の方法。
- 前記高度不飽和脂肪酸(PUFA)が、シス立体配置で炭素-炭素二重結合を含む分子である、請求項22または23記載の方法。
- 前記高度不飽和脂肪酸(PUFA)が、3個目の炭素毎に二重結合を含む分子である、請求項22または23記載の方法。
- 請求項2記載の少なくとも1種の組換え核酸分子を含むPKS系を発現するように、植物の細胞を遺伝的に改変する工程を含む、天然の植物とは異なる高度不飽和脂肪酸(PUFA)プロファイルを有する植物を作出する方法。
- 前記植物が、野生型植物と比べて、増加した量の少なくとも1種のPUPAを生成する、請求項27記載の方法。
- 請求項2記載の少なくとも1種の組換え核酸分子を発現するように、微生物細胞を遺伝的に改変する工程を含む、組換え微生物を作出する方法。
- 乳汁分泌非ヒト動物の乳汁-産生細胞を、請求項2記載の少なくとも1個の組換え核酸分子で遺伝的に改変する工程を含む、母乳化した動物乳を製造する方法。
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