JP4763149B2

JP4763149B2 - Test method to determine infection with Helicobacter pylori

Info

Publication number: JP4763149B2
Application number: JP2001139906A
Authority: JP
Inventors: 昌彦若杉; 清吾中谷; 信之鈴木; 晴久平田
Original assignee: Wakamoto Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Wakamoto Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2001-05-10
Filing date: 2001-05-10
Publication date: 2011-08-31
Anticipated expiration: 2021-05-10
Also published as: JP2002333447A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヘリコバクター・ピロリへの感染を判定する検査方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ）はヒトの胃粘膜に見られる細菌である。ヘリコバクター・ピロリへの感染率は、社会経済状態と密接に関連しており、発展途上国ほど感染率が高く、先進国ほど感染率が低くなる傾向がある。しかしながら、日本人の感染率は先進国の中でも際立って高く、４０歳以上では８０％の人が感染しているとも言われている。近年、ヘリコバクター・ピロリが胃潰瘍、十二指腸潰瘍、慢性胃炎、更には胃癌等のさまざまな胃、十二指腸疾患の原因となりうることが明らかにされてきた。
【０００３】
ヘリコバクター・ピロリを除菌することにより、これらの疾患に罹患する危険性を低減できることが明らかになり、このため、ヘリコバクター・ピロリの除菌対象疾患について国際的な議論がなされた。現在では胃潰瘍、十二指腸潰瘍、胃悪性リンパ腫、早期胃癌切除後胃等が除菌の適応対象疾患として認知されている。
【０００４】
ヘリコバクター・ピロリの除菌療法が胃、十二指腸疾患の新しい治療法として認知されるのに伴い、我が国でも日本消化器病学会により治験ガイドラインが作成され、ヘリコバクター・ピロリ感染の存在診断と除菌判定法が示された（日本消化器病学会雑誌、９６巻、１９９−２０７、１９９９年）。上記治験ガイドラインでは、存在診断は侵襲的検査法である胃部生検組織の培養、鏡検、ウレアーゼ試験にて行い、除菌判定は胃部生検組織の培養と鏡検及び非侵襲的検査法である尿素呼気試験を必須とすることが示されている。また、被験者が小児である等の特殊な場合、血中抗ヘリコバクター・ピロリ抗体検査と存在診断とを併用して判定を行うことが示されている。
【０００５】
しかし、これらのヘリコバクター・ピロリ感染の検査法には以下の問題点がある。侵襲的検査法は、胃内視鏡の挿入及び生検等により被験者が多大な苦痛を強いられることとなる。非侵襲的検査法では、被験者の苦痛は大幅に改善されるが、尿素呼気試験では、検査前の絶食が必要である。また、尿素呼気試験は、マススペクトルや赤外分光高度計等の装置が必要であり、特定の施設でしか実施できず、コストも高くなるという欠点がある。抗体検査は、除菌後も血中抗体価が長期にわたり高値であるので、除菌判定には適さない。従ってこれらの検査に代わる、非侵襲的で且つヘリコバクター・ピロリ感染を直接、特異的に精度良く検出できる検査方法が望まれている。
【０００６】
従来、消化管感染菌の直接検査法として消化管排泄物、特に糞便からの感染菌の選択培地を用いた分離培養が行われてきた。しかし、ヘリコバクター・ピロリに関しては数多くの試みにも拘らず、糞便から分離培養された報告はほとんどない。その理由として、ヘリコバクター・ピロリはｉｎｖｉｔｒｏで、低温、栄養欠乏、酸素欠乏等のように環境条件が悪化すると、通常のらせん状体から培養不能な球状体へ形態変化することから、下部消化管においても分離培養不能な球状体に変化していることが考えられる。
【０００７】
一方、抗原抗体反応に基づく免疫学的方法による糞便からのヘリコバクター・ピロリの直接検出に関して、ヘリコバクター・ピロリに対するポリクローナル抗体を用いたイムノアッセイにより糞便等の排泄物検体中のヘリコバクター・ピロリを検出する方法が報告されている（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３３巻、２１６２−２１６５、１９９５年、特開平１０−１０１２８号公報（特許第３０４３９９９号））。
【０００８】
しかし、ポリクローナル抗体は、一般に交差反応性があり、特異性が劣るうえ、抗血清のロット毎に抗体価や特異性が変動する欠点があるので、ポリクローナル抗体を用いた診断薬の製造は、本質的に品質管理が難しいという問題点がある。現実に、特許第３０４３９９９号の特許権者であるメリディアン社により製造されたポリクローナル抗体を用いた糞便中ヘリコバクター・ピロリ抗原検出キット「ＨｐＳＡ」に関しては、偽陰性の出現や特異性の低さが問題となっている（ＭｅｄｉｃａｌＴｒｉｂｕｎｅ、４−５、１９９９年６月３日号；Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．、９４巻、１８３０−１８３３、１９９９年）。
【０００９】
特開平１０−１０１２８号公報には、ヘリコバクター・ピロリは菌株の変異を起こすので、単一の抗原のみとしか反応できないモノクローナル抗体は、ヘリコバクター・ピロリの検出には不適であり、逆に、多様な抗原やエピトープに対応し得る点で、ポリクローナル抗体の方がヘリコバクター・ピロリの検出には適していると記載されている。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記現状に鑑み、被験者に苦痛を与えず、特別の装置を必要とせずに、安価にヘリコバクター・ピロリの感染が診断でき、交差反応性がなく特異性に優れ、優れた感度を有する検査方法を提供することを目的とするものである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、消化管排泄物中に存在するヘリコバクター・ピロリのネイティブなカタラーゼを、ヘリコバクター・ピロリのネイティブなカタラーゼに対するモノクローナル抗体を用いて検出することにより、ヘリコバクター・ピロリへの感染を判定する検査方法であって、前記モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ３１Ａ３（ＦＥＲＭＰ−１８３２９）及び／又はハイブリドーマ８２Ａ３（ＦＥＲＭＰ−１８３２８）により産生されたモノクローナル抗体である検査方法である。
以下に本発明を詳述する。
【００１２】
従来、ヘリコバクター・ピロリの菌体は下部消化管では破砕された状態にあり、そのタンパク質は消化管中でタンパク質分解酵素により分解されてしまうと考えられていた。
しかしながら、本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、驚くべきことに、ヘリコバクター・ピロリ感染者の糞便中にはヘリコバクター・ピロリのＮａｔｉｖｅなカタラーゼが存在していることを見出し、これがヘリコバクター・ピロリへの感染を判定するための指標になり得ることに想到し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
本発明の検査方法は、消化管排泄物中に存在するヘリコバクター・ピロリのＮａｔｉｖｅなカタラーゼを検出するものである。
上記消化管排泄物としては特に限定されないが、採取が容易で被験者への負担が少ない点で、糞便が検体として好適に用いられる。
【００１４】
上記Ｎａｔｉｖｅなカタラーゼとは、ほぼ生理的な条件でとっている固有の構造を保持しているカタラーゼを指し、全てのサブユニットを有し、かつ、活性を有しているカタラーゼであるが、本発明においてはハイブリドーマ３１Ａ３（ＦＥＲＭＰ−１８３２９）及び／又はハイブリドーマ８２Ａ３（ＦＥＲＭＰ−１８３２８）により産生されたモノクローナル抗体が認識するエピトープが保持されているものであれば特に限定されずに検出することができる。
【００１５】
本発明の検査方法では、ヘリコバクター・ピロリのＮａｔｉｖｅなカタラーゼに対するモノクローナル抗体が用いられる。
本発明で用いられるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ３１Ａ３（ＦＥＲＭＰ−１８３２９）により産生されたモノクローナル抗体（以下、モノクローナル抗体３１Ａ３ともいう）及びハイブリドーマ８２Ａ３（ＦＥＲＭＰ−１８３２８）により産生されたモノクローナル抗体（以下、モノクローナル抗体８２Ａ３ともいう）であり、モノクローナル抗体３１Ａ３及びモノクローナル抗体８２Ａ３には、これらの分解物であるＦ（ａｂ′）_２、Ｆａｂ′、Ｆａｂ等も含まれる。これらは単独で用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
【００１６】
本発明で用いられるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ３１Ａ３（ＦＥＲＭＰ−１８３２９）及びハイブリドーマ８２Ａ３（ＦＥＲＭＰ−１８３２８）は、平成１３年５月１０日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番１号中央第６）に寄託されたものである。ハイブリドーマ３１Ａ３（ＦＥＲＭＰ−１８３２９）及びハイブリドーマ８２Ａ３（ＦＥＲＭＰ−１８３２８）の製造方法は実施例１において示すとおりである。
【００１７】
モノクローナル抗体３１Ａ３とモノクローナル抗体８２Ａ３とは、ヘリコバクター・ピロリのＮａｔｉｖｅなカタラーゼを抗原とするものである。
【００１８】
本発明者らが、モノクローナル抗体３１Ａ３、及び、モノクローナル抗体８２Ａ３をそれぞれ用いてヘリコバクター・ピロリの菌体破砕物に対して抗体固定アフィニティークロマトグラフィーを行ったところ、ヘリコバクター・ピロリの菌体破砕物に含まれていた２７０ｋＤａの分子量を有するタンパク質が検出された。このタンパク質に対してＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ったところ５９ｋＤａの分子量を有する単一のバンドが検出された。また、このタンパク質のＮ末端のアミノ酸配列を調べたところヘリコバクター・ピロリのカタラーゼのアミノ酸配列と一致した。ヘリコバクター・ピロリのカタラーゼは２００ｋＤａの分子量を有し、５０ｋＤａの分子量を有するサブユニットが４個集合した４量体の構造を有することが知られている（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９１），１３７，５７−６１）。
【００１９】
以上の結果より、モノクローナル抗体３１Ａ３、及び、モノクローナル抗体８２Ａ３が検出したタンパク質は４個のサブユニットを有するヘリコバクター・ピロリのカタラーゼであると同定され、上記の各モノクローナル抗体は、４個のサブユニットを有するカタラーゼを認識するものであることが明らかとなった。
【００２０】
上記抗体固定アフィニティークロマトグラフィーで検出されたカタラーゼの活性を測定したところ、活性を有しており、このカタラーゼがいわゆるＮａｔｉｖｅな酵素であったことも判明した。
モノクローナル抗体３１Ａ３、及び、モノクローナル抗体８２Ａ３はいずれも、解離したカタラーゼのサブユニットとは反応しなかった。
【００２１】
ヘリコバクター・ピロリの菌体中の総タンパク質のうちカタラーゼの占める割合は、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９１），１３７，５７−６１に記載されたカタラーゼの精製過程における比活性の上昇度から概算して、重量換算でたかだか０．５％である。
この点に鑑みると、モノクローナル抗体３１Ａ３、及び、モノクローナル抗体８２Ａ３が、４個のサブユニットを有するカタラーゼを認識するものであったということは驚くべきことであり、到底予見しえない事項であった。
【００２２】
カタラーゼは異なる種の間でも極めてよく保存されており、ヘリコバクター・ピロリのカタラーゼも他の細菌のカタラーゼと相同性が高いことが知られている（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９６），１７８（２３），６９６０−６９６７）。しかしながら、モノクローナル抗体３１Ａ３、及び、モノクローナル抗体８２Ａ３は、ヘリコバクター・ピロリ以外の細菌のカタラーゼとは全く反応しなかった。
【００２３】
一方、ヘリコバクター・ピロリには多様な変異株が存在することが知られているが（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９６），２０，８３３−８４２）、驚くべきことに、実施例３に示すとおり、モノクローナル抗体３１Ａ３、及び、モノクローナル抗体８２Ａ３は、いずれのヘリコバクター・ピロリに対しても良好に反応した。
【００２４】
モノクローナル抗体３１Ａ３、及び、モノクローナル抗体８２Ａ３がヘリコバクター・ピロリの多様な変異株に対して良好に反応することに鑑みると、これらのモノクローナル抗体が認識するエピトープは変異株同士のカタラーゼの間で極めてよく保存されている部位であると思われる。
【００２５】
以下に詳述するように、モノクローナル抗体３１Ａ３、及び、モノクローナル抗体８２Ａ３は、糞便を検体として、極めて高い精度でヘリコバクター・ピロリへの感染の有無を判定することができるものである。
【００２６】
モノクローナル抗体３１Ａ３、及び、モノクローナル抗体８２Ａ３を用いて、糞便を検体として免疫学的測定を行ったところ、上記の各モノクローナル抗体はヘリコバクター・ピロリに感染している被験者の糞便のみと反応した。これにより、ヘリコバクター・ピロリに感染している被験者の糞便中には、４個のサブユニットを有するヘリコバクター・ピロリのカタラーゼが存在していることが明らかになった。糞便中に存在するヘリコバクター・ピロリのカタラーゼがサブユニットごとに解離したものではなく、４個のサブユニットを保有するものであるということは今まで全く知られておらず、このことは、通常タンパク質は消化管中でタンパク質分解酵素により分解されてしまうことに鑑みても全く驚くべきことである。
【００２７】
また、ヘリコバクター・ピロリの感染者の糞便を試料として、モノクローナル抗体３１Ａ３、及び、モノクローナル抗体８２Ａ３を固定したカラムを作製し、アフィニティークロマトグラフィーを行い、その溶出画分について、ＥＬＩＳＡとカタラーゼ活性測定を行ったところ、カタラーゼ活性と抗原性とは一致した。
【００２８】
以上のことから、ヘリコバクター・ピロリの感染者の糞便中には４個のサブユニットを有し、カタラーゼ活性も有するＮａｔｉｖｅなカタラーゼが含まれることがわかった。ヘリコバクター・ピロリのカタラーゼが消化管内で消化されずに、活性を有するＮａｔｉｖｅな酵素として排出され、糞便中に存在していたということは全く予想できないことであった。
【００２９】
モノクローナル抗体３１Ａ３及びモノクローナル抗体８２Ａ３を大量に調製する方法としては特に限定されず、例えば、あらかじめプリスタンを投与したマウスの腹腔にハイブリドーマを移植して、回収した腹水から得る方法等を挙げることができる。腹水中のモノクローナル抗体は、プロテインＡやプロテインＧカラム等を使用する公知の方法等により精製することができる。
【００３０】
本発明で用いられるハイブリドーマ３１Ａ３（ＦＥＲＭＰ−１８３２９）、ハイブリドーマ８２Ａ３（ＦＥＲＭＰ−１８３２８）、モノクローナル抗体３１Ａ３及びモノクローナル抗体８２Ａ３もまた、本発明の１つである。
【００３１】
本発明の検査方法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、ウエスタンブロット法、イムノクロマトグラフィー法等を挙げることができる。上記の各種検査方法は、競合法やサンドイッチ法等により、標識剤で標識された抗原又は抗体を用い、目的とする抗原又は抗体を測定することができるものである。
上記の各種検査方法のなかでも、ＥＬＩＳＡ法及びイムノクロマトグラフィー法が好ましい。
【００３２】
上記競合法は、例えば、検体中のヘリコバクター・ピロリのカタラーゼと、既知の量の標識されたヘリコバクター・ピロリのカタラーゼとの、モノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３に対する結合の量的な競合反応によるものである。上記で例示した競合法においては、ヘリコバクター・ピロリのカタラーゼを含む検体液に、担体上に保持された一定量の抗体を加え、更に標識剤で標識した一定量のヘリコバクター・ピロリのカタラーゼを加える。その後、担体上に保持された標識剤又は担体上に保持されなかった標識剤の活性を測定する。この際、抗体と標識された抗原の添加はほぼ同時に行うことが好ましい。
【００３３】
上記サンドイッチ法は、例えば、固相化されたモノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３と、標識剤で標識されたこれらのモノクローナル抗体とで、検体中のヘリコバクター・ピロリのカタラーゼをサンドイッチするものであり、酵素等の標識剤に対する基質等を加え発色等させることにより、検体中のヘリコバクター・ピロリのカタラーゼを検出するものである。
【００３４】
上記標識剤としては、^１２５Ｉ等の放射性同位元素（以下、ＲＩと記す）、酵素、酵素基質、発光物質、蛍光物質、ビオチン、着色物質等を挙げることができる。これら標識剤と抗原又は抗体との結合には、マレイミド法［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９７６），７９，２３３］、活性化ビオチン法［Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９７８），１００，３５８５］、疎水結合法等が用いられる。
【００３５】
上記酵素としては、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ等を挙げることができる。この際用いる基質としては、選択した酵素に適したものを選べばよく、例えば、ＡＢＴＳ、ルミノール−Ｈ_２Ｏ_２、ｏ−フェニレンジアミン−Ｈ_２Ｏ_２（ペルオキシダーゼ用）、ｐ−ニトロフェニルホスフェート、メチルウンベリフェリルホスフェート、３−（２'−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３"−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン（アルカリホスファターゼ用）、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトース、メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトース（β−ガラクトシダーゼ用）等を挙げることができる。
【００３６】
上記測定は、４〜４０℃で１分〜１８時間反応させ、生じた発色、蛍光量、発光量又は着色量を測定することにより行うことができ、他にも、４〜４０℃の範囲で加温しながら行ういわゆるレート法を採用してもよい。
【００３７】
上記抗原又は抗体への放射標識は、市販されているボルトンハンター試薬により容易に行うことができる。例えば、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液に溶かした抗原又は抗体溶液にボルトンハンター試薬を加え１〜２時間後に、Ｇ−２５の脱塩カラム等を用いて未反応のボルトンハンター試薬を除去することにより実施することができる。
この他、クロラミンＴ法やヨードジン法等を採用することにより容易に^１２５Ｉによる放射標識を行うことができる。
【００３８】
上記発光物質としては、例えば、イソルミノールやアクリジンエステル等を挙げることができ、上記蛍光物質としては、例えば、フルオレセインやローダミン等を挙げることができる。この際、標識の方法は活性化エステル法やイソシアネート法を採用することにより容易に行うことができる（「酵素免疫測定法」医学書院、１９８７年）。上記着色物質としては、例えば、着色ラテックス粒子、金コロイド等を挙げることができる。
【００３９】
本発明の検査方法として、上記競合法を実施するには、例えば、未知量のヘリコバクター・ピロリのカタラーゼを含有する検体を、公知の手段で物理的又は化学的にモノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３を結合させた固相に加えて反応させる。また、同時に標識剤で標識したヘリコバクター・ピロリのカタラーゼの一定量を加えて反応させる。
【００４０】
本発明の検査方法として、上記サンドイッチ法を実施するには、例えば、未知量のヘリコバクター・ピロリのカタラーゼを含有する検体を、公知の手段で物理的又は化学的にモノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３を結合させた固相に加えて反応させる。その後標識剤で標識したモノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３を加えて反応させる。
【００４１】
次いで、いずれの方法においても、必要な場合には固相をよく洗浄した後で、固相上に結合している標識剤の活性を測定する。上記標識剤がＲＩである場合、ウェル・カウンター又は液体シンチレーション・カウンターを用いて測定する。標識剤が酵素である場合、基質を加えて放置し、比色法又は蛍光法により酵素活性を測定する。標識剤が蛍光物質、発光物質、着色物質であっても、それぞれ公知の方法に従って測定する。
【００４２】
本発明の検査方法は、モノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３を用いるものであるので、ヘリコバクター・ピロリのカタラーゼに特異的に存在するエピトープを認識することができ、他の物質を、交差反応を原因として誤って検出してしまうことがなく、特異性が極めて高い測定を行うことができるという極めて優れた特色を有する。
【００４３】
本発明の検査方法を実施するためには、モノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３を構成成分とする検査試薬を用いることができる。このような検査試薬もまた、本発明の１つである。
上記検査試薬において用いられるモノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３としては、それらの分解物であるＦ（ａｂ′）_２、Ｆａｂ′、Ｆａｂ等であってもよい。これらは単独で用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
【００４４】
上記検査試薬では、モノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３はあらかじめ固相化されていてもよく、また、モノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３はあらかじめ上記標識剤で標識されていてもよい。
【００４５】
上記検査試薬において用いる固相としては特に限定されず、例えば、ポリスチレン等のポリマー、ガラスビーズ、磁性粒子、マイクロプレート、イムノクロマトグラフィー用濾紙、グラスフィルター等の不溶性担体を挙げることができる。
【００４６】
上記検査試薬は、消化管排泄物中に存在するヘリコバクター・ピロリのＮａｔｉｖｅなカタラーゼを、ヘリコバクター・ピロリのＮａｔｉｖｅなカタラーゼに対するモノクローナル抗体を用いて検出することにより、ヘリコバクター・ピロリへの感染を判定する検査キットの１構成品として用いられてもよい。このような検査キットもまた、本発明の１つである。
上記検査キットに含まれる他の成分としては特に限定されず、例えば、標識に用いる酵素、その基質、放射性同位元素、発光物質、蛍光物質、着色物質、緩衝液、プレート等を挙げることができ、これらとしては上述のものを用いることができる。
【００４７】
上記検査キットの形態としては特に限定されないが、迅速かつ簡便に診断を行うためには検査キットの構成成分が一体となった一体型の検査キットであることが好ましい。
上記一体型の検査キットとしては特に限定されず、例えば、カセット型、カートリッジ型等を挙げることができる。
【００４８】
上記カセット型の態様としては、例えば、イムノクロマトグラフィー法を用い、反応カセット内にメンブレンが収納されており、そのメンブレン上の一端（下流側）にはモノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３が固相化されており、メンブレン上の逆の一端（上流側）には、展開液が装着されており、その近傍の下流側には、上記標識剤の基質が添加されたパッドが配置されており、メンブレンの中間部には上記標識剤で標識されたモノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３が添加されたパッドが配置されている態様等を挙げることができる。
【００４９】
上記に例示したカセット型の態様を有する検査キットを使用する場合、上記標識剤で標識されたモノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３が添加されたパッド上に検体を添加し、検体に含まれるヘリコバクター・ピロリのカタラーゼと上記標識剤で標識されたモノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３との結合体を形成した後、上記展開液を展開させると、形成された結合体はモノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３が固相化されている箇所まで移送され、そこでヘリコバクター・ピロリのカタラーゼと上記標識剤で標識されたモノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３と固相化されたモノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３との複合体が形成される。次いで、上記標識剤と上記基質が反応し、発色等する。この発色等を感知することによって、ヘリコバクター・ピロリへの感染を判定することができる。
【００５０】
検体を充分な量の展開液で希釈してからメンブレン上に滴下する態様を採用する場合は、あらかじめメンブレン上に展開液を装着しておかなくともよい。また、上記標識剤として着色ラテックス粒子等の着色物質を用いる場合は、基質は不要であり、モノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３が固相化されている箇所で上記複合体が形成されたか否かは、着色物質による着色により判断される。
【００５１】
上記カートリッジ型の態様としては、例えば、反応が上記競合法である場合には、複数のウェルを有するカートリッジであり、（ａ）モノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３が収納されたウェル、（ｂ）上記標識剤で標識されたヘリコバクター・ピロリ等を含む液状試薬（例：バッファー溶液）が収納されたウェル、（ｃ）上記標識剤の基質を含む液状試薬（例：バッファー溶液）が収納されたウェル、が一体的に形成されてなるカートリッジ等を挙げることができ、反応がサンドイッチ法である場合には、複数のウェルを有するカートリッジであり、（ａ）モノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３が固相化された不溶性担体が収納されたウェル、（ｂ）上記標識剤で標識されたモノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３を含む液状試薬（例：バッファー溶液）が収納されたウェル、（ｃ）上記標識剤の基質を含む液状試薬（例：バッファー溶液）が収納されたウェル、が一体的に形成されてなるカートリッジ等を挙げることができる。
【００５２】
上記に例示したカートリッジ型の検査キットを使用する場合は、通常、競合法やサンドイッチ法を実施する際と同様に、反応及び測定を行うことができる。
上記検査キットは、上記競合法と上記サンドイッチ法のいずれの方法を実施するものであってもよいが、上記サンドイッチ法を実施するものであることが好ましい。上記サンドイッチ法は、感度が高く、反応時間が短くてすみ、精度に優れるという利点を有する。上記サンドイッチ法としてイムノクロマトグラフィー法を用いると、試験操作が簡便で、結果の判定も目視で容易に行うことのできるキットを作製することができる。また、ＥＬＩＳＡとして上記サンドイッチ法を用いると、測定対象物質の量に依存して酵素反応生成物が生じるので、ヘリコバクター・ピロリへの感染が陽性である場合の発色等を目視で確認できるような系の設定が容易である。
【００５３】
上記検査キットは、除菌治療前に感染の有無を調べるために用いられてもよく、除菌治療後にその成否の判定を行うために用いられてもよい。
上記検査キットは、モノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３を用いるためロット毎の差がなく、検出感度が高く、偽陰性や偽陽性の問題を生じない。
【００５４】
本発明によれば、ヘリコバクター・ピロリのＮａｔｉｖｅなカタラーゼを抗原とするモノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３を用いることによって、検体中の他の物質による影響を排除できるので、極めて高感度かつ特異的に、ヘリコバクター・ピロリの存在を検出することができる。また、ヘリコバクター・ピロリのＮａｔｉｖｅなカタラーゼに対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマが樹立されたことにより、同一のモノクローナル抗体を半永久的に製造することが可能となる。モノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３を用いた検査キットは、消化管排泄物を検体とするので、被験者に苦痛を与えることなく、簡便かつ効率よくヘリコバクター・ピロリ感染を検出することができる。また、モノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３を用いた検査キットは、１種のみのモノクローナル抗体を用いる場合であっても、極めて優れた精度を呈し、ロット毎の差がなく、安定しているので、常に特異的かつ精度良くヘリコバクター・ピロリ感染を検出することができる。また、本発明の検査キットは、測定が簡便であり、医療現場で非常に有用である。
【００５５】
【実施例】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００５６】
（実施例１）
［モノクローナル抗体の作製］
（１）ヘリコバクター・ピロリ球状菌体懸濁液（免疫原）の調製
５％馬脱繊血を添加したブレインハートインヒュージョン寒天培地（ディフコ社製）上にヘリコバクター・ピロリ（ＡＴＣＣ４３５０４）を筋状に画線した。このプレートを３７℃微好気性環境下にて３〜４日培養後、更に３７℃嫌気性環境下にて７日間インキュベートし、球状化させた。得られたコロニーを白金耳等でかきとり、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）に懸濁した。４℃にて、１００００×ｇで１０分間遠心分離したヘリコバクター・ピロリの菌体を０．５％ホルマリンに懸濁し、４℃にて４日間放置して不活化した。その後、ＰＢＳに懸濁し、４℃にて、１００００×ｇで１０分間遠心分離する操作を３回繰り返し、上記菌体を洗浄した後、ＰＢＳに懸濁した。
【００５７】
（２）ヘリコバクター・ピロリ球状菌体破砕物（免疫原）の調製
（１）で得られた菌体懸濁液を、超音波破砕機（セイコー電子工業社製、Ｍｏｄｅｌ７２５０）を用いて、ｏｕｔｐｕｔ３、５０％ｄｕｔｙｃｙｃｌｅの条件にて１０分間超音波処理して菌体を破砕した。
【００５８】
（３）免疫及び細胞融合
（１）、（２）にて調製した免疫原（ヘリコバクター・ピロリ球状菌体懸濁液又はヘリコバクター・ピロリ球状菌体破砕物）とＦｒｅｕｎｄのコンプリートアジュバント（カルビオケム社製）を当量混合し、オイルエマルジョンとした。これをＢＡＬＢ／ｃＡマウス（日本クレア社製、６週齢、雌）の背部皮下に０．２ｍＬずつ投与した。初回免疫後７日目と１４日目に追加免疫を行い、更に細胞融合３日前に上記免疫原を０．２ｍＬずつ腹腔内に投与した。最終免疫から３日目のマウス脾細胞を摘出し、骨髄腫細胞（Ｐ３ｘ６３．Ａｇ８．６５３株、ＲＣＢ０１４６、理研ジーンバンク）と１０：１の割合で混合し、５０％ポリエチレングリコール４０００を用いて融合した後、ＨＡＴ培地（ギブコ社製）によりハイブリドーマを選択培養した。
【００５９】
（４）ハイブリドーマの選択
細胞融合後１２日目に培養上清中の抗体活性をＥＬＩＳＡにより測定した。免疫原１０μｇ／ｍＬを固相化した９６穴ＥＬＩＳＡプレート（コースター社製）の各穴に融合細胞の培養上清液２００μＬを添加し、３７℃で１時間反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０入りＰＢＳ（洗浄液）で洗浄し、ぺルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ｃａｐｐｅｌ社製、１：２００００）２００μＬを添加した。３７℃で１時間反応後、上記洗浄液で洗浄した。洗浄後、基質液（０．１Ｍｏ−フェニレンジアミンと０．０１２％過酸化水素水）を各穴に２００μＬずつ添加し、室温で１５分反応させた。反応後、各穴に３．５Ｎ硫酸を５０μＬずつ添加し酵素反応を停止し、４９２ｎｍにおける吸光値を測定した。吸光値が０．１５以上を示した、上記免疫原に反応する抗体を産生するハイブリドーマクローンを選択した。各クローンを限界希釈法により２回クローニングを行った。クローニング後のハイブリドーマをＢＡＬＢ／ｃＡマウスに移植した結果、腹水として回収できるモノクローナル抗体を産生したハイブリドーマは３２クローンであった。
【００６０】
（実施例２）
［サンドイッチＥＬＩＳＡによる消化管排泄物中のヘリコバクター・ピロリを特異的に認識するモノクローナル抗体の選択］
（１）モノクローナル抗体固相化プレートの作製
３２クローンの腹水各１ｍＬをＰＢＳで２倍に希釈し、飽和硫酸アンモニウム２ｍＬを滴下して４℃で４時間放置した。その後、３０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離し、沈査をＰＢＳ２ｍＬに浮遊し透析を行った。これらのモノクローナル抗体を以下の方法により９６穴ＥＬＩＳＡプレートに固相化した。即ち、各モノクローナル抗体を５μｇ／ｍＬに希釈した後、９６穴ＥＬＩＳＡプレートの各穴に０．２ｍＬ加え、４℃で一夜放置した後、ＰＢＳで洗浄した。洗浄後、１％スキムミルク−ＰＢＳを各穴に０．２５ｍＬ加え、４℃で１時間放置してマスキングを行った。マスキング後、上記洗浄液で洗浄した。
【００６１】
（２）ビオチン標識モノクローナル抗体の作製
（１）にて調製した３２クローンのモノクローナル抗体３ｍｇとビオチニル−Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル（ザイメッド社製）１０ｍｇを混合し、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム（ｐＨ８）中、室温で、３時間攪拌しながら反応させた。反応液をＰＢＳ５Ｌに対して４℃で一夜透析し、ビオチン標識モノクローナル抗体を得た。
【００６２】
（３）消化管排泄物中のヘリコバクター・ピロリを特異的に認識するモノクローナル抗体の選択
尿素呼気試験によりヘリコバクター・ピロリ陽性者及び陰性者と判定された各１名の糞便検体２５０ｍｇを０．１％スキムミルク−ＰＢＳ０．５ｍＬに懸濁後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した上清を集め、糞便抽出液とした。糞便抽出液０．２ｍＬを（１）にて調製した各モノクローナル抗体固相化プレートの各穴に添加した。３７℃で１時間放置後、上記洗浄液にて５回洗浄し、（２）にて調製した各ビオチン標識モノクローナル抗体０．２ｍＬを添加した。３７℃で１時間放置後、上記洗浄液にて洗浄し、ぺルオキシダーゼ標識アビジン０．２ｍＬ（ザイメッド社製）を添加した。３７℃で１時間放置後、上記洗浄液にて洗浄後、基質液（０．１Ｍｏ−フェニレンジアミンと０．０１２％過酸化水素水）を各穴に０．２ｍＬずつ添加し、室温で１０分反応させた。反応後、各穴に３．５Ｎ硫酸を５０μＬずつ添加し酵素反応を停止し、４９２ｎｍにおける吸光値を測定した。結果を表１に示した。
【００６３】
【表１】

【００６４】
表１に示した通り、２種のモノクローナル抗体３１Ａ３、８２Ａ３を単独又は組合わせたサンドイッチＥＬＩＳＡは、ヘリコバクター・ピロリ感染者の糞便検体に対して高い反応性を示すことがわかった。各モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマはそれぞれ３１Ａ３（ＦＥＲＭＰ−１８３２９）、８２Ａ３（ＦＥＲＭＰ−１８３２８）として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番１号中央第６）に寄託されている。尚、各モノクローナル抗体のイムノグロブリンサブクラスをイムノグロブリンタイピングキットマウス（和光純薬工業社製）により調べた結果、３１Ａ３はＩｇＧ_２ｂ、８２Ａ３はＩｇＧ_１であった。
【００６５】
（実施例３）
［菌株による反応性の比較及び他菌種との反応性］
（１）ヘリコバクター・ピロリ菌体懸濁液の調製
５％馬脱繊血を添加したブレインハートインヒュージョン寒天培地上にヘリコバクター・ピロリ（ＡＴＣＣ４３５０４；東海大学病院臨床分離株Ｎｏ．１３０、及び、Ｎｏ．１１２）を筋状に画線した。このプレートを３７℃で３〜４日間微好気性培養して得られたらせん状菌のコロニー、又は、更に３７℃で嫌気性環境下にて７日間放置して得られた球状菌のコロニーを白金耳等でかきとり、ＰＢＳに懸濁した。４℃にて、１００００×ｇで１０分間遠心分離した菌体を０．５％ホルマリンに懸濁し、４℃にて４日間放置して不活化した。その後、ＰＢＳに懸濁し、４℃にて、１００００×ｇで１０分間遠心分離する操作を３回繰り返し、菌体を洗浄した後、再度、ＰＢＳに懸濁し、ヘリコバクター・ピロリらせん状菌体懸濁液及び球状菌体懸濁液を得た。
【００６６】
（２）ヒト腸内菌の菌体懸濁液の調製
ヒト糞便から分離される代表的な腸内菌バクテロイデス・ブルガタス、及び、エシェリヒア・コリの２菌種を以下の方法で培養し、得られたコロニーから（１）と同様の方法により各菌の菌体懸濁液を調製した。即ち、バクテロイデス・ブルガタス（ＩＦＯ１４２９１）は５％馬脱繊血を添加したＢＬ寒天培地（日水製薬社製）上で３７℃で２日間、嫌気培養した。エシェリヒア・コリ（ＡＴＣＣ２５９２２）はブレインハートインヒュージョン寒天培地上で、３７℃で１日間、好気培養した。
【００６７】
（３）他のヘリコバクター属の菌体懸濁液調製
ヘリコバクター・フェリス（ＡＴＣＣ４９１７９）、ヘリコバクター・ヘパティカス（ＡＴＣＣ５１４４８）、ヘリコバクター・ムステラエ（ＡＴＣＣ４３７７２）及びヘリコバクター・シナエディ（ＡＴＣＣ３５６８３）を５％馬脱繊血を添加したブレインハートインヒュージョン寒天培地上で（１）と同様に培養して、得られたらせん状菌のコロニーから（１）と同様にしてらせん状菌体懸濁液を得た。
【００６８】
（４）菌体破砕物の調製
（１）、（２）及び（３）で得られた各菌体懸濁液を、超音波破砕機（セイコー電子工業社製、Ｍｏｄｅｌ７２５０）を用いて、ｏｕｔｐｕｔ３、５０％ｄｕｔｙｃｙｃｌｅの条件にて１０分間超音波処理して菌体を破砕した。
【００６９】
（５）サンドイッチＥＬＩＳＡ
（４）で得られた各菌体破砕物（タンパク質濃度１０μｇ／ｍＬ）０．２ｍＬをそれぞれ、実施例２（３）の方法によりサンドイッチＥＬＩＳＡ（下表２に示したモノクローナル抗体３１Ａ３同士、８２Ａ３同士及びメリディアン社製ＨｐＳＡ）を行った。結果を表２に示した。
【００７０】
【表２】

【００７１】
表２に示した通り、モノクローナル抗体３１Ａ３、８２Ａ３は、ヘリコバクター・ピロリの各菌株のらせん状菌体、球状菌体に対して高い反応性を示すことがわかった。一方、バクテロイデス・ブルガタス、エシェリヒア・コリ、ヘリコバクター・フェリス、ヘリコバクター・ヘパティカス、ヘリコバクター・ムステラエ、及び、ヘリコバクター・シナエディに対しては全く反応しなかった。これに対して、メリディアン社製ＨｐＳＡは、ヘリコバクター・フェリス、ヘリコバクター・ヘパティカス、ヘリコバクター・ムステラエ、及び、ヘリコバクター・シナエディに対して反応性を示した。
【００７２】
【発明の効果】
本発明は、上述の構成よりなるので、被験者に苦痛を与えることなく、簡便かつ効率よく、極めて優れた精度で、安定して特異的にヘリコバクター・ピロリ感染を検出することができる。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a test method for determining infection with Helicobacter pylori.
[0002]
[Prior art]
Helicobacter pylori is a bacterium found in human gastric mucosa. The infection rate of Helicobacter pylori is closely related to the socio-economic status, and the infection rate tends to be higher in developing countries and lower in developed countries. However, the infection rate among Japanese is remarkably high in developed countries, and it is said that 80% of people are over 40 years old. In recent years, it has been clarified that Helicobacter pylori can cause various gastric and duodenal diseases such as gastric ulcer, duodenal ulcer, chronic gastritis and gastric cancer.
[0003]
It has become clear that the risk of suffering from these diseases can be reduced by eradicating Helicobacter pylori. For this reason, there has been an international discussion on the diseases to be sterilized by Helicobacter pylori. At present, gastric ulcer, duodenal ulcer, gastric malignant lymphoma, stomach after resection of early gastric cancer, etc. are recognized as diseases to be eradicated.
[0004]
With the recognition of Helicobacter pylori eradication therapy as a new treatment for stomach and duodenal diseases, clinical trial guidelines have been created by the Japanese Society of Gastroenterology, and the presence diagnosis and eradication determination method for Helicobacter pylori infection (Journal of Japanese Society of Gastroenterology, 96, 199-207, 1999). In the above clinical trial guideline, the presence diagnosis is performed by culturing, microscopic examination, and urease test of gastric biopsy tissue, which is an invasive examination method, and sterilization is determined by culture, microscopic examination and noninvasive examination of gastric biopsy tissue The method has been shown to require the urea breath test. Moreover, it has been shown that in a special case such as when the subject is a child, the determination is performed by using a combination of blood anti-Helicobacter pylori antibody test and presence diagnosis.
[0005]
However, these methods for testing for Helicobacter pylori infection have the following problems. In the invasive examination method, the subject is forced to suffer a great deal of pain by inserting a gastroscope and performing a biopsy. Non-invasive testing greatly improves the suffering of subjects, but urea breath testing requires fasting before testing. In addition, the urea breath test requires a device such as a mass spectrum or an infrared spectrophotometer, and can be performed only at a specific facility, resulting in a high cost. The antibody test is not suitable for sterilization determination because the antibody titer in blood remains high for a long time even after sterilization. Therefore, there is a demand for an inspection method that can directly and specifically detect Helicobacter pylori infection in place of these inspections.
[0006]
Conventionally, separation culture using a selective medium for infectious bacteria from gastrointestinal excrement, particularly feces, has been carried out as a direct inspection method for intestinal bacteria. However, despite many attempts on Helicobacter pylori, there have been few reports isolated from feces. The reason for this is that Helicobacter pylori is in vitro, and when the environmental conditions worsen such as low temperature, nutrient deficiency, oxygen deficiency, etc., the shape changes from normal spiral bodies to non-culturable spheroids. It can be considered that the spheroids that cannot be separated and cultured are also changed.
[0007]
On the other hand, regarding the direct detection of Helicobacter pylori from feces by an immunological method based on antigen-antibody reaction, there is a method for detecting Helicobacter pylori in fecal samples such as feces by immunoassay using a polyclonal antibody against Helicobacter pylori. (J. Clin. Microbiol., 33, 2162-2165, 1995, JP 10-10128 (Patent No. 3043999)).
[0008]
However, since polyclonal antibodies generally have cross-reactivity and are less specific and have the disadvantage that antibody titers and specificities vary from lot to lot of antisera, the production of diagnostic agents using polyclonal antibodies is essential. In particular, there is a problem that quality control is difficult. In reality, the appearance of false negatives and low specificity are problematic for the fecal Helicobacter pylori antigen detection kit “HpSA” using a polyclonal antibody manufactured by Meridian, the patent holder of Patent No. 3043999. (Medical Tribune, 4-5, June 3, 1999 issue; Am. J. Gastroenterol., 94, 1830-1833, 1999).
[0009]
In Japanese Patent Laid-Open No. 10-10128, Helicobacter pylori causes strain variation, so monoclonal antibodies that can react only with a single antigen are not suitable for detection of Helicobacter pylori. It is described that polyclonal antibodies are more suitable for detection of Helicobacter pylori in that they can correspond to antigens and epitopes.
[0010]
[Problems to be solved by the invention]
In view of the above situation, the present invention is capable of diagnosing Helicobacter pylori infection at low cost without causing pain to the subject and without requiring a special device, having no cross-reactivity, excellent specificity, and excellent sensitivity. It is an object of the present invention to provide an inspection method.
[0011]
[Means for Solving the Problems]
The present invention relates to a test method for determining Helicobacter pylori infection by detecting the native catalase of Helicobacter pylori present in digestive tract excreta using a monoclonal antibody against the native catalase of Helicobacter pylori. In this method, the monoclonal antibody is a monoclonal antibody produced by hybridoma 31A3 (FERM P-18329) and / or hybridoma 82A3 (FERMP-18328).
The present invention is described in detail below.
[0012]
Conventionally, Helicobacter pylori cells are in a state of being crushed in the lower digestive tract, and it has been thought that the protein is degraded by proteolytic enzymes in the digestive tract.
However, as a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventor has surprisingly found that the native catalase of Helicobacter pylori is present in the stool of Helicobacter pylori-infected persons. The inventor has come up with the idea that this can be an indicator for determining infection with Helicobacter pylori, and has completed the present invention.
[0013]
The test method of the present invention detects a native catalase of Helicobacter pylori present in digestive tract excreta.
Although it does not specifically limit as said digestive tract excretion, Feces are used suitably as a test substance at the point which is easy to extract | collect and there are few burdens to a test subject.
[0014]
The above-mentioned native catalase refers to a catalase having a unique structure taken under almost physiological conditions, and is a catalase having all subunits and having activity. In the invention, detection is not particularly limited as long as the epitope recognized by the monoclonal antibody produced by hybridoma 31A3 (FERM P-18329) and / or hybridoma 82A3 (FERM P-18328) is retained. it can.
[0015]
In the test method of the present invention, a monoclonal antibody against the native catalase of Helicobacter pylori is used.
The monoclonal antibody used in the present invention includes a monoclonal antibody produced by hybridoma 31A3 (FERMP-18329) (hereinafter also referred to as monoclonal antibody 31A3) and a monoclonal antibody produced by hybridoma 82A3 (FERM P-18328) (hereinafter monoclonal). Antibody 82A3), and monoclonal antibody 31A3 and monoclonal antibody 82A3 include F (ab ′) ₂ , Fab ′, Fab and the like. These may be used independently and 2 or more types may be used together.
[0016]
Hybridoma 31A3 (FERM P-18329) and hybridoma 82A3 (FERM P-18328) producing monoclonal antibodies used in the present invention were incorporated on May 10, 2001 by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) It was deposited in Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan, 1-1 1-1 Higashi 1-1-6. The production methods of the hybridoma 31A3 (FERM P-18329) and the hybridoma 82A3 (FERM P-18328) are as shown in Example 1.
[0017]
The monoclonal antibody 31A3 and the monoclonal antibody 82A3 are obtained by using a native catalase of Helicobacter pylori as an antigen.
[0018]
When the present inventors performed antibody-fixed affinity chromatography on Helicobacter pylori cell disruption using the monoclonal antibody 31A3 and the monoclonal antibody 82A3, respectively, they were included in the Helicobacter pylori cell disruption. A protein with a molecular weight of 270 kDa was detected. When this protein was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, a single band having a molecular weight of 59 kDa was detected. Further, when the amino acid sequence at the N-terminal of this protein was examined, the amino acid sequence of Helicobacter pylori catalase was found to be identical. Helicobacter pylori catalase has a molecular weight of 200 kDa and is known to have a tetramer structure in which four subunits having a molecular weight of 50 kDa are assembled (J. Gen. Microbiol. (1991), 137). 57-61).
[0019]
From the above results, the protein detected by the monoclonal antibody 31A3 and the monoclonal antibody 82A3 was identified as a Helicobacter pylori catalase having four subunits, and each of the monoclonal antibodies described above had four subunits. It was revealed that the catalase was recognized.
[0020]
The activity of catalase detected by the antibody-fixed affinity chromatography was measured, and it was found that this catalase was a so-called native enzyme.
Neither monoclonal antibody 31A3 nor monoclonal antibody 82A3 reacted with the dissociated catalase subunit.
[0021]
The proportion of catalase in the total protein in Helicobacter pylori cells is Gen. Microbiol. (1991), 137, 57-61, and estimated from the degree of increase in specific activity in the purification process of catalase, it is at most 0.5% in terms of weight.
In view of this point, it was surprising that the monoclonal antibody 31A3 and the monoclonal antibody 82A3 recognized a catalase having four subunits, which was an unexpected matter. .
[0022]
Catalase is very well conserved among different species, and it is known that Helicobacter pylori catalase is highly homologous to other bacterial catalases (J. Bacteriol. (1996), 178 (23), 6960-6967). However, monoclonal antibody 31A3 and monoclonal antibody 82A3 did not react at all with bacterial catalases other than Helicobacter pylori.
[0023]
On the other hand, although it is known that various mutants exist in Helicobacter pylori (Molecular Microbiology (1996), 20, 833-842), surprisingly, as shown in Example 3, the monoclonal antibody 31A3 The monoclonal antibody 82A3 reacted well against any Helicobacter pylori.
[0024]
Considering that the monoclonal antibody 31A3 and the monoclonal antibody 82A3 react well with various mutants of Helicobacter pylori, the epitopes recognized by these monoclonal antibodies are very well preserved between the catalases of the mutants. It seems to be a part that has been.
[0025]
As described in detail below, the monoclonal antibody 31A3 and the monoclonal antibody 82A3 can determine the presence or absence of Helicobacter pylori infection with extremely high accuracy using stool as a specimen.
[0026]
When monoclonal antibodies 31A3 and 82A3 were used for immunological measurement using stool as a specimen, each of the above monoclonal antibodies reacted only with the stool of subjects infected with Helicobacter pylori. This revealed that Helicobacter pylori catalase having four subunits was present in the stool of subjects infected with Helicobacter pylori. It has not been known so far that Helicobacter pylori catalase present in stool is not dissociated for each subunit but possesses 4 subunits, which is usually a protein Is quite surprising in view of being degraded by proteolytic enzymes in the digestive tract.
[0027]
In addition, using stool of a person infected with Helicobacter pylori as a sample, a column to which monoclonal antibody 31A3 and monoclonal antibody 82A3 were immobilized was prepared, affinity chromatography was performed, and ELISA and catalase activity measurement were performed on the eluted fraction. As a result, the catalase activity was consistent with the antigenicity.
[0028]
From the above, it was found that native catalase having four subunits and also having catalase activity was contained in the stool of an infected person with Helicobacter pylori. It was completely unpredictable that Helicobacter pylori catalase was excreted as an active native enzyme without being digested in the digestive tract and was present in feces.
[0029]
A method for preparing a large amount of the monoclonal antibody 31A3 and the monoclonal antibody 82A3 is not particularly limited, and examples thereof include a method in which a hybridoma is transplanted into the abdominal cavity of a mouse previously administered with pristane and obtained from the collected ascites. The monoclonal antibody in ascites can be purified by a known method using a protein A or protein G column.
[0030]
Hybridoma 31A3 (FERM P-18329), hybridoma 82A3 (FERM P-18328), monoclonal antibody 31A3 and monoclonal antibody 82A3 used in the present invention are also one aspect of the present invention.
[0031]
Examples of the test method of the present invention include enzyme immunoassay (EIA), solid phase enzyme immunoassay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), fluorescence immunoassay (FIA), Western blot, immunochromatography. The law etc. can be mentioned. The various inspection methods described above can measure a target antigen or antibody using an antigen or antibody labeled with a labeling agent by a competition method, a sandwich method, or the like.
Among the above various inspection methods, the ELISA method and the immunochromatography method are preferable.
[0032]
The competition method is based on, for example, quantitative competition reaction of binding of Helicobacter pylori catalase in a specimen with a known amount of labeled Helicobacter pylori catalase to monoclonal antibody 31A3 and / or monoclonal antibody 82A3. Is. In the competition method exemplified above, a certain amount of antibody held on a carrier is added to a sample solution containing Helicobacter pylori catalase, and then a certain amount of Helicobacter pylori catalase labeled with a labeling agent is added. Thereafter, the activity of the labeling agent retained on the carrier or the labeling agent not retained on the carrier is measured. At this time, it is preferable to add the antibody and the labeled antigen almost simultaneously.
[0033]
In the sandwich method, for example, the immobilized monoclonal antibody 31A3 and / or monoclonal antibody 82A3 and these monoclonal antibodies labeled with a labeling agent sandwich Helicobacter pylori catalase in a sample. By adding a substrate or the like to a labeling agent such as an enzyme to develop color, etc., Helicobacter pylori catalase in the sample is detected.
[0034]
As the labeling agent, ¹²⁵ Examples thereof include radioisotopes such as I (hereinafter referred to as RI), enzymes, enzyme substrates, luminescent substances, fluorescent substances, biotin, and colored substances. For binding between these labeling agents and antigens or antibodies, the maleimide method [J. Biochem. (1976), 79, 233], activated biotin method [J. Am. Chem. Soc. (1978), 100, 3585], a hydrophobic bonding method or the like is used.
[0035]
Examples of the enzyme include peroxidase, alkaline phosphatase, β-galactosidase, glucose oxidase and the like. As a substrate used in this case, a substrate suitable for the selected enzyme may be selected. For example, ABTS, luminol-H ₂ O ₂ O-Phenylenediamine-H ₂ O ₂ (For peroxidase), p-nitrophenyl phosphate, methylumbelliferyl phosphate, 3- (2'-spiroadamantane) -4-methoxy-4- (3 "-phosphoryloxy) phenyl-1,2-dioxetane (alkaline phosphatase) And p-nitrophenyl-β-D-galactose, methylumbelliferyl-β-D-galactose (for β-galactosidase), and the like.
[0036]
The above measurement can be performed by reacting at 4 to 40 ° C. for 1 minute to 18 hours, and measuring the resulting color development, fluorescence amount, luminescence amount, or coloring amount, and in addition, in the range of 4 to 40 ° C. You may employ | adopt what is called the rate method performed while heating.
[0037]
Radiolabeling of the antigen or antibody can be easily performed using a commercially available Bolton Hunter reagent. For example, by adding a Bolton Hunter reagent to an antigen or antibody solution dissolved in an aqueous 0.1 M sodium bicarbonate solution, and removing unreacted Bolton Hunter reagent using a G-25 desalting column etc. after 1-2 hours. Can be implemented.
In addition, it is easy to adopt chloramine T method and iododin method. ¹²⁵ Radiolabeling with I can be performed.
[0038]
Examples of the luminescent substance include isoluminol and acridine ester. Examples of the fluorescent substance include fluorescein and rhodamine. In this case, the labeling method can be easily performed by adopting an activated ester method or an isocyanate method (“Enzyme Immunoassay”, Medical School, 1987). Examples of the colored substance include colored latex particles and gold colloid.
[0039]
In order to carry out the competition method as the test method of the present invention, for example, a specimen containing an unknown amount of Helicobacter pylori catalase is obtained by using a known means physically or chemically by monoclonal antibody 31A3 and / or monoclonal antibody. It is added to the solid phase to which 82A3 is bound and reacted. Simultaneously, a certain amount of Helicobacter pylori catalase labeled with a labeling agent is added and reacted.
[0040]
In order to carry out the above-mentioned sandwich method as the test method of the present invention, for example, a specimen containing an unknown amount of Helicobacter pylori catalase is obtained by using a known means physically or chemically by monoclonal antibody 31A3 and / or monoclonal antibody. It is added to the solid phase to which 82A3 is bound and reacted. Thereafter, monoclonal antibody 31A3 and / or monoclonal antibody 82A3 labeled with a labeling agent is added and reacted.
[0041]
In any method, the solid phase is thoroughly washed if necessary, and then the activity of the labeling agent bound on the solid phase is measured. When the labeling agent is RI, measurement is performed using a well counter or a liquid scintillation counter. When the labeling agent is an enzyme, the substrate is added and allowed to stand, and the enzyme activity is measured by a colorimetric method or a fluorescence method. Even if the labeling agent is a fluorescent substance, a luminescent substance, or a colored substance, each is measured according to a known method.
[0042]
Since the test method of the present invention uses the monoclonal antibody 31A3 and / or the monoclonal antibody 82A3, it can recognize an epitope specifically present in Helicobacter pylori catalase, and cross-react with other substances. It has a very excellent feature that it can be measured with extremely high specificity without being erroneously detected as a cause.
[0043]
In order to carry out the test method of the present invention, a test reagent comprising the monoclonal antibody 31A3 and / or the monoclonal antibody 82A3 as a constituent component can be used. Such a test reagent is also one of the present invention.
Monoclonal antibody 31A3 and / or monoclonal antibody 82A3 used in the above-described test reagent include F (ab ′) which is a degradation product thereof. ₂ , Fab ′, Fab and the like. These may be used independently and 2 or more types may be used together.
[0044]
In the test reagent, the monoclonal antibody 31A3 and / or the monoclonal antibody 82A3 may be immobilized in advance, and the monoclonal antibody 31A3 and / or the monoclonal antibody 82A3 may be previously labeled with the labeling agent.
[0045]
The solid phase used in the test reagent is not particularly limited, and examples thereof include insoluble carriers such as polymers such as polystyrene, glass beads, magnetic particles, microplates, filter paper for immunochromatography, and glass filters.
[0046]
The above test reagent is a test for determining Helicobacter pylori infection by detecting Helicobacter pylori native catalase present in digestive tract excreta using a monoclonal antibody against Helicobacter pylori native catalase. It may be used as one component of a kit. Such a test kit is also one of the present invention.
Other components included in the test kit are not particularly limited, and examples include enzymes used for labeling, substrates thereof, radioisotopes, luminescent substances, fluorescent substances, colored substances, buffers, plates, and the like. As these, those described above can be used.
[0047]
Although it does not specifically limit as a form of the said test kit, In order to diagnose quickly and easily, it is preferable that it is an integrated test kit with which the component of the test kit was integrated.
The integrated inspection kit is not particularly limited, and examples thereof include a cassette type and a cartridge type.
[0048]
As an example of the cassette type, for example, an immunochromatography method is used, a membrane is accommodated in the reaction cassette, and the monoclonal antibody 31A3 and / or the monoclonal antibody 82A3 is a solid phase at one end (downstream side) on the membrane. The developing solution is attached to the opposite end (upstream side) on the membrane, and a pad to which the labeling agent substrate is added is arranged on the downstream side in the vicinity thereof, An embodiment in which a pad to which the monoclonal antibody 31A3 and / or the monoclonal antibody 82A3 labeled with the labeling agent is added is arranged in the middle part of the membrane.
[0049]
When using the test kit having the cassette type embodiment exemplified above, the specimen is added onto the pad to which the monoclonal antibody 31A3 and / or the monoclonal antibody 82A3 labeled with the labeling agent is added, and the Helicobacter contained in the specimen -After forming a conjugate of H. pylori catalase with the monoclonal antibody 31A3 and / or monoclonal antibody 82A3 labeled with the above-mentioned labeling agent, when the developing solution is developed, the formed conjugate is converted into the monoclonal antibody 31A3 and / or The monoclonal antibody 82A3 is transported to the position where the solid phase is immobilized, where the monoclonal antibody 31A3 and / or the monoclonal antibody 82A3 labeled with the Helicobacter pylori catalase and the labeling agent and / or the monoclonal antibody 31A3 and / or the solid phase immobilized Monoku Complex with Naru antibody 82A3 is formed. Next, the labeling agent and the substrate react to develop color. By detecting this color development or the like, infection with Helicobacter pylori can be determined.
[0050]
When adopting a mode in which the specimen is diluted with a sufficient amount of developing solution and then dropped on the membrane, the developing solution need not be mounted on the membrane in advance. Further, when a colored substance such as colored latex particles is used as the labeling agent, no substrate is required, and whether or not the complex is formed at the position where the monoclonal antibody 31A3 and / or the monoclonal antibody 82A3 is solid-phased. This is determined by coloring with a coloring substance.
[0051]
As an example of the cartridge type, for example, when the reaction is the competitive method, the cartridge has a plurality of wells, (a) a well in which the monoclonal antibody 31A3 and / or the monoclonal antibody 82A3 is accommodated, (b ) Well containing a liquid reagent (eg, buffer solution) containing Helicobacter pylori or the like labeled with the above labeling agent; (c) Liquid reagent containing a substrate of the above labeling agent (eg, buffer solution) In the case where the reaction is a sandwich method, the cartridge has a plurality of wells, and (a) the monoclonal antibody 31A3 and / or the monoclonal antibody 82A3 A well containing a solid-phase insoluble carrier; (b) mono labeled with the labeling agent; A well containing a liquid reagent (eg, buffer solution) containing the local antibody 31A3 and / or the monoclonal antibody 82A3, and (c) a well containing a liquid reagent containing the substrate of the labeling agent (eg, buffer solution). The cartridge etc. which are integrally formed can be mentioned.
[0052]
When using the cartridge-type test kit exemplified above, the reaction and measurement can usually be performed in the same manner as in the competition method or the sandwich method.
The test kit may be any one of the competition method and the sandwich method, but preferably the sandwich method. The sandwich method has the advantages of high sensitivity, short reaction time, and excellent accuracy. When an immunochromatography method is used as the sandwich method, it is possible to prepare a kit that can be easily tested and the results can be easily judged visually. In addition, when the above sandwich method is used as an ELISA, an enzyme reaction product is generated depending on the amount of the substance to be measured. Therefore, a system that allows visual confirmation of color development or the like in the case of positive infection with Helicobacter pylori Is easy to set.
[0053]
The test kit may be used for examining the presence or absence of infection before sterilization treatment, and may be used for determining success or failure after sterilization treatment.
Since the test kit uses the monoclonal antibody 31A3 and / or the monoclonal antibody 82A3, there is no difference between lots, the detection sensitivity is high, and the problem of false negative or false positive does not occur.
[0054]
According to the present invention, by using the monoclonal antibody 31A3 and / or the monoclonal antibody 82A3, which uses the native catalase of Helicobacter pylori as an antigen, the influence of other substances in the specimen can be eliminated, so that it is extremely sensitive and specific. In addition, the presence of Helicobacter pylori can be detected. In addition, the establishment of a monoclonal antibody-producing hybridoma against Helicobacter pylori native catalase makes it possible to produce the same monoclonal antibody semipermanently. Since the test kit using the monoclonal antibody 31A3 and / or the monoclonal antibody 82A3 uses the digestive tract excrement as a sample, Helicobacter pylori infection can be detected easily and efficiently without causing pain to the subject. Moreover, the test kit using the monoclonal antibody 31A3 and / or the monoclonal antibody 82A3 exhibits extremely excellent accuracy even when only one type of monoclonal antibody is used, and is stable with no difference between lots. Therefore, Helicobacter pylori infection can always be detected specifically and accurately. Moreover, the test kit of the present invention is easy to measure and is very useful in the medical field.
[0055]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
[0056]
Example 1
[Production of monoclonal antibodies]
(1) Preparation of Helicobacter pylori spheroid suspension (immunogen)
Helicobacter pylori (ATCC 43504) was streaked on a brain heart infusion agar medium (Difco) supplemented with 5% equine defibrinated blood. The plate was cultured for 3 to 4 days in a 37 ° C. microaerobic environment, and further incubated in a 37 ° C. anaerobic environment for 7 days to spheroidize. The obtained colonies were scraped with a platinum loop or the like and suspended in phosphate buffered saline (PBS). Helicobacter pylori cells centrifuged at 10,000 × g for 10 minutes at 4 ° C. were suspended in 0.5% formalin and left to inactivate at 4 ° C. for 4 days. Thereafter, the operation of suspending in PBS and centrifuging at 10,000 × g for 10 minutes at 4 ° C. was repeated three times to wash the cells, and then suspended in PBS.
[0057]
(2) Preparation of Helicobacter pylori spheroids (immunogen)
The bacterial cell suspension obtained in (1) was sonicated for 10 minutes under the conditions of output 3, 50% duty cycle using an ultrasonic crusher (Model 7250, manufactured by Seiko Denshi Kogyo Co., Ltd.). The cells were crushed.
[0058]
(3) Immunization and cell fusion
The immunogen (Helicobacter pylori spheroid suspension or Helicobacter pylori spheroid disruption) prepared in (1) and (2) and Freund's complete adjuvant (manufactured by Calbiochem) are mixed in an equivalent amount and an oil emulsion It was. 0.2 mL of this was administered subcutaneously to the back of BALB / cA mice (CLEA Japan, 6 weeks old, female). On the 7th and 14th days after the first immunization, booster immunization was performed, and 0.2 mL of the above immunogen was intraperitoneally administered 3 days before cell fusion. The mouse spleen cells on day 3 from the final immunization were removed, mixed with myeloma cells (P3x63.Ag8.653 strain, RCB0146, RIKEN Genebank) at a ratio of 10: 1, and fused using 50% polyethylene glycol 4000. After that, the hybridoma was selectively cultured in a HAT medium (Gibco).
[0059]
(4) Selection of hybridoma
On the 12th day after cell fusion, the antibody activity in the culture supernatant was measured by ELISA. 200 μL of the culture supernatant of the fused cells was added to each well of a 96-well ELISA plate (manufactured by Coaster) on which 10 μg / mL of the immunogen had been immobilized. After reacting at 37 ° C. for 1 hour, PBS containing 0.05% Tween 20 was added. After washing with (washing solution), 200 μL of peroxidase-labeled anti-mouse IgG (Cappel, 1: 20000) was added. After reacting at 37 ° C. for 1 hour, it was washed with the above washing solution. After washing, 200 μL of a substrate solution (0.1M o-phenylenediamine and 0.012% hydrogen peroxide solution) was added to each well and allowed to react at room temperature for 15 minutes. After the reaction, 50 μL of 3.5N sulfuric acid was added to each well to stop the enzyme reaction, and the absorbance value at 492 nm was measured. A hybridoma clone producing an antibody that reacts with the immunogen and showed an absorbance value of 0.15 or more was selected. Each clone was cloned twice by the limiting dilution method. As a result of transplanting the cloned hybridomas into BALB / cA mice, 32 hybridomas produced monoclonal antibodies that could be recovered as ascites.
[0060]
(Example 2)
[Selection of monoclonal antibody specifically recognizing Helicobacter pylori in digestive tract excretion by sandwich ELISA]
(1) Preparation of monoclonal antibody solid phase plate
1 mL of ascites of 32 clones was diluted 2 times with PBS, 2 mL of saturated ammonium sulfate was added dropwise and left at 4 ° C. for 4 hours. Thereafter, the mixture was centrifuged at 3000 rpm for 20 minutes, and the precipitate was suspended in 2 mL of PBS and dialyzed. These monoclonal antibodies were immobilized on a 96-well ELISA plate by the following method. That is, after each monoclonal antibody was diluted to 5 μg / mL, 0.2 mL was added to each well of a 96-well ELISA plate, left at 4 ° C. overnight, and then washed with PBS. After washing, 0.25 mL of 1% skim milk-PBS was added to each hole and allowed to stand at 4 ° C. for 1 hour for masking. After masking, it was washed with the above washing solution.
[0061]
(2) Preparation of biotin-labeled monoclonal antibody
3 mg of the 32-clonal monoclonal antibody prepared in (1) and 10 mg of biotinyl-N-hydroxysuccinimide ester (Zaimed) were mixed and stirred in 0.1 M sodium bicarbonate (pH 8) at room temperature for 3 hours. While reacting. The reaction solution was dialyzed overnight at 4 ° C. against 5 L of PBS to obtain a biotin-labeled monoclonal antibody.
[0062]
(3) Selection of monoclonal antibodies that specifically recognize Helicobacter pylori in gut excrement
Suspensions of 250 mg of stool specimens of each one determined to be Helicobacter pylori positive and negative by urea breath test were suspended in 0.5 mL of 0.1% skim milk-PBS, and then centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes to collect the supernatant A fecal extract was obtained. 0.2 mL of fecal extract was added to each hole of each monoclonal antibody solid-phased plate prepared in (1). After standing at 37 ° C. for 1 hour, the plate was washed 5 times with the above washing solution, and 0.2 mL of each biotin-labeled monoclonal antibody prepared in (2) was added. After standing at 37 ° C. for 1 hour, the plate was washed with the above washing solution, and 0.2 mL of peroxidase-labeled avidin (Zaimed) was added. After standing at 37 ° C. for 1 hour, after washing with the above washing solution, 0.2 mL of a substrate solution (0.1 M o-phenylenediamine and 0.012% hydrogen peroxide solution) is added to each hole and allowed to stand at room temperature for 10 minutes. Reacted. After the reaction, 50 μL of 3.5N sulfuric acid was added to each well to stop the enzyme reaction, and the absorbance value at 492 nm was measured. The results are shown in Table 1.
[0063]
[Table 1]

[0064]
As shown in Table 1, it was found that the sandwich ELISA in which two kinds of monoclonal antibodies 31A3 and 82A3 were used alone or in combination showed high reactivity with a stool specimen of a Helicobacter pylori infected person. The hybridomas producing the respective monoclonal antibodies are 31A3 (FERM P-18329) and 82A3 (FERM P-18328), respectively. National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center (1-1 1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan) Deposited in the center 6). In addition, as a result of examining the immunoglobulin subclass of each monoclonal antibody with an immunoglobulin typing kit mouse (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 31A3 is IgG _2b , 82A3 is IgG ₁ Met.
[0065]
(Example 3)
[Comparison of reactivity by strain and reactivity with other bacterial species]
(1) Preparation of Helicobacter pylori cell suspension
Helicobacter pylori (ATCC 43504; Tokai University Hospital clinical isolates No. 130 and No. 112) was streaked on a brain heart infusion agar medium supplemented with 5% equine defibrinated blood. A colony of spiral fungus obtained by microaerobic culture of this plate at 37 ° C. for 3 to 4 days, or a colony of cocci obtained by leaving the plate in an anaerobic environment at 37 ° C. for 7 days. It was scraped with a platinum loop or the like and suspended in PBS. The bacterial cells centrifuged at 10000 × g for 10 minutes at 4 ° C. were suspended in 0.5% formalin and left standing at 4 ° C. for 4 days to inactivate them. Thereafter, the procedure of suspending in PBS and centrifuging at 10000 × g for 10 minutes at 4 ° C. is repeated three times. After washing the cells, the cells are again suspended in PBS and suspended in Helicobacter pylori spiral cells. A liquid and a spherical cell suspension were obtained.
[0066]
(2) Preparation of cell suspension of human intestinal bacteria
Two bacterial species of typical intestinal bacteria Bacteroides bulgatus and Escherichia coli isolated from human feces are cultured by the following method, and the fungus of each bacterium is obtained from the obtained colony by the same method as (1). A body suspension was prepared. That is, Bacteroides bulgatus (IFO14291) was anaerobically cultured at 37 ° C. for 2 days on a BL agar medium (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) supplemented with 5% equine defibrinated blood. Escherichia coli (ATCC 25922) was aerobically cultured at 37 ° C. for 1 day on a brain heart infusion agar medium.
[0067]
(3) Preparation of cell suspensions of other Helicobacter species
Helicobacter ferris (ATCC 49179), Helicobacter hepaticas (ATCC 51448), Helicobacter mustellae (ATCC 43972) and Helicobacter sinaedi (ATCC 35683) on brain heart infusion agar medium supplemented with 5% horse defibrillated blood as in (1) In the same manner as in (1), a helical cell suspension was obtained from the resulting spiral colony.
[0068]
(4) Preparation of crushed cells
Each bacterial cell suspension obtained in (1), (2) and (3) was subjected to conditions of output 3, 50% duty cycle using an ultrasonic crusher (Model 7250, manufactured by Seiko Denshi Kogyo Co., Ltd.). The cells were sonicated for 10 minutes to disrupt the cells.
[0069]
(5) Sandwich ELISA
Sandwich ELISA (monoclonal antibodies 31A3 and 82A3 shown in Table 2 below) were obtained by using the method of Example 2 (3), respectively, for 0.2 mL of each microbial cell disruption product (protein concentration 10 μg / mL) obtained in (4). And HpSA manufactured by Meridian Co.). The results are shown in Table 2.
[0070]
[Table 2]

[0071]
As shown in Table 2, it was found that the monoclonal antibodies 31A3 and 82A3 showed high reactivity against the helical cells and the spherical cells of each strain of Helicobacter pylori. On the other hand, it did not react at all to Bacteroides bulgatas, Escherichia coli, Helicobacter ferris, Helicobacter hepaticas, Helicobacter mustellae, and Helicobacter sinaedi. In contrast, HpSA manufactured by Meridian Co. showed reactivity to Helicobacter ferris, Helicobacter hepaticas, Helicobacter mustellae, and Helicobacter sinaedi.
[0072]
【The invention's effect】
Since the present invention is configured as described above, Helicobacter pylori infection can be detected stably and specifically, easily and efficiently, with extremely high accuracy, without causing pain to the subject.

Claims

A test method for determining infection with Helicobacter pylori by detecting the native catalase of Helicobacter pylori present in digestive tract excretion using a monoclonal antibody against the native catalase of Helicobacter pylori,
The test method, wherein the monoclonal antibody is a monoclonal antibody produced by hybridoma 31A3 (FERM P-18329) and / or hybridoma 82A3 (FERM P-18328).

A test reagent for determining infection with Helicobacter pylori by detecting native catalase of Helicobacter pylori present in gastrointestinal excretion,
A test reagent comprising a monoclonal antibody produced by hybridoma 31A3 (FERM P-18329) and / or hybridoma 82A3 (FERM P-18328) as a constituent component.

Cassette type that determines the infection of Helicobacter pylori by immunochromatography by detecting the native catalase of Helicobacter pylori present in gastrointestinal excretion using a monoclonal antibody against the native catalase of Helicobacter pylori An inspection kit,
The monoclonal antibody is a monoclonal antibody produced by hybridoma 31A3 (FERM P-18329) and / or hybridoma 82A3 (FERM P-18328),
A membrane is housed in the cassette, the monoclonal antibody is immobilized on one end of the membrane, a developing solution is attached to the opposite end of the membrane, and a labeling agent substrate is located downstream of the membrane. A cassette type inspection kit, wherein a pad to which a monoclonal antibody labeled with the above-mentioned labeling agent is added is disposed in the middle part of the membrane.

Cartridge-type test for determining Helicobacter pylori native catalase present in gastrointestinal excreta using a monoclonal antibody against Helicobacter pylori native catalase to detect infection with Helicobacter pylori A kit,
The monoclonal antibody is a monoclonal antibody produced by hybridoma 31A3 (FERM P-18329) and / or hybridoma 82A3 (FERM P-18328),
(A) the monoclonal wells antibody is housed, (b) mark-well liquid reagent is housed, including a labeled Helicobacter pylori in識剤, and (c) a liquid reagent housing containing a substrate of the labeling agent A cartridge type inspection kit comprising a cartridge formed integrally with a well formed therein.

Cartridge-type test to determine Helicobacter pylori native catalase present in gastrointestinal excretion using a monoclonal antibody against Helicobacter pylori native catalase to detect infection with Helicobacter pylori A kit,
The monoclonal antibody is a monoclonal antibody produced by hybridoma 31A3 (FERM P-18329) and / or hybridoma 82A3 (FERM P-18328),
(A) wells that insoluble carrier wherein the monoclonal antibody is immobilized is housed, (b) mark-well liquid reagent is housed comprising a labeled monoclonal antibody in識剤, and (c) of the labeling agent A cartridge type inspection kit comprising a cartridge in which a well containing a liquid reagent containing a substrate is integrally formed.

A hybridoma producing a monoclonal antibody against the native catalase of Helicobacter pylori,
A hybridoma characterized by being a hybridoma 31A3 (FERM P-18329).

A hybridoma producing a monoclonal antibody against the native catalase of Helicobacter pylori,
A hybridoma characterized by being a hybridoma 82A3 (FERM P-18328).

A monoclonal antibody against the native catalase of Helicobacter pylori,
A monoclonal antibody produced by hybridoma 31A3 (FERM P-18329).

A monoclonal antibody against the native catalase of Helicobacter pylori,
A monoclonal antibody produced by the hybridoma 82A3 (FERM P-18328).