JP4054681B2

JP4054681B2 - Antibodies that recognize Helicobacter pylori, and methods for detecting Helicobacter pylori

Info

Publication number: JP4054681B2
Application number: JP2002566338A
Authority: JP
Inventors: 正男曽我; 康雄中臣; 文夫権平; 純一杉山; 憲一天野
Original assignee: Denka Seiken Co Ltd
Current assignee: Denka Seiken Co Ltd
Priority date: 2001-02-21
Filing date: 2002-02-21
Publication date: 2008-02-27
Anticipated expiration: 2022-02-21
Also published as: WO2002066631A1; JPWO2002066631A1

Description

技術分野
本発明は、ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳ（リポ多糖）のコアオリゴ糖部分を認識するモノクローナル抗体および該抗体を産生するハイブリドーマ、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリの菌株が共通して有するＬＰＳ抗原（ヘリコバクター・ピロリ菌種特異的ＬＰＳ）、すなわちヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳのＯ抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分であって、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリが共通して有するＬＰＳ抗原部分を特異的に認識するモノクローナル抗体（抗ヘリコバクター・ピロリ菌種特異的モノクローナル抗体）および該抗体を産生するハイブリドーマ、ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳのＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分であって、一部のＳ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体および該抗体を産生するハイブリドーマ、ならびに低抗原性ヘリコバクター・ピロリの低抗原性ＬＰＳ（ＬＰＳに存在する低抗原性エピトープ）を認識するモノクローナル抗体および該抗体を産生するハイブリドーマに関する。さらに本発明は、これらの抗体の１種または数種を含むヘリコバクター・ピロリの検出試薬およびキットならびにこれらの抗体の１種または数種を用いたヘリコバクター・ピロリの検出方法及びそのキットに関する。この試薬、キットおよび方法は胃疾患等の診断に有効に利用されるものである。
背景技術
近年の研究の結果、ヘリコバクター・ピロリが胃潰瘍、十二指腸潰瘍、慢性胃炎の主な原因であることが明らかになりつつある。また、ヘリコバクター・ピロリと胃がんの関連性も注目されている。
ヘリコバクター属を構成する菌種は多く知られており、胃生検材料から分離された細菌がヘリコバクター・ピロリであるかを確認（鑑別）し、ヘリコバクター・ピロリを特異的に検出する必要がある。
そのためには顕微鏡による形態学的観察に加え、ウレアーゼ、カタラーゼ、オキシダーゼ等の酵素が陽性であること、ナリジクス酸耐性、セファロチン感受性であることの確認など多くの試験を行う必要がある。これらの試験を行うためには多くの時間と労力を必要とすることから、簡便にヘリコバクター・ピロリを検出する試薬の開発が望まれていた。
また、多くのヘリコバクター・ピロリ感染患者がヘリコバクター・ピロリの表面抗原であるＬＰＳに対する抗体を有していること、すなわちＬＰＳにヘリコバクター・ピロリの主要なエピトープがあることが知られていた。
しかし、従来ヘリコバクター・ピロリに対する抗体としてＬＰＳのルイス抗原部分に対する抗体が得られていたが、これらはルイス抗原の各型に特異的であった。従って、ヘリコバクター・ピロリを菌株に関係なく広く検出するためにはルイス抗原の各型（Ｌｅ^ｘ、Ｌｅ^ｙ、Ｌｅ^ａ、Ｌｅ^ｂ、Ｌｅ^ｄ）に対する複数の抗体が必要とされた。
そこで、ヘリコバクター・ピロリの菌株に関係なくより少ない種類の抗体でヘリコバクター・ピロリを確実に検出する方法の開発、および該方法に用いる抗体の開発が望まれていた。
また、最近、ヘリコバクター・ピロリのリポ多糖（ＬＰＳ）と患者抗体との関係で、ヘリコバクター・ピロリはヒトに対して抗体価の上昇する多糖をもつ株（高抗原性ヘリコバクター・ピロリ株）と、上昇しない多糖をもつ株（低抗原性ヘリコバクター・ピロリ株）に分類され、それぞれ高抗原性ＬＰＳ、低抗原性ＬＰＳを有すること、低抗原性のヘリコバクターは癌患者由来の菌株に多いことが報告されている（横田伸一ら、：ヘリコバクター・ピロリのリポ多糖のヒトにおける抗原性、エンドトキシン研究１〜基礎と臨床〜、近藤元治ほか編、ｐ．１１３〜１２１、菜根出版、東京、１９９８）。
またそれを利用した試薬が、特許（公開番号：特開平１０−２１８９００号公報）として公開されている。これによると、胃癌患者由来のヘリコバクター・ピロリの菌株のＬＰＳでは欠失しているが、慢性胃炎患者、胃潰瘍患者または十二指腸潰瘍患者由来のヘリコバクターの菌株には存在する、ヒトに対する抗原決定基を認識する抗体を用いて、悪性度を検定するものである。すなわち、本血清に反応しないヘリコバクターは悪性度が高いとするものである。
しかし、この方法は分離されたヘリコバクター・ピロリ菌株から熱フェノール抽出法又はラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）存在下でプロテイナーゼＫ処理を行ってＬＰＳを調製しなければならない。さらに、調製したＬＰＳをポリアクリルアミド電気泳動に供するか、又は酵素免疫測定法（ＥＩＡ）に供するためにマイクロプレートに固相しなければならない。さらにこれらの調製ＬＰＳに抗体を反応させ、陰性であれば悪性度が高いと判定するものである。これらの試験には多くの時間と労力を必要とすると共に陽性ではなく陰性を重要視している。これらのことから、逆に低抗原性の菌株に特異的な抗原、すなわち低抗原性ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳ（低抗原性ＬＰＳ）に特異的に存在する低抗原性エピトープを認識する抗体を用いる簡便な試薬の開発が望まれていた。
発明の開示
本発明は、ヘリコバクター・ピロリを特異的に、簡便に、短時間に検出するためのモノクローナル抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ、ヘリコバクター・ピロリを特異的に、簡便に、短時間に検出する方法、ヘリコバクター・ピロリを特異的に、簡便に、短時間に検出するためのキットを提供することを目的とする。
具体的には、ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳのコアオリゴ糖部分を認識するモノクローナル抗体および該抗体を産生するハイブリドーマ、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリの菌株が共通して有するＬＰＳ抗原（ヘリコバクター・ピロリ菌種特異的ＬＰＳ）、すなわちヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳのＯ抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分であって、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリが共通して有するＬＰＳ抗原部分を特異的に認識するモノクローナル抗体（抗ヘリコバクター・ピロリ菌種特異的モノクローナル抗体）および該抗体を産生するハイブリドーマ、ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳのＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分であって、一部のＳ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体および該抗体を産生するハイブリドーマ、ならびにヘリコバクター・ピロリの低抗原性ＬＰＳを認識するモノクローナル抗体および該抗体を産生するハイブリドーマに関する。さらに本発明は、これらの抗体の１種または数種を含むヘリコバクター・ピロリの検出試薬ならびにこれらの抗体の１種または数種を用いたヘリコバクター・ピロリの検出方法及びその検出キットの提供を目的とする。
本発明者らは、ヘリコバクター・ピロリの血清学的分類の検討（特許公開２０００−２６２２９１号公報）を進める中で、ヘリコバクター・ピロリ２２０−Ｂ株を抗原として免疫化したマウスの脾臓細胞を骨髄腫細胞（ミエローマ）株と融合させて多数のハイブリドーマを作製した。その中から多くのヘリコバクター・ピロリに反応するモノクローナル抗体を該ヘリコバクター・ピロリから抽出した内毒素（ＬＰＳ）を抗原としてスクリーニングした結果、ヘリコバクター・ピロリ菌株と広く反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができた。ヘリコバクター・ピロリには図１に示すように、Ｏ−抗原多糖を有するスムース型（Ｓ型）ＬＰＳを有するスムース（Ｓ）型と称する正常型菌株とＯ−抗原多糖を有しないラフ型（Ｒ型）ＬＰＳを有するラフ型（Ｒ型）菌株が存在していることが知られていた。ほとんどのヘリコバクター・ピロリ菌株は、スムース型であり、Ｏ−抗原多糖は、末端の抗ルイス抗体と反応するルイス血液型抗原と共通する抗原部分と繰り返し部分で構成される。ほとんどのヘリコバクター・ピロリ菌株は、スムース型であるので、スムース型のヘリコバクター・ピロリは正常なヘリコバクター・ピロリであるということができる。従って、正常なヘリコバクター・ピロリの集団を対象とした場合、本発明のヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳのＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分であって、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリが共通して有するＬＰＳ抗原部分を特異的に認識するモノクローナル抗体は、ヘリコバクター・ピロリ菌株が共通して有するＬＰＳ抗原を認識するモノクローナル抗体であり、また、ヘリコバクター・ピロリ菌株のＬＰＳ抗原上のＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた部分であって、ヘリコバクター・ピロリ菌株が共通して有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体である。
本発明者らは、ヒト抗ヘリコバクター・ピロリ血清中のルイス抗原に対する抗体価は高くなく、ヒト血清中の抗体はＯ−抗原多糖のルイス抗原とは異なったエピトープを認識していることを確認した。そこで、このエピトープに対するモノクローナル抗体の作製を行ったところ、ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳのコアオリゴ糖部分を認識するモノクローナル抗体、ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳ上のＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原部分を除いた部分であって、スムース型のヘリコバクター・ピロリ菌株が共通して有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体、およびヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳのＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分であって、一部のＳ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体、ならびにこれらのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得た。モノクローナル抗体の反応性の検討の結果、該ＬＰＳのコアオリゴ糖部分を認識するモノクローナル抗体とヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳのＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分であって、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が共通して有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体とを組み合せて使用することによりほぼ総てのヘリコバクター・ピロリ菌株を検出できることを見出し、また該２種類の抗体の組み合わせにさらにヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳのＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分であって、一部のＳ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体を組み合わせて使用することにより総てのヘリコバクター・ピロリ菌株を検出することができることを見出し本発明を完成するに至った。
また、本発明者らは、胃癌患者由来のヘリコバクター・ピロリ菌株であって、慢性胃炎、胃潰瘍および十二指腸患者の血清とは反応しない低抗原性ＬＰＳを有する低抗原性ヘリコバクター・ピロリ菌株を抗原として、マウスを免疫し、マウス脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞（ミエローマ）とを融合し、得られたハイブリドーマから低抗原性ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳ、すなわち低抗原性ＬＰＳを特異的に認識するモノクローナル抗体を得ることに成功し、本発明を完成するに至った。
本発明者らは、低抗原性ＬＰＳを認識するモノクローナル抗体が胃癌患者由来のヘリコバクター・ピロリのＬＰＳのＯ−抗原多糖部分に多く存在するが、慢性胃炎患者、胃潰瘍患者および十二指腸潰瘍患者由来のヘリコバクター・ピロリのＬＰＳには存在しないＬＰＳ部分の低抗原性エピトープを認識することを見出した。
本発明者等は、さらに、上述のモノクローナル抗体を組み合わせることにより総てのヘリコバクター・ピロリを検出し得、さらに胃癌患者由来のヘリコバクター・ピロリ菌株を検出し得る試薬、キットおよび方法を見出したのである。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳのコアオリゴ糖部分を認識するモノクローナル抗体、
（２）６株のヘリコバクター・ピロリ菌株、２６６９５、ＣＡ９、ＣＡ６、ＣＡ４、ＣＡ２およびＧＵ２のうち、２６６９５、ＣＡ９、ＣＡ６およびＣＡ４菌株の表面ＬＰＳを認識する（１）のモノクローナル抗体、
（３）ハイブリドーマ株ＨＰＣＡ／Ｄ４２−３（受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７８９４で、２００１年８月１５日付（原寄託）で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されている（２００２年２月１４日付で原寄託よりブタペスト条約に基づく寄託への移管請求受領））の産生する（１）または（２）のモノクローナル抗体、
（４）Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２またはＦｖ断片である（１）〜（３）のいずれかのモノクローナル抗体、
（５）ハイブリドーマ株ＨＰＣＡ／Ｄ４２−３（受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７８９４）である、ハイブリドーマ、
（６）ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳのＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分であって、一部のＳ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体、
（７）６株のヘリコバクター・ピロリ菌株、２６６９５、ＣＡ９、ＣＡ６、ＣＡ４、ＣＡ２およびＧＵ２のうち、ＣＡ６、ＣＡ４、ＣＡ２およびＧＵ２菌株の表面ＬＰＳを認識する（６）のモノクローナル抗体、
（８）ハイブリドーマ株ＨＰ２２０／Ｂ２５−３（受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７８９３で、２００１年８月１５日付（原寄託）で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されている（２００２年２月１４日付で原寄託よりブタペスト条約に基づく寄託への移管請求受領））の産生する（６）または（７）のモノクローナル抗体、
（９）Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２またはＦｖ断片である（６）〜（８）のいずれかのモノクローナル抗体。
（１０）ハイブリドーマ株ＨＰ２２０／Ｂ２５−３（受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７８９３）であるハイブリドーマ、
（１１）ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳのＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分であって、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が共通して有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体、
（１２）６株のヘリコバクター・ピロリ菌株、２６６９５、ＣＡ９、ＣＡ６、ＣＡ４、ＣＡ２およびＧＵ２のうち、２６６９５、ＣＡ９、ＣＡ６、ＣＡ４、ＣＡ２およびＧＵ２の総ての菌株の表面ＬＰＳを認識する（１１）のモノクローナル抗体、
（１３）ハイブリドーマ株ＨＰ２２０／２Ｄ１０−２（受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７８９１で、２００１年２月１９日付（原寄託）で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されている（２００２年２月１４日付で原寄託よりブタペスト条約に基づく寄託への移管請求受領））の産生する（１１）または（１２）のモノクローナル抗体、
（１４）Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２またはＦｖ断片である（１１）〜（１３）のいずれかのモノクローナル抗体、
（１５）ハイブリドーマ株ＨＰ２２０／２Ｄ１０−２（受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７８９１）であるハイブリドーマ、
（１６）ヘリコバクター・ピロリ菌株の低抗原性ＬＰＳを認識するモノクローナル抗体、
（１７）胃癌患者由来のヘリコバクター・ピロリ菌株に多く存在し、慢性胃炎、胃潰瘍および十二指腸潰瘍患者の血清とは反応しない低抗原性ＬＰＳを認識する、（１６）のモノクローナル抗体、
（１８）６株のヘリコバクター・ピロリ菌株、２６６９５、ＣＡ９、ＣＡ６、ＣＡ４、ＣＡ２およびＧＵ２のうち、ＣＡ６、ＣＡ４およびＣＡ２菌株の表面ＬＰＳを認識する（１６）または（１７）のモノクローナル抗体、
（１９）ハイブリドーマ株ＨＰ２１７／Ｂ１５−４（受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７８９２で、２００１年２月１９日付（原寄託）で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されている（２００２年２月１４日付で原寄託よりブタペスト条約に基づく寄託への移管請求受領））の産生する（１６）〜（１８）のいずれかのモノクローナル抗体、
（２０）Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２またはＦｖ断片である（１６）〜（１９）のいずれかのモノクローナル抗体、
（２１）ハイブリドーマ株ＨＰ２１７／Ｂ１５−４（受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７８９２）であるハイブリドーマ、
（２２）（１）〜（４）のいずれかのモノクローナル抗体および（１１）〜（１４）のいずれかのモノクローナル抗体を用いてヘリコバクター・ピロリ菌株のＬＰＳを検出する方法、
（２３）さらに、（６）〜（９）のいずれかのモノクローナル抗体を用いる（２２）のヘリコバクター・ピロリ菌株のＬＰＳを検出する方法、
（２４）さらに、（１６）〜（２０）のいずれかのモノクローナル抗体を用いる（２３）のヘリコバクター・ピロリ菌株のＬＰＳを検出する方法、
（２５）（１６）〜（２０）のいずれかのモノクローナル抗体を用いて、胃癌患者由来のヘリコバクター・ピロリ菌株に多く存在し、慢性胃炎、胃潰瘍または十二指腸潰瘍患者の血清とは反応しない低抗原性ＬＰＳを検出する方法、
（２６）（１）〜（４）のいずれかのモノクローナル抗体および（１１）〜（１４）のいずれかのモノクローナル抗体を用いてヘリコバクター・ピロリを検出する方法、
（２７）さらに、（６）〜（９）のいずれかのモノクローナル抗体を用いる（２６）のヘリコバクター・ピロリを検出する方法、
（２８）さらに、（１６）〜（２０）のいずれかのモノクローナル抗体を用いる（２７）に記載のヘリコバクター・ピロリを検出する方法、
（２９）（１６）〜（２０）のいずれかのモノクローナル抗体を用いて、胃癌患者由来のヘリコバクター・ピロリ菌株に多く存在し、慢性胃炎、胃潰瘍または十二指腸潰瘍患者の血清とは反応しない低抗原性ＬＰＳを検出することを含む低抗原性ヘリコバクター・ピロリの検出方法、
（３０）（１）〜（４）のいずれかのモノクローナル抗体、（６）〜（９）のいずれかのモノクローナル抗体、（１１）〜（１４）のいずれかのモノクローナル抗体および（１６）〜（２０）のいずれかのモノクローナル抗体からなる群から選択される少なくとも１種のモノクローナル抗体を含むヘリコバクター・ピロリを検出するためのキット、
（３１）（１）〜（４）のいずれかのモノクローナル抗体および（１１）〜（１４）のいずれかのモノクローナル抗体を含む（３０）のヘリコバクター・ピロリを検出するためのキット、および
（３２）（１６）〜（２０）のいずれかのモノクローナル抗体を含む低抗原性ヘリコバクター・ピロリを検出するためのキット。
以下、本発明を詳細に説明する。
モノクローナル抗体の作製
本発明のモノクローナル抗体は、ケーラーとミルステインの方法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７，１９７５）等の公知の方法により作製し得る。
ホルマリン処理等により不活性化したヘリコバクター・ピロリ菌株を免疫原として用いることができる。不活性化した菌株を、ＰＢＳ等の緩衝液に、０．５〜１．５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１ｍｇ／ｍＬの濃度で浮遊させて免疫原を調製することができる。免疫原は、市販のフロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、ＢＣＧ、水酸化アルミニウムゲル、百日咳ワクチン等の適当なアジュバントと共に投与するのが望ましい。また、被免疫動物は、マウス、ラット、モルモット等が利用可能であるが、通常はマウスが汎用される。マウスの場合、３〜１０週齢、好ましくは４週齢のマウスを用いる。調製した免疫原は、動物の皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮内等いずれのルートを通しても投与することができる。免疫の間隔は特に限定されないが、例えば１〜２週間隔で、２〜５回免疫するのが望ましい。また、１回当たりの投与量も限定されないが、例えば上述のように調製した免疫原を適当なアジュバントと混合し、数十μｌ〜数百μｌの量を投与すればよい。
最終免疫後、３〜１０日後に、被免疫動物から抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、胸腺細胞、末梢血細胞が挙げられるが、脾臓細胞を用いるのが一般的である。被免疫動物から脾臓、リンパ節、胸腺、末梢血等を摘出または採取し、これらの組織を破砕する。さらにこの破砕物をＰＢＳ等の緩衝液またはＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０、Ｅ−ＲＤＦ等の培地に懸濁した後に、２００〜２５０μｍのステンレスメッシュ等を用いてろ過し、遠心分離することにより目的とする抗体産生細胞を調製することができる。
このようにして調製した抗体産生細胞を骨髄腫細胞と細胞融合させる。骨髄腫細胞としては、当業者が入手可能な株化細胞を用いることができる。骨髄腫細胞は、一般に被免疫動物と同種の動物より得られたものを用いるが、異種間でも可能な場合がある。使用する細胞株は、薬剤抵抗性を有し、未融合の状態ではヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン培地（ＨＡＴ培地）等の選択培地中で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態のみで生存できる性質を有するものが好ましい。一般的には、８−アザグアニン耐性株が用いられ、この細胞株は、ヒポキサンチン−グアニンホスフォリボシルトランスフェラーゼを欠損し（ＨＧＰＲＴ−）、ＨＡＴ培地に生育できない。骨髄腫細胞として、Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４［ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８１；Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２７１（１９７８）］、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８［ＡＴＣＣＴＩＢ−９；Ｎａｔｕｒｅ、２６５、４９５−４９７（１９７８）］、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｐ３Ｕ１）［ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８０；ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、８１、１−７（１９７８）］、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３［ＡＴＣＣＴＩＢ−１８；ＥｕｒｏｐｅａｎＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、６，５１１−５１９（１９７６）］、Ｐ２／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１［ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８１；Ｎａｔｕｒｅ、２７６、２６９−２７０（１９７８）］等のマウス骨髄腫細胞株が挙げられる。
細胞融合は、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０、Ｅ−ＲＤＦ等の動物細胞培養用培地中で１０^７〜１０^８細胞／ｍｌの骨髄腫細胞と抗体産生細胞とを、混合比１：１〜１：１０で、例えば１：５の割合で、融合促進剤の存在下、３０〜３７℃で１〜３分間細胞同士を接触させることにより効率的に行うことができる。融合促進剤としては、平均分子量１０００〜６０００のポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール等を用いることができる。また、センダイウイルス等の融合ウイルスを用いて細胞融合を行うこともできる。さらに、エレクトロポーレーション等の電気刺激を利用した方法によっても細胞融合を行うことができる。エレクトロポーレーションを利用した細胞融合装置は市販のものが利用可能である。
細胞融合処理後の細胞から、ＨＡＴ培地等の選択培地における細胞の選択的増殖を利用する方法によりハイブリドーマを選別することができる。例えば、融合した細胞の懸濁液をＨＡＴサプリメント（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）及びインターロイキン−６（１ｕｎｉｔ／ｍＬ）を添加したイスコフ培地（ＩＭＤＭ）に１０^３〜１０^７細胞／ｍＬとなるよう希釈後、９６ウェルの細胞培養用マイクロプレートに１０^２〜１０^６細胞／ウェルの細胞密度でまき、各ウェルにＨＡＴ培地等の選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換しながら細胞培養を行い、ハイブリドーマを選別する。
骨髄腫細胞として、８−アザグアニン耐性株、選択培地としてＨＡＴ培地を用いた場合は、未融合の骨髄腫細胞は培養後約７〜１０日目に死滅し、正常細胞である抗体産生細胞もインビトロでは長く生存できず、培養後約７〜１０日目に死滅する。その結果、培養６〜１０日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
増殖してきた細胞の培養上清について、ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳ抗原上のコアオリゴ糖部分に対する抗体の産生があるか否かを検定し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは通常の方法により行うことができる。例えば、ハイブリドーマが生育したウェルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法（ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ）等により目的とする抗体が含まれるか否か検定することができる。例えば、９６ウェルマイクロタイタープレートに免疫原として使用したヘリコバクター・ピロリ菌株から調製したＬＰＳおよび他のヘリコバクター・ピロリ菌株から調製したＬＰＳコアオリゴ糖を各々吸着させた９６ウェルマイクロタイタープレートにモノクローナル抗体を含む培養上清を添加して抗原と反応させる。
次いで、結合した特異的抗体に酵素標識抗マウス免疫グロブリン抗体を反応させ、各ウェルに酵素基質を添加して発色させ、培養上清中のモノクローナル抗体が固相化したＬＰＳと反応するかどうかを検定する。この際、酵素としてβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ等が用いられる。発色は、アッセイ系に応じた信号読取装置、例えばマイクロプレートリーダーを用いて測定することができる。ＬＰＳコアオリゴ糖と反応し結合するモノクローナル抗体を含む培養上清を選別することにより、ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳのコアオリゴ糖部分を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングすることができる。
また、ＬＰＳコアオリゴ糖を精製せずに、ＬＰＳを認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選別し、培養上清のＬＰＳとの反応性を確認することによりＬＰＳのコアオリゴ糖部分を認識するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを選別することもできる。ＬＰＳとの反応性は、ヘリコバクター・ピロリ菌体を熱フェノール処理またはプロテイナーゼＫ処理して得たＬＰＳをポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、これにモノクローナル抗体を反応させ、標識二次抗体による発色を見るイムノブロット法（ウエスタンブロット法）等により確認することができる。
このようにして、選別されたウェル中のハイブリドーマから目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをクローニングする。ハイブリドーマのクローニングは、限界希釈法、軟寒天法、フィブリンゲル法、蛍光励起セルソーター法等により行うことができ、最終的にヘリコバクター・ピロリのＬＰＳのコアオリゴ糖部分を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを取得することができる。
取得したヘリコバクター・ピロリのＬＰＳのコアオリゴ糖を認識するモノクローナル抗体（抗ヘリコバクター・ピロリＬＰＳコアオリゴ糖モノクローナル抗体）産生ハイブリドーマから通常の細胞培養法、腹水形成法等を用いて抗ヘリコバクター・ピロリＬＰＳコアオリゴ糖モノクローナル抗体を採取することができる。
細胞培養法においては、抗ヘリコバクター・ピロリＬＰＳコアオリゴ糖モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを１０〜２０％仔ウシもしくはウシ胎児血清を含有させたＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ−１６４０、ＭＥＭ、Ｅ−ＲＤＦまたは無血清培地等の動物細胞培養用培地中で、通常の培養条件（例えば、３７℃、５％ＣＯ_２濃度）で２〜１４日間培養し、その培養上清から抗体を取得することができる。また腹水形成法においては、骨髄腫細胞由来の動物と同種の動物の腹腔内にあらかじめプリスタン（２、６、１０、１４−テトラメチルペンタデカン）等の鉱物油を投与し、その後１×１０^７〜１×１０^９細胞、好ましくは５×１０^７〜１×１０^８細胞の抗ヘリコバクター・ピロリＬＰＳコアオリゴ糖モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを腹腔内に投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。１〜４週間後、好ましくは２〜３週間後に腹水または血液を採集して抗体を取得することができる。
抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、ＤＥＡＥセルロース等の陰イオン交換体を利用するイオン交換クロマトグラフィー、分子量や構造によってふるいわける分子ふるいクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー等の公知の方法を適宜に選択して、またはこれらを組み合わせることにより精製することができる。
このようにして、本願発明のモノクローナル抗体を得ることができる。モノクローナル抗体は、完全抗体であっても、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ等の抗原結合部位を有する断片であってもよい。
また、ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳコアオリゴ糖に対する特異的モノクローナル抗体として、例えばハイブリドーマ株ＨＰＣＡ／Ｄ４２−３の産生するものを用いることができる。
また、数種類のＳ型ヘリコバクター・ピロリ菌株のＬＰＳを用いて、ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳ抗原上のＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた部分を認識する抗体を得ることができる。この際、広くＳ型ヘリコバクター・ピロリ菌株のＬＰＳと反応するものを選択すれば、ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳ抗原上のＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた部分であって、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が共通して有するＬＰＳ抗原部分を認識する抗体を得ることができる。さらに、一部のＳ型ヘリコバクター・ピロリ菌株のＬＰＳと反応するものを選択すれば、ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳ抗原上のＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた部分であって、一部のＳ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が有するＬＰＳ抗原部分を認識する抗体を得ることができる。ここで、「一部のＳ型ヘリコバクター・ピロリが有するＬＰＳ抗原部分を認識する抗体」とは、胃癌、慢性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍等の胃疾患患者から分離した複数のＳ型ヘリコバクター・ピロリのうち、例えば、８０％以下のヘリコバクターと反応し認識する抗体をいい、好ましくは、７０％以下のヘリコバクターと反応し認識する抗体をいう。具体的には、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリ１４株中、７株と反応する場合、「一部のＳ型ヘリコバクター・ピロリが有するＬＰＳ抗原部分を認識する抗体」に該当する。前者の抗体として、ハイブリドーマ株ＨＰ２２０／２Ｄ１０−２を用いることもできる。また、後者の抗体としてハイブリドーマ株ＨＰ２２０／Ｂ−２５−３を用いることもできる。
ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳのコアオリゴ糖部分を認識するモノクローナル抗体の取得と同様に、ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳのＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分であって、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が共通して有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体またはヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳ抗原上のＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた部分であって、一部のＳ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体の取得においても、Ｓ型ＬＰＳのＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分を精製することなく、Ｓ型ＬＰＳを認識するモノクローナル抗体の中から、Ｓ型ＬＰＳおよびルイス抗原を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥとイムノブロットによる分析（ウエスタンブロット分析）により、Ｓ型ＬＰＳのＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分を認識するモノクローナル抗体を選別することができる。
さらに、以下のようにして低抗原性ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳを認識するモノクローナル抗体を得ることができる。増殖してきた細胞の培養上清について、低抗原性ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳを認識する抗体の産生があるか否かを検定し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは通常の方法により行うことができる。例えば、ハイブリドーマが生育したウェルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法（ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ）等により目的とする抗体が含まれるか否か検定することができる。例えば、９６ウェルマイクロタイタープレートに複数の胃癌患者由来の低抗原性ヘリコバクター・ピロリ菌株から調製したＬＰＳ及び複数の慢性胃炎患者、胃潰瘍患者または十二指腸潰瘍患者由来の高抗原性ヘリコバクター・ピロリ菌株から調製したＬＰＳを各々吸着させた９６ウェルマイクロタイタープレートにモノクローナル抗体を含む培養上清を添加して抗原と反応させる。次いで、結合した特異的抗体に酵素標識抗マウス免疫グロブリン抗体を反応させ、各ウェルに酵素基質を添加して発色させ、培養上清中のモノクローナル抗体が固相したＬＰＳと反応するかどうかを検定する。この際、酵素としてβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ等が用いられる。発色は、アッセイ系に応じた信号読取装置、例えばマイクロプレートリーダーを用いて測定することができる。低抗原性ヘリコバクター・ピロリ菌株由来のＬＰＳと反応するモノクローナル抗体を含む培養上清を選別することにより、低抗原性ヘリコバクター・ピロリ菌株に共通するＬＰＳ抗原を認識して結合する抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングすることができる。
このようにして、選別されたウェル中のハイブリドーマから目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをクローニングする。ハイブリドーマのクローニングは、限界希釈法、軟寒天法、フィブリンゲル法、蛍光励起セルソーター法等により行うことができ、最終的に目的とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを取得することができる。
取得した低抗原性ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳを認識するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマから通常の細胞培養法、腹水形成法等を用いて低抗原性ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳを認識するモノクローナル抗体を採取することができる。
細胞培養法においては、低抗原性ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳを認識するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを１０〜２０％仔ウシ若しくはウシ胎児血清を含有させたＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ−１６４０、ＭＥＭ、Ｅ−ＲＤＦまたは無血清培地等の動物細胞培養用培地中で、通常の培養条件（例えば、３７℃、５％ＣＯ_２濃度）で２〜１４日間培養し、その培養上清から抗体を取得することができる。また腹水形成法においては、骨髄腫細胞由来の動物と同種の動物の腹腔内にあらかじめプリスタン（２、６、１０、１４−テトラメチルペンタデカン）等の鉱物油を投与し、その後１×１０^７〜１×１０^９細胞、好ましくは５×１０^７〜１×１０^８細胞の低抗原性ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳを認識するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを腹腔内に投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。１〜４週間後、好ましくは２〜３週間後に腹水または血液を採集して抗体を取得することができる。
抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、ＤＥＡＥセルロース等の陰イオン交換体を利用するイオン交換クロマトグラフィー、分子量や構造によってふるいわける分子ふるいクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー等の公知の方法を適宜に選択して、またはこれらを組み合わせることにより精製することができる。
このようにして、本願発明の低抗原性ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳに対する特異的モノクローナル抗体を得ることができる。モノクローナル抗体は、完全抗体であっても、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ等の抗原結合部位を有する断片であってもよい。
また、モノクローナル抗体として、例えばハイブリドーマ株ＨＰ２１７／Ｂ１５−４の産生するものを用いることができる。
本願発明のモノクローナル抗体のＬＰＳとの反応性は、ヘリコバクター・ピロリ菌体を熱フェノール処理またはプロテイナーゼＫ処理して得たＬＰＳをポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、これにモノクローナル抗体を反応させ、標識二次抗体による発色を見るイムノブロット法等により確認することができる。
患者胃生検材料から分離されたヘリコバクター・ピロリが低抗原性であるかどうかの確認は、被検ヘリコバクター・ピロリ菌株から調製したＬＰＳをマイクロタイタープレートに固相し、胃潰瘍または十二指腸潰瘍患者の血清を反応させるＥＩＡ法により行うことができる。すなわち、胃潰瘍または十二指腸潰瘍患者血清が反応しないＬＰＳを持つヘリコバクター・ピロリ菌株が低抗原性ヘリコバクター・ピロリとされる。
ヘリコバクター・ピロリの検出
このようにして得られたヘリコバクター・ピロリのＬＰＳコアオリゴ糖特異的モノクローナル抗体を用いてＲ型ＬＰＳを有するヘリコバクター・ピロリ菌株、およびＳ型ＬＰＳを有するヘリコバクター・ピロリ菌株の一部を検出することが可能である。
また、ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳ抗原上のＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた部分であって、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が共通して有するＬＰＳ抗原部分を認識する抗体を用いてほとんどのＳ型ＬＰＳを有するヘリコバクター・ピロリ菌株を検出することが可能である。さらに、ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳ抗原上のＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた部分であって、一部のＳ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が有するＬＰＳ抗原部分を認識する抗体を用いて一部のＳ型ＬＰＳを有するヘリコバクター・ピロリ菌株を検出することが可能である。また、本発明のモノクローナル抗体を用いて被験体の胃内にヘリコバクター・ピロリが存在するかどうかを検出することにより、被験体の胃疾患罹患の危険性を評価することもできる。本発明のモノクローナル抗体により被験体の胃内にヘリコバクター・ピロリが検出された場合、概被験体の胃内の洗浄または抗生物質の投与等によりヘリコバクター・ピロリを除去し、胃疾患の罹患危険性を低減または消滅させることが可能である。本発明のモノクローナル抗体は、ヘリコバクター・ピロリの除去効果の判定にも用いることができる。
また、上述のようにして得られた低抗原性ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳを認識するモノクローナル抗体を用いて胃癌患者由来のヘリコバクター・ピロリを検出することが可能である。また、被験体の胃内に本発明の低抗原性ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳを認識するモノクローナル抗体が認識するヘリコバクター・ピロリが存在するかどうかを検出することにより、被験体の胃癌罹患の危険性を評価することもできる。本発明のモノクローナル抗体により被験体の胃内に低抗原性ヘリコバクター・ピロリが検出された場合、概被験体の胃内の洗浄または抗生物質の投与等により低抗原性ヘリコバクター・ピロリを除去し、胃癌の罹患危険性を低減または消滅させることが可能である。本発明のモノクローナル抗体は、低抗原性ヘリコバクター・ピロリの除去効果の判定にも用いることができる。
該抗ヘリコバクター・ピロリＬＰＳコアオリゴ糖モノクローナル抗体およびヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳのＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分であって、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が共通して有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体を組み合せて使用することによりほぼ総てのヘリコバクター・ピロリ菌株を検出することが可能になる。ここで、「ほぼ総てを検出する」とは、胃癌、慢性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍等の胃疾患患者から分離した複数のヘリコバクター・ピロリの好ましくは９５％以上を検出できることをいい、さらに好ましくは９８％以上を検出できることをいう。例えば、１８１の分離ヘリコバクター・ピロリのうち１７９を検出できた場合、「ほぼ総てを検出する」に該当する。さらに、これら２種類のモノクローナル抗体に、さらに上述のヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳ抗原上のＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた部分であって、一部のＳ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体を組み合せて使用することにより総てのヘリコバクター・ピロリ菌株を検出することが可能になる。ここで、「総て検出する」とは、好ましくは、胃疾患患者から分離した複数のヘリコバクター・ピロリの９９％以上を検出できることをいい、さらに好ましくは、ヘリコバクター・ピロリの１００％を検出できることをいう。例えば、１８１の分離ヘリコバクター・ピロリ中１８１総てを検出できる場合である。但し、ヘリコバクター・ピロリには、正常なＬＰＳ抗原構造を有さず、上述の抗ヘリコバクター・ピロリＬＰＳコアオリゴ糖モノクローナル抗体、ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳのＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分であって、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が共通して有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体およびヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳ抗原上のＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた部分であって、一部のＳ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体のいずれもが認識し得ない株もきわめて少数ながら存在し得、このような異常な株は、検出率の計算からは除くべきである。
上述の抗ヘリコバクター・ピロリＬＰＳコアオリゴ糖モノクローナル抗体、ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳのＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分であって、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が共通して有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体、ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳ抗原上のＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた部分であって、一部のＳ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体および低抗原性ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳを認識するモノクローナル抗体の総てを用いることにより、総てのヘリコバクター・ピロリを検出することができるとともに、胃癌患者に由来する低抗原性ヘリコバクター・ピロリ菌株を検出することができる。
ヘリコバクター・ピロリの検出はイムノブロット法、酵素免疫測定法（ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光抗体法、凝集反応を利用した方法、イムノクロマトグラフィー法等の当業者に知られた方法により行うことができる。この際、試料として、例えば胃潰瘍等の胃疾患患者の胃生検材料等から分離培養された細菌を用いることができるが、これに限定されるものではない。
例えば、凝集反応を利用した方法においては、ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳコアオリゴ糖を認識するモノクローナル抗体およびヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳのＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分であって、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が共通して有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体を感作した担体を用いてヘリコバクター・ピロリを検出することができる。さらに、検出率を上げるためにヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳ抗原上のＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた部分であって、一部のＳ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体を感作してもよい。さらに、胃癌患者由来株に由来する低抗原性ヘリコバクター・ピロリ菌株を検出するためには、低抗原性ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳを認識するモノクローナル抗体を感作すればよい。
これらのモノクローナル抗体を感作する担体としては、不溶性で、非特異的な反応を起こさず、かつ安定である限り、いかなる担体を使用してもよい。例えば、ラテックス粒子、ベントナイト、コロジオン、カオリン、固定羊赤血球等を使用することができるが、ラテックス粒子を使用するのが好ましい。ラテックス粒子としては、例えば、ポリスチレンラテックス粒子、スチレン−ブタジエン共重合体ラテックス粒子、ポリビニルトルエンラテックス粒子等を使用することができるが、ポリスチレンラテックス粒子を使用するのが好ましい。ラテックス粒子を使用する場合には、特別な処理をしなくても容易に抗体を担体に感作できるとともに、対象菌株と担体の反応により生じる凝集像が明瞭となり、対象菌株の担体に対する反応性を容易かつ精度よく判別できる点でさらに有利である。
この際、上述の４種の抗体の２〜４種を同時に担体に結合させてもよいし、これらの抗体を別々に担体に結合させて、各抗体を結合させた４種の担体の２〜４種を混ぜて用いることも可能である。さらには、別々にそれぞれの抗体を結合させた担体を別々に各抗体が認識するヘリコバクター・ピロリの検出に用いても良い。低抗原性ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳを認識するモノクローナル抗体は、他の３種とは別途に胃癌患者由来株に由来する低抗原性ヘリコバクター・ピロリ菌株を検出することができるので、他の３種とは別に担体に結合させるのが好ましい。
モノクローナル抗体を担体に感作する方法は、特に限定されない。例えば、モノクローナル抗体を担体に物理的に吸着させてもよいし、化学的に結合させてもよい。より具体的には、例えば、モノクローナル抗体と担体とを混和した後、３０〜３７℃で１〜２時間加温振盪することにより、抗体を担体に感作させることができる。担体に感作する抗体の量は、使用する担体の粒径に応じて適宜設定することができる。抗体を担体に感作した後、担体表面上の未感作部分をウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、卵白アルブミン等でブロッキングするのが好ましい。モノクローナル抗体を感作した担体は、ヘリコバクター・ピロリに属する対象菌株と反応させる時まで媒体分散液として保持しておくのが好ましい。この際、媒体としては、例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液等を使用することができる。モノクローナル抗体に感作した担体の含有量は、通常、媒体分散液に対して０．２〜０．５重量％とすることができるが、０．２５〜０．３重量％とするのが好ましい。媒体中には、必要に応じてウシ血清アルブミン、ゼラチン、アラビアゴム等を添加してもよい。このようにして調製したモノクローナル抗体感作担体を対象菌株と反応させ、凝集の有無またはその程度により対象菌株とモノクローナル抗体との反応性を判別し、ヘリコバクター・ピロリを検出することができる。この際、ヘリコバクター・ピロリ菌株をあらかじめ適当な抽出試薬、例えば酵素または酢酸および亜硝酸ナトリウム等により処理しておいてもよい。
また、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）においては、ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳ特異的モノクローナル抗体およびヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳのＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分であって、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が共通して有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体をマイクロタイタープレート、樹脂ビーズ、磁性化ビーズ等の担体に物理吸着や化学結合により固相化する。さらに、検出率を上げるためにヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳ抗原上のＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた部分であって、一部のＳ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体を固相化してもよい。さらに、胃癌患者に由来する低抗原性ヘリコバクター・ピロリ菌株を検出するためには、低抗原性ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳを認識するモノクローナル抗体を固相化すればよい。
この際、これらの抗体の２〜４種類を混合して担体に固相化し、２〜４種類の抗体を固相化した担体を調製してヘリコバクター・ピロリの検出に用いてもよいし、別々にそれぞれの抗体を固相化した担体を調製し、別々に各抗体との反応性を測定してもよい。低抗原性ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳを認識するモノクローナル抗体は、他の３種とは別途に胃癌患者に由来する低抗原性ヘリコバクター・ピロリ菌株を検出することができるので、他の３種とは別に担体に結合させるのが好ましい。
固相化量は、特に限定されないが担体がマイクロタイタープレートの場合、１ウェル当たり数ｎｇから数十μｇが望ましい。固相化は固相化すべき抗体を適切なバッファーに溶解し、担体と接触させて行うことができる。例えば、マイクロタイターウェルを用いる場合、抗体溶液をマイクロタイタープレートのウェルに分注し一定時間置くことにより固相化することができる。基質を固相化した後は、アッセイ中の非特異的結合を防ぐためにウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、卵白アルブミン等を含んだブロッキング溶液を用いてブロッキングを行うのが好ましい。次いで、固相化担体と試料を反応させ、洗浄後、ヘリコバクター・ピロリを認識する標識したモノクローナル抗体を反応させる。標識は、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼやグルコースオキシダーゼ等の酵素を用いて行うことができる。例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）においては、多数のウェル（例えば、９６穴）を有するマイクロタイタープレートに基質を固相化させ、ウェル中で抗原抗体反応を行わせることにより一度に大量測定が可能になる。また、用いる抗体および試料菌体の使用量を非常に少なくすることも可能である。さらに、全自動ＥＩＡ測定装置などの自動測定機器を用いることも可能になる。
本発明は、ほぼ総てのヘリコバクター・ピロリ菌株の検出を可能にするキットの提供をも目的とするが、該キットは少なくともヘリコバクター・ピロリのＬＰＳコアオリゴ糖を認識するモノクローナル抗体およびヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳのＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分であって、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が共通して有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体を含む。また、本発明は、総てのヘリコバクター・ピロリ菌株の検出を可能にするキットの提供をも目的とし、該キットはさらにヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳ抗原上のＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた部分であって、一部のＳ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体を含む。さらに、本発明は、胃癌患者に由来する低抗原性ヘリコバクター・ピロリ菌株の検出を可能にするキットの提供をも目的とし、該キットはさらに低抗原性ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳを認識するモノクローナル抗体を含む。該キットがＥＩＡ法に基づく場合は、抗体を固相化する担体を含んでいてもよく、抗体があらかじめ担体に結合していてもよい。該キットがラテックス等の担体を用いた凝集法に基づく場合は抗体が吸着した担体を含んでいてもよい。また、該キットは、適宜、ブロッキング溶液、反応溶液、反応停止液、試料を処理するための試薬等を含んでいてもよい。
以上のように、本発明のヘリコバクター・ピロリのＬＰＳのコアオリゴ糖を認識するモノクローナル抗体およびヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳのＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分であって、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が共通して有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体を用いることによりほぼ総てのヘリコバクター・ピロリを検出でき、さらにヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳ抗原上のＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた部分であって、一部のＳ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体をも用いて総てのヘリコバクター・ピロリを検出でき、さらに低抗原性ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳを認識するモノクローナル抗体を用いて、胃癌患者に由来する低抗原性ヘリコバクター・ピロリ菌株を検出することができることから、胃生検材料から分離された細菌を迅速にヘリコバクター・ピロリと鑑別し、ヘリコバクター・ピロリを検出することができ、生化学的性状を調べる時間と労力を大幅に省略することができる。
なお、ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳのコアオリゴ糖を認識するモノクローナル抗体およびヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳのＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分であって、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が共通して有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体を用いてほぼ総てのヘリコバクター・ピロリを検出するか、またはさらにヘリコバクター・ビロリのＳ型ＬＰＳ抗原上のＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた部分であって、一部のＳ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体をも用いて総てのヘリコバクター・ピロリを検出するか、あるいはさらに胃癌患者に由来する低抗原性ヘリコバクター・ピロリ菌株を検出するかは、目的とする検出率、診断または検出しようとする疾患等に応じて選択することができ、また使用する抗体の数を減らすことにより調製にかかる費用、時間を減じることができるので、これらを考慮して適宜選択することができる。
また、本発明の４種類のモノクローナル抗体との反応性パターンにより、ヘリコバクター・ピロリを分類することができ、その分類を各種胃疾患と関連付けることもできる。さらに、本発明の４種類のモノクローナル抗体に加え、抗ルイス（Ｌｅ^ｘ、Ｌｅ^ｙ、Ｌｅ^ａ、Ｌｅ^ｂ、Ｌｅ^ｄ）抗体との反応性パターンによりさらにヘリコバクター・ピロリを細分類することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により、本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１ヘリコバクター・ピロリに対するモノクローナル抗体の作製
免疫抗原の調製
ヘリコバクター・ピロリ２２０−Ｂ株を血液寒天培地を用いて、微好気条件下で３〜４日間、３７℃で培養する。増殖した菌体をリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）に浮遊させ、ホルマリン処理にて不活化する。不活化した菌体をＰＢＳにて濃度を０．５〜１．５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１ｍｇ／ｍＬに調製して免疫抗原とする。
モノクローナル抗体の調製
上記免疫抗原１００μＬをフロイント完全アジュバントと共に５週齢、雌のＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫し、２週間後同抗原５０μＬをフロイント不完全アジュバントで追加免疫を行った。さらに２週間後、同抗原２５μＬを静脈に注射し、その３日後に脾臓細胞を摘出した。摘出された脾臓細胞はケラーらの方法（Ｋｏｈｌｅｒｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．２５６，ｐ４９５−４９７（１９７５））によりマウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｘ６３）と融合し、炭酸ガスインキュベーター中で３７℃で培養した。得られたハイブリドーマの培養上清を検体として、ヘリコバクター・ピロリ菌株のＳ型ＬＰＳ（２１７，２２０，ＣＡ４株）を抗原として固相したＥＬＩＳＡ法でハイブリドーマのスクリーニングを行った。総てのＳ型ＬＰＳと反応した培養上清のハイブリドーマを選択した。スクリーニングされたハイブリドーマを限界希釈法によって０．５細胞／ウェルで、９６ウェルプレートに播き、ウェル中に単一コロニーとして発育したハイブリドーマのみクローンとし、この限界希釈法を２度繰り返すことによりクローニングを行った。以上により、ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳのコアオリゴ糖に対するモノクローナル抗体産生細胞株、ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳのＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分であって、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が共通して有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体産生細胞株およびヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳ抗原上のＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた部分であって、一部のＳ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体産生細胞株を取得した。取得した該細胞株をプリスタン処理したＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔投与し、約２週間後、抗体含有腹水を採取した。得られた腹水から硫安塩析法によってＩｇＧを精製した。
実施例２低抗原性ヘリコバクター・ピロリに対するモノクローナル抗体の作製免疫抗原の調製
低抗原性ヘリコバクター・ピロリＣＡ２株を血液寒天培地を用いて、微好気条件下で３〜４日間、３７℃で培養する。増殖した菌体をリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）に浮遊させ、ホルマリン処理にて不活化する。不活化した菌体をＰＢＳにて濃度を０．５〜１．５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１ｍｇ／ｍＬに調製して免疫抗原とする。
モノクローナル抗体の調製
上記免疫抗原１００μＬをフロイント完全アジュバントと共に５週齢、雌のＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫し、２週間後同抗原５０μＬをフロイント不完全アジュバントで追加免疫を行った。さらに２週間後、同抗原２５μＬを静脈に注射し、その３日後に脾臓細胞を摘出した。摘出された脾臓細胞はケラーらの方法（Ｋｏｈｌｅｒｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．２５６，ｐ４９５−４９７（１９７５））によりマウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｘ６３）と融合し、炭酸ガスインキュベーター中で３７℃で培養した。低抗原性ヘリコバクター・ピロリ菌株３株と高抗原性ヘリコバクター・ピロリ菌株３株のＬＰＳを抗原としてＥＬＩＳＡ法でハイブリドーマのスクリーニングを行った。すなわち、低抗原性ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳに反応し、高抗原性ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳに反応しないハイブリドーマを選択した。スクリーニングされたハイブリドーマを限界希釈法によって０．５細胞／ウェルで、９６ウェルプレートに播き、ウェル中に単一コロニーとして発育したハイブリドーマのみクローンとし、この限界希釈法を２度繰り返すことによりクローニングを行った。
以上により、数種の低抗原性ヘリコバクター・ピロリＬＰＳに対するモノクローナル抗体産生細胞株を取得した。取得した細胞をプリスタン処理したＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔投与し、約２週間後、抗体含有腹水を採取した。得られた腹水から硫安塩析法によってＩｇＧを精製し、これをモノクローナル抗体とした。
実施例３モノクローナル抗体のＬＰＳとの反応性
ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳは２種類の方法にて得た。第一は熱フェノール水抽出法であり、精製ＬＰＳが得られる。培養したヘリコバクター・ピロリの１％フェノール処理乾燥菌体１ｇを８０ｍＬ蒸留水に懸濁し、９０％フェノール水等量と混ぜた。６８℃、１５分間攪拌し、その後室温に戻し、次に遠心（２５００ｒｐｍ、２０分間）し、水層（上清）を取り出した。残りのフェノール層に８０ｍＬ蒸留水を加え、再び６８℃、１５分間攪拌する。室温に下がった後、遠心（２５００ｒｐｍ、２０分間）し、水層を取り出し、先の水層と一緒にして透析（１日２回蒸留水を交換して３日間）した。
透析後、透析内液を凍結乾燥し、少量の蒸留水に溶かし、超遠心（１００，０００ｘｇ、３時間）でＬＰＳを沈殿させた。この沈殿物を２回洗浄超遠心（１００，０００ｘｇ、３時間）して、最後に凍結乾燥して精製ＬＰＳを得た。
第二にプロテイナーゼＫ処理によるＬＰＳは精製されていないが、イムノブロットなどの免疫反応には用いることができる。乾燥菌体溶液（２ｍｇ）をＬｙｓｉｎｇｂｕｆｆｅｒ（２０％グリセロール、１０％２−メルカプトエタノール、６％ＳＤＳ、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに用いるｕｐｐｅｒＴｒｉｓｂｕｆｆｅｒ）１ｍＬに溶かし、１００℃、１０分間加熱した。室温まで冷却後、プロテイナーゼＫ２００μＬ（２．５ｍｇ／ｍＬ）を加え、３７℃、１４時間、さらに６５℃、２時間反応させた。得られた試料はＳＤＳ−ＰＡＧＥなどに用いた。
ＬＰＳのモノクローナル抗体との反応性はＳＤＳ−ＰＡＧＥとイムノブロットによって調べた。泳動用のサンプルとして精製ＬＰＳは約０．８μｇ、プロテイナーゼＫ処理ＬＰＳは最初の菌体に換算して約１００μｇを１ウェルに加えて、１２．５％ゲル濃度のＳＤＳ−ＰＡＧＥを常法にて行う。泳動後、ゲルをＰＶＤＦメンブレンフィルターに転写し、一次抗体としてモノクローナル抗体（５００倍希釈）、二次抗体として抗マウスＩｇ抗体（５００倍希釈）で反応し、ジアミノベンゼンにて発色させた。結果を図２に示す。図２に示すように、本発明の抗ヘリコバクター・ピロリＬＰＳコアオリゴ糖モノクローナル抗体（抗体Ｉ）は、低分子量のコアオリゴ糖と反応し、ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳのＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分であって、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が共通して有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体（抗体ＩＩ）は、Ｓ型ＬＰＳとラダー状に反応した。さらに、ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳ抗原上のＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた部分であって、一部のＳ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体（抗体ＩＩＩ）も、Ｓ型ＬＰＳとラダー状に反応したが、各菌株に対する反応性パターンは、抗体ＩＩとは異なっていた。さらに、低抗原性ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳを認識するモノクローナル抗体（抗体ＩＶ）も、ＬＰＳとラダー状に反応したが、各菌株に対する反応性パターンは他のモノクローナル抗体を異なっていた。
実施例４低抗原性ヘリコバクター・ピロリの確認
低抗原性ヘリコバクター・ピロリの確認は熱フェノール水抽出法或いはプロテイナーゼＫ処理ＬＰＳを用いたイムノブロット或いはＥＬＩＳＡによる検出法にて行った。
被検菌であるヘリコバクター・ピロリ菌株を血液寒天培地で微好気の条件下で４日間、３７℃で培養した。増殖した菌体を生理食塩液に浮遊し、等量の熱フェノールを加えＬＰＳの抽出を行った。次に遠心分離を行い水層部分を採取し、流水で透析を行いＬＰＳ標品とした。これを５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）で５０倍に希釈後、マイクロプレートに分注し、４℃一夜放置して固相した。その後、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）にてブロッキングを行いＥＩＡ用プレートとした。これに胃潰瘍患者血清を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０加リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳＴ）で２００倍に希釈し、その１００μｌを各ウェルに滴下し、室温で、１時間反応させた。反応液を吸引除去し、各ウェルに２００μＬのＰＢＳＴを加えて、３回洗浄した。洗浄後、ＰＢＳＴで５００００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体の１００μＬを各ウェルに加え、室温に１時間静置した。その後、各ウェルにＰＢＳＴを２００μＬ加えて、４回洗浄した。洗浄後、基質液（３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン、過酸化水素）を１００μＬ加えて室温で３０分間静置した。
次に反応停止液（０．６Ｎ硫酸）を１００μＬ加えて反応を停止し、オートリーダー（波長４５０ｎｍ／６３０ｎｍ）で吸光度を測定した。
実施例５ラテックススライド凝集法によるヘリコバクター・ピロリの鑑別
▲１▼モノクローナル抗体感作ラテックスの調製
支持体として直径０．３μｍのポリスチレン製球状粒子（ラテックス：市販品）を用いた。実施例１および２により得られたモノクローナル抗体とラテックス粒子を各々リン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．０）に溶解し、抗体とラテックス粒子の重量比が１：１０となるように抗体を支持体に固定化した。これをリン酸緩衝生理食塩液で洗浄し、牛血清アルブミンでブロッキングを行ったものを抗体感作ラテックスとした。
▲２▼検体処理法
血液寒天培地シャーレ１枚に培養した被検菌の全てを採取し、生理食塩液２５０μＬに懸濁する。これに抽出試薬１（酢酸）と抽出試薬２（亜硝酸ナトリウム）を各々２５０μＬ加え１０分間放置した。その後抽出液３（緩衝液）を２５０μＬ加え中和させ、検体とした。
▲３▼スライド凝集反応
紙製のスライド板のサークル内に▲２▼の方法で得た検体の２５μＬを滴下し、これに▲１▼で調製した抗体感作ラテックスの５０μＬを加え混和した。１分間攪拌後、肉眼的に凝集の有無を観察し、凝集の認められたものを陽性、認められないものを陰性とした。
実施例６低抗原性ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳを認識するモノクローナル抗体（抗体ＩＶ）感作ラテックス試薬の特異性
各種胃疾患患者から分離されたヘリコバクター・ピロリ株を実施例４に示した方法で、低抗原性または高抗原性を確認してから実施例５のとおり試験を行った。
結果を表１に示した。低抗原性ヘリコバクター・ピロリに属する菌株は全て本感作ラテックスで陽性を示した。一方高抗原性ヘリコバクター・ピロリは、本感作ラテックスには反応しなかった。

実施例７Ｓ型ヘリコバクター・ピロリの菌株が共通して有するＬＰＳ抗原（ヘリコバクター・ピロリ菌種特異的ＬＰＳ）、すなわちヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳのＯ抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分であって、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリが共通して有するＬＰＳ抗原部分を特異的に認識するモノクローナル抗体（抗体ＩＩ）感作ラテックス試薬の特異性
各種胃疾患患者から分離されたヘリコバクター・ピロリ株、ヘリコバクター属であるヘリコバクター・ピロリ以外の菌株およびカンピロバクターを用いて実施例５のとおり試験を行った。
結果を表２に示した。生化学的性状がヘリコバクター・ピロリに属する菌株は全て本感作ラテックスで陽性を示した。一方ヘリコバクター・ピロリ以外のヘリコバクター属に分類される菌株およびカンピロバクター属に分類される菌株は全て陰性と判定された。

実施例８４種類の抗体（抗体Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ）感作ラテックス試薬を用いたヘリコバクター・ピロリ菌株１８１株の反応性パターン
各種胃疾患患者から分離されたヘリコバクター・ピロリ株１８１株および抗体Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩを用いて実施例５のとおり試験を行った。
結果を表３に示した。抗体Ｉ、ＩＩを用いることにより、１８１株中１７９株とほぼ総てが検出でき、抗体Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩを用いることにより１８１株総てを検出することができる。

Ｉ：抗ヘリコバクター・ピロリＬＰＳコアオリゴ糖モノクローナル抗体
ＩＩ：ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳのＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分であって、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が共通して有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体
ＩＩＩ：ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳ抗原上のＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた部分であって、一部のＳ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体
さらに、抗体ＩＶをも用いて、同様に１８１の菌株を用いて試験を行った。
結果を表４に示した。低抗原性ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳを認識する抗体により検出されるヘリコバクター菌株が１８１株中１７株存在した。

ＩＶ：低抗原性ヘリコバクターのＬＰＳを認識するモノクローナル抗体
実施例９４種類の抗体（抗体Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ）およびヘリコバクター・ピロリ菌株１４株を用いての検出
実施例３に記載の方法により１４株のヘリコバクター・ピロリ菌株（日本細菌学雑誌、５６（２）：４２１−４３３，２００１等）からＬＰＳを精製し、市販の５種類の抗ルイス抗原抗体（Ｌｅ^ｘ：生化学工業社製、Ｌｅ^ａ；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製；Ｌｅ^ｙ、Ｌｅ^ｂ、Ｌｅ^ｄ：ＳｉｇｎｅｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）および３種類の抗ヘリコバクター・ピロリＬＰＳモノクローナル抗体（抗Ｈｐモノクローナル抗体）との反応性を実施例３に記載のイムノブロットにより確認した。
結果を表５に示した。電気泳動の結果より、１４株のヘリコバクター・ピロリ菌株のうちＣＧ１０株、ＤＵ８株およびＯ１株は、図１のＯ−抗原多糖を有しないＲ型ＬＰＳを有し、他の１１株がＯ−抗原多糖を有するＳ型ＬＰＳを有することがわかった。本発明の抗ヘリコバクター・ピロリＬＰＳコアオリゴ糖モノクローナル抗体（抗体Ｉ）は、Ｒ型ＬＰＳである３菌株のうち２菌株と反応し、Ｓ型ＬＰＳである１１菌株のうち９菌株と反応した。また、ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳ抗原上のＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた部分であって、一部のＳ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体（抗体ＩＩＩ）は、Ｓ型ＬＰＳである１１菌株のうち７菌株と反応した。ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳ上のＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原部分を除いた部分であって、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が共通して有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体（抗体ＩＩ）は、ラフ型菌株とは反応せず、総てのスムース型菌株と反応した。低抗原性ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳを認識するモノクローナル抗体（抗体ＩＶ）は、１４株中４株と反応した。
なお、Ｏ１株のように、いずれの抗ヘリコバクター・ピロリＬＰＳモノクローナル抗体および抗ルイス抗体とも反応しないヘリコバクター・ピロリ菌株も存在した。

Ｉ：抗ヘリコバクター・ピロリＬＰＳコアオリゴ糖モノクローナル抗体
ＩＩ：ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳ上のＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原部分を除いた部分であって、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が共通して有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体
ＩＩＩ：ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳ抗原上のＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた部分であって、一部のＳ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体
ＩＶ：低抗原性ヘリコバクターのＬＰＳを認識するモノクローナル抗体
＊：ヘリコバクター・ピロリ各菌株から精製したＬＰＳ
＊＊：銀染色による電気泳動パターンの分析Ｓ：スムース型
Ｒ：ラフ型
産業上の利用可能性
実施例に示すように本発明の抗ヘリコバクター・ピロリＬＰＳコアオリゴ糖モノクローナル抗体は、ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳ上のＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原部分を除いた部分を認識するモノクローナル抗体が認識しないヘリコバクター・ピロリ菌株を認識することができ、抗ヘリコバクター・ピロリＬＰＳコアオリゴ糖モノクローナル抗体およびヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳ上のＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原部分を除いた部分であって、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が共通して有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体を用いてヘリコバクター・ピロリの検出を行うことによりほぼ総てのヘリコバクター・ピロリ菌株を検出することが可能になる。さらに、本発明のヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳ抗原上のＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた部分であって、一部のＳ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体を用いてヘリコバクター・ピロリの検出を行うことにより総てのヘリコバクター・ピロリ菌株を検出することが可能になる。さらに、本発明の低抗原性ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳを認識する抗体を用いると胃癌患者由来のヘリコバクター・ピロリを検出することが可能であり、胃癌の可能性を診断することもできる。従って、本発明のモノクローナル抗体を広く胃疾患等の診断に有効に利用することができる。
本明細書に引用されたすべての刊行物は、その内容の全体を本明細書に取り込むものとする。また、添付の請求の範囲に記載される技術思想および発明の範囲を逸脱しない範囲内で本発明の種々の変形および変更が可能であることは当業者には容易に理解されるであろう。本発明はこのような変形および変更をも包含することを意図している。
【図面の簡単な説明】
図１は、ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳの推定構造を示した図である。
図２は、抗体に抗ヘリコバクター・ピロリＬＰＳコアオリゴ糖モノクローナル抗体（ＭｏＡｂＩ）、ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳのＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分であって、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が共通して有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体（ＭｏＡｂＩＩ）、ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳ抗原上のＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた部分であって、一部のＳ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体（ＭｏＡｂＩＩＩ）および低抗原性ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳを認識するモノクローナル抗体（ＭｏＡＢＩＶ）を用い、抗原にヘリコバクター・ピロリＬＰＳを用いたウエスタンブロットの結果を示す図である。Technical field
The present invention relates to a monoclonal antibody that recognizes the core oligosaccharide part of LPS (lipopolysaccharide) of Helicobacter pylori, a hybridoma that produces the antibody, and an LPS antigen (S. Helicobacter pylori) that is commonly shared by S strains of Helicobacter pylori. Specific LPS), that is, the antigen part excluding Lewis antigen from the O antigen polysaccharide part of S-type LPS of Helicobacter pylori, which specifically recognizes the LPS antigen part that S-type Helicobacter pylori has in common A monoclonal antibody (anti-Helicobacter pylori species-specific monoclonal antibody), a hybridoma that produces the antibody, and an antigen part excluding Lewis antigen from the O-antigen polysaccharide part of Helicobacter pylori S-type LPS LPs of S-type Helicobacter pylori strains The present invention relates to a monoclonal antibody that recognizes an antigen portion, a hybridoma that produces the antibody, a monoclonal antibody that recognizes a low antigenic LPS of Helicobacter pylori (a low antigenic epitope present in LPS), and a hybridoma that produces the antibody . The present invention further relates to a detection reagent and kit for Helicobacter pylori containing one or several of these antibodies, and a method and kit for detecting Helicobacter pylori using one or several of these antibodies. This reagent, kit and method are effectively used for diagnosis of gastric diseases and the like.
Background art
Recent research has revealed that Helicobacter pylori is the main cause of gastric ulcer, duodenal ulcer and chronic gastritis. The relationship between Helicobacter pylori and gastric cancer is also drawing attention.
Many species of Helicobacter species are known, and it is necessary to confirm (differentiate) whether the bacterium isolated from the gastric biopsy is Helicobacter pylori and to specifically detect Helicobacter pylori.
For this purpose, in addition to morphological observation under a microscope, it is necessary to conduct a number of tests such as confirmation that urease, catalase, oxidase and other enzymes are positive, nalidixic acid resistance, and cephalotin sensitivity. Since these tests require a lot of time and labor, development of a reagent that easily detects Helicobacter pylori has been desired.
It was also known that many Helicobacter pylori-infected patients have antibodies against LPS, which is a surface antigen of Helicobacter pylori, that is, LPS has a major epitope of Helicobacter pylori.
However, antibodies against the Lewis antigen portion of LPS have been obtained as antibodies against Helicobacter pylori, but these were specific to each type of Lewis antigen. Therefore, in order to detect Helicobacter pylori widely regardless of the strain, each type of Lewis antigen (Le^x, Le^y, Le^a, Le^b, Le^d) Multiple antibodies were required.
Therefore, it has been desired to develop a method for reliably detecting Helicobacter pylori with a smaller number of antibodies regardless of the strain of Helicobacter pylori, and to develop an antibody for use in the method.
Recently, due to the relationship between Helicobacter pylori lipopolysaccharide (LPS) and patient antibodies, Helicobacter pylori has increased with a strain (polysaccharide with high antigenic Helicobacter pylori) that has a polysaccharide with an increased antibody titer against humans. It is classified into strains with low polysaccharides (low antigenic Helicobacter pylori strains), and each has high antigenic LPS and low antigenic LPS. (Shinichi Yokota et al .: Antigenicity of lipopolysaccharide of Helicobacter pylori in humans, endotoxin research 1-basics and clinical practice, Motoharu Kondo et al., Pp. 113-121, Naone Publishing, Tokyo, 1998).
A reagent using the same is disclosed as a patent (publication number: JP-A-10-218900). It recognizes antigenic determinants for humans that are deleted in LPS of Helicobacter pylori strains from gastric cancer patients, but are present in Helicobacter strains from patients with chronic gastritis, gastric ulcers, or duodenal ulcers The antibody is tested for malignancy. That is, Helicobacter that does not react with this serum has a high malignancy.
However, in this method, LPS must be prepared from the isolated Helicobacter pylori strain by the hot phenol extraction method or proteinase K treatment in the presence of sodium lauryl sulfate (SDS). Furthermore, the prepared LPS must be solid-phased on a microplate in order to be subjected to polyacrylamide electrophoresis or subjected to enzyme immunoassay (EIA). Furthermore, an antibody is reacted with these prepared LPS, and if it is negative, it is determined that the grade of malignancy is high. These tests require a lot of time and effort and attach importance to negative rather than positive. From these, conversely, an antibody that recognizes a low antigenic epitope specific to a low antigenic strain, that is, a low antigenic epitope that specifically exists in LPS of low antigenic Helicobacter pylori (low antigenic LPS) is used. Development of a new reagent has been desired.
Disclosure of the invention
The present invention is a monoclonal antibody for detecting Helicobacter pylori specifically, conveniently, in a short time, a hybridoma producing the antibody, a method for detecting Helicobacter pylori specifically, simply, in a short time, An object is to provide a kit for detecting Helicobacter pylori specifically, simply and in a short time.
Specifically, a monoclonal antibody that recognizes the core oligosaccharide portion of LPS of Helicobacter pylori, a hybridoma that produces the antibody, and an LPS antigen that is commonly shared by strains of Helicobacter pylori (LPS specific to Helicobacter pylori species) I.e., a monoclonal antibody that specifically recognizes an LPS antigen portion shared by S-type Helicobacter pylori, which is an antigen portion excluding Lewis antigen from the O antigen polysaccharide portion of S-type LPS of Helicobacter pylori ( Anti-Helicobacter pylori species-specific monoclonal antibody), hybridoma producing the antibody, and antigenic portion excluding Lewis antigen from the O-antigen polysaccharide portion of S-type LPS of Helicobacter pylori, part of S-type LPS antigen part of Helicobacter pylori strain Recognizing monoclonal antibodies and hybridomas which produce the antibodies, as well as hybridomas producing monoclonal antibodies and antibody recognizing a low antigenicity LPS of Helicobacter pylori. A further object of the present invention is to provide a detection reagent for Helicobacter pylori containing one or several of these antibodies, a method for detecting Helicobacter pylori using one or several of these antibodies, and a detection kit thereof. To do.
As the present inventors proceeded with the examination of the serological classification of Helicobacter pylori (Patent Publication 2000-262291), the spleen cells of mice immunized with Helicobacter pylori 220-B strain as an antigen were treated with myeloma. Numerous hybridomas were prepared by fusing with cell (myeloma) strains. Among them, as a result of screening many monoclonal antibodies that react with Helicobacter pylori using the endotoxin (LPS) extracted from the Helicobacter pylori as an antigen, a hybridoma that produces monoclonal antibodies that react widely with Helicobacter pylori strains is obtained. I was able to. As shown in FIG. 1, Helicobacter pylori has a normal strain called a smooth (S) type having a smooth (S type) LPS having an O-antigen polysaccharide and a rough type (R type having no O-antigen polysaccharide). ) It was known that rough (R-type) strains with LPS exist. Most Helicobacter pylori strains are smooth and the O-antigen polysaccharide is composed of an antigen part and a repeat part in common with a Lewis blood group antigen that reacts with a terminal anti-Lewis antibody. Since most Helicobacter pylori strains are smooth, it can be said that smooth Helicobacter pylori is normal Helicobacter pylori. Therefore, when targeting a normal Helicobacter pylori population, the S-type LPS O-antigen polysaccharide part of the Helicobacter pylori of the present invention is an antigen part excluding Lewis antigen, and the S-type Helicobacter pylori The monoclonal antibody specifically recognizing the common LPS antigen portion is a monoclonal antibody that recognizes the LPS antigen common to Helicobacter pylori strains, and is an O-antigen on the LPS antigen of Helicobacter pylori strains. This is a monoclonal antibody that recognizes the LPS antigen part shared by Helicobacter pylori strains, which is a part of the polysaccharide part excluding the Lewis antigen.
The present inventors have confirmed that the antibody titer against the Lewis antigen in human anti-H. Pylori serum is not high, and that the antibody in human serum recognizes an epitope different from the Lewis antigen of O-antigen polysaccharide. . Therefore, when a monoclonal antibody against this epitope was prepared, a monoclonal antibody that recognizes the core oligosaccharide part of Helicobacter pylori LPS, and the Lewis antigen part of the O-antigen polysaccharide part on the S-type LPS of Helicobacter pylori were removed. A monoclonal antibody recognizing an LPS antigen part commonly shared by smooth Helicobacter pylori strains, and an antigen part excluding Lewis antigen from the O-antigen polysaccharide part of Helicobacter pylori S-type LPS Thus, monoclonal antibodies that recognize the LPS antigen portion possessed by some S-type Helicobacter pylori strains, and hybridomas that produce these monoclonal antibodies were obtained. As a result of the examination of the reactivity of the monoclonal antibody, an antigen part excluding Lewis antigen from the monoclonal antibody that recognizes the core oligosaccharide part of the LPS and the O-antigen polysaccharide part of Helicobacter pylori S-type LPS, It has been found that almost all Helicobacter pylori strains can be detected by using in combination with a monoclonal antibody that recognizes the LPS antigen portion shared by Helicobacter pylori strains. Use of a combination of monoclonal antibodies that recognize the LPS antigen part of the S-type Helicobacter pylori strain, which is an antigen part excluding Lewis antigen from the O-antigen polysaccharide part of S-type LPS of H. pylori To detect all Helicobacter pylori strains This has led to the completion of the present invention found that it is.
In addition, the present inventors have a Helicobacter pylori strain derived from a gastric cancer patient having a low antigenic LPS that does not react with serum from chronic gastritis, gastric ulcer and duodenum patients as an antigen, Immunize mice, fuse mouse spleen cells and mouse myeloma cells (myeloma), and obtain low antigenic Helicobacter pylori LPS, that is, monoclonal antibody that specifically recognizes low antigenic LPS from the resulting hybridoma In particular, the present invention has been completed.
The present inventors have found that monoclonal antibodies recognizing low antigenic LPS are abundant in the O-antigen polysaccharide portion of Helicobacter pylori LPS derived from gastric cancer patients, but Helicobacter derived from chronic gastritis patients, gastric ulcer patients and duodenal ulcer patients. It was found that a low antigenic epitope of the LPS part that does not exist in H. pylori LPS is recognized.
The present inventors have further found reagents, kits and methods capable of detecting all Helicobacter pylori by combining the above-described monoclonal antibodies, and further detecting Helicobacter pylori strains derived from gastric cancer patients. .
That is, the present invention is as follows.
(1) a monoclonal antibody that recognizes the core oligosaccharide portion of LPS of Helicobacter pylori,
(2) Monoclonal antibody of (1) that recognizes surface LPS of 26695, CA9, CA6 and CA4 strains among 6 Helicobacter pylori strains, 26695, CA9, CA6, CA4, CA2 and GU2,
(3) Hybridoma strain HPCA / D42-3 (Accession No. FERM BP-7894, as of August 15, 2001 (original deposit), National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center (Higashi 1 Tsukuba City, Ibaraki, Japan) (1) or (2) monoclonal antibody produced by (deposited transfer request from the original deposit to the deposit under the Budapest Treaty on February 14, 2002)
(4) Fab, Fab ', F (ab')₂Or the monoclonal antibody of any one of (1) to (3), which is an Fv fragment,
(5) a hybridoma which is a hybridoma strain HPCA / D42-3 (accession number FERM BP-7894),
(6) a monoclonal antibody that recognizes an LPS antigen part of an S-type Helicobacter pylori S-type LPS O-antigen polysaccharide part excluding a Lewis antigen, and possessed by some S-type Helicobacter pylori strains;
(7) Among the 6 strains of Helicobacter pylori strain 26695, CA9, CA6, CA4, CA2 and GU2, the monoclonal antibody of (6) which recognizes the surface LPS of CA6, CA4, CA2 and GU2 strains,
(8) Hybridoma strain HP220 / B25-3 (Accession No. FERM BP-7893, original deposit on August 15, 2001, the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biology Center (Higashi Tsukuba, Ibaraki, Japan) (6) or (7) monoclonal antibody produced at 1-chome, 1-address, 1-center, 6) (received transfer request from the original deposit to the deposit under the Budapest Treaty on February 14, 2002) ,
(9) Fab, Fab ', F (ab')₂Alternatively, the monoclonal antibody according to any one of (6) to (8), which is an Fv fragment.
(10) a hybridoma which is a hybridoma strain HP220 / B25-3 (accession number FERM BP-7893),
(11) A monoclonal antibody that recognizes an LPS antigen part common to S-type Helicobacter pylori strains, which is an antigen part excluding Lewis antigens from the O-antigen polysaccharide part of S-type LPS of Helicobacter pylori,
(12) Recognize surface LPS of all strains of 26695, CA9, CA6, CA4, CA2, and GU2 among 6 strains of Helicobacter pylori strain 26695, CA9, CA6, CA4, CA2 and GU2 (11) Monoclonal antibodies,
(13) Hybridoma strain HP220 / 2D10-2 (accession number FERM BP-7891, dated February 19, 2001 (original deposit), National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center (East 1 Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan) (11) or (12) central 6) (11) or (12) monoclonal antibody produced by (deposited on February 14, 2002 from the original deposit to transfer to the deposit under the Budapest Treaty),
(14) Fab, Fab ', F (ab')₂Or the monoclonal antibody of any one of (11) to (13), which is an Fv fragment,
(15) a hybridoma which is a hybridoma strain HP220 / 2D10-2 (accession number FERM BP-7891),
(16) a monoclonal antibody that recognizes the low antigenic LPS of Helicobacter pylori strain,
(17) The monoclonal antibody according to (16), which recognizes low antigenic LPS that is abundant in Helicobacter pylori strains derived from gastric cancer patients and does not react with sera of patients with chronic gastritis, gastric ulcer and duodenal ulcer,
(18) Among the six strains of Helicobacter pylori strain 26695, CA9, CA6, CA4, CA2 and GU2, the monoclonal antibody of (16) or (17) which recognizes the surface LPS of CA6, CA4 and CA2 strains,
(19) Hybridoma strain HP217 / B15-4 (Accession No. FERM BP-7892, dated February 19, 2001 (original deposit), National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center (East 1 Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan) Any one of (16) to (18) produced by the deposit at No. 1 Chome No. 1 (Chuo 6) (received transfer request from the original deposit to the deposit under the Budapest Treaty on February 14, 2002) Monoclonal antibodies,
(20) Fab, Fab ', F (ab')₂Or the monoclonal antibody of any one of (16) to (19), which is an Fv fragment,
(21) a hybridoma which is a hybridoma strain HP217 / B15-4 (accession number FERM BP-7892),
(22) A method for detecting LPS of Helicobacter pylori strains using any one of the monoclonal antibodies of (1) to (4) and any of the monoclonal antibodies of (11) to (14),
(23) Further, a method for detecting LPS of Helicobacter pylori strain of (22) using the monoclonal antibody according to any of (6) to (9),
(24) Further, the method for detecting LPS of Helicobacter pylori strains according to (23) using the monoclonal antibody according to any one of (16) to (20),
(25) Low antigenicity that is abundant in Helicobacter pylori strains derived from gastric cancer patients and does not react with serum of patients with chronic gastritis, gastric ulcer or duodenal ulcer using the monoclonal antibody according to any of (16) to (20) A method for detecting LPS;
(26) A method for detecting Helicobacter pylori using the monoclonal antibody of any one of (1) to (4) and the monoclonal antibody of any of (11) to (14),
(27) Furthermore, the method for detecting Helicobacter pylori according to (26) using the monoclonal antibody according to any one of (6) to (9),
(28) Furthermore, the method for detecting Helicobacter pylori according to (27), wherein the monoclonal antibody according to any one of (16) to (20) is used,
(29) Low antigenicity that is abundant in Helicobacter pylori strains derived from gastric cancer patients using the monoclonal antibody of any one of (16) to (20) and does not react with the serum of patients with chronic gastritis, gastric ulcer or duodenal ulcer A method for detecting low antigenic Helicobacter pylori comprising detecting LPS,
(30) The monoclonal antibody of any one of (1) to (4), the monoclonal antibody of any of (6) to (9), the monoclonal antibody of any of (11) to (14), and (16) to ( 20) a kit for detecting Helicobacter pylori comprising at least one monoclonal antibody selected from the group consisting of any monoclonal antibody;
(31) A kit for detecting Helicobacter pylori according to (30), comprising the monoclonal antibody according to any one of (1) to (4) and the monoclonal antibody according to any one of (11) to (14), and
(32) A kit for detecting low antigenic Helicobacter pylori comprising the monoclonal antibody according to any one of (16) to (20).
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
Production of monoclonal antibodies
The monoclonal antibody of the present invention can be prepared by a known method such as the method of Kohler and Milstein (Kohler, G. and Milstein, C., Nature, 256, 495-497, 1975).
A Helicobacter pylori strain inactivated by formalin treatment or the like can be used as an immunogen. An immunogen can be prepared by suspending the inactivated strain in a buffer solution such as PBS at a concentration of 0.5 to 1.5 mg / mL, preferably 1 mg / mL. The immunogen is desirably administered with a suitable adjuvant such as commercially available Freund's complete adjuvant, Freund's incomplete adjuvant, BCG, aluminum hydroxide gel, pertussis vaccine and the like. In addition, mice, rats, guinea pigs and the like can be used as the immunized animal, but mice are generally used. In the case of mice, mice that are 3 to 10 weeks old, preferably 4 weeks old are used. The prepared immunogen can be administered through any route such as subcutaneous, intraperitoneal, intravenous, intramuscular, or intradermal routes of animals. The interval between immunizations is not particularly limited, but it is desirable to immunize 2 to 5 times, for example, at intervals of 1 to 2 weeks. The dose per administration is not limited, but for example, the immunogen prepared as described above may be mixed with an appropriate adjuvant and administered in an amount of several tens of μl to several hundreds of μl.
Antibody-producing cells are collected from the immunized animal 3 to 10 days after the final immunization. Examples of antibody-producing cells include spleen cells, lymph node cells, thymocytes, and peripheral blood cells, and spleen cells are generally used. Spleen, lymph nodes, thymus, peripheral blood, etc. are removed or collected from the immunized animal, and these tissues are crushed. Further, the crushed material is suspended in a buffer solution such as PBS or a medium such as DMEM, RPMI-1640, E-RDF, and then filtered using a 200-250 μm stainless steel mesh, and then centrifuged. Antibody producing cells can be prepared.
The antibody-producing cells prepared in this way are fused with myeloma cells. As the myeloma cell, a cell line available to those skilled in the art can be used. Myeloma cells are generally obtained from the same species as the immunized animal, but may be possible between different species. The cell line used has drug resistance and cannot survive in a selective medium such as hypoxanthine / aminopterin / thymidine medium (HAT medium) in an unfused state, but only in a state fused with antibody-producing cells. What has the property which can be performed is preferable. Generally, an 8-azaguanine resistant strain is used, and this cell line lacks hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT-) and cannot grow in HAT medium. As myeloma cells, Sp2 / O-Ag14 [ATCC CRL-1581; Nature, 276, 271 (1978)], P3X63Ag8 [ATCC TIB-9; Nature, 265, 495-497 (1978)], P3X63 Ag8U. 1 (P3U1) [ATCC CRL-1580; Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1-7 (1978)], P3X63Ag8.653 [ATCC TIB-18; European J. Biol. Immunology, 6,511-519 (1976)], P2 / NSI / 1-Ag4-1 [ATCC CRL-1581; Nature, 276, 269-270 (1978)] and the like.
Cell fusion is performed in an animal cell culture medium such as MEM, DMEM, RPMI-1640, E-RDF and the like.⁷-10⁸Cells / ml of myeloma cells and antibody-producing cells at a mixing ratio of 1: 1 to 1:10, for example at a ratio of 1: 5, at 30 to 37 ° C. for 1 to 3 minutes in the presence of a fusion promoter. It can be carried out efficiently by bringing them into contact with each other. As the fusion accelerator, polyethylene glycol having an average molecular weight of 1000 to 6000, polyvinyl alcohol, or the like can be used. Cell fusion can also be performed using a fusion virus such as Sendai virus. Furthermore, cell fusion can also be performed by a method using electrical stimulation such as electroporation. A commercially available cell fusion device using electroporation can be used.
Hybridomas can be selected from the cells after cell fusion treatment by a method utilizing selective growth of cells in a selective medium such as HAT medium. For example, the suspension of fused cells is added to Iskov medium (IMDM) supplemented with HAT supplement (Gibco BRL) and interleukin-6 (1 unit / mL).³-10⁷After dilution to cells / mL, add 10 to a 96-well cell culture microplate.²-10⁶The cells are seeded at a cell density of cells / well, a selective medium such as HAT medium is added to each well, and then cell culture is performed while appropriately replacing the selective medium to select hybridomas.
When an 8-azaguanine resistant strain is used as the myeloma cell, and the HAT medium is used as the selection medium, the unfused myeloma cells die about 7 to 10 days after the culture, and the antibody-producing cells that are normal cells are also in vitro. Cannot survive for a long time, and it dies about 7 to 10 days after culture. As a result, cells that grow from about 6 to 10 days in culture can be obtained as hybridomas.
The culture supernatant of the proliferated cells is assayed for the production of antibodies against the core oligosaccharide moiety on the LPS antigen of Helicobacter pylori and screened for hybridomas producing the desired antibodies. Hybridoma screening can be performed by a conventional method. For example, a part of the culture supernatant contained in the well in which the hybridoma is grown is collected and tested for whether the target antibody is contained by enzyme immunoassay (EIA, ELISA), radioimmunoassay (RIA), etc. can do. For example, a culture containing a monoclonal antibody in a 96-well microtiter plate adsorbed with LPS prepared from Helicobacter pylori strains used as an immunogen on a 96-well microtiter plate and LPS core oligosaccharides prepared from other Helicobacter pylori strains. The supernatant is added to react with the antigen.
Next, the enzyme-labeled anti-mouse immunoglobulin antibody is reacted with the bound specific antibody, and an enzyme substrate is added to each well to cause color development, and whether the monoclonal antibody in the culture supernatant reacts with the immobilized LPS. Test. At this time, β-D-galactosidase, peroxidase, alkaline phosphatase, glucose oxidase, or the like is used as an enzyme. The color development can be measured using a signal reader corresponding to the assay system, for example, a microplate reader. By selecting a culture supernatant containing a monoclonal antibody that reacts with and binds to the LPS core oligosaccharide, a hybridoma that produces a monoclonal antibody that recognizes the core oligosaccharide portion of Helicobacter pylori LPS can be screened.
In addition, without purifying the LPS core oligosaccharide, a hybridoma that produces a monoclonal antibody that recognizes LPS is selected, and the reactivity of the culture supernatant with LPS is confirmed to produce a monoclonal antibody that recognizes the core oligosaccharide portion of LPS. Hybridomas can also be selected. The reactivity with LPS is determined by separating the LPS obtained from the treatment of Helicobacter pylori with hot phenol or proteinase K by polyacrylamide gel electrophoresis, reacting with this with a monoclonal antibody, and then developing the color with the labeled secondary antibody. It can be confirmed by a visible immunoblot method (Western blot method) or the like.
In this manner, a hybridoma that produces the desired monoclonal antibody is cloned from the hybridoma in the selected well. Hybridomas can be cloned by limiting dilution, soft agar, fibrin gel, fluorescence excitation cell sorter, etc., and finally a hybridoma that produces a monoclonal antibody that recognizes the core oligosaccharide part of Helicobacter pylori LPS. Can be acquired.
The monoclonal antibody (anti-Helicobacter pylori LPS core oligosaccharide monoclonal antibody) that recognizes the acquired Helicobacter pylori LPS core oligosaccharide is used to produce an anti-Helicobacter pylori LPS core oligosaccharide monoclonal using a normal cell culture method, ascites formation method, etc. Antibodies can be collected.
In the cell culture method, an animal such as IMDM, RPMI-1640, MEM, E-RDF or serum-free medium containing 10-20% calf or fetal bovine serum containing an anti-Helicobacter pylori LPS core oligosaccharide monoclonal antibody-producing hybridoma Normal culture conditions (eg, 37 ° C., 5% CO 2) in cell culture medium.₂The antibody can be obtained from the culture supernatant. In the ascites formation method, mineral oil such as pristane (2, 6, 10, 14-tetramethylpentadecane) is administered into the abdominal cavity of an animal of the same type as that derived from myeloma cells, and then 1 × 10.⁷~ 1x10⁹Cells, preferably 5 × 10⁷~ 1x10⁸A hybridoma producing an anti-Helicobacter pylori LPS core oligosaccharide monoclonal antibody is administered intraperitoneally, and the hybridoma is proliferated in large quantities. The antibody can be obtained by collecting ascites or blood after 1 to 4 weeks, preferably 2 to 3 weeks.
When antibody purification is required, known methods such as ammonium sulfate salting-out, ion exchange chromatography using anion exchangers such as DEAE cellulose, molecular sieve chromatography based on molecular weight and structure, hydroxyapatite chromatography, etc. The method can be appropriately selected, or can be purified by combining them.
In this way, the monoclonal antibody of the present invention can be obtained. Even if the monoclonal antibody is a complete antibody, Fab, Fab ', F (ab')₂Or a fragment having an antigen binding site such as Fv.
Moreover, as a specific monoclonal antibody with respect to the LPS core oligosaccharide of Helicobacter pylori, what a hybridoma strain HPCA / D42-3 produces can be used, for example.
Moreover, the antibody which recognizes the part except a Lewis antigen among the O-antigen polysaccharide part on the S type LPS antigen of Helicobacter pylori can be obtained using LPS of several types of S type Helicobacter pylori strains. At this time, if one that reacts with LPS of S. Helicobacter pylori strains is selected widely, it is a portion of the O-antigen polysaccharide portion on the S-type LPS antigen of Helicobacter pylori excluding Lewis antigen, An antibody recognizing the LPS antigen portion shared by Helicobacter pylori strains can be obtained. Furthermore, if a substance that reacts with LPS of some S-type Helicobacter pylori strains is selected, the O-antigen polysaccharide part on the S-type LPS antigen of Helicobacter pylori is a part excluding Lewis antigen, An antibody recognizing the LPS antigen part of some S-type Helicobacter pylori strains can be obtained. Here, “an antibody recognizing an LPS antigen part possessed by some S-type Helicobacter pylori” refers to a plurality of S-type Helicobacter pylori isolated from gastric disease patients such as gastric cancer, chronic gastritis, gastric ulcer, and duodenal ulcer. Among them, for example, an antibody that reacts with and recognizes 80% or less of Helicobacter, and preferably an antibody that reacts with and recognizes 70% or less of Helicobacter. Specifically, when reacting with 7 out of 14 S-type Helicobacter pylori strains, it corresponds to “an antibody recognizing an LPS antigen part possessed by some S-type Helicobacter pylori”. As the former antibody, hybridoma strain HP220 / 2D10-2 can also be used. Moreover, hybridoma strain HP220 / B-25-3 can also be used as the latter antibody.
Similar to the acquisition of the monoclonal antibody that recognizes the core oligosaccharide part of LPS of Helicobacter pylori, the antigen part excluding Lewis antigen from the O-antigen polysaccharide part of S-type LPS of Helicobacter pylori, A part of a monoclonal antibody that recognizes the LPS antigen part shared by Helicobacter pylori or a part of the O-antigen polysaccharide on the S-type LPS antigen of Helicobacter pylori, excluding Lewis antigen, In obtaining a monoclonal antibody that recognizes the LPS antigen portion of H. pylori strain, the monoclonal antibody that recognizes S-type LPS can be obtained without purifying the antigen portion excluding Lewis antigen from the O-antigen polysaccharide portion of S-type LPS. Among them, SDS-PAGE and immunoassay using S-type LPS and Lewis antigen Analysis by the lot (Western blot analysis), can be selected monoclonal antibodies that recognize an antigen portion excluding the Lewis antigen of O- antigen polysaccharide portion of the S-type LPS.
Furthermore, a monoclonal antibody that recognizes LPS of low antigenic Helicobacter pylori can be obtained as follows. The culture supernatant of the proliferating cells is assayed for the production of an antibody that recognizes LPS of low antigenic Helicobacter pylori, and a hybridoma that produces the target antibody is screened. Hybridoma screening can be performed by a conventional method. For example, a part of the culture supernatant contained in the well in which the hybridoma is grown is collected and tested for whether the target antibody is contained by enzyme immunoassay (EIA, ELISA), radioimmunoassay (RIA), etc. can do. For example, prepared in a 96-well microtiter plate from LPS prepared from low antigenic Helicobacter pylori strains from multiple gastric cancer patients and from high antigenic Helicobacter pylori strains from multiple chronic gastritis patients, gastric ulcer patients or duodenal ulcer patients A culture supernatant containing a monoclonal antibody is added to a 96-well microtiter plate to which LPS has been adsorbed, and reacted with an antigen. Next, the enzyme-labeled anti-mouse immunoglobulin antibody is reacted with the bound specific antibody, and an enzyme substrate is added to each well to develop color, and it is tested whether the monoclonal antibody in the culture supernatant reacts with the solid phase LPS. To do. At this time, β-D-galactosidase, peroxidase, alkaline phosphatase, glucose oxidase, or the like is used as an enzyme. The color development can be measured using a signal reader corresponding to the assay system, for example, a microplate reader. A hybridoma that produces an antibody that recognizes and binds to an LPS antigen common to low antigenic Helicobacter pylori strains by selecting a culture supernatant containing a monoclonal antibody that reacts with LPS derived from the low antigenic Helicobacter pylori strain Can be screened.
In this manner, a hybridoma that produces the desired monoclonal antibody is cloned from the hybridoma in the selected well. Hybridoma cloning can be performed by limiting dilution, soft agar, fibrin gel, fluorescence excitation cell sorter, or the like, and finally a hybridoma that produces the desired monoclonal antibody can be obtained.
Monoclonal antibodies that recognize LPS of low antigenic Helicobacter pylori can be collected from the obtained hybridoma producing monoclonal antibody that recognizes LPS of Helicobacter pylori using normal cell culture method, ascites formation method, etc. .
In the cell culture method, IMDM, RPMI-1640, MEM, E-RDF or serum-free monoclonal antibody-producing hybridoma that recognizes LPS of low antigenic Helicobacter pylori containing 10-20% calf or fetal bovine serum In an animal cell culture medium such as a medium, normal culture conditions (for example, 37 ° C., 5% CO 2₂The antibody can be obtained from the culture supernatant. In the ascites formation method, mineral oil such as pristane (2, 6, 10, 14-tetramethylpentadecane) is administered into the abdominal cavity of an animal of the same type as that derived from myeloma cells, and then 1 × 10.⁷~ 1x10⁹Cells, preferably 5 × 10⁷~ 1x10⁸A monoclonal antibody-producing hybridoma that recognizes LPS of low antigenic Helicobacter pylori in cells is administered intraperitoneally, and the hybridoma is proliferated in large quantities. The antibody can be obtained by collecting ascites or blood after 1 to 4 weeks, preferably 2 to 3 weeks.
When antibody purification is required, known methods such as ammonium sulfate salting-out, ion exchange chromatography using anion exchangers such as DEAE cellulose, molecular sieve chromatography based on molecular weight and structure, hydroxyapatite chromatography, etc. The method can be appropriately selected, or can be purified by combining them.
In this way, a specific monoclonal antibody against the low antigenic Helicobacter pylori LPS of the present invention can be obtained. Even if the monoclonal antibody is a complete antibody, Fab, Fab ', F (ab')₂Or a fragment having an antigen binding site such as Fv.
Further, as a monoclonal antibody, for example, one produced by hybridoma strain HP217 / B15-4 can be used.
The reactivity of the monoclonal antibody of the present invention with LPS is determined by separating the LPS obtained by heat phenol treatment or proteinase K treatment of Helicobacter pylori cells by polyacrylamide gel electrophoresis, reacting the monoclonal antibody with this, and labeling. This can be confirmed by immunoblotting, etc., in which color development by the secondary antibody is observed.
To confirm whether Helicobacter pylori isolated from a patient's stomach biopsy material is hypoantigenic, LPS prepared from the test Helicobacter pylori strain is solid-phased on a microtiter plate, and the serum of a gastric ulcer or duodenal ulcer patient Can be carried out by the EIA method in which is reacted. That is, a Helicobacter pylori strain having LPS to which the serum of a gastric ulcer or duodenal ulcer patient does not react is regarded as a low antigenic Helicobacter pylori.
Detection of Helicobacter pylori
Using the thus obtained Helicobacter pylori LPS core oligosaccharide-specific monoclonal antibody, it is possible to detect Helicobacter pylori strains having R-type LPS and part of Helicobacter pylori strains having S-type LPS It is.
Further, by using an antibody that recognizes an LPS antigen part common to S-type Helicobacter pylori strains, which is a part of the O-antigen polysaccharide part on the S-type LPS antigen of Helicobacter pylori excluding Lewis antigen. It is possible to detect Helicobacter pylori strains with most S-type LPS. Furthermore, by using an antibody that recognizes the LPS antigen part of a part of the S-type Helicobacter pylori strain, which is a part of the O-antigen polysaccharide part on the S-type LPS antigen of Helicobacter pylori, excluding the Lewis antigen. It is possible to detect Helicobacter pylori strains with some S-type LPS. In addition, the risk of developing a gastric disease in a subject can also be evaluated by detecting whether Helicobacter pylori is present in the subject's stomach using the monoclonal antibody of the present invention. When Helicobacter pylori is detected in the stomach of a subject with the monoclonal antibody of the present invention, the Helicobacter pylori is removed by washing in the stomach of the subject or administration of antibiotics, etc. It can be reduced or eliminated. The monoclonal antibody of the present invention can also be used to determine the effect of removing Helicobacter pylori.
Moreover, it is possible to detect Helicobacter pylori derived from a gastric cancer patient using the monoclonal antibody recognizing LPS of low antigenic Helicobacter pylori obtained as described above. Further, by detecting whether or not Helicobacter pylori recognized by the monoclonal antibody recognizing LPS of the low antigenic Helicobacter pylori of the present invention is present in the stomach of the subject, the risk of developing the subject's gastric cancer can be reduced. It can also be evaluated. When low antigenic Helicobacter pylori is detected in the stomach of a subject by the monoclonal antibody of the present invention, the low antigenic Helicobacter pylori is removed by washing the stomach of the subject or administering antibiotics, etc. It is possible to reduce or eliminate the risk of morbidity. The monoclonal antibody of the present invention can also be used to determine the effect of removing low antigenic Helicobacter pylori.
Among the anti-Helicobacter pylori LPS core oligosaccharide monoclonal antibody and the Helicobacter pylori S-type LPS O-antigen polysaccharide part, the antigen part excluding Lewis antigen, which is commonly shared by S-type Helicobacter pylori strains It is possible to detect almost all Helicobacter pylori strains by using a combination of monoclonal antibodies that recognize portions. Here, “detect almost all” means that it is possible to detect preferably 95% or more of a plurality of Helicobacter pylori isolated from gastric disease patients such as gastric cancer, chronic gastritis, gastric ulcer and duodenal ulcer, and more preferably Means that 98% or more can be detected. For example, when 179 out of 181 separated Helicobacter pylori can be detected, it corresponds to “detect almost all”. Further, these two types of monoclonal antibodies further include a part of the above-described Helicobacter pylori S-type LPS antigen on the O-antigen polysaccharide part excluding Lewis antigen, and some S-type Helicobacter pylori strains It becomes possible to detect all Helicobacter pylori strains by using a combination of monoclonal antibodies that recognize the LPS antigen portion. Here, “to detect all” preferably means that 99% or more of a plurality of Helicobacter pylori isolated from a stomach disease patient can be detected, and more preferably, 100% of Helicobacter pylori can be detected. Say. For example, 181 of 181 separated Helicobacter pylori can be detected. However, Helicobacter pylori does not have a normal LPS antigen structure, and Lewis antigen was excluded from the above-mentioned anti-Helicobacter pylori LPS core oligosaccharide monoclonal antibody, O-antigen polysaccharide part of S-type LPS of Helicobacter pylori. A portion of an antigenic portion that recognizes the LPS antigen portion shared by S-type Helicobacter pylori strains, and a portion excluding Lewis antigen from the O-antigen polysaccharide portion on the S-type LPS antigen of Helicobacter pylori In addition, there are very few strains that cannot be recognized by any of the monoclonal antibodies that recognize the LPS antigen part of some S-type Helicobacter pylori strains. Should be excluded from the calculation.
The above-mentioned anti-Helicobacter pylori LPS core oligosaccharide monoclonal antibody, the antigen part excluding Lewis antigen from the O-antigen polysaccharide part of S-type LPS of Helicobacter pylori, and the LPS commonly possessed by S-type Helicobacter pylori strains Monoclonal antibody that recognizes the antigen part, a part of the O-antigen polysaccharide part on the S-type LPS antigen of Helicobacter pylori, excluding the Lewis antigen, and the LPS antigen part of some S-type Helicobacter pylori strains By using all of the monoclonal antibodies that recognize LPS and low antigenic Helicobacter pylori LPS, all Helicobacter pylori can be detected, and low antigenic Helicobacter pylori derived from stomach cancer patients can be detected. H. pylori strain can be detected
The detection of Helicobacter pylori was known to those skilled in the art such as immunoblotting, enzyme immunoassay (EIA, ELISA), radioimmunoassay (RIA), fluorescent antibody method, method utilizing agglutination, immunochromatography, etc. It can be done by a method. At this time, as a sample, for example, bacteria separated and cultured from gastric biopsy material of a gastric disease patient such as gastric ulcer can be used, but it is not limited thereto.
For example, in a method utilizing an agglutination reaction, an antigen part excluding Lewis antigen from a monoclonal antibody that recognizes LPS core oligosaccharide of Helicobacter pylori and an O-antigen polysaccharide part of S-type LPS of Helicobacter pylori, Helicobacter pylori can be detected by using a carrier sensitized with a monoclonal antibody that recognizes the LPS antigen part commonly possessed by S-type Helicobacter pylori strains. Furthermore, in order to increase the detection rate, the portion of the O-antigen polysaccharide on the S-type LPS antigen of Helicobacter pylori, excluding the Lewis antigen, the LPS antigen part possessed by some S-type Helicobacter pylori strains Recognizing monoclonal antibodies may be sensitized. Furthermore, in order to detect a low antigenic Helicobacter pylori strain derived from a stomach cancer patient-derived strain, a monoclonal antibody that recognizes LPS of the low antigenic Helicobacter pylori may be sensitized.
As a carrier for sensitizing these monoclonal antibodies, any carrier may be used as long as it is insoluble, does not cause a nonspecific reaction, and is stable. For example, latex particles, bentonite, collodion, kaolin, fixed sheep erythrocytes and the like can be used, but it is preferable to use latex particles. As the latex particles, for example, polystyrene latex particles, styrene-butadiene copolymer latex particles, polyvinyl toluene latex particles and the like can be used, but it is preferable to use polystyrene latex particles. When latex particles are used, the antibody can be easily sensitized to the carrier without any special treatment, and the aggregated image generated by the reaction between the target strain and the carrier becomes clear, and the reactivity of the target strain to the carrier is improved. It is further advantageous in that it can be easily and accurately discriminated.
At this time, 2 to 4 types of the above-mentioned 4 types of antibodies may be bound to the carrier at the same time, or these antibodies may be bound to the carrier separately, and 2 to 4 types of 4 types of carriers to which each antibody is bound. It is also possible to use a mixture of four types. Furthermore, you may use the support | carrier to which each antibody was separately couple | bonded for the detection of Helicobacter pylori which each antibody recognizes separately. The monoclonal antibody that recognizes LPS of low antigenic Helicobacter pylori can detect a low antigenic Helicobacter pylori strain derived from a gastric cancer patient-separated strain separately from the other three types. It is preferable to bind to a carrier separately.
The method for sensitizing the monoclonal antibody to the carrier is not particularly limited. For example, the monoclonal antibody may be physically adsorbed on a carrier or chemically bound. More specifically, for example, after mixing a monoclonal antibody and a carrier, the antibody can be sensitized to the carrier by heating and shaking at 30 to 37 ° C. for 1 to 2 hours. The amount of antibody sensitized to the carrier can be appropriately set according to the particle size of the carrier used. After sensitizing the antibody to the carrier, the non-sensitized portion on the carrier surface is preferably blocked with bovine serum albumin, human serum albumin, rabbit serum albumin, ovalbumin or the like. The carrier sensitized with the monoclonal antibody is preferably retained as a medium dispersion until it is reacted with the target strain belonging to Helicobacter pylori. At this time, as the medium, for example, a phosphate buffer, a glycine buffer, or the like can be used. The content of the carrier sensitized to the monoclonal antibody can usually be 0.2 to 0.5% by weight, preferably 0.25 to 0.3% by weight, based on the medium dispersion. . Bovine serum albumin, gelatin, gum arabic and the like may be added to the medium as necessary. The thus prepared monoclonal antibody-sensitized carrier is reacted with the target strain, and the reactivity between the target strain and the monoclonal antibody is discriminated based on the presence or absence or the degree of aggregation, thereby detecting Helicobacter pylori. At this time, the Helicobacter pylori strain may be previously treated with an appropriate extraction reagent such as an enzyme or acetic acid and sodium nitrite.
Further, in the enzyme immunoassay (EIA), an antigen portion excluding Lewis antigen from the LPS-specific monoclonal antibody of Helicobacter pylori and the O-antigen polysaccharide portion of S-type LPS of Helicobacter pylori, wherein S-type Monoclonal antibodies that recognize the LPS antigen portion shared by Helicobacter pylori strains are immobilized on a carrier such as a microtiter plate, resin beads, and magnetized beads by physical adsorption or chemical bonding. Furthermore, in order to increase the detection rate, the portion of the O-antigen polysaccharide on the S-type LPS antigen of Helicobacter pylori, excluding the Lewis antigen, the LPS antigen part possessed by some S-type Helicobacter pylori strains The recognized monoclonal antibody may be immobilized. Further, in order to detect a low antigenic Helicobacter pylori strain derived from a stomach cancer patient, a monoclonal antibody that recognizes LPS of the low antigenic Helicobacter pylori may be immobilized.
At this time, 2 to 4 types of these antibodies may be mixed and immobilized on a carrier, and a carrier on which 2 to 4 types of antibodies are immobilized may be prepared and used for detection of Helicobacter pylori, or separately. Alternatively, a carrier on which each antibody is immobilized may be prepared, and the reactivity with each antibody may be measured separately. A monoclonal antibody that recognizes LPS of low antigenic Helicobacter pylori can detect a low antigenic Helicobacter pylori strain derived from a gastric cancer patient separately from the other three, so that it is separate from the other three It is preferably bound to a carrier.
The amount of the solid phase is not particularly limited, but when the carrier is a microtiter plate, it is preferably several ng to several tens of μg per well. The immobilization can be performed by dissolving the antibody to be immobilized in an appropriate buffer and bringing it into contact with a carrier. For example, when microtiter wells are used, the antibody solution can be solidified by dispensing into a well of a microtiter plate and placing it for a certain period of time. After immobilizing the substrate, blocking is preferably performed using a blocking solution containing bovine serum albumin, human serum albumin, rabbit serum albumin, ovalbumin and the like in order to prevent non-specific binding during the assay. Next, the immobilized carrier and the sample are reacted, and after washing, a labeled monoclonal antibody that recognizes Helicobacter pylori is reacted. The labeling can be performed using an enzyme such as β-D-galactosidase, peroxidase, alkaline phosphatase or glucose oxidase. For example, in enzyme immunoassay (ELISA), a large amount of measurement can be performed at a time by immobilizing a substrate on a microtiter plate having a large number of wells (for example, 96 wells) and performing an antigen-antibody reaction in the wells. It becomes possible. In addition, the amount of antibody used and the amount of sample cells used can be greatly reduced. Furthermore, it is possible to use an automatic measuring device such as a fully automatic EIA measuring device.
Another object of the present invention is to provide a kit that enables detection of almost all Helicobacter pylori strains, which kit comprises at least a monoclonal antibody that recognizes the LPS core oligosaccharide of Helicobacter pylori and S of Helicobacter pylori. The monoclonal antibody which recognizes the LPS antigen part which is an antigen part except the Lewis antigen among the O-antigen polysaccharide part of type | mold LPS, and is common to S type Helicobacter pylori strains. Another object of the present invention is to provide a kit that enables detection of all Helicobacter pylori strains, and the kit further comprises a Lewis antigen of the O-antigen polysaccharide portion on the S-type LPS antigen of Helicobacter pylori. And a monoclonal antibody that recognizes the LPS antigen part of some S-type Helicobacter pylori strains. Another object of the present invention is to provide a kit that enables detection of a low antigenic Helicobacter pylori strain derived from a stomach cancer patient. The kit further comprises a monoclonal antibody that recognizes LPS of low antigenic Helicobacter pylori. Including. When the kit is based on the EIA method, it may contain a carrier for immobilizing the antibody, and the antibody may be bound to the carrier in advance. When the kit is based on an agglutination method using a carrier such as latex, the kit may contain a carrier on which an antibody is adsorbed. Further, the kit may appropriately contain a blocking solution, a reaction solution, a reaction stop solution, a reagent for treating the sample, and the like.
As described above, among the monoclonal antibody that recognizes the core oligosaccharide of Helicobacter pylori LPS and the O-antigen polysaccharide portion of Helicobacter pylori S-type LPS according to the present invention, Almost all Helicobacter pylori can be detected by using a monoclonal antibody that recognizes the LPS antigen part shared by Helicobacter pylori strains, and among the O-antigen polysaccharide parts on the S-type LPS antigen of Helicobacter pylori All the Helicobacter pylori can be detected using a monoclonal antibody that recognizes the LPS antigen part of the S-type Helicobacter pylori strain, excluding the Lewis antigen. Using a monoclonal antibody that recognizes LPS of the stomach Because low antigenic Helicobacter pylori strains derived from patients can be detected, bacteria isolated from gastric biopsy materials can be quickly differentiated from Helicobacter pylori, and Helicobacter pylori can be detected. The time and labor required for investigating specific properties can be greatly reduced.
In addition, it is an antigen part except Lewis antigen among the monoclonal antibody which recognizes the core oligosaccharide of Helicobacter pylori LPS and the S-type LPS of Helicobacter pylori, and is the antigen part except for the Lewis antigen, and the S-type Helicobacter pylori strain is common. Almost all Helicobacter pylori was detected using a monoclonal antibody that recognizes the LPS antigen part, or Lewis antigen was removed from the O-antigen polysaccharide part on the S-type LPS antigen of Helicobacter bilori All of the Helicobacter pylori using a monoclonal antibody that recognizes the LPS antigen part of some S-type Helicobacter pylori strains, or low antigenic Helicobacter derived from a stomach cancer patient -Whether to detect H. pylori strain is the target detection rate, Can be selected according to the disease or the disease to be detected or detected, and the cost and time required for preparation can be reduced by reducing the number of antibodies to be used. it can.
Further, Helicobacter pylori can be classified by the reactivity pattern with the four types of monoclonal antibodies of the present invention, and the classification can be associated with various gastric diseases. In addition to the four monoclonal antibodies of the present invention, anti-Lewis (Le^x, Le^y, Le^a, Le^b, Le^d) Helicobacter pylori can be further subdivided according to the reactivity pattern with the antibody.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described specifically by way of examples. However, the present invention is not limited to these examples.
Example 1 Production of monoclonal antibody against Helicobacter pylori
Preparation of immune antigen
Helicobacter pylori strain 220-B is cultured at 37 ° C. for 3 to 4 days under microaerobic conditions using a blood agar medium. The grown cells are suspended in phosphate buffered saline (PBS) and inactivated by formalin treatment. The inactivated cells are prepared with PBS to a concentration of 0.5 to 1.5 mg / mL, preferably 1 mg / mL, and used as an immunizing antigen.
Preparation of monoclonal antibodies
100 μL of the above immunizing antigen was immunized with Freund's complete adjuvant to 5-week-old female BALB / c mice, and 2 weeks later, 50 μL of the same antigen was boosted with Freund's incomplete adjuvant. Two weeks later, 25 μL of the same antigen was injected into a vein, and spleen cells were removed 3 days later. The extracted spleen cells were fused with mouse myeloma cells (P3X63) by the method of Keller et al. (Kohler et al., Nature, vol. 256, p495-497 (1975)) and cultured at 37 ° C. in a carbon dioxide incubator. . The obtained hybridoma culture supernatant was used as a specimen, and the hybridoma was screened by ELISA using a solid phase with S-type LPS (217, 220, CA4 strain) of Helicobacter pylori strain as an antigen. Hybridomas of culture supernatant that reacted with all S-type LPS were selected. The hybridoma screened is seeded in a 96-well plate at 0.5 cells / well by the limiting dilution method, and only the hybridoma grown as a single colony in the well is used as a clone. Cloning is performed by repeating this limiting dilution method twice. It was. According to the above, a monoclonal antibody-producing cell line against the core oligosaccharide of Helicobacter pylori LPS, an antigen part excluding Lewis antigen from the O-antigen polysaccharide part of S-type LPS of Helicobacter pylori, and an S-type Helicobacter pylori strain Antibody-producing cell line recognizing the LPS antigen part in common and the O-antigen polysaccharide part on the S-type LPS antigen of Helicobacter pylori, excluding the Lewis antigen, and a part of the S-type Helicobacter A monoclonal antibody-producing cell line that recognizes the LPS antigen part possessed by H. pylori strains was obtained. The obtained cell line was intraperitoneally administered to pristane-treated BALB / c mice, and about 2 weeks later, antibody-containing ascites was collected. IgG was purified from the obtained ascites by an ammonium sulfate salting-out method.
Example 2 Production of monoclonal antibodies against low antigenic Helicobacter pyloriPreparation of immune antigen
The low antigenic Helicobacter pylori CA2 strain is cultured at 37 ° C. for 3 to 4 days under microaerobic conditions using a blood agar medium. The grown cells are suspended in phosphate buffered saline (PBS) and inactivated by formalin treatment. The inactivated cells are prepared with PBS to a concentration of 0.5 to 1.5 mg / ml, preferably 1 mg / mL, and used as an immunizing antigen.
Preparation of monoclonal antibodies
100 μL of the above immunizing antigen was immunized with Freund's complete adjuvant to 5-week-old female BALB / c mice, and 2 weeks later, 50 μL of the same antigen was boosted with Freund's incomplete adjuvant. Two weeks later, 25 μL of the same antigen was injected into a vein, and spleen cells were removed 3 days later. The extracted spleen cells were fused with mouse myeloma cells (P3X63) by the method of Keller et al. (Kohler et al., Nature, vol. 256, p495-497 (1975)) and cultured at 37 ° C. in a carbon dioxide incubator. Hybridomas were screened by ELISA using LPS of three low antigenic Helicobacter pylori strains and three high antigenic Helicobacter pylori strains as antigens. Specifically, hybridomas that react with LPS of low antigenic Helicobacter pylori but do not react with LPS of high antigenic Helicobacter pylori were selected. The hybridoma screened is seeded in a 96-well plate at 0.5 cells / well by the limiting dilution method, and only the hybridoma grown as a single colony in the well is used as a clone. Cloning is performed by repeating this limiting dilution method twice. It was.
As described above, monoclonal antibody-producing cell lines against several low antigenic Helicobacter pylori LPS were obtained. The obtained cells were intraperitoneally administered to pristane-treated BALB / c mice, and about 2 weeks later, antibody-containing ascites was collected. IgG was purified from the obtained ascites by an ammonium sulfate salting-out method to obtain a monoclonal antibody.
Example 3 Reactivity of monoclonal antibodies with LPS
Helicobacter pylori LPS was obtained in two ways. The first is a hot phenol water extraction method to obtain purified LPS. 1 g of 1% phenol-treated dry cells of Helicobacter pylori cultured was suspended in 80 mL distilled water and mixed with an equal amount of 90% phenol water. The mixture was stirred at 68 ° C. for 15 minutes, then returned to room temperature, and then centrifuged (2500 rpm, 20 minutes) to remove the aqueous layer (supernatant). Add 80 mL distilled water to the remaining phenol layer and stir again at 68 ° C. for 15 minutes. After cooling to room temperature, the mixture was centrifuged (2500 rpm, 20 minutes), the aqueous layer was taken out, and dialyzed together with the previous aqueous layer (changing distilled water twice a day for 3 days).
After dialysis, the dialyzed solution was lyophilized, dissolved in a small amount of distilled water, and LPS was precipitated by ultracentrifugation (100,000 × g, 3 hours). This precipitate was washed twice by ultracentrifugation (100,000 × g, 3 hours), and finally freeze-dried to obtain purified LPS.
Secondly, LPS by proteinase K treatment is not purified, but can be used for immune reactions such as immunoblotting. The dry cell solution (2 mg) was dissolved in 1 mL of Lysing buffer (upper Tris buffer used for 20% glycerol, 10% 2-mercaptoethanol, 6% SDS, 10% SDS-PAGE) and heated at 100 ° C. for 10 minutes. After cooling to room temperature, 200 μL of proteinase K (2.5 mg / mL) was added and reacted at 37 ° C. for 14 hours and further at 65 ° C. for 2 hours. The obtained sample was used for SDS-PAGE and the like.
The reactivity of LPS with monoclonal antibodies was examined by SDS-PAGE and immunoblotting. As a sample for electrophoresis, about 0.8 μg of purified LPS and about 100 μg of proteinase K-treated LPS converted to the first bacterial cells were added to one well, and SDS-PAGE with a 12.5% gel concentration was performed by a conventional method. Do. After the electrophoresis, the gel was transferred to a PVDF membrane filter, reacted with a monoclonal antibody (diluted 500 times) as a primary antibody and an anti-mouse Ig antibody (diluted 500 times) as a secondary antibody, and developed with diaminobenzene. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 2, the anti-Helicobacter pylori LPS core oligosaccharide monoclonal antibody (antibody I) of the present invention reacts with a low molecular weight core oligosaccharide, and Lewis of the O-antigen polysaccharide portion of Helicobacter pylori S-type LPS. A monoclonal antibody (antibody II) that recognizes the LPS antigen part, which is an antigen part excluding the antigen and which is common to S-type Helicobacter pylori strains, reacted with S-type LPS in a ladder form. Further, a monoclonal antibody (antibody) that recognizes the LPS antigen part of a part of the S-type Helicobacter pylori strain, which is a part of the O-antigen polysaccharide part on the S-type LPS antigen of Helicobacter pylori excluding the Lewis antigen III) also reacted with S-type LPS in a ladder form, but the reactivity pattern for each strain was different from that of antibody II. Furthermore, a monoclonal antibody (antibody IV) that recognizes LPS of low antigenic Helicobacter pylori also reacted with LPS in a ladder form, but the reactivity pattern for each strain was different from other monoclonal antibodies.
Example 4 Confirmation of low antigenic Helicobacter pylori
Low antigenic Helicobacter pylori was confirmed by hot phenol water extraction method, immunoblot using proteinase K-treated LPS, or detection method by ELISA.
The test strain, Helicobacter pylori strain, was cultured on a blood agar medium at 37 ° C. for 4 days under microaerobic conditions. The grown bacterial cells were suspended in physiological saline, and LPS was extracted by adding an equal amount of hot phenol. Next, centrifugation was performed to collect an aqueous layer portion, which was dialyzed against running water to obtain an LPS sample. This was diluted 50-fold with 50 mM sodium carbonate buffer (pH 9.6), dispensed onto a microplate, and allowed to stand overnight at 4 ° C. for solid phase. Then, it blocked with bovine serum albumin (BSA), and was set as the plate for EIA. Gastric ulcer patient serum was diluted 200-fold with 0.05% Tween 20 phosphate buffered saline (PBST), and 100 μl thereof was dropped into each well and reacted at room temperature for 1 hour. The reaction solution was removed by suction, and 200 μL of PBST was added to each well and washed three times. After washing, 100 μL of a peroxidase-labeled goat anti-human IgG antibody diluted 50000 times with PBST was added to each well and allowed to stand at room temperature for 1 hour. Thereafter, 200 μL of PBST was added to each well and washed four times. After washing, 100 μL of a substrate solution (3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine, hydrogen peroxide) was added and allowed to stand at room temperature for 30 minutes.
Next, 100 μL of a reaction stop solution (0.6 N sulfuric acid) was added to stop the reaction, and the absorbance was measured with an auto reader (wavelength 450 nm / 630 nm).
Example 5 Identification of Helicobacter pylori by latex slide aggregation method
(1) Preparation of monoclonal antibody-sensitized latex
As a support, spherical particles made of polystyrene having a diameter of 0.3 μm (latex: commercially available product) were used. The monoclonal antibody and latex particles obtained in Examples 1 and 2 were each dissolved in phosphate buffered saline (pH 7.0), and the antibody was supported so that the weight ratio of antibody to latex particles was 1:10. Immobilized to. This was washed with phosphate buffered saline and blocked with bovine serum albumin to obtain antibody-sensitized latex.
(2) Specimen processing method
All the test bacteria cultured on one blood agar medium petri dish are collected and suspended in 250 μL of physiological saline. To this, 250 μL each of extraction reagent 1 (acetic acid) and extraction reagent 2 (sodium nitrite) was added and left for 10 minutes. Thereafter, 250 μL of Extract 3 (buffer solution) was added to neutralize it to prepare a sample.
(3) Slide aggregation reaction
25 μL of the sample obtained by the method (2) was dropped into a circle of a paper slide plate, and 50 μL of the antibody-sensitized latex prepared in (1) was added and mixed. After stirring for 1 minute, the presence or absence of agglomeration was observed with the naked eye, and agglutination was positive and agglutination was negative.
Example 6 Specificity of a monoclonal antibody (antibody IV) -sensitized latex reagent that recognizes LPS of low antigenic Helicobacter pylori
The Helicobacter pylori strain isolated from various gastric disease patients was tested as in Example 5 after confirming low or high antigenicity by the method shown in Example 4.
The results are shown in Table 1. All strains belonging to the low antigenic Helicobacter pylori were positive in this sensitized latex. On the other hand, highly antigenic Helicobacter pylori did not react with the sensitized latex.

Example 7 LPS antigen shared by strains of S. Helicobacter pylori (LPS specific to Helicobacter pylori species), that is, an antigen portion excluding Lewis antigen from the O antigen polysaccharide portion of S-type LPS of Helicobacter pylori Specificity of a monoclonal antibody (antibody II) -sensitized latex reagent that specifically recognizes the LPS antigen portion shared by S-type Helicobacter pylori
The test was carried out as in Example 5 using Helicobacter pylori strains isolated from patients with various stomach diseases, strains other than Helicobacter pylori belonging to the genus Helicobacter, and Campylobacter.
The results are shown in Table 2. All the strains whose biochemical properties belong to Helicobacter pylori were positive in this sensitized latex. On the other hand, strains classified into the genus Helicobacter other than Helicobacter pylori and strains classified into the genus Campylobacter were all determined to be negative.

Example 8 Reactivity pattern of Helicobacter pylori strain 181 using four types of antibodies (antibodies I, II, III and IV) sensitized latex reagent
The test was carried out as in Example 5 using Helicobacter pylori strain 181 and antibodies I, II and III isolated from patients with various gastric diseases.
The results are shown in Table 3. By using antibodies I and II, almost 179 strains out of 181 strains can be detected, and by using antibodies I, II and III, all 181 strains can be detected.

I: Anti-Helicobacter pylori LPS core oligosaccharide monoclonal antibody
II: Monoclonal antibody that recognizes the LPS antigen part common to S-type Helicobacter pylori strains, which is the antigen part of the Helicobacter pylori S-type LPS O-antigen polysaccharide part excluding Lewis antigen
III: Monoclonal antibody that recognizes the LPS antigen part of some S-type Helicobacter pylori strains, which is a part of the O-antigen polysaccharide part on the S-type LPS antigen of Helicobacter pylori excluding the Lewis antigen
Furthermore, the test was similarly conducted using 181 strains using antibody IV.
The results are shown in Table 4. There were 17 Helicobacter strains detected by antibodies recognizing LPS of low antigenic Helicobacter pylori out of 181 strains.

IV: Monoclonal antibody that recognizes LPS of low antigenic Helicobacter
Example 9 Detection with 4 antibodies (antibodies I, II, III and IV) and 14 strains of Helicobacter pylori
LPS was purified from 14 strains of Helicobacter pylori (Nippon Bacteriology, 56 (2): 421-433, 2001, etc.) by the method described in Example 3, and five types of commercially available anti-Lewis antigen antibodies (Le^x: Seikagaku Corporation, Le^aManufactured by Chemicon; Le^y, Le^b, Le^dThe reactivity with three types of anti-Helicobacter pylori LPS monoclonal antibodies (anti-Hp monoclonal antibodies) was confirmed by immunoblotting described in Example 3.
The results are shown in Table 5. From the results of electrophoresis, among the 14 Helicobacter pylori strains, the CG10 strain, the DU8 strain and the O1 strain have the R-type LPS without the O-antigen polysaccharide of FIG. 1, and the other 11 strains have the O-antigen. It was found to have S-type LPS with polysaccharides. The anti-Helicobacter pylori LPS core oligosaccharide monoclonal antibody (antibody I) of the present invention reacted with 2 strains out of 3 strains that were R-type LPS and reacted with 9 strains among 11 strains that were S-type LPS. A monoclonal antibody (antibody) that recognizes the LPS antigen part of a part of the S-type Helicobacter pylori strain, which is a part of the O-antigen polysaccharide part of the S-type LPS antigen of Helicobacter pylori excluding the Lewis antigen III) reacted with 7 of 11 strains that were S-type LPS. Monoclonal antibody (antibody II) that recognizes the LPS antigen portion shared by S-type Helicobacter pylori strains, which is a portion excluding the Lewis antigen portion of the O-antigen polysaccharide portion on S-type LPS of Helicobacter pylori Did not react with the rough strain and reacted with all the smooth strains. A monoclonal antibody (antibody IV) that recognizes LPS of low antigenic Helicobacter pylori reacted with 4 out of 14 strains.
There were Helicobacter pylori strains that did not react with any of the anti-Helicobacter pylori LPS monoclonal antibodies and anti-Lewis antibodies, such as the O1 strain.

I: Anti-Helicobacter pylori LPS core oligosaccharide monoclonal antibody
II: Monoclonal antibody that recognizes the LPS antigen part common to S-type Helicobacter pylori strains, which is the part of the O-antigen polysaccharide part on the S-type LPS of Helicobacter pylori excluding the Lewis antigen part
III: Monoclonal antibody that recognizes the LPS antigen part of some S-type Helicobacter pylori strains, which is a part of the O-antigen polysaccharide part on the S-type LPS antigen of Helicobacter pylori excluding the Lewis antigen
IV: Monoclonal antibody that recognizes LPS of low antigenic Helicobacter
*: LPS purified from Helicobacter pylori strains
**: Analysis of electrophoresis pattern by silver staining S: Smooth type
R: Rough type
Industrial applicability
As shown in the Examples, the anti-Helicobacter pylori LPS core oligosaccharide monoclonal antibody of the present invention is recognized by the monoclonal antibody that recognizes the portion excluding the Lewis antigen portion from the O-antigen polysaccharide portion on the S-type LPS of Helicobacter pylori. Non-helicobacter pylori LPS core oligosaccharide monoclonal antibody and O-antigen polysaccharide part on S-type LPS of Helicobacter pylori, excluding the Lewis antigen part, It is possible to detect almost all Helicobacter pylori strains by detecting Helicobacter pylori using a monoclonal antibody that recognizes the LPS antigen part commonly shared by Helicobacter pylori strains. Furthermore, the O-antigen polysaccharide portion on the S-type LPS antigen of Helicobacter pylori according to the present invention is a portion excluding Lewis antigen, which is a monoclonal that recognizes the LPS antigen portion possessed by some S-type Helicobacter pylori strains. All Helicobacter pylori strains can be detected by detecting Helicobacter pylori using an antibody. Furthermore, if the antibody recognizing LPS of low antigenic Helicobacter pylori of the present invention is used, Helicobacter pylori derived from a stomach cancer patient can be detected, and the possibility of gastric cancer can also be diagnosed. Therefore, the monoclonal antibody of the present invention can be widely used effectively for diagnosis of gastric diseases and the like.
All publications cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety. It will be readily apparent to those skilled in the art that various modifications and variations can be made in the present invention without departing from the spirit or scope of the invention as set forth in the appended claims. The present invention is intended to encompass such variations and modifications.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing an estimated structure of Helicobacter pylori LPS.
FIG. 2 shows an anti-Helicobacter pylori LPS core oligosaccharide monoclonal antibody (MoAb I) as an antibody and an antigen portion excluding Lewis antigen from the O-antigen polysaccharide portion of S-type LPS of Helicobacter pylori, A monoclonal antibody (MoAb II) that recognizes the LPS antigen part commonly shared by Helicobacter pylori strains, a part of the O-antigen polysaccharide part on the S-type LPS antigen of Helicobacter pylori, excluding the Lewis antigen, A monoclonal antibody (MoAb III) recognizing the LPS antigen part of the S-type Helicobacter pylori strain and a monoclonal antibody (MoAB IV) recognizing LPS of low antigenic Helicobacter pylori were used, and Helicobacter pylori LPS was used as the antigen. Diagram showing the results of Western blotting A.

Claims

Method for detecting Helicobacter pylori using the following four types of monoclonal antibodies:
(a)   Hybridoma strain HPCA / D42-3 (Contract number FERM BP-7894 ) Produced by Helicobacter pylori LPS Antibody that recognizes or its Fab , Fab ’, F (ab ’ ) 2 Or Fv fragment;
(b)   Hybridoma strain HP220 / B25-3 (Contract number FERM BP-7893 ) Produced by Helicobacter pylori LPS Antibody that recognizes or its Fab , Fab ’, F (ab ’ ) 2 Or Fv fragment;
(c)   Hybridoma strain HP220 / 2D10-2 (Contract number FERM BP-7891 ) Produced by Helicobacter pylori LPS Antibody that recognizes or its Fab , Fab ’, F (ab ’ ) 2 Or Fv Fragments; and
(d)   Hybridoma strain HP217 / B15-4 (Contract number FERM BP-7892 ) Produced by Helicobacter pylori LPS Antibody that recognizes or its Fab , Fab ’, F (ab ’ ) 2 Or Fv fragment.

Hybridoma strain HPCA / D42-3 (Contract number FERM BP-7894 ) Produced by Helicobacter pylori LPS Antibody that recognizes or its Fab , Fab ’, F (ab ’ ) 2 Or Fv fragment.

Hybridoma strain HP220 / B25-3 (Contract number FERM BP-7893 ) Produced by Helicobacter pylori LPS Antibody that recognizes or its Fab , Fab ’, F (ab ’ ) 2 Or Fv fragment.

Hybridoma strain HP220 / 2D10-2 (Trust number FERM BP-7891 ) Produced by Helicobacter pylori LPS Antibody that recognizes or its Fab , Fab ’, F (ab ’ ) 2 Or Fv fragment.

Hybridoma strain HP217 / B15-4 (Contract number FERM BP-7892 ) Produced by Helicobacter pylori LPS Antibody that recognizes or its Fab , Fab ’, F (ab ’ ) 2 Or Fv fragment.