JP4762897B2 - siRNA発現システム - Google Patents
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Description
i) 5’および3’末端の形成に必要な配列を有さない、または非常に少ない配列しか有さない、
ii) pre-siRNAは、細胞質に迅速に運ばれ、そこで、効率的に成熟形態に変換される、
iii) ds-オリゴヌクレオチドの使用によって迅速にクローニングすることができるので、異常な生成物を非常に頻度高く産生することとなるPCR増幅工程を避けることができる、
iv) U1 snRNA遺伝子は、安定的な細胞クローンでサイレンシングを起こさない強力なpol IIプロモーターを有している。
更にその上、本発明者は、干渉応答メディエーターとして、1つの一本鎖siRNAのセレクションを可能とする特異的なエレメントを同定した。
正確なサイズの二重鎖siRNAの効率的な蓄積をもたらした。siRNA発現プラスミドでトランスフェクトしたHeLa細胞から抽出したタンパク質のウェスタンブロット分析によって、本発明の対象であるこれらのベクターがラミンA/Cタンパク質の発現を非常に効率的に抑制することが示された。二本鎖siRNAの一方の不均衡な遊離を決定する配列も同定した。
a) U1 snRNA遺伝子に由来するポリメラーゼII RNA依存性プロモーター配列;
b) pre-siRNAまたはpre-miRNAを転写する配列をクローニングするための適切な制限部位;
c) +1位でのAまたはG残基;サイレンシングさせる遺伝子によって転写されるmRNAのセンス領域に対応する21から23ヌクレオチドの配列であって、pre-siRNAのステムの第一の断片を構成する配列;pre-siRNAのループ領域からなるpre-miRNA配列から選択される配列;サイレンシングさせる遺伝子によって転写されるmRNAのアンチセンス領域に対応する21から23ヌクレオチドの配列であって、pre-siRNAのステムの第二の断片を構成する配列;以下の構造:
を含むpre-siRNAを転写する配列、または、その代わりとしてのpre-miRNAを転写する配列、
d) pre-siRNAまたはpre-miRNAそれぞれの3’末端の正確な形成に必要且つ十分な、U1 snRNA遺伝子の3’末端配列に由来する終結配列;
を含む。
siRNAのin vivo発現のためのベクターの使用は、選択した病気モデルに対するRNAi応答をもたらす治療ツールとして、非常に有力なアプリケーションであることが判明している。
1) 有害遺伝子の発現をダウンレギュレーションすること、
2) 細胞防御を再活性化すること、そして、
3) ウィルス遺伝子発現を阻害すること
に使用することができる。このことによって、ガンおよび他の遺伝的機能障害だけでなく重篤な感染症を含む多くの急性および持続性疾患に対する治療をもたらすことができる。
1) トランスフェクト細胞または構築した株化細胞で分析することができる。
2) 患者から構築した初代培養細胞および/または特定の遺伝子疾患のモデル動物において分析することができる。
(psiUxベクターの構築)
U1 snRNA遺伝子に基づくベクターは、その完全なヒト遺伝子を含むプラスミドpHU1-IDに由来した (De Angelis et al., 2002);このプラスミドは、SP6プロモーターの反対方向に、pSP65ベクター(Promega)のBamHI部位に挿入されたヒトU1 snRNA遺伝子の転写単位を含む600bpのBamH1断片を有する。プラスミドpsiUxは、BglIIおよびNheIを用いた二本鎖切断、ならびに、5’-BglII、kpnI、XhoI、NheI、BamHIおよびNheI-3’部位を含むポリリンカーの存在下で再ライゲーションすることによって、後者に由来した。BglII部位は、U1 snRNA遺伝子内の転写開始部位から-6位に位置するが、NheI部位は、ベクター中でSP6プロモーターから300ヌクレオチド上流に位置する。リンカーは、以下の2つのヌクレオチドをアニーリングすることによって調製した。
ラミンA/C上の選択した標的配列は、Sui et al. (2002)に由来し、NCBIデーターベースのX03444のヌクレオチド1602-1622をカバーする。以下のオリゴをアニールさせ、psiUxのBglIIおよびXhoI部位に挿入し、プラスミドpsiUa-lamを調製した。
サブコンフルエント状態のHeLa細胞を、Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Gibco BRL)を使用することによって、製造元の指示に従って60mmプレート内でトランスフェクトした。6μgのpsiUxプラスミド誘導体を、トランスフェクションの内部コントロールとしての2μgのプラスミドU7-3’ (DeAngelis et al., 2002)と一緒にトランスフェクトした。
9.2nlのプラスミドDNA(300ng/μl)を、Caffarelli et al. (1987)に従って、ステージIVのXenopus laevisの卵母細胞の核にインジェクトした。12時間19℃でインキュベーションしてから、核および細胞質を手で解剖し、RNAを記載したように抽出した (Caffarelli et al., 1987)。
一過的にトランスフェクトしたHeLa細胞に由来する総RNAを、Ultraspec RNA isolation system (Biotech Laboratories, Houston)を用いて、製造元の指示に従って単離した。siRNAを検出するために、15μgの総RNAを10%ポリアクリルアミド-8M尿素ゲルで電気泳動し、Hybond-N+メンブレン (Amersham Pharmacia Biotech.)上にエレクトロブロッティングすることによって転写した。ハイブリダイゼーションは、37℃で、5×SSPE、5×Denhardt’s solution、0.5%SDS、25μg/mlサケ精子DNA (Invitrogen)中で行った。洗浄は、37℃で、6×SSPEおよび2×SSPEおよび0.2×SSPE中で行った。プローブは、末端を32Pで放射線標識した以下のDNAオリゴを使用した。
タンパク質抽出物(20μg)を、10%ポリアクリルアミド-SDSゲルで分離し、ニトロセルロース (ProTran, Schleicher and Schuell)に転写した。メンブレンを、3%のスキムミルクを溶かしたTBSでブロッキングした。TBS/3%スキムミルクで1:200に希釈したマウスモノクローナル抗-ラミンA/C抗体 (sc-7292, Santa Cruz Biotechnology)を、一次抗体として使用した。免疫染色は、ECL Western blotting detection system (Amersham UK)を用いて行った。
本システムは、ヒトU1 snRNA遺伝子、ならびに、そのプロモーターおよびターミネーター領域の特徴を利用する (Hernandez, 1985, Hernandez and Weiner, 1986)。U1プロモーターは、RNAポリメラーゼIIによる転写を調節し、一様に活性であり、高レベルの発現を確実なものとする。一次転写産物は、モノメチル化キャップを有し、そのRNAは効率的に細胞質に輸送される。Dicer酵素は細胞質に局在することが示されているので、このことはpre-siRNAの効率的なプロセシングに極めて重要である (Billy et al., 2001)。加えて、U1 snRNAの正確な3’末端形成は、特異的なU1プロモーター配列と関連してのみ機能するU1 snRNAコード領域から10ヌクレオチド下流に位置するbox element (GTTTCAAAAGTAGAC-3’ box)によって導かれる (Hernandez and Weiner 1986; de Vegvar et al., 1986)。類似の配列が、U2 snRNAの正確な3’末端形成をも導くことが見出されている (Hernandez, 1985)。この点において、これらのsnRNAは、mRNA合成とは異なる特定の転写機構によって転写されることが示唆されている。Medlin et al. (2003)による最近の研究により、pol IIのCTDが欠失している場合には終結が適切に起こらないことが見出された。これは、転写の非常に早期の段階で、3’末端形成に必要な因子が必要であることを示している。
i) U1に基づくベクターは、転写産物の5’および3’末端に必要な配列が非常に少ない、
ii) U1に基づくベクターは、polIIIベクターの場合と異なり、転写領域にU配列を有することが可能である、
iii) クローニングが大変容易であり、異なるクローニング部位の間でのセレクションが可能である、
iv) 一次転写産物が、効率的に細胞質へと輸送され、成熟形態へと転換される。
加えて、特異的な配列を、5’および3’末端に挿入し、これにより干渉複合体へ導入される一本鎖siRNAのセレクションが可能となる。このことは、望まない標的化をもたらし得るセンス鎖の蓄積を除外する点で、siRNAベクターにとって重要な特性である。
U1 snRNA遺伝子プロモーターは、転写のエンハンサーとして機能するDistal Sequence Element (DSE)と、転写開始部位に位置するProximal Sequence Element (PSE)からなる。PSEと+1ヌクレオチドの距離は、厳密に保存されているが、その一次配列は保存されていない。このプロモーター機構は、有利には、誘導性プロモーターへと変更および改変できる。
miRNAの機能は、ハエにおける細胞増殖、細胞死、および脂肪代謝の制御、線虫における神経パターン形成、哺乳動物における造血幹細胞系の分化の調節、ならびに植物における葉および花の制御などの複合的な細胞回路と相互に関連している。最近、腫瘍遺伝子のmicroRNAの役割が提案されている。主に、寄生虫およびハエの研究から、microRNAがRNAi経路を介して細胞内でプロセシングを受け、機能化すること、および、mRNAの3’非翻訳領域の塩基ペアを介して、mRNAの発現を著しく減少させることが示されている。
1) pri-miRNA配列(この配列は、明確に定義された二次構造を有する約80-110ヌクレオチドの領域を含み、遺伝子データから推定することができる (Griffiths-Jones et al., 2003))を、psiUxベクターのプロモーターと終結領域の間にクローニングする。
2) miRNA配列を、アンチセンスsiRNA配列として、psiUにクローニングする。
i) U1に基づくベクターは、転写産物の5’および3’末端に必要な配列が非常に少ない、
ii) U1に基づくベクターは、polIIIベクターの場合と異なり、転写領域にU配列を有することが可能である、
iii) クローニングが大変容易であり、異なるクローニング部位の間でのセレクションが可能である、
iv) 一次転写産物が、効率的に細胞質へと輸送され、成熟形態へと転換される、
v) 特異的な配列を、5’および3’末端に挿入し、干渉複合体へ導入される一本鎖siRNAのセレクションが可能となる。このことは、望まない標的化をもたらし得るセンス鎖の蓄積を除外する点で、siRNAベクターにとって重要な特性である。このことは、この発現システムを人の臨床的プロトコールで使用しなければならない場合、高いレベルの安全性を保障するのに非常に重要である。
[参考文献]
Claims (7)
- 哺乳類細胞において、正確、安定且つ効率的なsiRNAまたはmiRNAの発現のためのリコンビナントベクターであり、5’から3’の方向に:
a) U1 snRNA遺伝子のRNAポリメラーゼII依存性プロモーター配列;
b) pre-siRNAまたはpre-miRNAを転写する配列をクローニングするための適切な制限部位の5’側の配列;
c) +1位でのAまたはG残基;サイレンシングさせる遺伝子によって転写されるmRNAのセンス領域に対応する21から23ヌクレオチドの配列であって、pre-siRNAのステムの第一の断片を構成する配列;pre-siRNAのループ領域を構成するpre-miRNA配列から選択される配列;サイレンシングさせる遺伝子によって転写されるmRNAのアンチセンス領域に対応する21から23ヌクレオチドの配列であって、pre-siRNAのステムの第二の断片を構成する配列;
以下の構造:
を含むpre-siRNAを転写する配列、または、pre-miRNAを転写する配列、
d) pre-siRNAまたはpre-miRNAの3’の正確な形成に必要且つ十分な、U1 snRNA遺伝子の3’の配列の終結配列;
を含む、ベクター。 - pre-siRNAを転写する配列の5’のクローニング部位がBglIIである、請求項1に記載のベクター。
- U1 snRNA遺伝子の3’の配列の終結配列が、CCCCTG/ACTTTCTGGAGTTTCAAAAGTAGACである、請求項4に記載のベクター。
- RNA pol IIプロモーターを誘導性とする適切な配列を更に含む、請求項1から5のいずれか一項に記載のベクター。
- 請求項1から6のいずれか一項に記載のベクターを含む、遺伝子治療用の組成物。
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