JP4741210B2

JP4741210B2 - 新規化合物及び遺伝子発現制御剤並びに遺伝子発現制御方法

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Publication number: JP4741210B2
Application number: JP2004229182A
Authority: JP
Inventors: 青木　　伸; 理恵子岡谷; 敬武田; 榮一木村
Original assignee: Tokyo University of Science
Current assignee: Tokyo University of Science
Priority date: 2004-08-05
Filing date: 2004-08-05
Publication date: 2011-08-03
Anticipated expiration: 2024-08-05
Also published as: JP2006045131A

Description

本発明は、遺伝子発現制御剤として使用可能な新規化合物及びこれを用いた遺伝子発現制御方法に関する。

シスプラチンやカルボプラチンなどの白金（II）錯体は、臨床で最も汎用されている抗癌剤のひとつであり、現在もその抗腫瘍活性の増強，抗腫瘍スペクトルの拡大、耐性の克服、毒性の低減を目的とした研究が進められている。またこのような白金錯体が有する抗癌作用に着目して、種々の白金錯体による抗癌剤も開発されている（例えば、特許文献１乃至３）。
特にシスプラチン（cisplatin, cis-DDP:cis-diaminedichloroplatinum(II)）は、二本鎖ＤＮＡやタンパク質と架橋を形成することによって、二本鎖ＤＮＡやタンパク質の高次構造を変化させて、抗腫瘍作用を発揮し、精巣腫瘍、卵巣癌、頭頚部癌、食道癌、小細胞肺癌等のいくつかの固形癌で優れた効果が認められている。
特開２００２−１２１１３５号公報特開２０００−３１９２９０号公報特表２００２−５２３３６１号公報

しかしながら、シスプラチンとＤＮＡとの相互作用は、その白金（ＩＩ）錯体が二重鎖ＤＮＡの隣接する２つのグアニン塩基のＮ７位に架橋することによって行われており、他の配列に対しては殆ど認識せず、周辺の塩基配列にも拘束されない。このため、ＤＮＡの特定部位に対して架橋することがわかっていても、配列特異的な制御に用いられていない。
従って、本発明の目的は、特定配列に基づく遺伝子発現を制御することができる新規な化合物及び遺伝子発現制御方法を提供することである。

本発明の化合物は、下記一般式（Ｉ）で表されるものである。

［式（Ｉ）中、Ａ¹及びＡ²は、それぞれ独立に、少なくとも１個の窒素原子を含む５又は６員環であり、各環中の１個の窒素原子は共に白金原子に結合している；Ｘ¹及びＸ²は、それぞれ独立に、ハロゲン、窒素、硫黄、酸素、カルボン酸、アミン、水酸基からなる群より選択されたものである；ｍ及びｎは、それぞれ独立に１〜２の整数を示す；Ｙ^-は、ハロゲンアニオン、硝酸イオン、過塩素酸イオン、硫酸イオン及びカルボン酸イオンからなる群より選択されたものを表す。］
この化合物として特に好ましいものは、下記一般式（II）で表される化合物である。

本発明の遺伝子発現制御剤は、上記一般式（Ｉ）又は（II）で表される化合物を有効成分とするものである。
また本発明の遺伝子発現制御方法は、特定遺伝子の発現を制御する方法であって、上記一般式（Ｉ）で示される化合物を、前記特定遺伝子に関連する特定のＤＮＡ配列に結合させること、を含むことを特徴としている。

本発明の新規化合物は、白金錯体化合物を２つの亜鉛錯体化合物で挟んだような構造をしており、白金錯体部分が、隣接する２つのグアニン（Ｇ）塩基を認識すると共に、亜鉛錯体部分がチミジン（Ｔ）を認識する。また、本発明の新規化合物は、二本鎖ＤＮＡの間に入り込み、いわゆる二本鎖間架橋を形成することもできる。
この結果、それぞれの錯体が、Ｇとその周囲のＴで構成される特定の配列を認識することによって、化合物全体として４個以上の核酸配列、例えば、ＴＧＧＴやＴＣＧＡのような配列に結合することができる。このような配列は、遺伝子発現において重要な配列に多く存在しているので、本発明の化合物を結合させることによって、これらの配列に基づいた遺伝子発現を阻害することができる。

本発明によれば、上述したように亜鉛錯体化合物及び白金錯体化合物からなる３つの錯体の組み合わせで構成されているので、特定の核酸配列に基づく遺伝子の発現を効果的に制御することができる。

本発明の化合物は、下記一般式（Ｉ）で表されるものである。即ち、白金錯体化合物と、２つの亜鉛錯体化合物とが、連結部で連結された構造をしている。

本発明の化合物における白金錯体部分は、上記式（Ｉ）で表された化合物の中心部分に配置されており、Ａ¹及びＡ²と、Ｘ¹及びＸ²と、これらに配位して安定化した白金イオンとで構成されている。
上記式（Ｉ）中、Ａ¹及びＡ²は、それぞれ独立に、少なくとも１個の窒素原子を含む５又は６員環であり、環におけるそれぞれ１個の窒素原子は共に白金原子に結合している。Ａ¹及びＡ²は、ヘテロ原子を含んでもよく、ヘテロ原子としては例えば硫黄を挙げることができる。少なくとも１個の窒素原子を含む５又は６員環としては、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、トリアジン、チアゾール、トリアゾールを挙げることができるが、合成効率及び生理活性の観点からピリジンであることが好ましい。また、Ａ¹とＡ²はそれぞれ、隣接する連結部又は環とパラ−、メタ−、オルト−の各位置で結合することができるが、生理活性、特に、塩基配列の認識しやすさの観点から、パラ位であることが好ましい。
Ａ¹及びＡ²は同じであっても異なってもよいが、合成効率の観点から同じであることが好ましい。

また白金イオンは２価のイオンであり、化合物全体の基本構造を損なわれない限り、上記５又は６員環のいずれの位置の窒素原子を介して錯体を形成してもよい。
また上記式（Ｉ）中、Ｘ¹及びＸ²は、それぞれ独立に、ハロゲン、窒素、硫黄、酸素、カルボン酸、アミン、水酸基からなる群より選択されたものである。このうち、安定性及び合成効率の観点から、Ｃｌ、Ｓ、N、Oであることが好ましい。
上記式（Ｉ）中のｍ及びｎは、本発明の化合物における連結部の長さを決定する繰り返し単位の数であり、それぞれ独立に、合成効率及び生理活性の観点から１〜２の整数を示し、合成効率の観点から１であることが特に好ましい。

本発明の化合物における亜鉛錯体部分は、４つの窒素原子を含む大環状ポリアミンと亜鉛とで構成された亜鉛−サイクレン部分であり、大環状ポリアミン上の窒素原子のひとつが上記連結部に結合している。
上記式（Ｉ）中のＹ^-は、ハロゲンアニオン、硝酸イオン、過塩素酸イオン、硫酸イオン及びカルボン酸イオンからなる群より選択されたものを表す。

上記化合物において特に好ましいものは、下記一般式（II）で表されるものである。

本発明の化合物は、例えば以下のようにして合成することができる。
２，２’−ビピリジル誘導体と、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）で保護されたサイクレン誘導体とを反応させ、次いで、得られた化合物に白金化合物を加えて、白金イオンを配位させ、単核白金錯体化合物（ＰｔＬ）を得る。この単核白金錯体化合物に亜鉛化合物を添加して、亜鉛イオンを配位させ、本発明の化合物（ＰｔＺｎ₂Ｌ）を得ることができる。

上記式（Ｉ）又は（II）で表される化合物は、２つの亜鉛イオンと１つの白金イオンを含む複合錯体化合物である。この化合物を二本鎖のＤＮＡに添加すると、化合物中の白金イオンは、ＤＮＡ配列を構成する塩基であるグアニン（アデニンの場合も認められる）塩基の７位に反応して、２つのグアニンのそれぞれとの間に架橋構造を形成する。更に、白金イオンの両隣に配置された亜鉛イオンは、２つのグアニンに隣接するチミジン塩基のイミド構造に反応して、チミジンとの間にそれぞれ架橋構造を形成する。
この結果、本化合物をＤＮＡ及びＲＮＡなどの核酸配列に添加すると、シスプラチンによる架橋構造（Ｂ）とは異なり、Ｔ及びＧを含む４つの塩基配列を認識して不可逆的に結合する。さらにＤＮＡの二本鎖の場合には、塩基が相補的に結合しているため、いずれかの鎖がチミジン又はグアニンであれば、本発明の化合物が結合することができる。
これにより、ＴＧＧＴのみならず、ＴＣＧＡ、ＴＧＡＣ、ＧＡＣＴ、ＴＣＧＴ、ＴＧＧＡ、ＡＣＣＴなどの配列を認識して、これに結合することができる。その結果、これらの塩基配列に結合すべき他の塩基配列やタンパク質などとの結合を阻害することができる。
更に、これらの配列は遺伝子制御領域に多く存在することがわかっており、本発明の化合物によって、ＤＮＡ発現制御因子、例えば、ＣＲＥＢ／ＡＴＦやエストロゲンレセプターのような転写因子の結合を阻害することができる。

本発明の遺伝子発現制御剤は、上記本発明の化合物を有効成分として含むものである。
また、本発明の遺伝子発現制御方法は、上記本発明の化合物を、特定遺伝子に関連する特定の核酸配列に結合させることを特徴とするものである。
上述の通り、本発明の式（Ｉ）で表される化合物、好ましくは式（II）で表される化合物は特定塩基配列に不可逆的に結合するので、特定塩基配列と他の因子との結合を阻害することによって特定遺伝子の発現を制御することができる。

本発明の遺伝子発現制御剤には、投与形態に応じた種々の薬学的に許容可能な賦形剤及び／又は担体を更に含むことができる。このような賦形剤及び担体の種類及び量は、本発明の遺伝子発現制御剤の剤形に応じて、当業界でこの用途に通常用いられる既知のものから適宜選択することができる。本発明の遺伝子制御剤の剤形としては、経口投与のための固体組成物、液体組成物及びその他の組成物、非経口投与のための注射剤、外用剤、坐剤等が挙げられ、経口投与のための固体組成物としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤等を挙げることができ、更にカプセルは、ソフトカプセル及びハードカプセルであってもよい。これらの製造方法は、当業界で既知の方法に従って行うことができる。
また、本発明の遺伝子発現制御剤における上記式（Ｉ）又は（II）の化合物の使用量は、化合物の最終濃度として、１ｎＭ〜１０μＭ、生理活性の観点から好ましくは１０ｎＭ〜１μＭである。

本化合物が結合する標的核酸配列は、ＤＮＡ及びＲＮＡのいずれであってもよい。
ＤＮＡには、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡのほか、ｃＤＮＡも含まれる。ＤＮＡを対象とする場合には、特定遺伝子の構造遺伝子であってもよく、プロモータ、エンハンサーなどの調節領域のものであってもよい。標的核酸配列がプロモータ配列の場合には、遺伝子の発現を効果的に阻害することができるため、好ましい。
プロモータ配列としては、種々の真核生物の転写制御因子の標的となっているＤＮＡ配列であることが好ましく、例えば下記表１に示されるものが挙げられる。

またＲＮＡには、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡなどが含まれるが、特定遺伝子をコードするｍＲＮＡであることが好ましい。ｍＲＮＡを標的核酸配列とした場合には、このｍＲＮＡの基づくタンパク質合成を効果的に阻害することができる。また、遺伝情報がｍＲＮＡ主体であるＲＮＡウィルスのように、逆転写酵素を利用して合成を行う場合には、本発明の化合物を用いることによって、逆転写を阻害し、ウィルスＲＮＡに基づく遺伝子の発現も阻害することができる。

以下に本発明の実施例について説明するが、これに限定されるものではない。また実施例中の％は、特に断らない限り、重量（質量）基準である。
[実施例１]
化合物の合成例

（１）５，５’−ビス（ブロモメチル）−２，２’−ビピリジル［１］の合成
５，５’−ジメチル−２，２’−ビピリジル（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）（１．０ｇ，５，４ｍｍｏｌ）を、四塩化炭素に溶解し、Ｎ−ブロモスクシンイミド（２．２ｇ，１１ｍｍｏｌ）、ベンソイルペルオキシド（２０ｍｇ，０．３８ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気下、５時間加熱還流した。反応液を減圧留去した後、残査をジクロロメタンに溶解させ、Ｎａ₂Ｓ₂Ｏ₃溶液で洗浄した。Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥後、減圧留去し、残差をシリカゲルクロマトグラフィー（溶出液：ＡｃＯＥｔ：ヘキサン＝１：５）で精製した。さらにこれを酢酸エチルで再結晶し、無色の針状結晶として得た（０．６０ｇ，３２％ｙｉｅｌｄ）。

（２）５，５’−ビス［４，７，１０−トリス（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１−メチル］−２，２’−ビピリジル［３］の合成
１，４，７−トリス（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン［２］（１．０ｇ，２．１ｍｍｏｌ）を、アセトニトリル（２０ｍｌ）に溶解させた後、５，５’−ビス（ブロモメチル）−２，２’−ビピリジル［１］（０．４０ｇ，１．１ｍｍｏｌ）とＮａ₂ＣＯ₃（０．６５ｇ，６．１ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気下、６０℃で１２時間攪拌した。不溶性の無機物を濾去した後、濾液を減圧留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶出液：ＡｃＯＥｔ：ヘキサン＝１：６）で分離精製し、無色のアモルファスとして得た（１．１ｇ，９６％ｙｉｅｌｄ）。
ＩＲ（ＫＢｒｐｅｌｌｅｔ）：３００５，２９６７，２９３１，２９３１，１６８５，１４５８，１４１４，１３６５，１２５０，１１７１，１１５３，９７８，７５４ｃｍ^-1
¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）： δ＝１．４２（１８Ｈ，ｓ，−ＣＨ₃），１．４５（１８Ｈ，ｓ，−ＣＨ₃），１．４８（１８Ｈ，ｓ，−ＣＨ₃），３．３５−３．６０（３２Ｈ，ｓ，−ＣＨ₂−），３．８３（４Ｈ，ｓ，−ＣＨ₂−），７．７６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，ＡｒＨ），８．３３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，ＡｒＨ），８．５３（２Ｈ，ｓ，ＡｒＨ）），
¹³ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）： δ＝１４．２，２１．１，４７．８，５０．２，５３．８，５４．８，５５．４，６０．４，１２０．６，１３２．４，１３８．９，１５０．３，１５５．１

（４）［５，５’−ビス（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１−メチル）−２，２’−ビピリジル］ＰｔＣｌ₂錯体６ＨＣｌ塩１０水和物［４］の合成
化合物［３］（１００ｍｇ，０．０９ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（０．５ｍｌ）に溶解させた後、水（０．０５ｍｌ）に溶解させたＫ₂ＰｔＣｌ₄（３７ｍｇ，０．０９ｍｍｏｌ）を加え、１０秒間、マイクロウェイブ７００Ｗをかけた。この操作を２０回繰り返した。次に、この溶液に１ＮＨＣｌ水溶液（５ｍｌ）を加え、室温で３時間撹拌し、脱保護を行った。反応液を減圧留去し、残渣を１ＮＨＣｌ水溶液中で結晶化し、黄色の粉体として１２を得た（１４１ｍｇ，９０％ｙｉｅｌｄ）。
融点：＞２５０℃
ＩＲ（ＫＢｒｐｅｌｌｅｔ）：３４１６，２９６５，２７５５，１６０９，１４２２，１０６８，１００４，９４２，８３３，７２４ｃｍ^-1
¹ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）： δ＝３．３５〜３．８７（３２Ｈ，ｂｒ−ＣＨ₂−），４．５３（４Ｈ，ｓ，−ＣＨ₂−），９．１８（４Ｈ，ｓ，ＡｒＨ），９．９０（２Ｈ，ｓ，ＡｒＨ）
¹³ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）： δ＝４２．０，４２．４，４６．９，１２４．１，１４２．２，１４８．４，１５５．５，１５６．０
元素分析：Ａｎａｌ．ＣａｌｃｄｆｏｒＣ₂₈Ｈ₇₄Ｎ₁₀Ｏ₁₀Ｃｌ₂Ｐｔ：Ｃ，２８．３：Ｈ，６．３；Ｎ，１１．８．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，２８．４；Ｈ，６．２；Ｎ，１１，７．

（５）［５，５’−ビス（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１−メチル）−２，２’−ビピリジル］ＰｔＣｌ₂・（ＺｎＣｌ₂）₂錯体塩５水和物モノメタレート［５］の合成
化合物［４］（１００ｍｇ，０．０９ｍｍｏｌ）を０．１ＭＮａＣｌ（１ｍｌ）に溶解させた後、ＺｎＣｌ₂（３７ｍｇ，０．０９ｍｍｏｌ）を加え、ｐＨ６に調整し、これを室温で１時間撹拌した。再びｐＨ６に調整し、溶液を濾去した後、減圧留去した。水とメタノール混合溶媒にて再結晶を行い、黄色の針状結晶として６を得た（３６ｍｇ，３５％ｙｉｅｌｄ）。
融点：＞２５０℃
ＩＲ（ＫＢｒｐｅｌｌｅｔ）：３４２２，２９２７，１６１３，１４９２，１３８８，１０９２，９９１，８３５，５１６ｃｍ^-1
¹ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）： δ＝３．３５〜３．６６（３２Ｈ，ｂｒ−ＣＨ₂−），４．４５（４Ｈ，Ｓ，−ＣＨ₂−），９．０２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，ＡｒＨ），９，０９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，ＡｒＨ），９．８７（４Ｈ，ｓ，ＡｒＨ）
¹³ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）： δ＝４２．１，４４．７，４７．５，５０．２，５５．９，１２４．７，１３５．９，１４２．８，１５３．０
元素分析：Ａｎａｌ．ＣａｌｃｄｆｏｒＣ₂₈Ｈ₆₄Ｎ₁₀Ｏ₂₅Ｃｌ₈ＮａＰｔＺｎ₂：Ｃ，２８．５；Ｈ，５．４；Ｎ，１１．８．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，２８．７；Ｈ，５．６；Ｎ，１１．３．

（６）５，５’−ビス（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１−メチル）−２，２’−ビピリジル７ＨＢｒ塩５水和物［６］の合成
化合物［３］（６５０ｍｇ，０．５８ｍｍｏｌ）を、メタノール（２０ｍｌ）に溶解させた後、氷冷下で４７％ＨＢｒ水溶液（８ｍｌ）を少しずつ加え、室温で２時間反応させた。この溶液を減圧留去し、残渣を１ＮＨＢｒ水溶液とメタノール混合溶媒で再結晶し、無色の針状結晶として得た（６１５ｍｇ，９０％ｙｉｅｌｄ）。
融点：２２１℃
ＩＲ（ＫＢｒｐｅｌｌｅｔ）：３４３１，３１８４，１６４０，１４５３，１３５５，１２８４，１２５０，１１４３，１１２２，１０３３，９８４，６２１ｃｍ^-1
¹ＨＮＭＲ（Ｄ₂Ｏ）： δ＝２．９３〜３．３２（３２Ｈ，ｂｒ，−ＣＨ₂−），４．０３（４Ｈ，ｓ，−ＣＨ₂−），８．１３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，ＡｒＨ），８．２３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，ＡｒＨ），８，７０（４Ｈ，ｓ，ＡｒＨ）
¹³ＣＮＭＲ（Ｄ₂Ｏ）： δ＝４４．６，４４．９，４７．５，５０．２，５５．９，１３７．７，１４７．４，１４９．８，１５０．０
元素分析：Ａｎａｌ．ＣａｌｃｄＦｏｒＣ₂₈Ｈ₆₅Ｎ₁₀Ｏ₅Ｂｒ₇：Ｃ，２８．５；Ｈ，５．４；Ｎ，１１．８．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，２８．７；Ｈ，５．６：Ｎ，１１．３．

（７）［５，５’−ビス（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１−メチル）−２，２’−ビピリジル］ＺｎＮＯ₃錯体５水和物モノエタレート［７］の合成
化合物［６］（５０ｍｇ，０．０４ｍｍｏｌ）に５ＭのＮａＯＨ水（３０ｍｌ）に加え、クロロホルム（２００ｍｌ）で抽出し、合わせた有機層を減圧留去する。残渣にエタノール（５ｍｌ）と水（２ｍｌ）を加えて無色溶液とした後、Ｚｎ（ＮＯ₃）₂（１３ｍｇ，０．０８ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。溶液を減圧留去して得られた残渣をエタノールと水の混合溶媒から再結晶し、無色の粒状結晶として１１を得た（１２ｍｇ，２６％ｙｉｅｌｄ）。
融点：＞２５０℃
ＩＲ（ＫＢｒｐｅｌｌｅｔ）：３０４０，３２２８，２９２３，２８７５，１５９５，１５５３，１４１７，１３８３，１２４１，１１３０，１０９１，１０５４，１０２８，９９１，７５５，６７３，６５０ｃｍ^-1
¹ＨＮＭＲ（Ｄ₂Ｏ）： δ＝２．９６〜３．１５（３２Ｈ，ｂｒ−ＣＨ₂−），４．３４（４Ｈ，ｓ，−ＣＨ₂−），８．２０（２Ｈ，ｓ，ＡｒＨ），８．３０（２Ｈ，ｓ，ＡｒＨ），８．８０（２Ｈ，ｓ，ＡｒＨ）
¹³ＣＮＭＲ（Ｄ₂Ｏ）： δ＝４４．５，４６．４，４７．３，５０．３，５１．８，１２５．０，１４４．３，１５３．８
元素分析：Ａｎａｌ．ＣａｌｃｄｆｏｒＣ₃₀Ｈ₆₄Ｎ₁₄Ｏ₂₅Ｚｎ₂：Ｃ，３４．６；Ｈ，６．２；Ｎ，１８．９．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，３４．１；Ｈ，５．７；Ｎ，１８．９．

［実施例２］
ヘテロ複核錯体によるＤＮＡ溶解温度の変化
二本鎖ＤＮＡに温度勾配をかけていくと、二本鎖が解離し一本鎖になり、その吸光度が増大する。このとき、５０％のＤＮＡが解離する温度が融解温度（Ｔ_m）である。Ｔｍ値は、ＤＮＡの二本鎖が安定化すると上昇し、二本鎖がほどかれて不安定化すると低下する。二本鎖を安定化する物質としては、カチオン（Ｎａ⁺、Ｍｇ²⁺、Ｚｎ²⁺等）やＤＮＡグループ結合剤（スペルミジン、ジスタマイシン等）、インターカレート剤（エチジウムブロマイド等が挙げられる。本発明の化合物［５］が与えるＤＮＡ二本鎖への影響を調べた。

５０μＭのＤＮＡ（Ｐ）、１０ｍＭのＥＰＰＳバッファー（ｐＨ８．０、２５℃，１０ｍＭのＮａＮＯ₃）と各化合物とを、０．０１、０．０５、０．１のｒ値（ｒ＝［ａｄｄｉｔｉｖｅ］／［ＤＮＡ（Ｐ）］）として、室温で２４時間反応させた後、プログラムに従い、２７０ｎｍでの吸光度変化を測定した。イオン強度Ｉは、０．０１（ＮａＮＯ₃）とした。
ポリ（ｄＴ）・ポリ（ｄＡ）及びポリ（ｄＧ−ｄＣ）（アマシャム・ファルマシア社製）は、Ｈ₂Ｏに溶解させて調整し、ＤＮＡ中のリン酸濃度をそれぞれε₂₆₀＝６０００Ｍ^-1ｃｍ^-1、ε₂₅₄＝８４００Ｍ^-1ｃｍ^-1として計算した。ただし、ポリ（ｄＧ−ｄＣ）₂については、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒド／Ｈ₂Ｏ溶液中で測定した。
測定には、ＵＶスペクトルの測定には、ＪＡＳＣＯ社製、spectorophotometer V500を用い、ふた付きの１ｃｍ角の石英セルを使用した。得られた吸光度変化曲線より、プログラムを用いて融解温度を計算した（ＪＡＳＣＯ spectra manager for windows 98, DNA melting program）。
結果を表２に示す。

表２に示されるように、本発明の化合物（ＰｔＺｎ₂Ｌ）では、ポリ（ｄＡ）・ポリ（ｄＣ）とポリ（ｄＧ−ｄＣ）₂のいずれにおいても、低濃度（ｒ＝０．０１、０．０５）ではＴｍが上昇し、高濃度（ｒ＝０．１）ではＴｍが消失した。
亜鉛のみを含む化合物Ｚｎ₂Ｌでは、ｒ値の増加と共にＴｍが低下し、ｒ値が０．１の時のＴｍは消失したが、ｒ値の上昇と共にＴｍが上昇した。
これに対して、白金のみを含む化合物ＰｔＬでは、ポリ（ｄＡ）・ポリ（ｄＣ）に対してｒ値の増加と共にＴｍが上昇し、ポリ（ｄＧ−ｄＣ）₂に対しては（ｒ＝０．０１、０．０５）ではＴｍが上昇し、高濃度（ｒ＝０．１）ではＴｍが消失した。
一方、亜鉛も白金も含まない化合物Ｌでは、いずれの場合も、ｒ値の上昇に伴ってＴｍ値が上昇した。

これらのことから、本発明の化合物ＰｔＺｎ₂は、ポリ（ｄＡ）・ポリ（ｄＣ）及びポリ（ｄＧ−ｄＣ）２のいずれの配列も認識し、これらの一本鎖又は二本鎖間に結合していることがわかる。
また、化合物Ｌは、配列に関係なく二本鎖を安定化させるのに対し、化合物Ｚｎ₂Ｌは、ｄＴを含まないＤＮＡでは化合物Ｌと同様に二本鎖を安定化させたが、ｄＴを含むＤＮＡでは不安定化させた。従って、化合物Ｌのビピリジル基部分は、二本鎖を安定化するのに寄与し、化合物Ｚｎ₂Ｌ⁴のＺｎ²⁺−サイクレン部分は、チミン塩基を認識し、二本鎖を不安定化するのに寄与しているといえる。ピリジル基の結合様式としては、他の芳香環と同様に塩基間のインターカレートであると考えられる。
一方、本発明の化合物ＰｔＺｎ₂Ｌや化合物ＰｔＬは、Ｇを含む配列において、低濃度では二本鎖を安定化させ、高濃度では二本鎖を不安定化させた。また、本発明の化合物ＰｔＺｎ₂Ｌと化合物ＰｔＬを比較すると、ポリ（ｄＧ−ｄＣ）₂の場合ではその挙動は同じであるが、ＧとＴが共存するウシ胎児胸腺ＤＮＡの場合では挙動に変化がみられ（データ示さず）、本発明の化合物ＰｔＺｎ₂ＬのＺｎ²⁺−サイクレン部分のチミン塩基認識能により、優位となる結合様式に違いがあることが示唆された。
本発明の化合物ＰｔＺｎ₂Ｌや化合物ＰｔＬは、低濃度（ｒ値０．０１、０．０５）において、二本鎖が安定化されたことから二本鎖間架橋が優位になっていることが示唆される。

［実施例３］
化合物ＰｔＺｎ₂Ｌや化合物ＰｔＬがグアニン塩基のＮ７位を架橋修飾しているかを確認するため、Ｆａｒｒｅｌｌらによって報告されたクロスリンクアッセイ法（Biochem. Vol.29, pp.9522-9531 (1990)）による解析を行った。
ｐＵＣ１８を鋳型とし、５’−ＧＣＧＴＣＡＧＡＣＣＣＣＧＴＡＧＡＡＡＡ−３’（配列番号１）及び、５’−ＡＧＴＴＡＣＣＴＴＣＧＧＡＡＡＡＡＧＡＧ−３’（配列番号２）（ＳＩＧＭＡ製）の二種類のオリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ａ−Ｔｒｉｃｈ領域を含む１５０ｂｐ断片（１８８１から２０３０）をＰＣＲ増幅した。これをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）と［γ−³²］ＡＴＰ（アマシャム・ファルマシア・バイオテック社製）により５’−³²Ｐ標識した。
この５’−³²Ｐフラグメント（１０，０００ｃｐｍ）をウシ胎児胸腺ＤＮＡ（１００μＭリン酸塩）存在下、１０ｍＭのＥＰＰＳバッファー（ｐＨ８．０、２５℃、１０ｍＭＮａＮＯ₃）溶液中（全量１０μｌ）で、各々の濃度の化合物ＰｔＺｎ₂Ｌ、化合物Ｌ、化合物Ｚｎ₂Ｌ、化合物ＰｔＬ及びシスプラチンと、３７℃で３時間インキュベートした。この反応液に５ＭのＮａＣ１を５μｌ、加えて反応を停止させた後、ゲルローディングバッファー（０．０５％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルー、０．０５％（ｗ／ｖ）キシレンシアノール、２０ｍＭのＥＤＴＡ、９５％（ｖ／ｖ）ホルムアミド／Ｈ₂Ｏ溶液）を１０μｌ加えた。９５℃で５分間加温し、すぐに氷冷し、ＤＮＡを変性させた。この反応液１０μｌを６％変性ゲルにローディングし、電気泳動した（５００Ｖ、ＴＢＥバッファー）。ゲルを乾燥させた後、イメージングプレート（ＦｕｊｉＢＡＳ−ＩＩＩｓ）に、室温で一晩露光させ、ＦｕｊｉＢＡＳ−１５００で読取りを行った。結果を図１に示す。

図１の下左の８〜１０レーンに示されるように、シスプラチンは、ｒ値０．１〜１０でバンドを与えた。化合物ＰｔＺｎ₂Ｌ（図１下中央の２〜５レーン）や化合物ＰｔＬ（図１下右の１〜４レーン）は、いずれもシスプラチンより１オーダ低い濃度（ｒ＝０．０１）で二本鎖間架橋のバンドのみが見られ、ｒ＝０．０５で同一鎖内架橋のバンドが出現し、ｒ＝０．１で、同一鎖内架橋の割合が優位になった。また原因は不明だが、ｒ＝０．５では放射性ＤＮＡの検出が減少した。化合物Ｌや化合物Ｚｎ₂Ｌでは、クロスリンクバンドは検出されなかった。
この解析より、本発明の化合物ＰｔＺｎ₂Ｌや化合物ＰｔＬが、シスプラチンよりも低濃度で架橋修飾していることを確認された。そしてその傾向は、前項で述べた、Ｔ_mの結果と一致する。

［実施例４］
次に、塩基配列に対する化合物ＰｔＺｎ₂Ｌ、化合物Ｌ、化合物Ｚｎ₂Ｌ、化合物ＰｔＬ及びシスプラチンの選択性について検討した。
化合物ＰｔＺｎ₂Ｌ、化合物Ｌ、化合物Ｚｎ₂Ｌ、化合物ＰｔＬ又はシスプラチン存在下、２．０μＭのｐＵＣ１８、１０ｍＭのＥＰＰＳバッファー（全量５０μｌ）を、３７℃で３時間反応させた。この反応液に５ＭのＮａＣｌを５μｌ加え、反応を停止させた後、エタノール沈澱をし、未反応の化合物を取り除いた。このｐＵＣ１８を鋳型として、TaKaRa Taq Cycle Sequencing Kitのプロトコールに従い、ＰＣＲ増幅反応を行った（図２）。
個々で用いたプライマーには、キットに含まれるＢｃａＢＥＳＴ（商品名）Sequencing Primer Ｍ１３−４７（５’−ＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’：配列番号３）及びＢｃａＢＥＳＴ（商品名）Sequencing Primer ＲＶ−Ｍ（５’−ＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧ−３’：配列番号４）を用いた。また、ＳＩＧＭＡ製の２種類のオリゴヌクレオチド（５’−ＧＣＧＴＣＡＧＡＣＣＣＣＧＴＡＧＡＡＡＡ−３’：配列番号５）及び、（５’−ＡＧＴＴＡＣＣＴＴＣＧＧＡＡＡＡＡＧＡＧ−３’：配列番号６）を用いた。
この反応液にゲルローディングバッファー（０．０５％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルー、０．０５％（ｗ／ｖ）キシレンシアノール、２０ｍＭのＥＤＴＡ、９５％（ｖ／ｖ）フォルムアミド／Ｈ₂Ｏ溶液）を加え、９５℃で５分間加温し、すぐに氷冷し、６％変性ゲルで電気泳動した（３，０００Ｖ、ＴＢＥバッファ）。ゲルを乾燥させた後、イメージングプレート（ＦｕｊｉＢＡＳ−ＩＩＩｓ）に、室温で一晩露光させ、ＦｕｊｉＢＡＳ−１５００で読取りを行った。
結果を図３及び図４に示す。

図３には、プライマーＡ（配列番号３）及びプライマーＢ（配列番号４）を用いた場合のシークエンス解析結果が示されている。ＡＣＧＴはジデオキシ法によるシークエンスマーカーであり、娘鎖の配列に相当する。伸長反応が阻害された配列に関して、鋳型ＤＮＡの配列を横に示す。この２種類のプライマーはいずれもマルチクローニングサイト領域を解析できる（図２参照）。この領域にはSmaIやXmaIなどの制限酵素が認識するＧＧＧＣＣＣという多ＧＣ領域や、ＴＣＧＡ、ＴＧＣＡなどの回文配列が存在する。
プライマーＡを用いた場合、シスプラチンは、Ｇが片鎖に２つ以上並ぶ配列（ＧＧＧＧ、ＧＧＧ、ＡＧＧＡ、ＣＧＧＡ）において伸長反応の阻害が見られたが、本発明の化合物ＰｔＺｎ₂Ｌについても、多ＧＣ領域に存在するＧが４つ並ぶＧＧＧＧという配列において、強い伸長阻害が見られた。
プライマーＢを用いた場合、プライマーＡを用いた場合と同様にシスプラチンは、Ｇが片鎖にふたつ以上並ぶ配列において伸長反応を阻害した。また、本発明の化合物ＰｔＺｎ₂Ｌは、Ｇが３つ並ぶＧＧＧという配列では伸長反応の阻害が見られなかったが、５つ並ぶＧＧＧＧＧという配列では伸長反応の阻害が見られた。

図４には、プライマーＣ（配列番号５）及びプライマーＤ（配列番号６）を用いた場合のシークエンス解析結果が示されている。この２種類のプライマーはいずれもＡＴｒｉｃｈ領域付近を解析できる（図２参照）。
プライマーＣを用いた場合、本発明の化合物ＰｔＺｎ₂Ｌは、ＡＴｒｉｃｈ領域付近の、ＴＧＣＡやＴＧＧＴなどの配列で伸長反応が阻害された。プライマーＤを用いた場合、本発明の化合物ＰｔＺｎ₂Ｌは、ＡＴｒｉｃｈ領域付近に存在する、ＴＧＣＴ、ＴＧＣＧＣＧＴ、ＴＧＡＧＡＴの配列で、さらにその上流に含まれる、ＴＧＧＴ、ＴＧＡＣで伸長反応が阻害された。

これらの結果から、本発明の化合物ＰｔＺｎ₂Ｌは、ＴとＧを含む配列を認識して結合することが示された。この結合は、シスプラチンと比較しても高い親和性を示すものであった。

［実施例５］
本発明の化合物ＰｔＺｎ₂Ｌは、上述のように、ＴとＧを含む配列を認識結合するものであるので、ＴＧＧＴのようなＤＮＡ配列に特異的に結合する。その上、二本鎖間架橋を形成することにより、結合可能なＤＮＡ配列の種類が広がり、前掲の表１に挙げられた各種の遺伝子制御にかかる転写因子の認識部位に結合可能となる。
図５は、その一例を示したものである。これによれば、例えばＣＲＥＢ／ｂＺＩＰの認識部位中のＴＧＡＣの配列に対して、本発明の化合物が不可逆的に結合することにより、ＣＲＥＢ／ｂＺＩＰが結合できなくなる。これにより、ＣＲＥＢ／ｂＺＩＰによる遺伝子発現を阻害することができる。

本発明の実施例にかかる各種化合物によるクロスリンクアッセイの結果を示す図である。本発明の実施例で用いたプライマーのベクター上の位置を示す図である。本発明の実施例にかかる伸長阻害の結果を示す電気泳動図である。本発明の実施例にかかる伸長阻害の結果を示す電気泳動図である。本発明の実施例にかかる遺伝子制御の概要を示す模式図である。

Claims

下記一般式（II）で表される化合物。

［式（II）中、Ｙ^-は、ハロゲンアニオン、硝酸イオン、過塩素酸イオン、硫酸イオン又はカルボン酸イオンを表す。］
請求項１記載の一般式（II）で表される化合物を有効成分とする遺伝子発現制御剤。