JP4696223B2

JP4696223B2 - 画像解析を利用した植物体の色素含有量の定量方法

Info

Publication number: JP4696223B2
Application number: JP2005104222A
Authority: JP
Inventors: 慶太杉山; 孝治亀岡; 篤橋本; 洋一川頭
Original assignee: Mie University NUC
Current assignee: Mie University NUC
Priority date: 2004-03-31
Filing date: 2005-03-31
Publication date: 2011-06-08
Anticipated expiration: 2025-03-31
Also published as: JP2005315877A

Description

本発明は、植物体に含まれる色素の含有量の定量方法に関し、より詳しくは植物体を撮影したデジタル画像を画像解析し得られた色彩情報から色素含有量を定量する方法である。

植物体に含まれる色素含有量を測定するには、測定試料の作成において煩雑な操作を必要とする。例えば、カロテン、キサントフィルなどの色素の含有量を測定する場合、まず試料を乳鉢で石英砂（ＣａＣＯ_３）を加えて磨砕し、クロロフィラーゼ活性の強いものは熱湯で数分煮沸し、酵素活性を失わせる。また、組織汁液の酸度が高い場合は中和してから抽出する。磨砕物に最終濃度が８０％になるようにアセトンを加え、濾過して、残渣の緑色が無くなるまでアセトンで抽出、濾過を繰り返す。次に、アセトン抽出液にエーテルを加えて混和し、水を徐々に加えて色素をエーテル層に移す。このエーテル層を水が入った容器に加えてアセトンを除く。この水洗操作を３回繰り返し、エーテル層のみをフラスコに移して無水硫酸ナトリウムを加えて暗所で３０分以上脱水後濾過する。得られたエーテル抽出液を減圧乾固し、水酸化カリウム−メタノール溶液を加え、暗所で２時間放置する。最後に、この反応液に水とエーテルを加えて、カロテンをエーテル層に移す。最後に、エーテル層を再び減圧乾固後、メタノールと石油エーテルを加えて、カロテンは石油エーテル層を定溶して、分光光度計で吸光度の測定を行い、キサントフィルはメタノール層を定溶して、分光光度計で吸光度を測定するという方法が採られてきていた。

また、カロテンの含有量を測定する場合は、上記の他に次のような方法が挙げられる。始めにアセトンやテトラヒドロフランなどの有機溶剤を加えて試料を乳鉢で磨砕して濾過する。試料残渣が無色になるまで有機溶剤を加えて磨砕と濾過を繰り返す。このカロテンを含む抽出液に石油エーテルと食塩水を加えて転溶し、石油エーテル層を無水硫酸ナトリウムで脱水後、エバポレーターによって減圧乾固させる。これに、高速液体クロマトグラフフィー（以下ＨＰＬＣとする）で用いる溶離液で溶離させた後測定する。

このように、ＨＰＬＣや分光光度計によって測定するには、試料の磨砕、有機溶剤による抽出、脱水、減圧乾固等の煩雑な操作を必要とするとともに、１試料の測定に非常に多くの時間がかかってしまう。このため、試料を短時間で分析する必要がある場合には、利用することができないという問題がある。

色彩色差計によるカロテン含有量との関係を報告した例としては、色彩色差計によってサツマイモのＬ＊ａ＊ｂ＊値を測定し、β−カロテン量が推定可能と報告されている（非特許文献１参照）。また、色彩色差計によってニンジンのＬ＊ａ＊ｂ＊値を測定し、β−カロテンとａ値が高い相関があることを報告されている（非特許文献２参照）。
ジャパニーズジャーナルオブブリーディング（ＪａｐａｎｅａｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｒｅｅｄｉｎｇ．４３：４２１−４２７，１９９３）ジャーナルオブソサエティオブハイテクノロジーインアグリカルチャー（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｏｃｉｅｔｙｏｆＨｉｇｈＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ．１２（２）、１３４−１３７、２０００）

非特許文献１及び２に記載のＬ＊ａ＊ｂ＊値を使用したカロテンの含有量を用いる方法は、比較的容易にカロテンの含有量を推測することが可能であり、植物体の色素の数量的評価方法として一般的な方法である。しかし、Ｌ＊ａ＊ｂ＊表色系は分光測色による人の三刺激値であるＸ，Ｙ，Ｚの算出を行い、その後数学的に導かれる表色系であるため、局所的な計測となってしまう。このような分光的な局所計測では、表面全体の色を表すことはできないため、Ｌ＊ａ＊ｂ＊値からカロテン含有量を推定しても実測値とは大幅な誤差が生じてしまう。

色彩色差計によるＬ＊ａ＊ｂ＊値とカロテンとの関係を推定が有効な場合としては、工業用製品のように植物全体が均一な色である場合が挙げられる。しかし、植物体は柔細胞、形成層、篩管など様々な細胞や組織で構成されており、それぞれの細胞、組織ごとに色素含有量やその物質構成が異なり、表面色も複雑な状態で混在している。さらに、測定面が均一な平面でなく凹凸状となっているため、複雑な形状による光の反射等の影響で色彩色差計による方法などでは正確な色を評価することができないという問題がある。

本発明は以上の課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、植物体表面全体の色値を評価するのに適した装置と色の座標系を利用し、植物体の表面全体の色を正確に評価することによって植物体の色彩値と色素含有量を定量する方法を提供することである。

本発明は具体的に以下のようなものを提供する。

（１）植物体に含まれる色素の定量方法であって、デジタル画像撮影機を用いて前記植物体のデジタル画像を撮影し、このデジタル画像から算出した色彩情報と前記植物体の色素量との相関に関する情報に基づいて、色素量未知の植物体の色彩情報から色素含有量を算出する植物体の色素含有量の定量方法。

（１）の発明によれば、デジタル画像はピクセルごとにＲ（Ｒｅｄ）、Ｇ（Ｇｒｅｅｎ）、Ｂ（Ｂｌｕｅ）の色彩情報を有しているため、デジタル画像撮影機を用いたことによって、煩雑な操作を必要とすることなく、撮影したデジタル画像を上記の色彩情報に容易に変換することができる。このため、この色彩情報を測定したことによって植物体中の色素量との相関に関する情報を得ることが可能となる。

（２）前記情報は、定期的又は常時更新するものであることを特徴とする（１）に記載の植物体に含まれる色素含有量の定量方法。

（２）の発明によれば、デジタル画像から算出した色彩情報と植物体の色素量との相関に関する情報を、定期的あるいは常時更新したことで色素濃度未知の試料の濃度を最適化することが可能となる。

（３）植物体に含まれる色素の定量方法であって、色素濃度が既知の複数の標準試料を、デジタル画像撮影機を用いて、前記標準試料のデジタル画像を撮影する撮影工程と、この撮影工程で撮影したそれぞれのデジタル画像から、前記標準試料の色彩情報に分解する分解工程と、前記色彩情報と、前記標準試料の色素濃度と、に基づいて単回帰法又は直線重回帰法の少なくともいずれか１つにより検量線を算出する検量線算出工程と、色素濃度が未知の対象試料を前記標準試料と同じ撮影条件で撮影したデジタル画像から色彩情報を得た後、この色彩情報から前記検量線に基づいて前記対象試料の色素濃度を算出する濃度算出工程と、を有する（１）又は（２）に記載の植物体に含まれる色素含有量の定量方法。

（３）の発明によれば、分解工程を設けたことによって、デジタル画像を客観的に評価し、それを数値化した色彩情報を得ることが可能となる。また、検量線算出工程及び濃度算出工程において、単回帰法又は直線重回帰法を使用したことによって色素濃度が未知の試料の濃度を正確、かつ、迅速に算出することが可能となる。

ここで、「分解工程」とは、撮影した生データ（ＲＡＷ画像）をＴＩＦＦ画像に変換する工程をいう。この変換手段は公知の方法を用いる。また、市販の専用ソフト（例えばＰｈｏｔｏｓｈｏｐＣＳ（商品名））を用いた場合には、撮影した生データ（ＲＡＷ画像）をそのまま解析を行なうことが可能となる。

またここで、「単回帰法又は直線重回帰法」とは、複数の変数間の関係を一次方程式（ｙ＝ａｘ＋ｂ）で表現する分析方法をいう。単回帰法を使用する場合は、用いる試料の種類は１種類であるが、直線重回帰法を使用する場合は、複数種の試料を用いることが可能となる。そのため、同じ試料の異なる箇所でデジタル画像を撮影し、直線重回帰法を用いることによって、より正確に試料中の色素濃度を算出することが可能となる。また、ＧＭＤＨ法によってカロテンと高い相関が得られていることがわかったため、ＧＭＤＨ法を用いて色素濃度を算出してもよい。

ＧＭＤＨ法とは、（ＧｒｏｕｐｉｎｇＭｅｔｈｏｄｏｆＤａｔａＨａｎｄｌｉｎｇ）といい、説明変数間の積等の項目を加えて線形回帰分析を行い、簡単な非線形性を作り出す手法である。非線形要素となる項目を作った後の工程は回帰分析と同様の手段で計算を行う。また、重回帰分析は説明変数の数が増加すると、単純に相関係数が増加する問題がある。そこで本発明では、クロスバリデーション（Ｌｅａｖｅ−ｏｎｅｏｕｔ法）により与えられる予測的相関係数の二乗Ｑ＾２を用いてモデルの妥当性を評価している。

（４）前記色素は、カロテノイド、クロロフィル、フラボノイド、キノン、フラビン、及びジヒドロフラビンからなる群から選ばれる１種以上のものである（１）から（３）いずれかに記載の植物体に含まれる色素含有量の定量方法。

（４）の発明によれば、上記の色素の測定を可能なものとしたことによって、様々な種類の植物体の色素含有量を定量することが可能となる。また、これらの色素に関する色彩情報を組み合わせて行なってもよい。

（５）前記色彩情報は、ＲＧＢ色空間及び／又はＨＳＬ色空間より得られる色素子である（１）から（４）いずれかに記載の植物体に含まれる色素含有量の定量方法。

（５）の発明によれば、ＲＧＢ色空間及び／又はＨＳＬ色空間を用いることによって照明条件の影響を殆ど受けない色素子を得ることが可能となる。

なお、色彩情報から光源の影響を排除したい場合はＲＧＢ座標系からＨＳＢ、ＨＳＶ色座標系等へ変換した変換値を用いる。ここで、「ＲＧＢ色空間」とは、赤、緑、青の色彩情報を有する空間をいう。ＲＧＢ色座標系とは、ＲＧＢ色空間中のそれぞれの色素を赤、緑、青の要素に分解した色彩情報をいう。ＲＧＢ色座表系はＬ＊ａ＊ｂ＊やＸＹＺの基となっているＲＧＢ表色系とは異なり、真に人間が感じる色を表現している訳ではない。そのため客観的、かつ、正確な評価を行なうことが可能である。

「ＨＳＬ色空間」とは、色相、彩度、明度の色彩情報を有する空間をいう。ＨＳＬ色空間は、ＲＧＢ色座標系をＬ＊ａ＊ｂ＊表色系のようにマンセル色立体に沿って人間の感覚に準じた座標系に変換したものである。ＨＳＬ色座標系とは、ＨＳＬ（Ｉ）色空間中の色相（Ｈ）：純粋な色の種類、彩度（Ｓ）：純粋な色に白を混ぜる割合、明度（Ｌ）：単位面積あたりの明るさ又は強度（Ｉ）に関する色彩情報をいう。このＨＳＬ色座標系は理論的には、照明条件は明度Ｌのみに集約され、色彩情報であるＨ、Ｓには影響を与えられない。そのため、デジタル画像でこのＨＳＬ色座標系を用いる事でマンセル色立体やＬ＊ａ＊ｂ＊表色系のようにわかりやすく、面情報（分布や構造、形）を得ることができ、照明条件によらない、即ち凸凹による影響をほとんど受けない状態の色彩情報を得ることができる。

（６）植物体に含まれる色素の定量方法であって、デジタル画像撮影機を用いて前記植物体のデジタル画像を撮影し、このデジタル画像から算出した色彩情報と前記植物体の色素量との相関に関する情報に基づいて、色素量未知の植物体の色彩情報から色素含有量を算出する植物体の選抜方法。

（６）の発明によれば、植物体の色素含有量を求めたことによって植物体の品種を選別することが可能となる。また、同一品種の植物体における色素含有量を比較することによって、植物体の品質の選別を行なうことができる。更に、複数種の色素の色素濃度を定量したことによってより正確な品質の選別を行なうことが可能となる。

（７）記憶手段と制御手段と処理手段とデジタル画像撮影機とを備える色素定量装置に対して、植物体に含まれる色素の定量方法をコンピュータに実行させるためのプログラムであって、色素濃度が既知の複数の標準試料を、前記デジタル画像撮影機に対して、前記標準試料のデジタル画像を撮影させる撮影工程と、この撮影工程で撮影されたそれぞれのデジタル画像から、前記標準試料の色彩情報に分解する分解工程と、前記色彩情報と、前記標準試料の色素濃度と、に基づいて単回帰法又は直線重回帰法の少なくともいずれか１つにより検量線を算出させる検量線算出工程と、色素濃度が未知の対象試料を前記標準試料と同じ撮影条件で撮影したデジタル画像から色彩情報を得た後、この色彩情報から前記検量線に基づいて前記対象試料の色素濃度を算出させる濃度算出工程と、この濃度算出工程で得られた色素濃度を表示させる表示手段と、を前記処理手段に対して実行させるものである植物体に含まれる色素含有量の定量方法をコンピュータに実行させるためのプログラム。

本発明により、農産物のカロテン等の色素含有量を有機溶剤などの化学薬品が不要となり、抽出、濃縮操作なども必要なくなるため、ＨＰＬＣ等の分析機器を使用することなく容易に推定することができる。このため、ニンジン等のカロテン等含有量が瞬時に推定でき、育種における品種選抜や個体選抜の効率が飛躍的に向上する。また、市場等流通関係、量販店等においても、カロテン含有量等による農産物の選別が簡易となり、差別化商品等の分別作業に有効となる。

以下、本発明の各工程について詳しく説明する。

本発明は、植物体に含まれる色素の定量方法であって、デジタル画像撮影機を用いて植物体のデジタル画像を撮影し、このデジタル画像から算出した色彩情報と植物体の色素量との相関に関する情報に基づいて、色素量未知の植物体の色彩情報から色素含有量を算出することを特徴とする。

＜撮影工程＞
本発明は、色素濃度が既知の複数の標準試料を、デジタル画像撮影機を用いて、前記標準試料のデジタル画像を撮影する撮影工程を有する。測定試料（標準試料）には植物体を用いる。「植物体」とは、色素を含有する植物全てをいい、主としてニンジン、サツマイモ等の農産物をいい、測定の対象なる箇所は特に問わないが、主に食用とする器官（根、茎、葉、果実、種など）を測定することが好ましく、ニンジン、サツマイモ、ジャガイモなど根を食するものは根を、トマト、カボチャ、イチゴ、ミカンなど果実を食するものは果実を、レタス、キャベツ、ホウレンソウなど葉を食するものは葉を、イネ、ムギ、ダイズ、トウモロコシなど種を食するものは種を測定することが好ましい。測定に好ましい箇所は、根、茎、葉、果実、種子の表面、または切断面（縦断面または中央部の横断面）である。測定に必要な試料の大きさは特に問わない。また「デジタル画像撮影機」とは、デジタルカメラ、デジタルビデオ、スキャナー等をいい、デジタルカメラを用いることが好ましい。

撮影条件は特に問わないが、室内であれば、太陽の自然光に近いトルーライトあるいは演色性に優れた蛍光灯等の照明を用いて撮影を行なうことが好ましい。また標準カラーチャートを利用すればどの環境で撮影しても色補正ができるため、野外での撮影も可能である。デジタルカメラの画素数は１００万画素〜６５０万画素であることが好ましく、色のばらつきを少なくするために１３８万画素〜６１０万画素であることがさらに好ましい。また、ＲＧＢ色空間の色数を、２４ビットに設定した条件下での撮影が好ましい。

＜分解工程＞
また本発明は、試料のデジタル画像を、標準試料の色彩情報に分解する分解工程を有する。「分解工程」では、標準試料の表面色をデジタルカメラで撮影したデジタル画像をコンピュータに取り込み、１ピクセル毎にＲＧＢ色空間で与えられた平均ＲＧＢ値を算出する。撮影したデジタル画像が光源などの影響をそれほど受けていない場合には、平均ＲＧＢ値からＹ＝０．２９９Ｒ＋０．５８７Ｇ＋０．１１４Ｂの関係式を用いて算出したＹ（輝度）を色彩情報として用いることが可能である。

なお、撮影したデジタル画像が光源などによって色彩情報に影響を受けている場合には、平均ＲＧＢ値からＨＳＬ（Ｉ）色空間へ変換し、デジタル画像全体の平均ＨＳＬ値を求め、この値を色彩情報として用いることが可能である。ＲＧＢ値からＨＳＬ（Ｉ）色空間への変換は以下の通りである。

まず、ＲＧＢ座標系の点Ｐ（Ｒ，Ｇ，Ｂ）をＨＳＬ座標系へ変換した点を点Ｐ´（Ｈ，Ｓ，Ｌ）とする。また、０≦（Ｒ，Ｇ，Ｂ）≦１、０≦（Ｓ，Ｌ）≦１、０≦Ｈ＜３６０とする。以下次のような工程を経てＨ、Ｓ、Ｌに変換する。

＜検量線算出工程＞
さらにまた、本発明は分解工程で得た色彩情報と、前記標準試料の色素濃度に基づいて検量線を算出する検量線算出工程を有する。検量線算出工程における「検量線」とは、分解工程で算出した試料の色彩情報（ｙ）と色素濃度（ｘ）の相関関係を単回帰法又は直線重回帰法を用いて一次方程式（ｙ＝ａｘ＋ｂ）に表したものである。ｘ軸の色素濃度は、ＨＰＬＣを用いて予め測定し、算出した値を用いている。「単回帰法又は直線重回帰法」とは一般に、幾つかの変数（独立変数又は説明変数）に基づいて、別の変数（従属変数又は目的変数）を予測することである。独立変数をｘ、従属変数をｙ、ｙの予測値をｙ´としたとき、ｘ、ｙの各点の近くを通るような直線（検量線）ｙ´＝ａｘ＋ｂが考えられる。なお、この直線式の定数は最小自乗法により求めることができる。この検量線の精度は、検量線上に乗らない点の数によって決定される。なお本発明では、測定の便宜上、独立変数をｙに従属変数をｘに設定している。更に検量線の精度は、検量線評価時（予測値）の標準誤差（ＳＥＰ）を用いて評価している。また、全ての色彩情報の組み合わせにおいて線形回帰分析を行い、色素濃度を算出することが好ましい。この場合、例えば説明変数がＹ，Ｒ，Ｇ，Ｂの時の線形回帰式は、Ｃ＝ｂＹ＋ｃＲ＋ｄＧ＋ｅＢ＋ａとなる。

以下、検量線算出工程及濃度算出工程の具体的な方法を説明する。

また、重回帰分析計算や主成分回帰分析計算は市販の計算ソフトもしくは自作のものでも特に限定されるものではない。更にこれら一連の作業をコンピュータプログラムに組込んで色素濃度検出用プログラムとしてもよい。具体的には、本実施形態に係るプログラムは、コンピュータで実行される。例えば、パーソナルコンピュータやワークステーションなどのコンピュータであり、データを記憶するための記憶装置、演算や他の装置の制御を行なうための制御装置、ユーザの指定によりデータを入力し処理するための処理装置、及びユーザに対し演算結果を示すための表示装置を主要部として備える。これらの装置はバスにより接続されている。

記憶装置は、ＲＡＭやＲＯＭなどの半導体メモリ、ハードディスク、フレキシブルディスク、又は光磁気ディスクといった記憶媒体及び装置、若しくはこれらの組み合わせからなる。また、記憶装置には記憶されたデータを読み出すだけのＣＤ−ＲＯＭといった光ディクスも含む。記憶装置には制御装置が実行するコンピュータプログラムの他、各種データが記憶される。制御装置は、例えば、中央演算装置（ＣＰＵ）からなり、コンピュータプログラムに従ってデータの演算、記憶装置が記憶するデータの読み書き、他の装置に対する制御、及びデータの入力を行なう。処理装置は、制御装置が記憶装置に記憶されたプログラムに従って記憶装置からデータを読み出し、データの演算を行い演算の結果を記憶装置に書き込み、又は表示装置に表示させることにより実行される。入力装置は、例えばキーボードやマウスからなる。表示装置は例えば液晶ディスプレイやＣＲＴディスプレイ及びこれらに接続する制御回路からなる。

濃度算出工程では、色素濃度未知の試料の色彩情報を算出し、その値を上記の検量線算出工程で得られた検量線に代入して色素濃度を算出することが可能となる。

次に、本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

[実施例１]
＜試料の撮影＞
ニンジン２４品種、系統３３個体を用いそれぞれ根の中央部から幅１ｃｍを切断して試料とした。その試料の横断面の両側をデジタルカメラ（ＦｉｎｅＰｉｘＳ２Ｐｒｏ：富士フイルム社製）で撮影し、デジタル画像データとして保存した。なお、光源にはインバータ回路搭載スタンドに設置した色温度５５００Ｋ、演色性９１のトルーライト蛍光灯を採用した。

＜濃度の測定＞
撮影されたニンジンの試料を、アセトンとともに乳鉢で磨砕してカロテンを抽出し、石油エーテルと食塩水を加えて石油エーテル層に転溶し、無水硫酸ナトリウムで脱水後、エバポレーターで減圧乾固した。それを高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）溶離液（アセトニトリル：メタノール：ジクロロメタン：ヘキサン＝６０：１０：１５：１５）に溶かし、ＨＰＬＣ（島津ＳＰＤ−Ｍ１０Ａｖｐ、検出波長３００〜５００ｎｍ）でαカロテン、βカロテン含有量を測定した。カラムには逆送系充填剤カラムＷａｋｏＮａｖｉＣ３０−５（和光純薬社製）を用いた。

＜検量線作成＞
保存した画像をコンピュータに取り込み、背景の画像を削除した後、ＲＧＢ色座標系からＨＳＬ色座標系に変換を行い、試料画像全体の平均色として赤成分Ｒ，緑成分Ｇ，青成分Ｂ，色相Ｈ，彩度Ｓ，明度Ｌの色彩情報を算出した。撮影された試料のαカロテン、βカロテン含有量を表１、試料の横断面の平均ＲＧＢ値、ＲＧＢ値からＹ＝０．２９９Ｒ＋０．５８７Ｇ＋０．１１４Ｂの関係式を用いて算出したＹ（輝度）及びＨＳＬ値を表２に示す。

また、カロテンを含むニンジンの大半は色相Ｈが１６から２１の範囲内に分布することから、その範囲内の個体におけるＲ、Ｇ、Ｂ、Ｙ、Ｈ、Ｓ、Ｌ値とカロテン含有量との全ての相関係数を表３に示す。これより単回帰及び重回帰共に相関係数が約０．８の高い相関が得られることが示され、カロテン含有量を推測することが可能であることがわかった。

図１に輝度Ｙとカロテン含有量との関係を示す。ここで、リコピンニンジンである本紅金時を除いて、カロテン含有量の高い個体は輝度Ｙが低い傾向が認められた。また、緑成分Ｇと青成分Ｂ，色相Ｈ，明度Ｌについてもばらつきはあるものの同様の傾向が認められ、赤成分Ｒと彩度Ｓには輝度Ｙとは逆の傾向が認められた。

目的変数をカロテン含有量とし、説明変数を色彩情報とした線形回帰分析によりモデル構築を行った。その際、クロスバリデーション（ｌｅａｖｅ−ｏｎｅ−ｏｕｔ法）によりモデルの妥当性を評価した結果、輝度Ｙの単回帰モデルが決定係数Ｒ^２＝０．６９３、予測的決定係数Ｑ^２＝０．６２１と最も精度が高いことが判った。さらに、ＧＭＤＨ（ＧｒｏｕｐｉｎｇＭｅｔｈｏｄｏｆＤａｔａＨａｎｄｌｉｎｇ）法を用いて、色相Ｈと明度Ｌの重回帰モデルにそれらの積等の項目を加えることで、非線形性を検討した。その結果、表４に示すように色相Ｈと明度Ｌに補正項として（Ｈ＋Ｌ）の関数を加えたモデルが最も良い結果を与えることが判った。このことから、色彩情報とカロテン含量との関係には非線形性を有することが認められた。

［実施例２］
＜試料の撮影＞
ホウレンソウ１品種を用いて、葉齢の異なる４ステージの葉を材料とした。ホウレンソウの葉全体の表側をスキャナー（機種：ＧＴ−Ｘ７００（ＥＰＳＯＮ））で撮影しデジタル画像データとして保存した。記録方式は色補正なしＴＩＦＦ（１６ｂｉｔ）、解像度：４００ｄｐｉ、露出：固定（写真向き）とした。

＜濃度の測定＞
ホウレンソウの葉を水洗して裁断し後、８０％アセトンを加えてホモジナイザーで破砕した。その後破砕溶液を１分間３０００回転で遠沈して、上澄み溶液を抽出液として別容器に移した。残りの溶液に８０％アセトンを加えて破砕し、遠沈して抽出する操作を繰り返し、抽出液を合わせて定容した。その上澄み液をマイクロチューブに入れて７０００回転（５分間、４℃）し、分光光度計（ＨｉｔａｃｈｉＧｅｎｅｓｐｅｃIII）で吸光度を６６３ｎｍと６４５ｎｍにおいて測定し、以下の式に従って全クロロフィルの濃度を決定した。
全クロロフィル濃度（ｍｇ／ｍｌ）＝８．０５ＯＤ_６４３＋２０．３ＯＤ_６４５

＜クロロフィル含量と色彩情報との相関＞
保存した画像をコンピュータに取り込み、背景の画像を削除した後、ＲＧＢ色座標系からＨＳＬ色座標系に変換を行ない試料画像全体の平均色として赤成分Ｒ，緑成分Ｇ，青成分Ｂ，色相Ｈ，彩度Ｓ，明度Ｌの色彩情報を算出した。撮影された試料のクロロフィルａ、クロロフィルｂ、全クロロフィルの含有量、試料の平均ＲＧＢ値、ＨＳＬ値及びＲ，Ｇ，Ｂ，Ｈ，ＳｖＬ値とクロロフィル含有量との全ての相関係数を表５に示す。これよりクロロフィルと色彩情報値との相関係数が０．９８以上の高い相関が得られることが示され、葉の全体のクロロフィル含有量を正確に推測することが可能であることがわかった。

［実施例３］
＜試料の撮影＞
タマネギ６品種（ホワイトケッパー、ツキサップ、月交２２号、トヨヒラ、スーパー北もみじ、Ｄｒケルシー）を用いた。タマネギの外側の鱗葉をデジタルカメラ（ＦｉｎｅＰｉｘＳ２Ｐｒｏ：富士フイルム）で撮影し、デジタル画像データとして保存した。なお、光源にはインバータ回路搭載スタンドに設置した蛍光灯（ブラックライト）を採用した。また、反射板としてアルミ板を利用した。撮影条件としては、記録方式：ＲＡＷ（１２ｂｉｔ）、焦点距離：４３ｍｍ、絞り値：Ｆ８．０、シャッター速度：３０ｓｅｃ（信号が微弱のため）、ＩＳＯ感度：ＩＳＯ４００である。

＜濃度の測定＞
撮影されたタマネギの鱗葉を細断して、８０％メタノールに浸漬し、その後濾過してケルセチンを抽出した。抽出溶液を分光光度計（吸光度３６０ｎｍ）と高速液体クロマトグラフ（検出波長３６０ｎｍ、移動層：液２５％メタノール＋２％酢酸、液１００％メタノール）によって分離、定量した。

＜ケルセチン含量と色彩情報との相関＞
保存した画像をコンピュータに取り込み、背景の画像を削除した後、ＲＧＢ色座標系からＨＳＬ色座標系に変換を行ない試料画像全体の平均色として赤成分Ｒ，緑成分Ｇ，青成分Ｂ，色相Ｈ，彩度Ｓ，明度Ｌの色彩情報を算出した。撮影された試料のケルセチン含有量、試料の平均ＲＧＢ値、ＨＳＬ値及びＲ、Ｇ、Ｂ、Ｈ、Ｓ、Ｌ値とケルセチン含有量との全ての相関係数を表６に示す。これよりケルセチン含量と色彩情報との相関係数が０．９以上の高い相関が得られることが示され、フラボノイド類についても本方法により含量を推測することが可能であることがわかった。

［実施例４：ＲＡＷ画像によるカロテン含量の定量］
＜実験試料＞
実験試料は色・カロテン含量のバラエティーを重視し、１５品種、各品種３個体の計４５個体のニンジンを使用した。ニンジンは播種後およそ１００〜１０５日で収穫した。根の中央部から約１ｃｍの厚さに切断して試料とした。色彩画像計測は測定部の両断面に対して行った。ＲＡＷ画像、ＴＩＦＦ画像の撮影条件を表７に示す。また、測定後の試料は、ＨＰＬＣ分析によりカロテンを定量した。

＜画像取得方法とカロテン含量との相関＞
ニンジンの切断面をＲＡＷ画像で取得した場合と、ＴＩＦＦ画像で取得した場合のカロテン含量とＨＳＬ値との相関係数をみると、いずれもＲＡＷ画像の方が高い相関値を示した。特に、Ｓを説明変数に加えた場合、顕著となった（表８参照）。また、簡単な非線形性をモデルに加えてみると、Ｓを説明変数としたモデルにおいてＲＡＷ画像の方が高い相関値を示す傾向が、さらに顕著に現れた（表９、表１０参照）。Ｈ、ＬにおいてはＲＡＷ画像とＴＩＦＦ画像に大きな違いはない。以上の結果から、カロテン推定モデルには、ＲＡＷ画像によって取得したデータをＨ、Ｓ（Ｓに重点をおいて）を説明変数とした非線形モデルに当てはめて解析を行なうことがよいということが示された。

以上より、本発明は植物体の断面の色彩情報から色素含有量を定量することが可能であることがわかった。これにより植物体の品質管理、育種選抜システムに有用であることが示唆された。

本発明の分析方法により算出した色彩情報と色素含有量を示した図である。

Claims

記憶手段と制御手段と処理手段とデジタル画像撮影機と表示手段とを備える色素定量装置に対して、植物体に含まれる色素の定量方法をコンピュータに実行させるためのプログラムであって、
色素濃度が既知の複数の標準試料を、前記デジタル画像撮影機に対して、前記標準試料のデジタル画像を撮影させる撮影工程と、
この撮影工程で撮影されたそれぞれのデジタル画像から、前記標準試料の色彩情報に分解する分解工程と、
前記色彩情報と、前記標準試料の色素濃度と、に基づいて直線重回帰法により検量線を算出させる検量線算出工程と、
前記検量線に、説明変数を変数とする関数を補正項として加える工程と、
色素濃度が未知の対象試料を前記標準試料と同じ撮影条件で撮影したデジタル画像から色彩情報を得た後、この色彩情報から前記補正項が加えられた検量線に基づいて前記対象試料における任意の一種の色素濃度を算出させる濃度算出工程と、
この濃度算出工程で得られた色素濃度を前記表示手段に表示させる表示工程と、を前記処理手段に対して実行させるものである植物体に含まれる色素含有量の定量方法をコンピュータに実行させるためのプログラム。
前記色彩情報は、明度と色相である請求項１に記載のプログラム。
前記色素は、カロテノイド、クロロフィル、フラボノイド、キノン、フラビン、及びジヒドロフラビンからなる群から選ばれる１種以上のものである請求項１に記載のプログラム。
前記色素はカロテノイド、クロロフィルから選ばれる１種以上のものである請求項１から３のいずれかに記載のプログラム。
植物体に含まれる色素の定量方法であって、
デジタル画像撮影機を用いて、色素濃度が既知の複数の標準試料のデジタル画像を撮影し、それぞれのデジタル画像から、前記標準試料の色彩情報を得て、前記色彩情報と、前記標準試料の色素濃度と、に基づいて直線重回帰法により得られる検量線を用い、
前記検量線に、説明変数を変数とする関数を補正項として加える工程と、
色素濃度が未知の対象試料を前記標準試料と同じ撮影条件で撮影したデジタル画像から色彩情報を得た後、この色彩情報から前記補正項が加えられた検量線に基づいて前記対象試料における任意の一種の色素濃度を算出する濃度算出工程と、
を有する植物体に含まれる色素含有量の定量方法。
前記検量線の情報は、定期的又は常時更新するものであることを特徴とする請求項１に記載の植物体に含まれる色素含有量の定量方法。