JP4635272B2 - 植物根の活性度定量測定方法、及び測定試薬 - Google Patents
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Description
また、極めて薄いメチレンブルーを用いる場合に微小容量の容器内では組織の発生する水素の影響が支配的になることも知られていなかった。
そこで簡便で根の活性を確実に定量できる測定法が要望されている。
本根系活性度定量測定法は、圃場において簡便に作物の根系の呼吸状態を定量的に測って、どの様な栽培対策を取れば良いかを圃場で即座に判断する材料を与えることを可能としている。
また、従来は植物の根系の活性の正確な測定法がなかったので、本方法とCK反応液を用いれば、植物の根の活性が、植物の種類、栽培法、樹齢または生育のステージ、気象の影響等でどの様な相違があるのか、従来誰も手を付けられなかった未知の事象を科学的に、学問的に解明することを可能としている。
基準溶液は、容積3mlの、比色可能で透明な微小溶液を容れる容器群を用意し、これに標準濃度の1〜50×10 −6 mol/Lのメチレンブルー溶液を容れて濃度基準を作成する。
次ぎに、同じく容積3mlの、比色可能で透明な微小溶液を容れる透明キューベット容器群を用い、琥珀酸脱水素酵素反応容器とする。
1 分光光度計または比色計
2 上皿天秤
3 透明キューベット(=セミミクロデイスポセル) サイズ3.0ml 20個
4 セルラック サイズ209×70×35
5 注射器
6 カッターナイフ
7 ハサミ
8 ピンセット
1)基質緩衝液の調整
2.5×10−3mol/L琥珀酸ナトリウム、10−2mol/Lクエン酸ナトリウム、0.8×10−2mol/Lリン酸ナトリウムの調整。
琥珀酸ナトリウムを0.270g秤量し、結晶クエン酸ナトリウム0.371gを秤量し、リン酸ナトリウム粉末5.85gを秤量し、およそ80mlの水に溶かしてpH7〜8に調整し、容量を100mlにする。
植物の根の酵素活性の強さに応じてメチレンブルー濃度を変更する。
メチレンブルーの濃度は、10−4mol/Lメチレンブルー、4×10−5mol/Lメチレンブルー、及び2×10−5mol/Lメチレンブルーの3段階を設ける。
10−2mol/Lメチレンブルーは、メチレンブルー0.374gを秤量し、水に溶かして100mlにする。
10−4mol/Lメチレンブルーは、10−2mol/Lメチレンブルーを10ml採って100mlに薄め、更に10ml採って100mlに薄める。
5×10−5mol/Lメチレンブルーは、10−4mol/Lメチレンブルーを50ml採って100mlに薄め使用する。
2×10−5mol/Lメチレンブルーは、10−4mol/Lメチレンブルーを20ml採って100mlに薄め使用する。
10−5mol/Lメチレンブルーは、10−4mol/Lメチレンブルーを10ml採って100mlに薄め使用する。
反応試薬は作物の酵素活性の強さに応じてメチレンブルー濃度を選び、
10×10−6mol/LのCK反応試薬は、基質緩衝液100mlと2×10−5mol/Lメチレンブルー100ml、2×10−5mol/LのCK反応試薬は、基質緩衝液100mlと4×10−5mol/Lメチレンブルー100ml、5×10−5mol/LのCK反応試薬は、基質緩衝液100mlと1×10−4mol/Lメチレンブルー100ml、をそれぞれ混合して冷蔵庫に貯蔵する。
1×10−6mol/Lメチレンブルー、2×10−6mol/Lメチレンブルー、3×10−6メチレンブルー、4×10−6mol/Lメチレンブルー、5×10−6mol/Lメチレンブルー、6×10−6mol/Lメチレンブルー、7×10−6mol/Lメチレンブルー、8×10−6mol/Lメチレンブルー、9×10−6mol/Lメチレンブルー、10×10−6mol/Lメチレンブルー、15×10−6mol/Lメチレンブルー、20×10−6mol/Lメチレンブルー、25×10−6mol/Lメチレンブルー、30×10−6mol/Lメチレンブルー、35×10−6mol/Lメチレンブルー、40×10−6mol/Lメチレンブルー、45×10−6mol/Lメチレンブルー、50×10−6mol/Lメチレンブルーのシリーズで低濃度の場合は、10−5mol/Lメチレンブルーをそれぞれ10ml、20ml、30ml、40ml、50ml、60ml、70ml、80ml、90ml、を採取して100mlに希釈する。
高濃度の場合は、10−4mol/Lメチレンブルーをそれぞれ10ml、15ml、20ml、25ml、30ml、35ml、40ml、40ml、50mlを採取して100mlに希釈する。
これらを標準液として比色に供し、デヒドロゲナーゼ活性を測定する。
透明キューベットに予め定温にしたCK反応試薬を2ml注射器で注入する。
この反応試薬へ先に用意した植物根の切片0.1gを加え、温度センサーで温度を確認しながら、5分から10分で一定時間振盪浸漬し、反応する。
デヒドロゲナーゼによるメチレンブルーの脱色の後、一定時間後に、CK反応試薬の色相を比較調査する。色相調査は、透明キューベットにメチレンブルー標準液0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50×10mol/Lの溶液2mlを注射器で注入し、比色標準とする。
低濃度は現場で肉眼比色し、高濃度は比色計で精密比色する。
サニーレタスを水耕栽培し、根の活性に相違を生ずる様に、一方を通常的な通気をさせるためにエジェクターで空気の泡通気を行い、一方を非常に効率の高いマイクロバブル通気を行い、根の活性を比較した。
本根系活性度定量測定法による測定の結果、琥珀酸脱水素酵素活性を定量的に比色測定することにより、微細な量の根の呼吸量も数値として捕捉された。すなわち、マイクロバブル通気区がエジェクター通気区の2倍活性が高いことが測定された。
Claims (2)
- 呼吸促進緩衝液であるpH7の8×10−2mol/L燐酸ナトリウム、1×10−2mol/Lクエン酸ナトリウム緩衝液、呼吸基質の2.5×10−3mol/L琥珀酸ナトリウム、及び(1〜5)×10−5mol/LのメチレンブルーからなるCK反応試薬へ、植物の切断根を浸漬し、前記植物の根に含まれる琥珀酸脱水素酵素が前記CK反応試薬に含まれる琥珀酸をフマル酸に変化させる際に放出する少量の水素をメチレンブルーと反応させ、メチレンブルーの色の濃さの比較によって、放出された水素量を測定することによって、前記植物の根の有する琥珀酸脱水素酵素活性を、前記植物根とCK反応試薬を接触させるだけで比色測定することにより、前記植物根の活性度を簡便にかつ定量的に測定することを特徴とする植物根の活性度定量測定方法。
- 請求項1に記載の植物根の活性度定量測定方法において、前記植物根に含まれる琥珀酸脱水素酵素が琥珀酸をフマル酸に変化させる際に放出する少量の水素をメチレンブルーと反応させるため、メチレンブルーの濃度を(1〜5)×10 −5 mol/Lの範囲になるように定め、8×10−2 mol/L燐酸ナトリウム及び1×10−2mol/Lクエン酸ナトリウムからなるpH7の緩衝液と、呼吸基質の2.5×10−3mol/L琥珀酸ナトリウムと、を含み、前記植物根の活性度定量に当たって、前記植物の切断根を浸漬するだけでメチレンブルーの色の変化が起って、前記植物根の活性度が測定できることを特徴とする植物根の活性度測定用CK反応試薬。
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