JP4630865B2 - Substance immobilizing agent, substance immobilizing method using the same, and substance immobilizing substrate using the same - Google Patents

Substance immobilizing agent, substance immobilizing method using the same, and substance immobilizing substrate using the same Download PDF

Info

Publication number
JP4630865B2
JP4630865B2 JP2006513624A JP2006513624A JP4630865B2 JP 4630865 B2 JP4630865 B2 JP 4630865B2 JP 2006513624 A JP2006513624 A JP 2006513624A JP 2006513624 A JP2006513624 A JP 2006513624A JP 4630865 B2 JP4630865 B2 JP 4630865B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
substance
group
water
substrate
immobilized
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP2006513624A
Other languages
Japanese (ja)
Other versions
JPWO2005111618A1 (en
Inventor
伊藤  嘉浩
馨 大村
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Original Assignee
RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by RIKEN Institute of Physical and Chemical Research filed Critical RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Publication of JPWO2005111618A1 publication Critical patent/JPWO2005111618A1/en
Application granted granted Critical
Publication of JP4630865B2 publication Critical patent/JP4630865B2/en
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)

Description

本発明は、ポリペプチド、核酸、脂質等の所望の物質を基体上に固定化するための物質固定化剤、それを用いた物質固定化方法及びそれを用いた物質固定化基体に関する。   The present invention relates to a substance immobilizing agent for immobilizing a desired substance such as a polypeptide, nucleic acid, lipid, etc. on a substrate, a substance immobilizing method using the same, and a substance immobilizing substrate using the same.

従来より、抗体又は抗原をプレート上に固定化した、免疫測定のためのイムノプレートや、核酸をチップ上に固定化したDNAチップ等が広く用いられている。従来、基体上にタンパク質や核酸を固定化する方法の1つとして、物理吸着が広く用いられている。すなわち、例えばポリスチレンのような疎水性の基体と、基体上に固定化すべきタンパク質や核酸の水溶液とを接触させて放置することにより、物理吸着によってタンパク質や核酸が基体上に固定化される。   Conventionally, an immunoplate for immunoassay in which an antibody or antigen is immobilized on a plate, a DNA chip in which a nucleic acid is immobilized on a chip, and the like are widely used. Conventionally, physical adsorption has been widely used as one method for immobilizing proteins and nucleic acids on a substrate. That is, when a hydrophobic substrate such as polystyrene and an aqueous solution of protein or nucleic acid to be immobilized on the substrate are left in contact with each other, the protein or nucleic acid is immobilized on the substrate by physical adsorption.

しかしながら、物理吸着を用いる方法では、基体と固定化物質との結合が弱く、物質を固定化した基体の安定性が不十分であるという問題がある。また、目的のタンパク質や核酸で被覆されなかった領域への非特異吸着を防止するために、ウシ血清アルブミン(BSA)、カゼイン、スキムミルク等のタンパク質(タンパク質を固定化する場合)や、サケ精子DNA等のDNA(DNAを固定化する場合)でブロッキングすることが行われているが、ブロッキングによる非特異吸着の防止効果も必ずしも満足できるものではない。   However, the method using physical adsorption has a problem that the bond between the substrate and the immobilized substance is weak, and the stability of the substrate on which the substance is immobilized is insufficient. In order to prevent non-specific adsorption to areas not covered with the target protein or nucleic acid, proteins such as bovine serum albumin (BSA), casein, skim milk, etc. (when proteins are immobilized), salmon sperm DNA However, blocking with non-specific adsorption due to blocking is not always satisfactory.

また、基体上の官能基と、固定化すべきタンパク質や核酸の官能基とを共有結合させることにより基体上にタンパク質や核酸を固定化することも行われている。しかしながら、この方法では、用いる官能基が物質の活性部位の中又はその近傍にある場合には、固定化により物質の活性が失われてしまう。また、適当な官能基が存在しない場合には、この方法により固定化することができない。また、物理吸着の場合と同様、ブロッキングにより非特異吸着が防止されているが、その防止効果は必ずしも満足できるものではない。   In addition, the protein or nucleic acid is immobilized on the substrate by covalently bonding the functional group on the substrate to the functional group of the protein or nucleic acid to be immobilized. However, in this method, when the functional group to be used is in or near the active site of the substance, the activity of the substance is lost due to immobilization. In addition, when there is no appropriate functional group, it cannot be immobilized by this method. Further, as in the case of physical adsorption, non-specific adsorption is prevented by blocking, but the prevention effect is not always satisfactory.

一方、光反応性基を利用して物質を基板に固定化することも知られている(Y. Ito and M. Nogawa, "Preparation of a protein micro-array using a photo-reactive polymer for a cell adhesion assay," Biomaterials, 24、3021-3026 (2003))。しかしながら、この方法では、非特異吸着を防止するための配慮は特にされてはいない。   On the other hand, it is also known to immobilize substances on substrates using photoreactive groups (Y. Ito and M. Nogawa, "Preparation of a protein micro-array using a photo-reactive polymer for a cell adhesion assay, "Biomaterials, 24, 3021-3026 (2003)). However, in this method, no special consideration is given to prevent nonspecific adsorption.

また、ある物質と他の物質との相互作用を調べる方法として、水晶発振子(QCM)や表面プラズモン共鳴(SPR)が広く用いられている。これらの方法は、物質間の反応をリアルタイムで検出することができるという優れた利点を有しており、化学分野における様々な研究に広く用いられている。これらの方法を用いる場合には、被検物質を金に結合することが必要である。   As a method for examining the interaction between a certain substance and another substance, a crystal oscillator (QCM) and surface plasmon resonance (SPR) are widely used. These methods have an excellent advantage that a reaction between substances can be detected in real time, and are widely used in various studies in the chemical field. When using these methods, it is necessary to bind the test substance to gold.

従って、ポリペプチド、核酸、脂質等の所望の物質と他の物質の相互作用、例えば、抗原抗体反応や核酸間のハイブリダイゼーションをQCMやSPRで検出しようとする場合には、これらの生体分子を金表面に結合することが必要になる。生体分子を金表面に結合するために、従来、アミノ基やカルボキシル基のような官能基を生体分子に導入したり、ビオチンやFcセグメントを生体分子に導入することが必要であった。このため、金表面に固定化できないか又は固定化すると活性が失われて目的とする反応を行なうことができない場合も多かった。また、金表面に生体分子が結合できる場合であっても、該生体分子との反応を調べようとする物質が金表面に非特異的に吸着し、所望の反応を特異的に検出することが困難になる場合もしばしばあった。   Therefore, when trying to detect the interaction between desired substances such as polypeptides, nucleic acids, lipids, and other substances, such as antigen-antibody reactions and hybridization between nucleic acids, using QCM or SPR, these biomolecules It is necessary to bond to the gold surface. In order to bind a biomolecule to a gold surface, it has been conventionally necessary to introduce a functional group such as an amino group or a carboxyl group into the biomolecule, or to introduce biotin or an Fc segment into the biomolecule. For this reason, in many cases, it cannot be immobilized on the gold surface, or if immobilized, the activity is lost and the intended reaction cannot be performed. Further, even when a biomolecule can bind to the gold surface, the substance to be examined for the reaction with the biomolecule can be adsorbed nonspecifically on the gold surface and the desired reaction can be specifically detected. Often it was difficult.

特開平11−337551号公報JP 11-337551 A 特開2001−337089号公報JP 2001-337089 A Y. Ito and M. Nogawa, "Preparation of a protein micro-array using a photo-reactive polymer for a cell adhesion assay," Biomaterials, 24、3021-3026 (2003)Y. Ito and M. Nogawa, "Preparation of a protein micro-array using a photo-reactive polymer for a cell adhesion assay," Biomaterials, 24, 3021-3026 (2003) ナノテクノロジー大辞典((株)工業調査会発行(2003年12月25日))838〜839頁Nanotechnology Large Dictionary (published by Industrial Research Council, Inc. (December 25, 2003)) 838-839 Japan Nanonet Bulletin 第58号(2004年3月16日)Japan Nanonet Bulletin 58th (March 16, 2004)

従って、本発明の目的は、基体上に種々の固定化すべき物質を共有結合により固定化することができ、かつ、非特異吸着の防止効果に優れた、物質固定化剤、それを用いた物質固定化方法及びそれを用いた物質固定化基体を提供することである。   Therefore, an object of the present invention is to fix a substance to be immobilized on a substrate by covalent bonding and to be excellent in the effect of preventing nonspecific adsorption, and a substance using the same An immobilization method and a substance immobilization substrate using the same are provided.

また、本発明の目的は、ポリペプチド、核酸、脂質等の所望の物質を、その種類に関わらず金等の金属表面に固定化することができ、かつ、非特異吸着を抑制することができる物質固定化剤、それを用いた物質固定化方法及びそれを用いた物質固定化基体を提供することである。   The object of the present invention is to fix a desired substance such as a polypeptide, nucleic acid, or lipid on a metal surface such as gold regardless of the type, and to suppress nonspecific adsorption. It is to provide a substance immobilizing agent, a substance immobilizing method using the same, and a substance immobilizing substrate using the same.

本願発明者らは、鋭意研究の結果、1分子中に少なくとも2個の光反応性基を有する光架橋剤と、分子全体として電気的に中性な水溶性ポリマーとの混合物を物質固定化剤として用いることにより、基体上に種々の固定化すべき物質を共有結合により固定化することができ、かつ、非特異吸着の防止効果に優れることを見出し本発明を完成した。   As a result of diligent research, the inventors of the present application have developed a substance immobilizing agent comprising a mixture of a photocrosslinking agent having at least two photoreactive groups in one molecule and a water-soluble polymer that is electrically neutral as a whole molecule. As a result, it was found that various substances to be immobilized on a substrate can be immobilized by covalent bonds, and that the effect of preventing nonspecific adsorption is excellent, and the present invention has been completed.

すなわち、本発明は、1分子中に少なくとも2個の光反応性基を有する光架橋剤と、分子全体として電気的に中性な水溶性ポリマーとを含む、基体上に所望の物質を固定化するための物質固定化剤を提供する。また、本発明は、基体に固定化すべき物質と、上記本発明の物質固定化剤とを含む水溶液又は水懸濁液を前記基体に塗布し、光照射することを含む、基体上への物質の固定化方法を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の方法により前記物質が固定化された基体を提供する。   That is, the present invention immobilizes a desired substance on a substrate containing a photocrosslinking agent having at least two photoreactive groups in one molecule and an electrically neutral water-soluble polymer as a whole molecule. A substance immobilizing agent is provided. Further, the present invention provides a substance on a substrate, which comprises applying an aqueous solution or a water suspension containing the substance to be immobilized on the substrate and the substance immobilizing agent of the present invention to the substrate and irradiating with light. The immobilization method is provided. Furthermore, the present invention provides a substrate on which the substance is immobilized by the method of the present invention.

本発明により、基体上に種々の固定化すべき物質を共有結合により固定化することができ、かつ、非特異吸着の防止効果に優れた、物質固定化剤、それを用いた物質固定化方法及びそれを用いた物質固定化基体が提供された。本発明によれば、固定化すべき物質を、その種類に関係なく共有結合により固定化することができ、安定な固定化基板を得ることができる。また、本発明の物質固定化剤を用いて物質を固定化すると、非特異吸着が効果的に防止される。さらに、本発明の物質固定化剤を用いて物質を固定化する場合、選択露光を行うことにより、固定化物質のパターニングも可能であり、容易にマイクロアレイ等の任意のパターンに物質を固定化することができる。   According to the present invention, various substances to be immobilized on a substrate can be immobilized by covalent bonds, and are excellent in the effect of preventing nonspecific adsorption, a substance immobilization method using the same, and A substance-immobilized substrate using the same was provided. According to the present invention, a substance to be immobilized can be immobilized by a covalent bond regardless of the type, and a stable immobilized substrate can be obtained. Further, when the substance is immobilized using the substance immobilizing agent of the present invention, nonspecific adsorption is effectively prevented. Further, when immobilizing a substance using the substance immobilizing agent of the present invention, it is possible to pattern the immobilized substance by performing selective exposure, and the substance can be easily immobilized in an arbitrary pattern such as a microarray. be able to.

また、本発明により、ポリペプチド、核酸、脂質等の所望の物質を、その種類に関わらず金等の金属表面に固定化することができ、かつ、非特異吸着を抑制することができる物質固定化剤が初めて提供された。光反応性基は、有機化合物中の炭素原子とも結合するので、本発明の物質固定化剤を用いれば、有機物をその種類に関わらず金属表面に固定化することができる。また、両極性又はノニオン性の水溶性ポリマーにより非特異吸着が効果的に抑制される。従って、本発明は、各種生体分子と他の物質との相互作用のQCM測定やSPR測定に大いに寄与するものと考えられる。   In addition, according to the present invention, a desired substance such as a polypeptide, nucleic acid, or lipid can be immobilized on a metal surface such as gold regardless of the type, and substance immobilization capable of suppressing nonspecific adsorption. An agent was provided for the first time. Since the photoreactive group is also bonded to the carbon atom in the organic compound, the organic substance can be immobilized on the metal surface regardless of the type by using the substance immobilizing agent of the present invention. Further, non-specific adsorption is effectively suppressed by the bipolar or nonionic water-soluble polymer. Therefore, the present invention is considered to greatly contribute to QCM measurement and SPR measurement of interaction between various biomolecules and other substances.

本発明の実施例3で行った免疫測定における基板の平均表面粗さと発光強度との関係を示す図である。It is a figure which shows the relationship between the average surface roughness of a board | substrate in the immunoassay performed in Example 3 of this invention, and emitted light intensity. 水晶発振子マイクロバランス測定装置を用いてQCM測定する方法を模式的に示す図である。It is a figure which shows typically the method of measuring QCM using a crystal oscillator microbalance measuring apparatus. 本発明の実施例6で調製した物質固定化剤と、水晶発振子マイクロバランス測定装置のセンサチップの金電極との反応をQCM測定した際の、周波数変化の経時変化を示す図である。It is a figure which shows the time-dependent change of a frequency change at the time of carrying out QCM measurement of the reaction of the substance fixing agent prepared in Example 6 of this invention, and the gold electrode of the sensor chip of a crystal oscillator microbalance measuring apparatus. 本発明の実施例7で行った、本発明の物質固定化剤を用いてダニアレルゲン抗体を水晶発振子マイクロバランス測定装置のセンサチップの金電極に固定化し、ダニアレルゲンとの抗原抗体反応をQCM測定した際の、周波数変化の経時変化を示す図である。The mite allergen antibody was immobilized on the gold electrode of the sensor chip of the quartz crystal microbalance measuring apparatus using the substance immobilizing agent of the present invention, which was carried out in Example 7 of the present invention, and the antigen-antibody reaction with the mite allergen was measured by QCM. It is a figure which shows the time-dependent change of the frequency change at the time of measuring.

上記の通り、本発明の第1の局面の物質固定化剤は、1分子中に少なくとも2個の光反応性基を有する光架橋剤と、分子全体として電気的に中性な水溶性ポリマーとを含む。   As described above, the substance immobilizing agent according to the first aspect of the present invention includes a photocrosslinking agent having at least two photoreactive groups in one molecule, a water-soluble polymer that is electrically neutral as a whole molecule, including.

光架橋剤が有する光反応性基の好ましい例として、アジド基(-N3)を挙げることができるがこれに限定されるものではない。光架橋剤としては、アジド基を2個有するジアジド化合物が好ましく、特に水溶性ジアジド化合物が好ましい。本発明に用いられる光架橋剤の好ましい例として、下記一般式[III]で表されるジアジド化合物を挙げることができる。Preferable examples of the photoreactive group possessed by the photocrosslinking agent include an azide group (—N 3 ), but are not limited thereto. As the photocrosslinking agent, a diazide compound having two azide groups is preferable, and a water-soluble diazide compound is particularly preferable. Preferable examples of the photocrosslinking agent used in the present invention include diazide compounds represented by the following general formula [III].

Figure 0004630865
Figure 0004630865

一般式[I]中、Rは単結合又は任意の基を示す。-R-は、2個のフェニルアジド基を連結するだけの構造であるから、特に限定されない。好ましい-R-の例として、単結合(すなわち、2個のフェニルアジド基が直接連結される)、炭素数1〜6のアルキレン基(1個又は2個の炭素間不飽和結合を含んでいてもよく、1個又は2個の炭素原子が酸素と二重結合してカルボニル基を構成していてもよい)(特に好ましくはメチレン基)、-O-、-SO2-、-S-S-、-S-、-R2 ・・・Y・・・R3-(ただし、・・・は単結合又は二重結合を示し、Yは炭素数3〜8のシクロアルキレン基、R2及びR3は互いに独立に炭素数1〜6のアルキレン基(1個又は2個の炭素間不飽和結合を含んでいてもよく、該アルキレン基の基端の炭素原子とYとの結合が二重結合であってもよく)、1個又は2個の炭素原子が酸素と二重結合してカルボニル基を構成していてもよい)を示し、シクロアルキレン基は、1個又は2個以上の任意の置換基で置換されていてもよく(置換されている場合、好ましくはシクロアルキレン基を構成する炭素原子のうち、1個若しくは2個が酸素と二重結合してカルボニル基を構成し、及び/若しくは1個若しくは2個の炭素数1〜6のアルキル基で置換されている)を挙げることができ、また、一般式[II]中のそれぞれのベンゼン環は、1個又は2個以上の任意の置換基(好ましくはハロゲン、炭素数1〜4のアルコキシル基、スルホン酸若しくはその塩等の親水性基)で置換されていてもよい。好ましい-R-の具体例として次のものを例示することができる。−、-CH2-、-O-、-SO2-、-S-S-、-S-、-CH=CH-、-CH=CH-CO-、-CH=CH-CO-CH=CH-、-CH=CH-、In general formula [I], R represents a single bond or an arbitrary group. -R- is not particularly limited because it is a structure that only links two phenyl azide groups. Examples of preferred —R— include a single bond (that is, two phenyl azide groups are directly linked), an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms (including one or two carbon-carbon unsaturated bonds). 1 or 2 carbon atoms may be bonded to oxygen to form a carbonyl group) (particularly preferably a methylene group), —O—, —SO 2 —, —SS—, -S-, -R 2 ... Y ... R 3- (where ... represents a single bond or a double bond, Y represents a cycloalkylene group having 3 to 8 carbon atoms, R 2 and R 3 Are each independently an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms (which may contain one or two carbon-carbon unsaturated bonds, and the bond between the carbon atom at the end of the alkylene group and Y is a double bond). 1 or 2 carbon atoms may be double-bonded with oxygen to form a carbonyl group), and the cycloalkylene group is 1 May be substituted with two or more arbitrary substituents (when substituted, preferably one or two of the carbon atoms constituting the cycloalkylene group are double-bonded to oxygen to form carbonyl And / or substituted with one or two alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms, and each benzene ring in the general formula [II] is 1 It may be substituted with one or more arbitrary substituents (preferably a hydrophilic group such as halogen, an alkoxyl group having 1 to 4 carbon atoms, a sulfonic acid or a salt thereof). Specific examples of preferred —R— include the following. -, -CH 2- , -O-, -SO 2- , -SS-, -S-, -CH = CH-, -CH = CH-CO-, -CH = CH-CO-CH = CH-, -CH = CH-,

Figure 0004630865
Figure 0004630865

好ましいジアジド化合物の具体例として、下記のものを例示することができる。   Specific examples of preferred diazide compounds include the following.

Figure 0004630865
Figure 0004630865

Figure 0004630865
Figure 0004630865

Figure 0004630865
Figure 0004630865

Figure 0004630865
Figure 0004630865

Figure 0004630865
Figure 0004630865

本発明に用いられる光架橋剤の内、特に好ましいのは水溶性のものである。光架橋剤についての「水溶性」とは、0.5mM以上、好ましくは2mM以上の濃度の水溶液を与えることができることを意味する。   Among the photocrosslinking agents used in the present invention, particularly preferred are water-soluble ones. “Water-soluble” for the photocrosslinking agent means that an aqueous solution having a concentration of 0.5 mM or more, preferably 2 mM or more can be provided.

光架橋剤の使用時の濃度(被固定化物質と混合する前の濃度)は、特に限定されないが、1μMないし2mMが好ましく、さらに好ましくは0.01mMないし0.5mMである。また、水溶性ポリマーに対する添加量としては、特に制限はないが、好ましくは0.1〜50重量%、特に1〜30重量%、更には1〜10重量%である。   The concentration at the time of using the photocrosslinking agent (concentration before mixing with the substance to be immobilized) is not particularly limited, but is preferably 1 μM to 2 mM, more preferably 0.01 mM to 0.5 mM. Moreover, there is no restriction | limiting in particular as addition amount with respect to a water-soluble polymer, However, Preferably it is 0.1-50 weight%, Especially 1-30 weight%, Furthermore, it is 1-10 weight%.

本発明の物質固定化剤に含まれる水溶性ポリマーは、分子全体として電気的に中性な水溶性ポリマーである。ここで、「分子全体として電気的に中性」とは、中性付近のpH(pH6〜8)の水溶液中で電離してイオンになる基を有さないか、又は有していても陽イオンになるものと陰イオンになるものを有していて、その電荷の合計が実質的に0になることを意味する。ここで「実質的に」とは、電荷の合計が0になるか、又は0にはならないとしても本発明の効果に悪影響を与えない程度に小さいことを意味する。   The water-soluble polymer contained in the substance fixing agent of the present invention is a water-soluble polymer that is electrically neutral as a whole molecule. Here, “electrically neutral as a whole molecule” means that it does not have or does not have a group that becomes ionized by ionization in an aqueous solution having a pH near pH (pH 6 to 8). It has an ion and an anion, and it means that the total charge becomes substantially zero. Here, “substantially” means that the total charge becomes 0 or is small enough not to adversely affect the effect of the present invention even if it does not become 0.

本発明に用いられる水溶性ポリマーの水に対する溶解度(水100gに溶解するグラム数)は、好ましくは5以上である。   The water solubility of the water-soluble polymer used in the present invention (the number of grams dissolved in 100 g of water) is preferably 5 or more.

水溶性ポリマーの好ましい例として、ノニオン性水溶性ポリマーを挙げることができる。ノニオン性水溶性ポリマーは、優れた非特異吸着防止効果を有し、また、安価に製造又は入手可能であるという利点を有する。   Preferable examples of the water-soluble polymer include nonionic water-soluble polymers. The nonionic water-soluble polymer has an excellent non-specific adsorption preventing effect and has an advantage that it can be produced or obtained at low cost.

ここで、「ノニオン性」とは、中性付近のpH(pH6〜8)の水溶液中で電離してイオンになる基を実質的に有さないことを意味する。ここで「実質的に」とは、このような基を全く含まないか、又は含んでいるとしても本発明の効果に悪影響を与えない程度に微量(例えば、このような基の数が炭素数の1%以下)であることを意味する。   Here, “nonionic” means that it has substantially no group that becomes ionized by ionization in an aqueous solution having a pH close to neutrality (pH 6 to 8). Here, “substantially” means that such a group is not contained at all, or even if such a group is contained, it is so small that the effect of the present invention is not adversely affected (for example, the number of such groups is the number of carbon atoms). 1% or less).

ノニオン性水溶性ポリマーの分子量(平均分子量、以下同じ)は、特に限定されず、通常、350〜500万程度であるが、ノニオン性水溶性ポリマーの分子量が大きいと、ノニオン性水溶性ポリマー同士の架橋が多くなり、被固定化物質と、被固定化物質との反応に供される物質(以下、便宜的に「反応物質」と呼ぶことがある)との反応が起きにくくなる場合があるので、500〜数10万程度が好ましい。   The molecular weight (average molecular weight, the same applies hereinafter) of the nonionic water-soluble polymer is not particularly limited, and is usually about 3.5 to 5,000,000. If the molecular weight of the nonionic water-soluble polymer is large, Since the number of crosslinks increases, the reaction between the substance to be immobilized and the substance used for the reaction with the substance to be immobilized (hereinafter sometimes referred to as “reactive substance” for convenience) may be difficult to occur. 500 to several hundred thousand is preferable.

本発明で用いられるノニオン性水溶性ポリマーの好ましい例として、ポリエチレングリコール(PEG)やポリプロピレングリコールのようなポリアルキレングリコール;ビニルアルコール、メチルビニルエーテル、ビニルピロリドン、ビニルオキサゾリドン、ビニルメチルオキサゾリドン、2-ビニルピリジン、4-ビニルピリジン、N-ビニルサクシンイミド、N-ビニルホルムアミド、N-ビニル-N-メチルホルムアミド、N-ビニルアセトアミド、N-ビニル-N-メチルアセトアミド、2-ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリエチレングリコールメタクリレート、ポリエチレングリコールアクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、N,N-ジメチルアクリルアミド、N-iso-プロピルアクリルアミド、ジアセトンアクリルアミド、メチロールアクリルアミド、アクリロイルモルホリン、アクリロイルピロリジン、アクリロイルピペリジン、スチレン、クロロメチルスチレン、ブロモメチルスチレン、酢酸ビニル、メチルメタクリレート、ブチルアクリレート、メチルシアノアクリレート、エチルシアノアクリレート、n-プロピルシアノアクリレート、iso-プロピルシアノアクリレート、n-ブチルシアノアクリレート、iso-ブチルシアノアクリレート、tert-ブチルシアノアクリレート、グリシジルメタクリレート、エチルビニルエーテル、n-プロピルビニルエーテル、iso-プロピルビニルエーテル、n-ブチルビニルエーテル、iso-ブチルビニルエーテル、tert-ブチルビニルエーテルなどのモノマー単位を単独か混合物を構成成分とするノニオン性のビニル系高分子;ゼラチン、カゼイン、コラーゲン、アラビアガム、キサンタンガム、トラガントガム、グアーガム、プルラン、ペクチン、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸、キトサン、キチン誘導体、カラギーナン、澱粉類(カルボキシメチルデンプン、アルデヒドデンプン)、デキストリン、サイクロデキストリン等の天然高分子、メチルセルロース、ビスコース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースのような水溶性セルロース誘導体等の天然高分子を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。これらのうち、特に好ましいものはポリエチレングリコール系ポリマー(ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコール部分を有するビニル化合物のビニル重合体)、ポリ(メタ)アクリルアミド(本明細書及び特許請求の範囲において、「(メタ)アクリル」は、「メタクリル」又は「アクリル」を意味する)及びポリ(グリシジル(メタ)アクリレート)であり、これらの中で特に好ましくは、ポリエチレングリコール系ポリマーであり、更には、疎水性の主鎖に親水性の側鎖がついたポリエチレングリコール(メタ)アクリレートのビニル重合体がもっとも好ましい効果を有する。   Preferred examples of nonionic water-soluble polymers used in the present invention include polyalkylene glycols such as polyethylene glycol (PEG) and polypropylene glycol; vinyl alcohol, methyl vinyl ether, vinyl pyrrolidone, vinyl oxazolidone, vinyl methyl oxazolidone, and 2-vinyl pyridine. 4-vinylpyridine, N-vinylsuccinimide, N-vinylformamide, N-vinyl-N-methylformamide, N-vinylacetamide, N-vinyl-N-methylacetamide, 2-hydroxyethyl methacrylate, polyethylene glycol methacrylate, Polyethylene glycol acrylate, acrylamide, methacrylamide, N, N-dimethylacrylamide, N-iso-propylacrylamide, diacetone acrylamide, methylol acrylamide, acrylic Liloylmorpholine, acryloylpyrrolidine, acryloylpiperidine, styrene, chloromethylstyrene, bromomethylstyrene, vinyl acetate, methyl methacrylate, butyl acrylate, methyl cyanoacrylate, ethyl cyanoacrylate, n-propyl cyanoacrylate, iso-propyl cyanoacrylate, n Monomers such as -butyl cyanoacrylate, iso-butyl cyanoacrylate, tert-butyl cyanoacrylate, glycidyl methacrylate, ethyl vinyl ether, n-propyl vinyl ether, iso-propyl vinyl ether, n-butyl vinyl ether, iso-butyl vinyl ether, tert-butyl vinyl ether Nonionic vinyl polymer whose unit is a single unit or a mixture; gelatin, casein, collagen, gum arabic, Xanthan gum, tragacanth gum, guar gum, pullulan, pectin, sodium alginate, hyaluronic acid, chitosan, chitin derivative, carrageenan, starch (carboxymethyl starch, aldehyde starch), dextrin, cyclodextrin, and other natural polymers, methylcellulose, viscose, hydroxy Examples include natural polymers such as water-soluble cellulose derivatives such as ethyl cellulose, hydroxyethyl methyl cellulose, carboxymethyl cellulose, and hydroxypropyl cellulose, but are not limited thereto. Among these, particularly preferred are polyethylene glycol polymers (polyethylene glycol and vinyl polymers of vinyl compounds having a polyethylene glycol moiety), poly (meth) acrylamide (in the present specification and claims, “(meth) acrylic”). "Means" methacryl "or" acryl ") and poly (glycidyl (meth) acrylate), and among these, polyethylene glycol-based polymers are particularly preferable. A vinyl polymer of polyethylene glycol (meth) acrylate having a hydrophilic side chain has the most preferable effect.

水溶性ポリマーの好ましい例として、下記一般式[I]で表される構造を有する単位を有する水溶性ポリマーを挙げることができる。   Preferable examples of the water-soluble polymer include water-soluble polymers having units having a structure represented by the following general formula [I].

Figure 0004630865
Figure 0004630865

(ただし、一般式[I]中、Xは、重合した状態の重合性原子団を表わす) (In the general formula [I], X represents a polymerizable atomic group in a polymerized state)

なお、上記一般式[I]で表される構造を有する単位を以下、便宜的に「単位[I]」と言うことがある。   The unit having the structure represented by the general formula [I] may be hereinafter referred to as “unit [I]” for convenience.

上記ホスホリルコリン含有ポリマーは、生体膜が種々の物質と接触するにもかかわらず、非特異吸着がほとんど起きないことに着目し、生体膜の構成成分であるホスホリルコリンを含む高分子を利用して、所望の物質を基体に固定化することにより非特異吸着を有効に防止できるのではないかという着想に基づいて発明されたものである。   The above-mentioned phosphorylcholine-containing polymer is not desired because non-specific adsorption hardly occurs even though the biological membrane comes into contact with various substances, and a polymer containing phosphorylcholine, which is a constituent of the biological membrane, is used as a desired polymer. It was invented based on the idea that nonspecific adsorption can be effectively prevented by immobilizing the above substance on a substrate.

単位[I]は、ホスホリルコリン基を含む単位であり、Xは重合した状態の重合性原子団を表す。Xとしては、ビニル系モノマー残基が好ましい。単位[I]としては、下記一般式[I']で示されるものが好ましい。   The unit [I] is a unit containing a phosphorylcholine group, and X represents a polymerizable atomic group in a polymerized state. X is preferably a vinyl monomer residue. As the unit [I], those represented by the following general formula [I ′] are preferable.

Figure 0004630865
Figure 0004630865

(ただし、X'は、ビニル部分が付加重合している状態のメタクリルオキシ基、メタクリルアミド基、アクリルオキシ基、アクリルアミド基、スチリルオキシ基又はスチリルアミド基を表し、R1は単結合又は炭素数1〜10のアルキレン基(ただし1個又は2個のヒドロキシル基で置換されていてもよい)を表す)(However, X ′ represents a methacryloxy group, a methacrylamide group, an acryloxy group, an acrylamide group, a styryloxy group or a styrylamide group in a state where the vinyl moiety is addition-polymerized, and R 1 is a single bond or a carbon number. 1 to 10 alkylene groups (which may be substituted with one or two hydroxyl groups)

このような単位の好ましい具体例として、2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、2−アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、N−(2−メタクリルアミド)エチルホスホリルコリン、4−メタクリロイルオキシブチルホスホリルコリン、6−メタクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、10-メタクリロイルオキシデシルシルホスホリルコリン、ω−メタクリロイルジオキシエチレンホスホリルコリン又は4−スチリルオキシブチルホスホリルコリンに由来する(すなわち、これらの単位を重合させた)単位を挙げることができる。これらの中でも2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンに由来する単位が特に好ましい。   Preferred examples of such units include 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine, 2-acryloyloxyethyl phosphorylcholine, N- (2-methacrylamide) ethyl phosphorylcholine, 4-methacryloyloxybutylphosphorylcholine, 6-methacryloyloxyhexyl phosphorylcholine, 10 -Methacryloyloxydecylsylphosphorylcholine, ω-methacryloyldioxyethylene phosphorylcholine or 4-styryloxybutylphosphorylcholine (that is, these units are polymerized). Among these, a unit derived from 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine is particularly preferable.

単位[I]を含有する水溶性ポリマーは、単位[I]のみが重合したものであってもよいし、単位[I]と、本発明の効果に悪影響を与えない他の重合性モノマーとの共重合体であってもよい。他の重合性モノマーとしては、ビニル系モノマーが好ましく、特に(メタ)アクリル酸又はその塩若しくはエステル(好ましくは低級アルキル(炭素数1〜6)エステル)が好ましい。共重合体の場合、共重合体を構成する単位[I]と他の重合性モノマーとの比率は、特に限定されないが、モル比で1:0.7以下、特に1:0.5以下が好ましい。なお、光架橋剤として親水性基と疎水性基の両方を有する化合物を用いる場合、ミセル化を防ぐため、(メタ)アクリル酸アルキルエステル(アルキル部分の炭素数が好ましくは3〜6)のような親水性基と疎水性基(アルキルエステル部分)の両方を含むモノマーと共重合することが好ましい。   The water-soluble polymer containing the unit [I] may be one in which only the unit [I] is polymerized, or the unit [I] and other polymerizable monomers that do not adversely affect the effects of the present invention. A copolymer may also be used. As the other polymerizable monomer, a vinyl monomer is preferable, and (meth) acrylic acid or a salt or ester thereof (preferably a lower alkyl (carbon number 1 to 6) ester) is particularly preferable. In the case of a copolymer, the ratio between the unit [I] constituting the copolymer and the other polymerizable monomer is not particularly limited, but is preferably 1: 0.7 or less, particularly preferably 1: 0.5 or less in terms of molar ratio. In addition, when using the compound which has both a hydrophilic group and a hydrophobic group as a photocrosslinking agent, in order to prevent micellization, (meth) acrylic-acid alkylester (The carbon number of an alkyl part, Preferably it is 3-6.) It is preferable to copolymerize with a monomer containing both a hydrophilic group and a hydrophobic group (alkyl ester moiety).

単位[I]を含有する水溶性ポリマーの分子量は、特に限定されないが、通常、1,000〜2,000,000程度であり、好ましくは、5,000〜1,500,000程度である。   The molecular weight of the water-soluble polymer containing the unit [I] is not particularly limited, but is usually about 1,000 to 2,000,000, preferably about 5,000 to 1,500,000.

水溶性ポリマーの使用時の濃度(被固定化物質と混合する前の濃度)は、特に限定されないが、通常、0.005重量%〜10重量%、好ましくは0.04重量%〜1重量%程度である。   The concentration at the time of use of the water-soluble polymer (concentration before mixing with the substance to be immobilized) is not particularly limited, but is usually about 0.005 wt% to 10 wt%, preferably about 0.04 wt% to 1 wt%.

本発明の物質固定化剤は、上記した光架橋剤及び水溶性ポリマーに加え、さらに溶媒を含んでいてもよい。溶媒としては、水、水と任意の割合で混じり合う低級アルコール(好ましくはエタノール)及びこれらの混合物を用いることができ、水が好ましい。   The substance fixing agent of the present invention may further contain a solvent in addition to the above-mentioned photocrosslinking agent and water-soluble polymer. As the solvent, water, lower alcohol (preferably ethanol) mixed with water at an arbitrary ratio and a mixture thereof can be used, and water is preferable.

本発明の物質固定化剤に含まれる光架橋剤及び水溶性ポリマーは、それ自体公知であり、公知の製造方法により製造可能であり、また、市販されているものもある。   The photocrosslinking agent and the water-soluble polymer contained in the substance fixing agent of the present invention are known per se, can be produced by a known production method, and some are commercially available.

本発明の物質固定化剤を用いて固定化される物質は、特に限定されないが、ポリペプチド(糖タンパク質及びリポタンパク質を包含する)、核酸、脂質並びに細胞(動物細胞、植物細胞、微生物細胞等)及びその構成要素(核、ミトコンドリア等の細胞内小器官、細胞膜や単位膜等の膜等を包含する)を例示することができる。本発明の物質固定化剤に光反応性基として用いられるアジド基は、光を照射することにより窒素分子が離脱すると共に窒素ラジカルが生じ、この窒素ラジカルは、アミノ基やカルボキシル基等の官能基のみならず、有機化合物を構成する炭素原子とも結合することが可能であるので、ほとんどの有機物を固定化することが可能である。   Substances immobilized using the substance immobilizing agent of the present invention are not particularly limited, but include polypeptides (including glycoproteins and lipoproteins), nucleic acids, lipids, and cells (animal cells, plant cells, microbial cells, etc.) ) And components thereof (including nuclei, organelles such as mitochondria, and membranes such as cell membranes and unit membranes). The azide group used as a photoreactive group in the substance immobilizing agent of the present invention generates nitrogen radicals when nitrogen molecules are released when irradiated with light, and these nitrogen radicals are functional groups such as amino groups and carboxyl groups. In addition, since it is possible to bond to carbon atoms constituting the organic compound, most organic substances can be immobilized.

基体としては、少なくともその表面が、上記光反応性基と結合し得る物質から成るものであれば特に限定されず、マイクロプレート等で広く用いられているポリスチレンをはじめ、アクリル樹脂、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネートやポリプロピレン等の有機物から成るものを例示することができる。ガラス板にシランカップリング剤をコーティングしたもの等も用いることができる。更には、金表面をアルキルチオールなどで有機処理されたものも好ましく使用可能である。また、基体の形態は何ら限定されるものではなく、マイクロアレイ用基板のような板状のものや、ビーズ状、繊維状のもの等を用いることができる。さらに、板に設けられた穴や溝、例えば、マイクロプレートのウェル等も用いることができる。本発明の物質固定化剤は、これらのうち、特にマイクロアレイ用に適している。また、基体の平均表面粗さが14μmないし17μm、特に15μmである場合に、被固定化物質と反応物質との反応が特に起きやすくなるので好ましい。なお、平均表面粗さは、通常使用されている表面粗さ計により測定することができる。   The substrate is not particularly limited as long as at least the surface thereof is made of a substance capable of binding to the photoreactive group, and includes polystyrene, acrylic resin, polyethylene terephthalate, polycarbonate, which are widely used in microplates and the like. Examples thereof include organic materials such as polypropylene and polypropylene. A glass plate coated with a silane coupling agent can also be used. Furthermore, it is also possible to preferably use a gold surface that has been organically treated with alkylthiol or the like. Further, the form of the substrate is not limited at all, and a plate-like one such as a microarray substrate, a bead-like shape, a fiber-like shape, or the like can be used. Furthermore, holes and grooves provided in the plate, for example, wells of a microplate can be used. Of these, the substance immobilizing agent of the present invention is particularly suitable for microarrays. Further, it is preferable that the average surface roughness of the substrate is 14 μm to 17 μm, particularly 15 μm, since the reaction between the substance to be immobilized and the reactive substance is particularly likely to occur. The average surface roughness can be measured with a commonly used surface roughness meter.

本発明の物質固定化剤を用いて、基体上に所望の物質を固定化することは、次のようにして行うことができる。先ず、基体に固定化すべき物質と、本発明の物質固定化剤とを含む水溶液又は水懸濁液を前記基体に塗布する。この場合、水溶液中の物質固定化剤の各成分の好ましい濃度は上記した通りである。また、固定化すべき物質の濃度(重量基準)は、通常、用いる物質固定化剤の10倍ないし200倍程度であり、好ましくは20倍ないし100倍程度である。   Immobilization of a desired substance on a substrate using the substance fixing agent of the present invention can be performed as follows. First, an aqueous solution or water suspension containing a substance to be immobilized on a substrate and the substance immobilizing agent of the present invention is applied to the substrate. In this case, the preferable concentration of each component of the substance fixing agent in the aqueous solution is as described above. Further, the concentration (weight basis) of the substance to be immobilized is usually about 10 to 200 times, preferably about 20 to 100 times that of the substance immobilizing agent to be used.

次に、塗布した液を好ましくは乾燥した後、光を照射する。光は、用いる光反応性基がラジカルを生じさせることができる光であり、光反応性基としてアジド基を用いる場合には、紫外線が好ましい。照射する光線の線量は、特に限定されないが、通常、1cm2当たり1mW〜100mW程度である。Next, the applied liquid is preferably dried and then irradiated with light. The light is light that allows the photoreactive group to be used to generate radicals, and ultraviolet light is preferred when an azide group is used as the photoreactive group. The dose of the irradiated light is not particularly limited, but is usually about 1 mW to 100 mW per 1 cm 2 .

光を照射することにより、光架橋剤中の光反応性基がラジカルを生じ、光架橋剤が基体及び固定化すべき物質の双方と共有結合する。その結果、固定化すべき物質が光架橋剤を介して基体に固定化される。また、水溶性ポリマーも光架橋剤を介して基板に固定化される。光反応性基として用いられるアジド基は、光を照射することにより窒素分子が離脱すると共に窒素ラジカルが生じ、この窒素ラジカルは、アミノ基やカルボキシル基等の官能基のみならず、有機化合物を構成する炭素原子とも結合することが可能であるので、ほとんどの有機物を固定化することが可能である。なお、本発明の方法では、光反応性基により生じるラジカルを利用して結合反応を行うので、固定化すべき物質の特定の部位と結合するのではなく、ランダムな部位と結合する。従って、活性部位が結合に供されて活性を喪失する分子も当然出てくると考えられるが、活性部位に影響を与えない部位で結合する分子も当然存在するので、本発明の方法によれば、従来、適当な置換基が活性部位又はその近傍にあるために、共有結合で固定化することが困難であった物質であっても、全体として活性を喪失させることなく、共有結合により基体に固定化することができる。   By irradiating with light, the photoreactive group in the photocrosslinking agent generates a radical, and the photocrosslinking agent is covalently bonded to both the substrate and the substance to be immobilized. As a result, the substance to be immobilized is immobilized on the substrate via the photocrosslinking agent. In addition, the water-soluble polymer is also immobilized on the substrate via a photocrosslinking agent. The azide group used as a photoreactive group releases nitrogen molecules and generates nitrogen radicals when irradiated with light. These nitrogen radicals constitute not only functional groups such as amino groups and carboxyl groups, but also organic compounds. Most organic substances can be immobilized. In the method of the present invention, since a binding reaction is performed using radicals generated by a photoreactive group, it binds to a random site rather than to a specific site of the substance to be immobilized. Therefore, it is considered that molecules that lose their activity due to binding of the active site will naturally appear, but naturally there are also molecules that bind at sites that do not affect the active site, so according to the method of the present invention. Conventionally, even if a substance that has been difficult to immobilize by a covalent bond due to the presence of an appropriate substituent at or near the active site, the substance can be covalently bonded to the substrate without losing the activity as a whole. Can be immobilized.

光が照射されなかった部分では、光反応性基が基体及び固定化すべき物質に結合しないので、洗浄すれば光架橋剤も固定化すべき物質も除去される。従って、フォトマスク等を介して選択露光を行うことにより、任意のパターンで固定化すべき物質を固定化することができる。従って、選択露光により、マイクロアレイ等の任意の種々の形状に固定化すべき物質を固定化することができるので、非常に有利である。   In the portion not irradiated with light, the photoreactive group does not bind to the substrate and the substance to be immobilized, so that the photocrosslinking agent and the substance to be immobilized are removed by washing. Therefore, by performing selective exposure through a photomask or the like, a substance to be fixed in an arbitrary pattern can be fixed. Therefore, selective exposure can be very advantageous because substances to be immobilized in any of various shapes such as a microarray can be immobilized.

あるいは、本発明の物質固定化剤と、固定化すべき物質の混合物を基体上にマイクロスポッティングし、基体の全面を光照射してもよい。マイクロスポッティングは、液を基体上に非常に狭い領域に塗布する手法であり、DNAチップ等の作製に常用されており、そのための装置も市販されているので、市販の装置を用いて容易に行うことができる。あるいは、先ず、基体上に本発明の物質固定化剤を全面にコーティングし、その上に固定化すべき物質をマイクロスポッティングし、次いで基体の全面に光照射してもよい。この場合、固定化すべき物質のスポットが、物質固定化剤の層の上に形成され、光架橋剤を介して基体に共有結合で固定化される物質の割合が高くなる。さらに、基体上に本発明の物質固定化剤をマイクロスポッティングし、その上に固定化すべき物質をマイクロスポッティングし、次いで基体の全面に光照射してもよい。この場合にも固定化すべき物質のスポットが、物質固定化剤の層(それぞれ分離したスポット)の上に形成され、光架橋剤を介して基体に共有結合で固定化される物質の割合が高くなる。   Alternatively, a mixture of the substance immobilizing agent of the present invention and the substance to be immobilized may be microspotted on the substrate, and the entire surface of the substrate may be irradiated with light. Micro-spotting is a technique for applying a liquid to a very narrow area on a substrate, and is commonly used for the production of DNA chips and the like. Equipment for that purpose is also commercially available, so it is easily performed using a commercially available apparatus. be able to. Alternatively, first, the substance-immobilizing agent of the present invention may be coated on the entire surface of the substrate, the substance to be immobilized thereon may be microspotted, and then the entire surface of the substrate may be irradiated with light. In this case, the spot of the substance to be immobilized is formed on the substance immobilizing agent layer, and the ratio of the substance that is immobilized by covalent bonding to the substrate via the photocrosslinking agent is increased. Further, the substance fixing agent of the present invention may be microspotted on the substrate, the substance to be immobilized thereon may be microspotted, and then the entire surface of the substrate may be irradiated with light. In this case as well, the spot of the substance to be immobilized is formed on the substance immobilizing agent layer (each separated spot), and the ratio of the substance covalently immobilized on the substrate via the photocrosslinking agent is high. Become.

本発明の方法は、抗体若しくはその抗原結合性断片又は抗原を固定化した免疫測定用プレートの作製、DNAやRNAを基板上に固定化した核酸チップ、マイクロアレイ等の作製に好適に用いることができるがこれらに限定されるものではなく、例えば、細胞全体やその構成要素の固定化等にも適用することができる。   The method of the present invention can be suitably used for the production of an immunoassay plate on which an antibody or antigen-binding fragment thereof or an antigen is immobilized, a nucleic acid chip on which a DNA or RNA is immobilized on a substrate, a microarray, or the like. However, the present invention is not limited to these, and can also be applied to, for example, immobilization of whole cells or components thereof.

一方、上記の通り、本発明の第2の局面の物質固定化剤は、両極性又はノニオン性の水溶性ポリマーであって、1個以上の光反応性基を有し、かつ、金属と共有結合又は配位結合可能な基を有するポリマーから成る。ここで、「両極性」とは、中性付近のpH(pH6〜8)の水溶液中で電離して陽イオンになる基と陰イオンになる基を有していて、その電荷の合計が実質的に0になることを意味する。ここで「実質的に」とは、電荷の合計が0になるか、又は0にはならないとしても本発明の効果に悪影響を与えない程度に小さいことを意味する。また、「ノニオン性」とは、上記したとおり、中性付近のpH(pH6〜8)の水溶液中で電離してイオンになる基を実質的に有さないことを意味する。ここで「実質的に」とは、このような基を全く含まないか、又は含んでいるとしても本発明の効果に悪影響を与えない程度に微量(例えば、このような基の数が炭素数の1%以下)であることを意味する。   On the other hand, as described above, the substance immobilizing agent according to the second aspect of the present invention is a bipolar or nonionic water-soluble polymer having one or more photoreactive groups and sharing with a metal. It consists of a polymer having groups capable of bonding or coordination. Here, “bipolar” means a group that becomes a cation and a group that becomes an anion by ionization in an aqueous solution having a pH near pH (pH 6 to 8), and the sum of the charges is substantially equal. Means zero. Here, “substantially” means that the total charge becomes 0 or is small enough not to adversely affect the effect of the present invention even if it does not become 0. Moreover, "nonionic" means that it has substantially no group which ionizes and becomes ion in the aqueous solution of pH near pH (pH 6-8) as above-mentioned. Here, “substantially” means that such a group is not contained at all, or even if such a group is contained, it is so small that the effect of the present invention is not adversely affected (for example, the number of such groups is the number of carbon 1% or less).

上記水溶性ポリマーの水に対する溶解度(水100gに溶解するグラム数)は、好ましくは5以上である。   The solubility of the water-soluble polymer in water (grams dissolved in 100 g of water) is preferably 5 or more.

上記光反応性基の好ましい例としてアジド基(-N3)を挙げることができるが、これに限定されるものではない。A preferred example of the photoreactive group is an azide group (—N 3 ), but is not limited thereto.

本発明に用いられる水溶性ポリマーの好ましい例として、下記一般式[I](上記一般式[I]と同じ)で表される構造を有する単位と、下記一般式[II]で示される構造を有する単位を含むポリマーを挙げることができる。なお、以下に説明する好ましい水溶性ポリマーは、光反応性基を有するが、金属と共有結合又は配位結合可能な基はまだ導入されていない。金属と共有結合又は配位結合可能な基は、該水溶性ポリマーに後で説明する方法により導入される。   Preferred examples of the water-soluble polymer used in the present invention include a unit having a structure represented by the following general formula [I] (same as the above general formula [I]) and a structure represented by the following general formula [II]. The polymer containing the unit which has can be mentioned. In addition, although the preferable water-soluble polymer demonstrated below has a photoreactive group, the group which can be covalently bonded or coordinate-bonded with the metal has not been introduce | transduced yet. A group capable of being covalently or coordinately bonded to a metal is introduced into the water-soluble polymer by a method described later.

Figure 0004630865
Figure 0004630865

Figure 0004630865
Figure 0004630865

(ただし、一般式[I]及び[II]中、X及びYは、互いに独立して、重合した状態の重合性原子団を表し、Rは光反応性基を有する原子団を表し、一般式[I]及び[II]で表される単位は、[I]は2個以上で[II]は1個以上であり、かつ、一般式[I]で表される単位の数は、一般式[II]で表される単位の数よりも大きい)。
(上記一般式[I]で表される構造を有する単位を、上記の通り本明細書において便宜的に「単位[I]」と言うことがある。また、上記一般式[II]で示される構造を有する単位を、以下、便宜的に「単位[II]」と言うことがある。)
を挙げることができる。
(However, in the general formulas [I] and [II], X and Y independently represent a polymerizable atomic group in a polymerized state, R 1 represents an atomic group having a photoreactive group, The units represented by the formulas [I] and [II] have two or more [I] and one or more [II], and the number of units represented by the general formula [I] Greater than the number of units represented by formula [II]).
(The unit having the structure represented by the general formula [I] may be referred to as “unit [I]” for convenience in the present specification as described above. Hereinafter, the unit having a structure may be referred to as “unit [II]” for convenience.)
Can be mentioned.

上記ホスホリルコリン含有ポリマーは、生体膜が種々の物質と接触するにもかかわらず、非特異吸着がほとんど起きないことに着目し、生体膜の構成成分であるホスホリルコリンを含むポリマーを利用して、所望の物質を基体に固定化することにより非特異吸着を有効に防止できるのではないかという着想に基づいて発明されたものである。   The above-mentioned phosphorylcholine-containing polymer pays attention to the fact that non-specific adsorption hardly occurs even though the biological membrane comes into contact with various substances, and uses the polymer containing phosphorylcholine, which is a constituent of the biological membrane, to obtain a desired It was invented based on the idea that nonspecific adsorption can be effectively prevented by immobilizing a substance on a substrate.

単位[I]は、ホスホリルコリン基を含む単位であり、Xは重合した状態の重合性原子団を表す。Xとしては、ビニル系モノマー残基が好ましい。単位[I]としては、下記一般式[I'](上記一般式[I']と同じ)に示されるものが好ましい。   The unit [I] is a unit containing a phosphorylcholine group, and X represents a polymerizable atomic group in a polymerized state. X is preferably a vinyl monomer residue. As the unit [I], those represented by the following general formula [I ′] (same as the above general formula [I ′]) are preferable.

Figure 0004630865
Figure 0004630865

(ただし、式中、X’は、ビニル部分が付加重合している状態のメタクリルオキシ基、メタクリルアミド基、アクリルオキシ基、アクリルアミド基、スチリルオキシ基又はスチリルアミド基を表し、Rは単結合又は炭素数1〜10のアルキレン基(ただし1個又は2個のヒドロキシル基で置換されていてもよい)を表す)。(Wherein, X ′ represents a methacryloxy group, a methacrylamide group, an acryloxy group, an acrylamide group, a styryloxy group or a styrylamide group in which the vinyl moiety is addition-polymerized, and R 1 is a single bond. Or an alkylene group having 1 to 10 carbon atoms (which may be substituted with one or two hydroxyl groups).

このような単位の好ましい具体例として、2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、2−アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、N−(2−メタクリルアミド)エチルホスホリルコリン、4−メタクリロイルオキシブチルホスホリルコリン、6−メタクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、10-メタクリロイルオキシデシルシルホスホリルコリン、ω−メタクリロイルジオキシエチレンホスホリルコリン又は4−スチリルオキシブチルホスホリルコリンに由来する(すなわち、これらの単位を重合させた)単位を挙げることができる。これらの中でも2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンに由来する単位が特に好ましい。   Preferred examples of such units include 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine, 2-acryloyloxyethyl phosphorylcholine, N- (2-methacrylamide) ethyl phosphorylcholine, 4-methacryloyloxybutylphosphorylcholine, 6-methacryloyloxyhexyl phosphorylcholine, 10 -Methacryloyloxydecylsylphosphorylcholine, ω-methacryloyldioxyethylene phosphorylcholine or 4-styryloxybutylphosphorylcholine (that is, these units are polymerized). Among these, a unit derived from 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine is particularly preferable.

一方、単位[II]中の光反応性基の好ましい例としてアジド基(-N3)を挙げることができるがこれに限定されるものではない。また、一般式[II]のYとしては、ビニル系モノマー残基が好ましい。単位[II]の好ましい例として、下記一般式[VI]で示されるものを挙げることができる。On the other hand, preferred examples of the photoreactive group in the unit [II] include an azide group (—N 3 ), but are not limited thereto. Moreover, as Y in the general formula [II], a vinyl monomer residue is preferable. Preferable examples of the unit [II] include those represented by the following general formula [VI].

Figure 0004630865
Figure 0004630865

(ただし、Y’は、ビニル部分が付加重合している状態のメタクリルオキシ基、メタクリルアミド基、アクリルオキシ基、アクリルアミド基、スチリルオキシ基又はスチリルアミド基を表し、Rは単結合、炭素数1〜10のアルキレン基(ただし1個又は2個のヒドロキシル基で置換されていてもよい)、フェニレン基(ただし、1〜3個の炭素数1〜4のアルキル基又はヒドロキシル基で置換されていてもよい。)(However, Y ′ represents a methacryloxy group, a methacrylamide group, an acryloxy group, an acrylamide group, a styryloxy group, or a styrylamide group in a state where the vinyl moiety is addition-polymerized, and R 2 is a single bond, a carbon number. 1 to 10 alkylene groups (which may be substituted with 1 or 2 hydroxyl groups), phenylene groups (however, substituted with 1 to 3 carbon atoms of 1 to 4 alkyl groups or hydroxyl groups) May be.)

単位[I]の数は単位[II]の数よりも大きく、その比率は、特に限定されないが、100:1〜100:50程度が好ましく、特に100:1〜100:20程度が好ましい。このように、ポリマーは、ホスホリルコリン基を有する単位[I]から主として成ることにより、非特異吸着が効果的に防止される。また、水溶性ポリマーの分子量は、特に限定されないが、通常、1,000〜2,000,000程度であり、好ましくは、5,000〜1,500,000程度である。   The number of units [I] is larger than the number of units [II], and the ratio is not particularly limited, but is preferably about 100: 1 to 100: 50, and more preferably about 100: 1 to 100: 20. Thus, the polymer mainly consists of the unit [I] having a phosphorylcholine group, so that nonspecific adsorption is effectively prevented. The molecular weight of the water-soluble polymer is not particularly limited, but is usually about 1,000 to 2,000,000, preferably about 5,000 to 1,500,000.

上記水溶性ポリマーは、本発明の効果に悪影響を与えない範囲で他の重合性モノマー由来の単位を含んでいてもよい。このような他の単位の割合は、本発明の効果に悪影響を与えない範囲であれば特に限定されないが、通常、ポリマー中の全単位中の70モル%以下、好ましくは50モル%以下である。   The water-soluble polymer may contain units derived from other polymerizable monomers as long as the effects of the present invention are not adversely affected. The proportion of such other units is not particularly limited as long as it does not adversely affect the effects of the present invention, but is usually 70 mol% or less, preferably 50 mol% or less of all units in the polymer. .

上記水溶性ポリマーの好ましい例として、下記一般式[V]で表すものを挙げることができる。   Preferable examples of the water-soluble polymer include those represented by the following general formula [V].

Figure 0004630865
Figure 0004630865

(ただし、式中、X’、Y’、R、Rは上記定義と同じ意味を表し、n及びmは、互いに独立して、nは2以上、mは1以上の整数であり、かつ、nはmよりも大きく、X’を含む単位とY’を含む単位はランダムな順序で結合している。)(Wherein, X ′, Y ′, R 1 and R 2 have the same meaning as defined above, n and m are independently of each other, n is 2 or more, m is an integer of 1 or more, N is larger than m, and the unit containing X ′ and the unit containing Y ′ are bonded in a random order.)

上記一般式[V]で示される化合物の中でも、特に下記式[IV]で示されるポリマーが好ましい。   Among the compounds represented by the general formula [V], a polymer represented by the following formula [IV] is particularly preferable.

Figure 0004630865
Figure 0004630865

(ただし、n'は2以上の整数、m'は1以上の整数を表し、かつn'はm'よりも大きく、ホスホリルコリン含有単位と、アジドフェニル基含有単位はランダムな順序で結合している)。
なお、n'は10〜6000が好ましく、m'は1〜200が好ましい。
(However, n ′ represents an integer of 2 or more, m ′ represents an integer of 1 or more, and n ′ is larger than m ′, and the phosphorylcholine-containing unit and the azidophenyl group-containing unit are bonded in a random order. ).
N ′ is preferably 10 to 6000, and m ′ is preferably 1 to 200.

上記水溶性ポリマーは、上記した単位[I]及び単位[II]を単に重合させることにより製造することができる。あるいは、側鎖(ホスホリルコリン基含有基及び光反応性基含有基)を含まない主鎖のポリマーを先に合成し、後から側鎖を結合してもよい。また、ホルホリルコリン基含有基を有する単位[I]と、光反応性基を有さない単位[II]とを先ず重合し、後から光反応性基含有基を結合させてもよい。下記の実施例ではこの方法を採用している。なお、モノマーの重合や、側鎖の結合は、当業者の技術常識に従って容易に実施することができるし、下記の実施例にもその一例が具体的に記載されている。   The water-soluble polymer can be produced by simply polymerizing the above unit [I] and unit [II]. Alternatively, a main chain polymer that does not contain a side chain (phosphorylcholine group-containing group and photoreactive group-containing group) may be synthesized first, and the side chain may be bonded later. Alternatively, the unit [I] having a formylcholine group-containing group and the unit [II] having no photoreactive group may be polymerized first, and the photoreactive group-containing group may be bonded later. This method is adopted in the following embodiments. The polymerization of monomers and the bonding of side chains can be easily carried out according to the common general knowledge of those skilled in the art, and examples thereof are specifically described in the following examples.

なお、上記したホスホリルコリン含有水溶性ポリマーは、後述の通り、金属と共有結合又は配位結合可能な基を導入するために、遊離のカルボキシル基を有していることが好ましい。このような遊離のカルボキシル基は、メタクリル酸やアクリル酸のようなカルボキシル基含有ビニルモノマーをさらに共重合させるか、又は、光反応性基含有基を側鎖に結合させる際に、反応させる光反応性基含有基のモル数を、遊離のカルボキシル基のモル数よりも少なくして、光反応性基含有基を側鎖に導入した後にも遊離のカルボキシル基が残留するようにすることにより、水溶性ポリマー中に含めることができる。なお、遊離のカルボキシル基のモル数は、水溶性ポリマー分子を構成する全ての単位の合計のモル数を基準として、5%〜50%程度が好ましい。   The phosphorylcholine-containing water-soluble polymer described above preferably has a free carboxyl group in order to introduce a group that can be covalently or coordinately bonded to a metal, as described later. Such a free carboxyl group is a photoreaction that is reacted when a carboxyl group-containing vinyl monomer such as methacrylic acid or acrylic acid is further copolymerized or when a photoreactive group-containing group is bonded to a side chain. The number of moles of the reactive group-containing group is less than the number of moles of the free carboxyl group so that the free carboxyl group remains even after the photoreactive group-containing group is introduced into the side chain. Can be included in the conductive polymer. The number of moles of free carboxyl groups is preferably about 5% to 50% based on the total number of moles of all units constituting the water-soluble polymer molecule.

また、本発明に用いられる水溶性ポリマーとしては、上記した、ホスホリルコリン部分を含有する両極性ポリマーの他に、ノニオン性水溶性ポリマーも好ましく用いることができる。ノニオン性水溶性ポリマーは、上記したホスホリルコリン含有ポリマーと同等の非特異吸着防止効果を有し、それでいてホスホリルコリン含有ポリマーよりも安価に製造又は入手可能であるという利点を有する。   Further, as the water-soluble polymer used in the present invention, in addition to the above-described bipolar polymer containing a phosphorylcholine moiety, a nonionic water-soluble polymer can also be preferably used. The nonionic water-soluble polymer has the same non-specific adsorption preventing effect as the above-described phosphorylcholine-containing polymer, and yet has the advantage that it can be produced or obtained at a lower cost than the phosphorylcholine-containing polymer.

ノニオン性水溶性ポリマーの分子量は、特に限定されないが、通常、350〜500万程度であり、好ましくは、500〜数10万程度である。   The molecular weight of the nonionic water-soluble polymer is not particularly limited, but is usually about 3.5 to 5,000,000, and preferably about 500 to several hundred thousand.

このようなノニオン性水溶性ポリマーの好ましい例として、ポリエチレングリコール(PEG)やポリプロピレングリコールのようなポリアルキレングリコール;ビニルアルコール、メチルビニルエーテル、ビニルピロリドン、ビニルオキサゾリドン、ビニルメチルオキサゾリドン、2-ビニルピリジン、4-ビニルピリジン、N-ビニルサクシンイミド、N-ビニルホルムアミド、N-ビニル-N-メチルホルムアミド、N-ビニルアセトアミド、N-ビニル-N-メチルアセトアミド、2-ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリエチレングリコールメタクリレート、ポリエチレングリコールアクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、N,N-ジメチルアクリルアミド、N-iso-プロピルアクリルアミド、ジアセトンアクリルアミド、メチロールアクリルアミド、アクリロイルモルホリン、アクリロイルピロリジン、アクリロイルピペリジン、スチレン、クロロメチルスチレン、ブロモメチルスチレン、酢酸ビニル、メチルメタクリレート、ブチルアクリレート、メチルシアノアクリレート、エチルシアノアクリレート、n-プロピルシアノアクリレート、iso-プロピルシアノアクリレート、n-ブチルシアノアクリレート、iso-ブチルシアノアクリレート、tert-ブチルシアノアクリレート、グリシジルメタクリレート、エチルビニルエーテル、n-プロピルビニルエーテル、iso-プロピルビニルエーテル、n-ブチルビニルエーテル、iso-ブチルビニルエーテル、tert-ブチルビニルエーテルなどのモノマー単位を単独か混合物を構成成分とするノニオン性のビニル系ポリマー;ゼラチン、カゼイン、コラーゲン、アラビアガム、キサンタンガム、トラガントガム、グアーガム、プルラン、ペクチン、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸、キトサン、キチン誘導体、カラギーナン、澱粉類(カルボキシメチルデンプン、アルデヒドデンプン)、デキストリン、サイクロデキストリン等の天然ポリマー、メチルセルロース、ビスコース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースのような水溶性セルロース誘導体等の天然ポリマーを挙げることができるがこれらに限定されるものではない。これらのうち、特に好ましいものはポリエチレングリコール系ポリマー、ポリ(メタ)アクリルアミド及びポリ(グリシジル(メタ)アクリレート)であり、これらの中で特に好ましくは、ポリエチレングリコール系ポリマーであり、更にはポリエチレングリコール(メタ)アクリレートである。   Preferred examples of such nonionic water-soluble polymers include polyalkylene glycols such as polyethylene glycol (PEG) and polypropylene glycol; vinyl alcohol, methyl vinyl ether, vinyl pyrrolidone, vinyl oxazolidone, vinyl methyl oxazolidone, 2-vinyl pyridine, 4 -Vinylpyridine, N-vinylsuccinimide, N-vinylformamide, N-vinyl-N-methylformamide, N-vinylacetamide, N-vinyl-N-methylacetamide, 2-hydroxyethyl methacrylate, polyethylene glycol methacrylate, polyethylene glycol Acrylate, acrylamide, methacrylamide, N, N-dimethylacrylamide, N-iso-propylacrylamide, diacetoneacrylamide, methylolacrylamide, acryloyl Morpholine, acryloylpyrrolidine, acryloylpiperidine, styrene, chloromethylstyrene, bromomethylstyrene, vinyl acetate, methyl methacrylate, butyl acrylate, methyl cyanoacrylate, ethyl cyanoacrylate, n-propyl cyanoacrylate, iso-propyl cyanoacrylate, n-butyl Monomer units such as cyanoacrylate, iso-butyl cyanoacrylate, tert-butyl cyanoacrylate, glycidyl methacrylate, ethyl vinyl ether, n-propyl vinyl ether, iso-propyl vinyl ether, n-butyl vinyl ether, iso-butyl vinyl ether, tert-butyl vinyl ether Nonionic vinyl-based polymer consisting of a single component or a mixture; gelatin, casein, collagen, gum arabic, xanthan Tangam, tragacanth gum, guar gum, pullulan, pectin, sodium alginate, hyaluronic acid, chitosan, chitin derivative, carrageenan, starch (carboxymethyl starch, aldehyde starch), dextrin, cyclodextrin and other natural polymers, methylcellulose, viscose, hydroxyethylcellulose , Natural polymers such as water-soluble cellulose derivatives such as hydroxyethylmethylcellulose, carboxymethylcellulose, and hydroxypropylcellulose can be exemplified, but the invention is not limited thereto. Of these, polyethylene glycol polymers, poly (meth) acrylamides and poly (glycidyl (meth) acrylates) are particularly preferable. Among these, polyethylene glycol polymers are particularly preferable, and polyethylene glycol ( (Meth) acrylate.

上記したノニオン性水溶性ポリマーは、光反応性基を有する。ノニオン性水溶性ポリマー1分子当りの光反応性基の数は、1個以上であれば、特に限定されるものではないが、2個以上が好ましく、一方、あまりに多すぎると、非特異吸着が増大する恐れがあるので、ポリマーを構成する炭素数(側鎖の炭素を含まない)の10%以下が好ましく、さらに好ましくは5%以下である。光反応性基の好ましい例としてアジド基(-N3)を挙げることができるがこれに限定されるものではない。光反応性基の具体例としてフェニルアジド基、アセチル基、ベンゾイル基が挙げられるが、特に好ましくはフェニルアジド基である。アジド基等の光反応性基は、ノニオン性水溶性ポリマーに直接結合していてもよいが、任意のスペーサー構造を介してノニオン性水溶性ポリマーに結合されていてもよく、通常、後者の方が製造が容易であり好ましい。後者の場合、スペーサー構造は、何ら限定されるものではなく、例えば炭素数1〜10のアルキレン基(ただし1個又は2個のヒドロキシル基で置換されていてもよい)、フェニレン基(ただし、1〜3個の炭素数1〜4のアルキル基又はヒドロキシル基で置換されていてもよい)等を挙げることができる。The nonionic water-soluble polymer described above has a photoreactive group. The number of photoreactive groups per molecule of the nonionic water-soluble polymer is not particularly limited as long as it is 1 or more. However, 2 or more is preferable. Since it may increase, it is preferably 10% or less, more preferably 5% or less, of the number of carbon atoms constituting the polymer (excluding side chain carbon). Preferred examples of the photoreactive group include, but are not limited to, an azide group (—N 3 ). Specific examples of the photoreactive group include a phenyl azide group, an acetyl group, and a benzoyl group, and a phenyl azide group is particularly preferable. A photoreactive group such as an azide group may be directly bonded to the nonionic water-soluble polymer, but may be bonded to the nonionic water-soluble polymer through an arbitrary spacer structure. Is preferable because it is easy to manufacture. In the latter case, the spacer structure is not limited in any way. For example, an alkylene group having 1 to 10 carbon atoms (which may be substituted with one or two hydroxyl groups), a phenylene group (however, 1 And may be substituted with 3 alkyl groups having 1 to 4 carbon atoms or a hydroxyl group).

ノニオン性水溶性ポリマーへの光反応性基の導入は、常法に基づき容易に行うことができる。例えば、官能基を有するノニオン性水溶性ポリマーと、該官能基と反応する官能基を有するアジド化合物を反応させて、ノニオン性水溶性ポリマーにアジド基を結合させることができる。好ましいノニオン性水溶性ポリマーであるポリエチレングリコールを用いる場合、両末端にアミノ基やカルボキシル基を有するポリエチレングリコールが市販されているので、このような市販の官能基含有ポリエチレングリコールの官能基に、アジド基含有化合物を反応させてポリエチレングリコールにアジド基を結合させることができる。あるいは、ノニオン性水溶性ポリマーが水溶性ビニル系ポリマーのように、モノマーの重合により形成されるものである場合には、水溶性ビニル系ポリマーの主な構成単位となるビニル系モノマーと、光反応性ビニル系モノマーとを共重合させることにより光反応性基を有するノニオン性水溶性ポリマーを製造することもできる。この方法により得られる光反応性水溶性ビニル系ポリマーの好ましい例として、ポリ((メタ)アクリルアミド−光反応性(メタ)アクリル酸アミド)共重合体及びポリ(グリシジル(メタ)アクリレート−光反応性(メタ)アクリル酸アミド)共重合体、(ポリエチレングリコールモノ(メタ)アクリレート−光反応性アクリル酸アミド)共重合体等を挙げることができ、特に(ポリエチレングリコールモノ(メタ)アクリレート−光反応性アクリル酸アミド)共重合体が好ましい。   Introduction of the photoreactive group into the nonionic water-soluble polymer can be easily performed based on a conventional method. For example, a nonionic water-soluble polymer having a functional group and an azide compound having a functional group that reacts with the functional group can be reacted to bond the azide group to the nonionic water-soluble polymer. When polyethylene glycol, which is a preferred nonionic water-soluble polymer, is used, since polyethylene glycol having an amino group or a carboxyl group at both ends is commercially available, an azide group is added to the functional group of such a commercially available functional group-containing polyethylene glycol. The containing compound can be reacted to bond the azide group to the polyethylene glycol. Alternatively, in the case where the nonionic water-soluble polymer is formed by polymerization of a monomer, such as a water-soluble vinyl polymer, the vinyl monomer that is the main constituent unit of the water-soluble vinyl polymer and photoreaction It is also possible to produce a nonionic water-soluble polymer having a photoreactive group by copolymerizing a reactive vinyl monomer. Preferred examples of the photoreactive water-soluble vinyl polymer obtained by this method include poly ((meth) acrylamide-photoreactive (meth) acrylic acid amide) copolymer and poly (glycidyl (meth) acrylate-photoreactive property. (Meth) acrylic acid amide) copolymer, (polyethylene glycol mono (meth) acrylate-photoreactive acrylic acid amide) copolymer, and the like, and in particular, (polyethylene glycol mono (meth) acrylate-photoreactive property). Acrylic amide) copolymers are preferred.

なお、上記したノニオン性水溶性ポリマーは、後述の通り、金属と共有結合又は配位結合可能な基を導入するために、遊離のカルボキシル基を有していることが好ましい。このような遊離のカルボキシル基は、例えば、メタクリル酸やアクリル酸のようなカルボキシル基含有ビニルモノマーをさらに共重合させることにより容易に付与することができる。なお、遊離のカルボキシル基のモル数は、水溶性ポリマーを構成する全ての単位の合計のモル数を基準として、5%〜50%程度が好ましい。   The nonionic water-soluble polymer described above preferably has a free carboxyl group in order to introduce a group capable of covalent bonding or coordination bonding with a metal, as will be described later. Such a free carboxyl group can be easily imparted, for example, by further copolymerizing a carboxyl group-containing vinyl monomer such as methacrylic acid or acrylic acid. The number of moles of free carboxyl groups is preferably about 5% to 50% based on the total number of moles of all units constituting the water-soluble polymer.

上記の通り、本発明に用いられる水溶性ポリマーは、金属と共有結合又は配位結合可能な基を有する。ここで、金属としては、QCMやSPRに用いられている金が重要である。金と共有結合可能な基としては、チオール基を挙げることができる。なお、チオール基が金と共有結合すること自体は公知であり、例えば、Japan Nanonet Bulletin 第58号(2004年3月16日)に記載されている。   As described above, the water-soluble polymer used in the present invention has a group capable of covalent bonding or coordination bonding with a metal. Here, as the metal, gold used in QCM and SPR is important. Examples of the group capable of covalently bonding to gold include a thiol group. In addition, it is publicly known that a thiol group is covalently bonded to gold, and is described in, for example, Japan Nanonet Bulletin No. 58 (March 16, 2004).

上記した水溶性ポリマーにチオール基を導入する方法としては、例えば、アミノ基とチオール基の両方を1分子中に有する2-メルカプトエチルアミン等の化合物のチオール基を保護し、そのアミノ基と、水溶性ポリマー中の上記した遊離のカルボキシル基とをカルボジイミド等の架橋剤で結合し、次いで、チオール基を脱保護する方法を挙げることができる。チオール基の保護は、例えば、1分子中にアミノ基とチオール基を有する2-メルカプトエチルアミンのような化合物をジスルフィドダイマーに変換することにより行なうことができる。一方、脱保護は、ジスルフィドダイマーを、例えばジチオスレイトールのようなジスルフィド結合を切断する還元剤を作用させてジスルフィド結合を切断して遊離のチオール基を生じさせることにより行うことができる。このような方法によりチオール基を導入する方法が、下記実施例に具体的に記載されている。なお、チオール基の導入方法は、上記の方法に限定されるものではない。チオール基のモル数は、水溶性ポリマー1分子中に0.1〜100モル、特に1〜50モル程度が好ましい。   As a method for introducing a thiol group into the above-mentioned water-soluble polymer, for example, a thiol group of a compound such as 2-mercaptoethylamine having both an amino group and a thiol group in one molecule is protected, Examples include a method in which the above-mentioned free carboxyl group in the conductive polymer is bonded with a crosslinking agent such as carbodiimide, and then the thiol group is deprotected. The protection of the thiol group can be performed, for example, by converting a compound such as 2-mercaptoethylamine having an amino group and a thiol group in one molecule into a disulfide dimer. On the other hand, the deprotection can be performed by causing the disulfide dimer to act on a disulfide bond-reducing agent such as dithiothreitol to cleave the disulfide bond to generate a free thiol group. The method of introducing a thiol group by such a method is specifically described in the following examples. The method for introducing a thiol group is not limited to the above method. The number of moles of the thiol group is preferably 0.1 to 100 moles, and particularly preferably about 1 to 50 moles in one molecule of the water-soluble polymer.

水溶性ポリマー中のチオール基は、水溶性ポリマーの溶液を金に常温で接触させるだけで金と結合する。   The thiol group in the water-soluble polymer is bonded to gold simply by bringing the solution of the water-soluble polymer into contact with gold at room temperature.

一方、金と配位結合可能な基としては、カルボキシル基及びアミノ基を挙げることができる。カルボキシル基は、上記した、水溶性ポリマー中に含まれる遊離のカルボキシル基をそのまま利用することができる。また、アミノ基は、該遊離のカルボキシル基に、カルボジイミドのような架橋剤を用いてジアミン化合物を結合させることにより容易に導入することができる。   On the other hand, examples of the group capable of coordinate bond with gold include a carboxyl group and an amino group. As the carboxyl group, the above-described free carboxyl group contained in the water-soluble polymer can be used as it is. The amino group can be easily introduced by bonding a diamine compound to the free carboxyl group using a crosslinking agent such as carbodiimide.

なお、上記方法では、光反応基を有する水溶性ポリマーに、金属と共有結合又は配位結合可能な基を導入する態様を記載したが、金属と共有結合又は配位結合可能な基を先にポリマーに結合し、後から光反応性基を導入してもよい。これは、上記した遊離のカルボキシル基を利用して先にチオール基等を導入し、次に、余っている遊離のカルボキシル基を利用して上記のように光反応性基を導入することにより行うことができる。また、光反応性基と、金属と共有結合又は配位結合可能な基を同時にポリマーに導入することも可能である。   In the above method, the mode in which a group capable of covalent bond or coordinate bond with a metal is introduced into a water-soluble polymer having a photoreactive group, but the group capable of covalent bond or coordinate bond with a metal is first described. The photoreactive group may be introduced later by bonding to the polymer. This is performed by first introducing a thiol group or the like using the above-described free carboxyl group, and then introducing a photoreactive group as described above using the remaining free carboxyl group. be able to. It is also possible to simultaneously introduce a photoreactive group and a group capable of covalent bonding or coordination bonding with a metal into the polymer.

上記の通り、本発明は、両極性又はノニオン性の水溶性ポリマーであって、1分子中に少なくとも2個の光反応性基を有する水溶性ポリマーと、金属と共有結合又は配位結合可能な基を有する低分子化合物とを含む、金属に物質を固定化するための物質固定化剤をも提供する。ここで、1分子中に少なくとも2個の光反応性基を有する水溶性ポリマーは、上記した通りである(ただし、光反応性基は1分子中に少なくとも2個導入する必要があり、また、金属と共有結合又は配位結合可能な基を導入する必要がないので、上記した、遊離のカルボキシル基は含まない)。一方、金属と共有結合又は配位結合可能な基を有する低分子化合物は、好ましくは上記したチオール基又はカルボキシル基若しくはアミノ基を有する低分子化合物であり、これらの基を有するものであれば特に限定されない。好ましい例として、オクタデカンチオールのようなアルキルチオール、メルカプトエタノールのようなメルカプトアルキルアルコール、アルキルアミン及びアルキルカルボン酸等を挙げることができる(これらの化合物中のアルキル基の炭素数は好ましくは2〜20)。また、「低分子化合物」とは、分子量が1000以下の化合物を意味し、好ましくは、分子量は、50〜500程度である。   As described above, the present invention is a bipolar or nonionic water-soluble polymer having at least two photoreactive groups in one molecule and capable of being covalently or coordinately bonded to a metal. There is also provided a substance immobilizing agent for immobilizing a substance on a metal, comprising a low molecular compound having a group. Here, the water-soluble polymer having at least two photoreactive groups in one molecule is as described above (provided that at least two photoreactive groups need to be introduced in one molecule, Since it is not necessary to introduce a group capable of being covalently or coordinately bonded to the metal, the above-mentioned free carboxyl group is not included). On the other hand, the low molecular compound having a group capable of covalent bond or coordinate bond with a metal is preferably the above-described low molecular compound having a thiol group, a carboxyl group or an amino group, and particularly if it has these groups. It is not limited. Preferred examples include alkylthiols such as octadecanethiol, mercaptoalkyl alcohols such as mercaptoethanol, alkylamines and alkylcarboxylic acids (the carbon number of the alkyl group in these compounds is preferably 2 to 20). ). The “low molecular weight compound” means a compound having a molecular weight of 1000 or less, and preferably has a molecular weight of about 50 to 500.

上記水溶性ポリマーと、上記低分子化合物との混合比率は、特に限定されないが、好ましくは、水溶性ポリマー100に対して低分子化合物がモル比で1〜50、さらに好ましくは5〜50程度である。   The mixing ratio of the water-soluble polymer and the low-molecular compound is not particularly limited, but the low-molecular compound is preferably in a molar ratio of 1 to 50, more preferably about 5 to 50 with respect to the water-soluble polymer 100. is there.

上記の通り、本発明はまた、両極性又はノニオン性の水溶性ポリマーと、1分子中に少なくとも2個の光反応性基を有する光架橋剤と、金属と共有結合又は配位結合可能な基を有する低分子化合物とを含む、金属に物質を固定化するための物質固定化剤をも提供する。ここで、「両極性又はノニオン性の水溶性ポリマー」は、上記した水溶性ポリマーと同様である(ただし、光反応性基は1分子中に少なくとも2個導入する必要があり、また、金属と共有結合又は配位結合可能な基を導入する必要がないので、上記した、遊離のカルボキシル基は含まない。また、光反応性基が不要であるので、上記水溶性ポリマーから-N3基を除去したもの又は単位[II]を含まないものでよい)。また、「金属と共有結合又は配位結合可能な基を有する低分子化合物」は、上記の通りである。As described above, the present invention also provides a bipolar or nonionic water-soluble polymer, a photocrosslinking agent having at least two photoreactive groups in one molecule, and a group capable of covalent bonding or coordination bonding with a metal. There is also provided a substance immobilizing agent for immobilizing a substance on a metal, comprising a low molecular compound having Here, the “ambipolar or nonionic water-soluble polymer” is the same as the above-described water-soluble polymer (however, at least two photoreactive groups need to be introduced in one molecule, Since it is not necessary to introduce a group capable of covalent bonding or coordination bonding, the above-mentioned free carboxyl group is not included, and since a photoreactive group is unnecessary, the —N 3 group is removed from the water-soluble polymer. Removed or not including unit [II]). The “low molecular compound having a group capable of covalent bonding or coordination bonding with a metal” is as described above.

光架橋剤が有する光反応性基の好ましい例として、アジド基(-N3)を挙げることができるがこれに限定されるものではない。光架橋剤としては、アジド基を2個有するジアジド化合物が好ましく、特に水溶性ジアジド化合物が好ましい。本発明に用いられる光架橋剤の好ましい例として、下記一般式[III](上記一般式[III]と同じ)で表される、本発明の第1の局面の物質固定化剤において光架橋剤として好ましく用いられるジアジド化合物を挙げることができる。Preferable examples of the photoreactive group possessed by the photocrosslinking agent include an azide group (—N 3 ), but are not limited thereto. As the photocrosslinking agent, a diazide compound having two azide groups is preferable, and a water-soluble diazide compound is particularly preferable. As a preferable example of the photocrosslinking agent used in the present invention, the photocrosslinking agent in the substance fixing agent according to the first aspect of the present invention represented by the following general formula [III] (same as the above general formula [III]) Examples of the diazide compound that can be preferably used.

Figure 0004630865
Figure 0004630865

一般式[III]中、Rは単結合又は任意の基を示す。-R-は、2個のフェニルアジド基を連結するだけの構造であるから、特に限定されない。好ましい-R-の例として、単結合(すなわち、2個のフェニルアジド基が直接連結される)、炭素数1〜6のアルキレン基(1個又は2個の炭素間不飽和結合を含んでいてもよく、1個又は2個の炭素原子が酸素と二重結合してカルボニル基を構成していてもよい)(特に好ましくはメチレン基)、-O-、-SO2-、-S-S-、-S-、-R2 ・・・Y・・・R3-(ただし、・・・は単結合又は二重結合を示し、Yは炭素数3〜8のシクロアルキレン基、R2及びR3は互いに独立に炭素数1〜6のアルキレン基(1個又は2個の炭素間不飽和結合を含んでいてもよく、該アルキレン基の基端の炭素原子とYとの結合が二重結合であってもよく)、1個又は2個の炭素原子が酸素と二重結合してカルボニル基を構成していてもよい)を示し、シクロアルキレン基は、1個又は2個以上の任意の置換基で置換されていてもよく(置換されている場合、好ましくはシクロアルキレン基を構成する炭素原子のうち、1個若しくは2個が酸素と二重結合してカルボニル基を構成し、及び/若しくは1個若しくは2個の炭素数1〜6のアルキル基で置換されている)を挙げることができ、また、一般式[III]中のそれぞれのベンゼン環は、1個又は2個以上の任意の置換基(好ましくはハロゲン、炭素数1〜4のアルコキシル基、スルホン酸若しくはその塩等の親水性基)で置換されていてもよい。好ましい-R-の具体例として次のものを例示することができる。−、-CH2-、-O-、-SO2-、-S-S-、-S-、-CH=CH-、-CH=CH-CO-、-CH=CH-CO-CH=CH-、-CH=CH-、In general formula [III], R represents a single bond or an arbitrary group. -R- is not particularly limited because it is a structure that only links two phenyl azide groups. Examples of preferred —R— include a single bond (that is, two phenyl azide groups are directly linked), an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms (including one or two carbon-carbon unsaturated bonds). 1 or 2 carbon atoms may be bonded to oxygen to form a carbonyl group) (particularly preferably a methylene group), —O—, —SO 2 —, —SS—, -S-, -R 2 ... Y ... R 3- (where ... represents a single bond or a double bond, Y represents a cycloalkylene group having 3 to 8 carbon atoms, R 2 and R 3 Are each independently an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms (which may contain one or two carbon-carbon unsaturated bonds, and the bond between the carbon atom at the end of the alkylene group and Y is a double bond). 1 or 2 carbon atoms may be double-bonded with oxygen to form a carbonyl group), and the cycloalkylene group is 1 May be substituted with two or more arbitrary substituents (when substituted, preferably one or two of the carbon atoms constituting the cycloalkylene group are double-bonded to oxygen to form carbonyl And / or substituted with one or two alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms, and each benzene ring in the general formula [III] is 1 It may be substituted with one or more arbitrary substituents (preferably a hydrophilic group such as halogen, an alkoxyl group having 1 to 4 carbon atoms, a sulfonic acid or a salt thereof). Specific examples of preferred —R— include the following. -, -CH 2- , -O-, -SO 2- , -SS-, -S-, -CH = CH-, -CH = CH-CO-, -CH = CH-CO-CH = CH-, -CH = CH-,

Figure 0004630865
Figure 0004630865

好ましいジアジド化合物の具体例としては、本発明の第1の局面の物質固定化剤において光架橋剤として好ましく用いられる、上記したジアジド化合物の好ましい具体例を例示することができる。   Specific examples of preferred diazide compounds include preferred specific examples of the above-mentioned diazide compounds that are preferably used as a photocrosslinking agent in the substance fixing agent according to the first aspect of the present invention.

本発明に用いられる光架橋剤の内、特に好ましいのは水溶性のものである。光架橋剤についての「水溶性」とは、0.5mM以上、好ましくは2mM以上の濃度の水溶液を与えることができることを意味する。   Among the photocrosslinking agents used in the present invention, particularly preferred are water-soluble ones. “Water-soluble” for the photocrosslinking agent means that an aqueous solution having a concentration of 0.5 mM or more, preferably 2 mM or more can be provided.

上記水溶性ポリマー、低分子化合物及び架橋剤の混合比率は、特に限定されないが、好ましくは、水溶性ポリマー100に対して低分子化合物がモル比で1〜50、さらに好ましくは5〜50程度であり、架橋剤がモル比で1〜50、さらに好ましくは1〜30程度である。   The mixing ratio of the water-soluble polymer, the low-molecular compound and the crosslinking agent is not particularly limited. And the cross-linking agent is 1 to 50, more preferably about 1 to 30, in molar ratio.

上記本発明の物質固定化剤を用いて物質を固定化する基体としては、表面が金属であり、QCM測定やSPR測定において用いられている表面が金製の基板を好ましい例として挙げることができる。   As a substrate for immobilizing a substance using the substance immobilizing agent of the present invention, a substrate whose surface is a metal and whose surface used in QCM measurement or SPR measurement is gold can be cited as a preferred example. .

本発明の物質固定化剤を用いて、基体上に所望の物質を固定化することは、次のようにして行うことができる。先ず、基体に固定化すべき物質と、本発明の物質固定化剤とを含む水溶液又は水懸濁液を前記基体に塗布する。この場合、水溶液中の水溶性ポリマーの濃度(重量基準)は、特に限定されないが、通常、0.005%〜10%程度であり、好ましくは0.04〜1%程度である。また、固定化すべき物質の濃度(重量基準)は、通常、用いる水溶性ポリマーの10倍ないし200倍程度であり、好ましくは20倍ないし100倍程度である。塗布後、室温で15分間〜1時間程度放置すると、金属と共有結合又は配位結合可能な基が基体と結合し、それによって水溶性ポリマー(該ポリマーが金属と共有結合又は配位結合可能な基を有する場合)又は上記低分子化合物が基体に結合される。なお、物質固定化剤が上記低分子化合物を含む場合、該低分子化合物を先ず基体に作用させて基体に結合させ、次いで固定化すべき物質と水溶性ポリマーとを含む水溶液若しくは水懸濁液、又は固定化すべき物質と水溶性ポリマーと架橋剤とを含む水溶液若しくは水懸濁液を前記基体に塗布してもよい。   Immobilization of a desired substance on a substrate using the substance fixing agent of the present invention can be performed as follows. First, an aqueous solution or water suspension containing a substance to be immobilized on a substrate and the substance immobilizing agent of the present invention is applied to the substrate. In this case, the concentration (weight basis) of the water-soluble polymer in the aqueous solution is not particularly limited, but is usually about 0.005% to 10%, preferably about 0.04 to 1%. The concentration (weight basis) of the substance to be immobilized is usually about 10 to 200 times, preferably about 20 to 100 times that of the water-soluble polymer to be used. When the coating is allowed to stand for 15 minutes to 1 hour at room temperature, a group capable of covalent bonding or coordination bonding with a metal binds to a substrate, whereby a water-soluble polymer (the polymer is capable of covalent bonding or coordination bonding with a metal). Or a low molecular weight compound bound to a substrate. When the substance immobilizing agent contains the low molecular weight compound, the low molecular weight compound is first allowed to act on the substrate to bind to the substrate, and then the aqueous solution or water suspension containing the substance to be immobilized and the water-soluble polymer, Alternatively, an aqueous solution or a water suspension containing a substance to be immobilized, a water-soluble polymer, and a crosslinking agent may be applied to the substrate.

次に、塗布した液を好ましくは乾燥した後、光を照射する。光は、用いる光反応性基がラジカルを生じさせることができる光であり、光反応性基としてアジド基を用いる場合には、紫外線が好ましい。照射する光線の線量は、特に限定されないが、通常、1cm2当たり1mW〜100mW程度である。Next, the applied liquid is preferably dried and then irradiated with light. The light is light that allows the photoreactive group to be used to generate radicals, and ultraviolet light is preferred when an azide group is used as the photoreactive group. The dose of the irradiated light is not particularly limited, but is usually about 1 mW to 100 mW per 1 cm 2 .

光を照射することにより、光反応性基がラジカルを生じる。水溶性ポリマーが、金属と共有結合又は配位結合可能な基及び光反応性基の両者を有する場合には、基体に結合された水溶性ポリマーの光反応性基に、固定化すべき物質が共有結合され、これにより固定化すべき物質が、水溶性ポリマーを介して基体に結合される。また、水溶性ポリマーが1分子中に少なくとも2個の光反応性基を有し、金属と共有結合又は配位結合可能な基を有する低分子化合物が併用される場合には、基体に結合した低分子化合物に水溶性ポリマーが共有結合し、かつ、固定すべき物質が水溶性ポリマーに共有結合される。また、水溶性ポリマーが光反応性基を含まず、金属と共有結合又は配位結合可能な基を有する低分子化合物及び光架橋剤が併用される場合には、基体に結合した低分子化合物に光架橋剤を介して水溶性ポリマーが共有結合し、かつ、固定すべき物質が水溶性ポリマーに共有結合される。従って、いずれの場合も固定化すべき物質が基体に固定化される。   By irradiating light, the photoreactive group generates a radical. When the water-soluble polymer has both a group capable of covalent bonding or coordination with metal and a photoreactive group, the substance to be immobilized is shared by the photoreactive group of the water-soluble polymer bound to the substrate. The substance to be bound and thereby to be immobilized is bound to the substrate via the water-soluble polymer. In addition, when the water-soluble polymer has at least two photoreactive groups in one molecule and a low molecular compound having a group capable of covalent bond or coordinate bond with a metal is used in combination, it is bonded to the substrate. The water-soluble polymer is covalently bonded to the low molecular weight compound, and the substance to be immobilized is covalently bonded to the water-soluble polymer. In addition, when the water-soluble polymer does not contain a photoreactive group and a low molecular compound having a group capable of covalent bonding or coordination bonding with a metal and a photocrosslinking agent are used in combination, the low molecular compound bonded to the substrate The water-soluble polymer is covalently bonded via the photocrosslinking agent, and the substance to be immobilized is covalently bonded to the water-soluble polymer. Therefore, in any case, the substance to be immobilized is immobilized on the substrate.

なお、光反応性基として用いられるアジド基は、光を照射することにより窒素分子が離脱すると共に窒素ラジカルが生じ、この窒素ラジカルは、アミノ基やカルボキシル基等の官能基のみならず、有機化合物を構成する炭素原子とも結合することが可能であるので、ほとんどの有機物を固定化することが可能である。なお、本発明の方法では、光反応性基により生じるラジカルを利用して結合反応を行うので、固定化すべき物質の特定の部位と結合するのではなく、ランダムな部位と結合する。従って、活性部位が結合に供されて活性を喪失する分子も当然出てくると考えられるが、活性部位に影響を与えない部位で結合する分子も当然存在するので、本発明の方法によれば、従来、適当な置換基が活性部位又はその近傍にあるために、共有結合で固定化することが困難であった物質であっても、全体として活性を喪失させることなく、共有結合により基体に固定化することができる。 In addition, the azide group used as a photoreactive group releases a nitrogen molecule and generates a nitrogen radical when irradiated with light. This nitrogen radical is not only a functional group such as an amino group and a carboxyl group, but also an organic compound. Can be bonded to the carbon atoms constituting the carbon atom, so that most organic substances can be immobilized. In the method of the present invention, since a binding reaction is performed using radicals generated by a photoreactive group, it binds to a random site rather than to a specific site of the substance to be immobilized. Therefore, it is considered that molecules that lose their activity due to binding of the active site will naturally appear, but naturally there are also molecules that bind at sites that do not affect the active site, so according to the method of the present invention. Conventionally, even if a substance that has been difficult to immobilize by a covalent bond due to the presence of an appropriate substituent at or near the active site, the substance can be covalently bonded to the substrate without losing the activity as a whole. Can be immobilized.

光が照射されなかった部分では、光反応性基が固定化すべき物質に結合しないので、洗浄すれば固定化すべき物質は除去される。従って、フォトマスク等を介して選択露光を行うことにより、任意のパターンで物質を固定化することができる。従って、選択露光により、マイクロアレイ等の任意の種々の形状に物質を固定化することができるので、非常に有利である。   In the portion not irradiated with light, the photoreactive group does not bind to the substance to be immobilized. Therefore, the substance to be immobilized is removed by washing. Therefore, by performing selective exposure through a photomask or the like, the substance can be fixed in an arbitrary pattern. Therefore, selective exposure can be very advantageous because the substance can be immobilized in any of various shapes such as a microarray.

あるいは、本発明の物質固定化剤と、固定化すべき物質の混合物を基体上にマイクロスポッティングし、基体の全面を光照射してもよい。マイクロスポッティングは、液を基体上に非常に狭い領域に塗布する手法であり、DNAチップ等の作製に常用されており、そのための装置も市販されているので、市販の装置を用いて容易に行うことができる。あるいは、先ず、基体上に本発明の物質固定化剤を全面にコーティングし、その上に固定化すべき物質をマイクロスポッティングし、次いで基体の全面に光照射してもよい。この場合、固定化すべき物質のスポットが、物質固定化剤の層の上に形成され、物質固定化剤を介して基体に共有結合で固定化される物質の割合が高くなる。さらに、基体上に本発明の物質固定化剤をマイクロスポッティングし、その上に固定化すべき物質をマイクロスポッティングし、次いで基体の全面に光照射してもよい。この場合にも固定化すべき物質のスポットが、物質固定化剤の層(それぞれ分離したスポット)の上に形成され、物質固定化剤を介して基体に固定化される物質の割合が高くなる。   Alternatively, a mixture of the substance immobilizing agent of the present invention and the substance to be immobilized may be microspotted on the substrate, and the entire surface of the substrate may be irradiated with light. Micro-spotting is a technique for applying a liquid to a very narrow area on a substrate, and is commonly used for the production of DNA chips and the like. Equipment for that purpose is also commercially available, so it is easily performed using a commercially available apparatus. be able to. Alternatively, first, the substance-immobilizing agent of the present invention may be coated on the entire surface of the substrate, the substance to be immobilized thereon may be microspotted, and then the entire surface of the substrate may be irradiated with light. In this case, the spot of the substance to be immobilized is formed on the substance immobilizing agent layer, and the ratio of the substance immobilized on the substrate by the covalent bond via the substance immobilizing agent is increased. Further, the substance fixing agent of the present invention may be microspotted on the substrate, the substance to be immobilized thereon may be microspotted, and then the entire surface of the substrate may be irradiated with light. Also in this case, a spot of the substance to be immobilized is formed on the substance immobilizing agent layer (each separated spot), and the ratio of the substance immobilized on the substrate via the substance immobilizing agent is increased.

本発明の方法は、抗体若しくはその抗原結合性断片又は抗原を固定化した免疫測定用プレートの作製、DNAやRNAをQCMやSPRの基板上に固定化した核酸チップ、マイクロアレイ等の作製に好適に用いることができるがこれらに限定されるものではなく、例えば、細胞全体やその構成要素の固定化等にも適用することができる。   The method of the present invention is suitable for preparing an immunoassay plate on which an antibody or an antigen-binding fragment thereof or an antigen is immobilized, a nucleic acid chip in which DNA or RNA is immobilized on a QCM or SPR substrate, a microarray, or the like. Although it can be used, it is not limited to these, For example, it can apply also to fixation of the whole cell, its component, etc.

以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。   Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on examples. However, the present invention is not limited to the following examples.

1. 水溶性ポリマーの調製
(1) メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(MPC)(一般式[I']中、R1が-C2H4-でX'が-CH2-C(CH3)(COO-)-)-メタクリル酸共重合体及びMPC-ブチルメタクリレート共重合体の製造
MPCは市販品を用いた。MPCとメタクリル酸又はブチルメタクリレートとを通常の方法によりランダム共重合した。以上によりMPC-メタクリル酸共重合体(MPC:メタクリル酸(モル比)=9:1)及びMPC-ブチルメタクリレート共重合体(MPC:ブチルメタクリレート(モル比)=3:7)を得た。
1. Preparation of water-soluble polymer
(1) Methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) (in general formula [I '], R 1 is -C 2 H 4 -and X' is -CH 2 -C (CH 3 ) (COO-)-)-methacrylic acid Production of copolymer and MPC-butyl methacrylate copolymer
MPC used the commercial item. MPC and methacrylic acid or butyl methacrylate were randomly copolymerized by a conventional method. Thus, MPC-methacrylic acid copolymer (MPC: methacrylic acid (molar ratio) = 9: 1) and MPC-butyl methacrylate copolymer (MPC: butyl methacrylate (molar ratio) = 3: 7) were obtained.

(2) 水溶性ポリマー水溶液の調製
上記の通り製造したMPC-メタクリル酸共重合体若しくはMPC-ブチルメタクリレート共重合体又は市販のポリエチレングリコール(平均分子量1000)を水溶性ポリマーとして用いた。各水溶性ポリマーを水に溶解し、0.5重量%の濃度に調整した。
(2) Preparation of water-soluble polymer aqueous solution MPC-methacrylic acid copolymer or MPC-butyl methacrylate copolymer produced as described above or commercially available polyethylene glycol (average molecular weight 1000) was used as the water-soluble polymer. Each water-soluble polymer was dissolved in water and adjusted to a concentration of 0.5% by weight.

2. A抗原陽性パネル血球の固定化
4,4'-ジアジドスチルベン-2,2'-ジスルホン酸ナトリウム(市販品)を光架橋剤として用いた。光架橋剤の濃度が0.25mMになるように、1(2)で調製した水溶性ポリマーと光架橋剤を混合した。得られた混合物(1mL)とA抗原陽性パネル血球(1mL)を混合した。得られた血球浮遊液をポリスチレンディッシュに0.5μLずつスポットした。乾燥後、UV照射(波長260nm、照射量40mW/cm2、10秒間)によりパネル血球を固定化した(水溶性ポリマーも固定化される)。
2. Immobilization of A antigen positive panel blood cells
Sodium 4,4′-diazidostilbene-2,2′-disulfonate (commercially available) was used as a photocrosslinking agent. The water-soluble polymer prepared in 1 (2) and the photocrosslinking agent were mixed so that the concentration of the photocrosslinking agent was 0.25 mM. The obtained mixture (1 mL) and A antigen positive panel blood cells (1 mL) were mixed. The obtained blood cell suspension was spotted on a polystyrene dish at 0.5 μL each. After drying, panel blood cells were immobilized by UV irradiation (wavelength 260 nm, irradiation amount 40 mW / cm 2 , 10 seconds) (water-soluble polymer is also immobilized).

3. A抗原の免疫測定
PBS(0.1% Tween20(登録商標))で洗浄後、モノクローナルA抗体(市販品)と室温で2時間反応させた。PBS(0.1% Tween20(登録商標))で洗浄後、セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識二次抗体(市販品)と室温で1時間反応させた。PBS(0.1% Tween20(登録商標))で洗浄後、化学発光試薬を添加し、発光強度を測定した。
3. Immunoassay for A antigen
After washing with PBS (0.1% Tween20 (registered trademark)), it was reacted with monoclonal A antibody (commercially available) at room temperature for 2 hours. After washing with PBS (0.1% Tween20 (registered trademark)), it was reacted with a horseradish peroxidase (HRP) labeled secondary antibody (commercially available) at room temperature for 1 hour. After washing with PBS (0.1% Tween20 (registered trademark)), a chemiluminescent reagent was added, and the luminescence intensity was measured.

4. 結果
測定した発光強度を下記表1に示す。
4). Results The measured emission intensity is shown in Table 1 below.

Figure 0004630865
Figure 0004630865

表1に示すように、いずれの水溶性ポリマーを用いた場合にも、有意な発光強度が得られ、免疫測定が可能であることがわかる。また、水溶性ポリマーとして、MPC-ブチルメタクリレートを用いた場合の方がMPC-メタクリル酸を用いた場合よりも発光強度が大きくなっているのは、MPC-ブチルメタクリレートが親水性基と疎水性基(ブチル基)を有し、光架橋剤とミセルを作りにくく、より効率的な反応が可能であったためと考えられる。   As shown in Table 1, when any water-soluble polymer is used, significant luminescence intensity is obtained and it can be seen that immunoassay is possible. In addition, when MPC-butyl methacrylate is used as the water-soluble polymer, the emission intensity is larger than when MPC-methacrylic acid is used. MPC-butyl methacrylate has a hydrophilic group and a hydrophobic group. This is considered to be due to having a (butyl group), making it difficult to form a photocrosslinker and micelles, and enabling a more efficient reaction.

スギアレルゲンの免疫測定
水溶性ポリマーとして、平均分子量1000のポリエチレングリコール(PEG1000)(市販品)、平均分子量10000のポリエチレングリコール(PEG10000)(市販品)又は実施例1で製造したMPC-ブチルメタクリレート共重合体を用いた。各水溶性ポリマーを、0.125重量%の濃度になるように水に溶解した。得られた各水溶性ポリマー水溶液を、光架橋剤(4,4'-ジアジドスチルベン-2,2'-ジスルホン酸ナトリウム)と混合した(光架橋剤の終濃度は0.125mM)。得られた各水溶性ポリマー水溶液を、スギアレルゲン(市販品)水溶液(0.25重量%)と1:1で混合した。得られた混合液をポリスチレンディッシュに0.5μLずつスポットした。乾燥後、UV照射(波長260nm、照射量40mW/cm2、10秒間)によりスギアレルゲンを固定化した(水溶性ポリマーも固定化される)。PBS(0.1% Tween20(登録商標))で洗浄後、スギアレルゲン抗体(市販品)と室温で3時間反応させた。PBS(0.1% Tween20(登録商標))で洗浄後、HRP標識二次抗体(市販品)と室温で1時間反応させた。PBS(0.1% Tween20(登録商標))で洗浄後、化学発光試薬を添加し、発光強度を測定した。また、比較のため、スギアレルゲン抗体に代えてダニアレルゲン抗体(市販品)を用いて上記と同じ操作を行なった。
Suierergen immunoassay As water-soluble polymer, polyethylene glycol (PEG1000) with an average molecular weight of 1000 (commercial product), polyethylene glycol with an average molecular weight of 10000 (PEG10000) (commercial product), or MPC-butyl methacrylate co-polymer prepared in Example 1 Coalescence was used. Each water-soluble polymer was dissolved in water to a concentration of 0.125% by weight. Each obtained water-soluble polymer aqueous solution was mixed with a photocrosslinking agent (sodium 4,4′-diazidostilbene-2,2′-disulfonate) (the final concentration of the photocrosslinking agent was 0.125 mM). Each obtained aqueous solution of water-soluble polymer was mixed 1: 1 with a water allergen (commercially available) aqueous solution (0.25 wt%). The resulting mixture was spotted on a polystyrene dish by 0.5μL. After drying, squeer allergen was immobilized by UV irradiation (wavelength 260 nm, irradiation amount 40 mW / cm 2 , 10 seconds) (water-soluble polymer is also immobilized). After washing with PBS (0.1% Tween20 (registered trademark)), the mixture was reacted with a Sumiergen antibody (commercially available) at room temperature for 3 hours. After washing with PBS (0.1% Tween20 (registered trademark)), the mixture was reacted with an HRP-labeled secondary antibody (commercially available) at room temperature for 1 hour. After washing with PBS (0.1% Tween20 (registered trademark)), a chemiluminescent reagent was added, and the luminescence intensity was measured. For comparison, the same operation as described above was performed using a mite allergen antibody (commercially available product) instead of the swirl allergen antibody.

さらに、比較のため、本願発明者らが、先に発明し、国際特許出願(PCT/JP2004/004510)している、光反応性ポリエチレングリコール又は光反応性MPCポリマーを物質固定化剤として用い、上記と同様の操作を行なった。光反応性ポリエチレングリコールは、100mgのポリ(エチレングリコール)ビス (3-アミノプロピル)末端(Aldrich社より市販、平均分子量1500)と68.6mgのN-(4-アジドベンジロキシ)スクシンイミドをジメチルホルムアミド10mlに溶解し、pH6で4℃で24時間攪拌して反応させて得られたものである。また、光反応性MPCポリマーは、2mLのPMAc水溶液(5wt%=50mg/mL)(PMAcは2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(90%)とメタクリル酸(10%)のランダム共重合体)に12.44mgの4−アジドアニリンと、17.47mgの水溶性カルボジイミド(WSC)を混合し,最終的に純水で100mLにメスアップし、pH7で24時間撹拌(冷蔵庫中4℃)して反応させて得られたものである。   Further, for comparison, the inventors of the present invention previously invented and applied for international patent (PCT / JP2004 / 004510), using photoreactive polyethylene glycol or photoreactive MPC polymer as a substance fixing agent, The same operation as described above was performed. Photoreactive polyethylene glycol is 100 mg poly (ethylene glycol) bis (3-aminopropyl) end (commercially available from Aldrich, average molecular weight 1500) and 68.6 mg N- (4-azidobenzyloxy) succinimide in 10 ml dimethylformamide It was obtained by reacting at pH 6 with stirring at 4 ° C. for 24 hours. The photoreactive MPC polymer was 12.44 mg in 2 mL of a PMAc aqueous solution (5 wt% = 50 mg / mL) (PMAc is a random copolymer of 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (90%) and methacrylic acid (10%)). Of 4-azidoaniline and 17.47 mg of water-soluble carbodiimide (WSC), finally made up to 100 mL with pure water, and stirred at pH 7 for 24 hours (4 ° C. in a refrigerator). It is a thing.

結果を下記表2に示す。表2に示されるように、ダニアレルゲン抗体を一次抗体として用いた場合の発光強度が0であり、スギアレルゲン抗体を一次抗体として用いた場合にはいずれの水溶性ポリマーを用いた場合も大きな発光強度が測定されたので、本発明の物質固定化剤により非特異吸着を防止して免疫測定が可能であることが明らかになった。なお、先に国際特許出願している光反応性ポリエチレングリコール又は光反応性MPCポリマーを物質固定化剤を用いた場合の発光強度は、PEG1000を用いた場合と同等であった。   The results are shown in Table 2 below. As shown in Table 2, when the mite allergen antibody is used as the primary antibody, the luminescence intensity is 0, and when the water allergen antibody is used as the primary antibody, a large amount of light is emitted when any water-soluble polymer is used. Since the strength was measured, it became clear that nonspecific adsorption was prevented by the substance immobilizing agent of the present invention and immunoassay was possible. Note that the emission intensity when using a substance immobilizing agent for the photoreactive polyethylene glycol or photoreactive MPC polymer for which an international patent application was previously filed was the same as when using PEG1000.

Figure 0004630865
Figure 0004630865

基板として、平均表面粗さ0.2μm若しくは0.4μmのポリスチレン基板又は平均表面粗さ2.5μmないし20μmのアクリル基板を用いることを除き、実施例1と同じ操作を行った(用いた水溶性ポリマーはポリエチレングリコール)。   The same operation as in Example 1 was performed except that a polystyrene substrate having an average surface roughness of 0.2 μm or 0.4 μm or an acrylic substrate having an average surface roughness of 2.5 μm to 20 μm was used as the substrate (the water-soluble polymer used was polyethylene). Glycol).

結果を図1に示す。図1に示されるように基板の平均表面粗さが15μmの場合に、他の表面粗さの基板よりも明らかに発光強度が高くなった。   The results are shown in FIG. As shown in FIG. 1, when the average surface roughness of the substrate was 15 μm, the emission intensity was clearly higher than that of the other surface roughness substrates.

ダニアレルゲンの免疫測定
ポリエチレングリコールモノメタクリレート(ポリエチレングリコール部分子量352)4.5gを50mlの酢酸エチルに溶解し、AIBNを開始剤として14.03mg加え、60℃で6時間反応させた。反応液はエバポレーターにて溶媒を取り除いた後、水で溶解し、限外ろ過を行い未反応のモノマーを取り除いた。ゲル濾過クロマトグラフィー(GPC)にてポリマー生成を確認した。
Mite allergen immunoassay 4.5 g of polyethylene glycol monomethacrylate (polyethylene glycol part molecular weight 352) was dissolved in 50 ml of ethyl acetate, and 14.03 mg of AIBN was added as an initiator and reacted at 60 ° C. for 6 hours. After removing the solvent with an evaporator, the reaction solution was dissolved in water and subjected to ultrafiltration to remove unreacted monomers. Polymer formation was confirmed by gel filtration chromatography (GPC).

水溶性ポリマーとして、上記ポリエチレングリコールメタクリレートのポリマー以外に、平均分子量1000のポリエチレングリコール(PEG1000)(市販品)、平均分子量10000のポリエチレングリコール(PEG10000)(市販品)又は実施例1で製造したMPC-ブチルメタクリレート共重合体を用いた。   As the water-soluble polymer, in addition to the above polyethylene glycol methacrylate polymer, polyethylene glycol (PEG 1000) (commercial product) with an average molecular weight of 1000, polyethylene glycol (PEG 10000) (commercial product) with an average molecular weight of 10,000, or MPC- produced in Example 1 Butyl methacrylate copolymer was used.

各水溶性ポリマーを、0.125重量%の濃度になるように水に溶解した。得られた各水溶性ポリマー水溶液を、光架橋剤(4,4'-ジアジドスチルベン-2,2'-ジスルホン酸ナトリウム)と混合した(光架橋剤の添加量はポリマーに対して5重量%)。得られた各水溶性ポリマー水溶液を、ダニアレルゲン(市販品)水溶液(0.25重量%)と1:1で混合した。得られた混合液をポリスチレンディッシュに50nLずつスポットした。乾燥後、UV照射(波長290〜390nm、照度17mW/cm2、10秒間)によりダニアレルゲンを固定化した(水溶性ポリマーも固定化される)。Each water-soluble polymer was dissolved in water to a concentration of 0.125% by weight. Each obtained water-soluble polymer aqueous solution was mixed with a photocrosslinking agent (sodium 4,4′-diazidostilbene-2,2′-disulfonate) (the addition amount of the photocrosslinking agent was 5% by weight based on the polymer). ). Each obtained water-soluble polymer aqueous solution was mixed 1: 1 with a mite allergen (commercially available) aqueous solution (0.25 wt%). The obtained mixture was spotted on a polystyrene dish by 50 nL. After drying, mite allergen was immobilized by UV irradiation (wavelength 290 to 390 nm, illuminance 17 mW / cm 2 , 10 seconds) (water-soluble polymer is also immobilized).

本実施例では、処理時間の短縮を図るべく、以下の処理はすべてミキサーを用いて行った。PBS(0.1% Tween20(登録商標))で洗浄後、ダニアレルゲン抗体(市販品)と室温で20分反応させた。同様にPBS(0.1% Tween20(登録商標))で洗浄後、HRP標識二次抗体(市販品)と室温で20分反応させた。PBS(0.1% Tween20(登録商標))で洗浄後、化学発光試薬を添加し、発光強度を測定した。   In this example, in order to shorten the processing time, the following processes were all performed using a mixer. After washing with PBS (0.1% Tween20 (registered trademark)), it was reacted with a mite allergen antibody (commercially available) at room temperature for 20 minutes. Similarly, after washing with PBS (0.1% Tween20 (registered trademark)), it was reacted with an HRP-labeled secondary antibody (commercially available) at room temperature for 20 minutes. After washing with PBS (0.1% Tween20 (registered trademark)), a chemiluminescent reagent was added, and the luminescence intensity was measured.

結果を下記表3に示す。表3に示されるように、ポリエチレングリコールモノメタクリレートポリマー(PEGMAP)を用いた場合が、もっとも大きな発光強度が測定された。これはポリエチレングリコールモノメタクリレートポリマーが、蛋白固定に適した疎水性構造と水溶性を併せ持っているためと考えられる。このため、従来の1/4以下の時間で充分な発光強度を得ることが出来、診断現場での即日検査が可能になった。   The results are shown in Table 3 below. As shown in Table 3, when the polyethylene glycol monomethacrylate polymer (PEGMAP) was used, the highest light emission intensity was measured. This is probably because the polyethylene glycol monomethacrylate polymer has both a hydrophobic structure suitable for protein immobilization and water solubility. For this reason, sufficient light emission intensity can be obtained in less than 1/4 of the conventional time, and the same day inspection at the diagnosis site becomes possible.

また、上記ダニアレルゲン固定化チップを−30℃で1ヶ月保存した後、同様にダニアレルゲン抗体と反応させ、そのときの発光強度も表3の下段に示した。安定性においてもポリエチレングリコールモノメタクリレートポリマーが優れていることが明らかになった。   The mite allergen-immobilized chip was stored at −30 ° C. for 1 month and then reacted with a mite allergen antibody in the same manner. It was also revealed that the polyethylene glycol monomethacrylate polymer is superior in terms of stability.

Figure 0004630865
Figure 0004630865

1. MPCポリマーの合成
下記の合成スキームに従い、常法によりメタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(MPC)ポリマーを合成した。なお、2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとメタクリル酸の配合比率をモル比(下記式中のnとmの比)で9:1(以下、「MPC9:1」)、7:3(以下、「MPC7:3」)、5:5(以下、「MPC5:5」)とした3種類のポリマーを合成した。なお、合成したポリマーは、ランダム共重合体である。合成されたMPCポリマーの平均分子量は、MPC9:1が215000、MPC7:3が550000、MPC5:5が1104000であった。
1. Synthesis of MPC polymer A methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) polymer was synthesized by a conventional method according to the following synthesis scheme. The mixing ratio of 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine and methacrylic acid is 9: 1 (hereinafter referred to as “MPC9: 1”), 7: 3 (hereinafter referred to as “MPC7”) in terms of molar ratio (ratio of n and m in the following formula). : 3 "), 5: 5 (hereinafter" MPC5: 5 "), three types of polymers were synthesized. The synthesized polymer is a random copolymer. The average molecular weight of the synthesized MPC polymer was 215000 for MPC9: 1, 550000 for MPC7: 3, and 1104000 for MPC5: 5.

Figure 0004630865
Figure 0004630865

2. MPCポリマーへのチオール基およびアジド基の導入
(1) 2-メルカプトエチルアミンダイマーの調製
2-メルカプトエチルアミン水溶液NaOHによりpH8.5に調整)を攪拌しながらインキュベーション(20℃、48時間)により2-メルカプトエチルアミンダイマーを生成した。なお、生成物は、5-5'ジチオビス2-ニトロベンゼンのエルマン反応の産生した3-カルボキシレート4−ニトロチオフィノイレート(TNB)の412nmの吸光度から評価した。
2. Introduction of thiol and azide groups into MPC polymers
(1) Preparation of 2-mercaptoethylamine dimer
A 2-mercaptoethylamine dimer was produced by incubation (20 ° C., 48 hours) with stirring while adjusting the pH to 8.5 with aqueous 2-mercaptoethylamine NaOH. The product was evaluated from the absorbance at 412 nm of 3-carboxylate 4-nitrothiophinoylate (TNB) produced by the Elman reaction of 5-5′dithiobis-2-nitrobenzene.

(2) MPCポリマーへのチオール基の導入
各MPCポリマーに、2-メルカプトエチルアミンダイマー(メタクリル酸モル濃度の2倍濃度)及び水溶性カルボジイミド(メタクリル酸モル濃度の2倍濃度)の水溶液を添加し、4℃、pH7.0で24時間インキュベートした。次いでジチオトレイトール(DTT)(メタクリル酸モル濃度の2倍濃度)を添加し、ジスルフィドダイマーを還元した(pH10、12時間)。透析によりポリマー以外の未反応物を除去した。導入されたチオールの量を、エルマン反応により定量した。MPCポリマー1分子中に導入されたチオール基は、MPC9:1が0.14mol、MPC7:3が7.5mol、MPC5:5が10.3molであった。
(2) Introduction of thiol group into MPC polymer To each MPC polymer, an aqueous solution of 2-mercaptoethylamine dimer (double concentration of methacrylic acid molar concentration) and water-soluble carbodiimide (double concentration of methacrylic acid molar concentration) was added. Incubation was performed at 4 ° C. and pH 7.0 for 24 hours. Dithiothreitol (DTT) (2 times the molar concentration of methacrylic acid) was then added to reduce the disulfide dimer (pH 10, 12 hours). Unreacted substances other than the polymer were removed by dialysis. The amount of thiol introduced was quantified by the Elman reaction. The thiol groups introduced into one molecule of MPC polymer were 0.14 mol for MPC9: 1, 7.5 mol for MPC7: 3, and 10.3 mol for MPC5: 5.

(3) MPCポリマーへのアジド基の導入
チオール基を導入したMPCポリマーを、アジドアニリン(メタクリル酸モル濃度の2倍濃度)と水溶液中で4℃で24時間、pH7.0で反応させ、透析により未反応物を除去した。得られた生成物を凍結乾燥し、アジド基を吸光度測定より定量した。MPCポリマー1分子中に導入されたアジド基は、MPC9:1が1.1mol、MPC7:3が29.4mol、MPC5:5が99.5molであった。
(3) Introduction of azide group into MPC polymer MPC polymer introduced with thiol group was reacted with azidoaniline (2 times the molar concentration of methacrylic acid) in aqueous solution at 4 ° C for 24 hours at pH 7.0, followed by dialysis. To remove unreacted material. The obtained product was freeze-dried, and the azide group was quantified by measuring absorbance. The azide group introduced into one molecule of the MPC polymer was 1.1 mol of MPC9: 1, 29.4 mol of MPC7: 3, and 99.5 mol of MPC5: 5.

金製基板との結合
実施例5で調製した、チオール基及びアジド基含有MPC9:1、MPC7:3、MPC5:5を以下の方法により、水晶発振子マイクロバランス測定装置の金製のセンサチップ電極部分に固定化した。先ず、センサチップの電極部分にピランハ溶液(過酸化水素水:濃硫酸 1:3)をのせ、5分間静置し、水で洗浄後、エアーを吹付け、水を取り除いた。この操作を繰り返した。センサチップを水晶発振子マイクロバランス測定装置に図2のようにセットし、水に浸してベースラインが安定するのを待った。なお、図2中、参照番号1がセンサチップ、2が純水である。安定後、サンプル(チオール基及びアジド基含有MPC9:1、MPC7:3又はMPC5:5の水溶液)を添加し、センサー部への結合量を周波数変化として測定した。対照として、チオール基を導入していないMPC7:3の水溶液も同様にして基板に滴下し、測定した。
Bonding with gold substrate Gold sensor chip electrode of crystal oscillator microbalance measuring device prepared in Example 5 containing MPC9: 1, MPC7: 3, MPC5: 5 containing thiol group and azide group by the following method Immobilized to the part. First, a piranha solution (hydrogen peroxide solution: concentrated sulfuric acid 1: 3) was placed on the electrode part of the sensor chip, allowed to stand for 5 minutes, washed with water, then blown with air to remove the water. This operation was repeated. The sensor chip was set in a quartz crystal microbalance measuring apparatus as shown in FIG. 2 and immersed in water to wait for the baseline to stabilize. In FIG. 2, reference numeral 1 is a sensor chip, and 2 is pure water. After stabilization, a sample (thiol group and azide group-containing MPC9: 1, MPC7: 3 or MPC5: 5 aqueous solution) was added, and the amount of binding to the sensor part was measured as a change in frequency. As a control, an MPC7: 3 aqueous solution into which no thiol group was introduced was dropped on the substrate in the same manner and measured.

結果を図3及び表4に示す。サンプル添加後、コントロールのチオール基の導入していないMPCポリマーではほとんど変化が見られないのに対して、チオール基を導入したMPCポリマーではどの条件でも周波数に変化が生じた。周波数変化は表4に示すように、平均分子量の大きい順、1分子中に含まれるチオール基の量の順に変化量が大きく、予想したデータと同じ結果となった。これにより金表面とチオール基との共有結合を確認することができた。   The results are shown in FIG. After the sample was added, the MPC polymer without the introduction of the control thiol group showed almost no change, whereas the MPC polymer with the thiol group introduced changed the frequency under any condition. As shown in Table 4, the change in frequency was large in the order of increasing average molecular weight and in the order of the amount of thiol group contained in one molecule, and the results were the same as the predicted data. This confirmed the covalent bond between the gold surface and the thiol group.

Figure 0004630865
Figure 0004630865

QCMによるダニアレルゲンの免疫測定
市販のダニアレルゲンを透析により脱塩し、凍結乾燥により25倍に濃縮した。一方、実施例1で調製したMPC7:3と市販のダニアレルゲン抗体を重量比0.5:1で緩衝液中で混合し、得られた水溶液(MPC7:3ポリマー濃度0.125重量%)をセンサチップ上に1μLスポットした。乾燥後、紫外線照射(10秒間、線量40mW/cm)により固定化した。PBS(1%BSA)2mlにセンサチップをセットした。ベースライン安定後、先に濃縮したダニアレルゲン(100μg/ml)10μLを滴下した。周波数変化をQCMにより経時的に測定した。一方、対照として、ダニアレルゲン抗体を含まないものも同様にセンサチップに固定化し、測定した。
Immunity measurement of mite allergen by QCM Commercial mite allergen was desalted by dialysis and concentrated 25 times by lyophilization. On the other hand, MPC7: 3 prepared in Example 1 and a commercially available mite allergen antibody were mixed in a buffer solution at a weight ratio of 0.5: 1, and the resulting aqueous solution (MPC7: 3 polymer concentration 0.125 wt%) was used as a sensor chip. 1 μL spotted on top. After drying, it was fixed by ultraviolet irradiation (10 seconds, dose 40 mW / cm 2 ). The sensor chip was set in 2 ml of PBS (1% BSA). After the baseline was stabilized, 10 μL of the previously concentrated mite allergen (100 μg / ml) was added dropwise. Frequency change was measured over time by QCM. On the other hand, as a control, those without mite allergen antibody were similarly immobilized on a sensor chip and measured.

結果を図4に示す。ダニアレルゲン滴下後、MPCポリマーのみではほぼ周波数に変化が無いのに対して、ダニアレルゲン抗体を固定化したセンサチップでは、周波数が約500Hz変化した。この周波数変化は抗原抗体反応によるセンサ表面の重量変化に由来するものであり、MPCポリマーで固定化したダニアレルゲン抗体がアレルゲンを認識できることを実証することができた。これにより、本発明の物質固定化剤を用いたQCMによりアレルゲンを検知することが可能であることが明らかになった。   The results are shown in FIG. After dropping the mite allergen, the MPC polymer alone showed almost no change in frequency, whereas the sensor chip with mite allergen antibody immobilized changed the frequency by about 500 Hz. This change in frequency originates from a change in the weight of the sensor surface due to the antigen-antibody reaction, and it was demonstrated that mite allergen antibodies immobilized with MPC polymer can recognize allergens. Thus, it has been clarified that allergens can be detected by QCM using the substance immobilizing agent of the present invention.

1. 水溶性ポリマーの調製
ポリエチレングリコールモノメタクリレート(ポリエチレングリコール部分子量350)4.5gを50mlの酢酸エチルに溶解し、AIBNを開始剤として14.03mg加え、60℃で6時間反応させた。反応液はエバポレーターにて溶媒を取り除いた後、水で溶解し、限外ろ過を行い未反応のモノマーを取り除いた。ゲル濾過クロマトグラフィー(GPC)にてポリマー生成を確認した。
1. Preparation of Water-Soluble Polymer 4.5 g of polyethylene glycol monomethacrylate (polyethylene glycol part molecular weight 350) was dissolved in 50 ml of ethyl acetate, and 14.03 mg of AIBN was added as an initiator and reacted at 60 ° C. for 6 hours. After removing the solvent with an evaporator, the reaction solution was dissolved in water and subjected to ultrafiltration to remove unreacted monomers. Polymer formation was confirmed by gel filtration chromatography (GPC).

2. 水溶性ポリマー水溶液の調製及び固定化
4,4'-ジアジドスチルベン-2,2'-ジスルホン酸ナトリウム(市販品)を光架橋剤として用いた。光架橋剤の濃度が0.003125%、上記水溶性ポリマーの濃度が0.0625%、BSA(Aldrich社製)濃度が0.125%となるように混合した。得られた水溶液を、ビアコア社製SPR用金基板をメルカプトエタノールで20分間処理した後、その上に7×7mmの面積に20μL塗布し、乾燥した(膜厚約0.2μm)。次いで、UV照射(ブラックライトで7分間)によりBSAを固定化した。
2. Preparation and immobilization of water-soluble polymer aqueous solution
Sodium 4,4′-diazidostilbene-2,2′-disulfonate (commercially available) was used as a photocrosslinking agent. Mixing was performed so that the concentration of the photocrosslinking agent was 0.003125%, the concentration of the water-soluble polymer was 0.0625%, and the concentration of BSA (Aldrich) was 0.125%. The obtained aqueous solution was treated with a metal substrate for SPR manufactured by Biacore for 20 minutes with mercaptoethanol, and then 20 μL was applied to an area of 7 × 7 mm 2 and dried (film thickness: about 0.2 μm). Next, BSA was immobilized by UV irradiation (black light for 7 minutes).

3. 測定
PBS(0.1% Tween20(登録商標))で洗浄後、抗BSAウサギIgG(市販品)(20μg/mL)を使用して、SPR測定を実施した。
3. Measurement
After washing with PBS (0.1% Tween20 (registered trademark)), SPR measurement was performed using anti-BSA rabbit IgG (commercial product) (20 μg / mL).

4. 結果
測定の結果、SPR感度(RU)は300であった。
4). Result As a result of the measurement, the SPR sensitivity (RU) was 300.

1. 水溶性ポリマーの調整
実施例8と同様に処理した。
1. Preparation of water-soluble polymer The same treatment as in Example 8 was performed.

2. 水溶性ポリマー水溶液の調製及び固定化
イニシアム社製QCM用センサーチップの電極部分に1mMメルカプトエタノールを5μL滴下し、20分静置した後、超純水で洗浄し、乾燥させた。 4,4'-ジアジドスチルベン-2,2'-ジスルホン酸ナトリウム(市販品)を光架橋剤として用いて、光架橋剤の濃度が0.003125%、上記水溶性ポリマーの濃度が0.0625%、BSA(Aldrich社製)濃度が0.125%となるように混合した溶液を、チップに0.5μL滴下し、乾燥させた。次いで、UV照射(ブラックライトで7分間)によりBSAを固定化した。
2. Preparation and Immobilization of Water-Soluble Polymer Aqueous Solution 5 μL of 1 mM mercaptoethanol was dropped onto the electrode part of the QCM sensor chip manufactured by Inicium, and left to stand for 20 minutes, then washed with ultrapure water and dried. Using sodium 4,4'-diazidostilbene-2,2'-disulfonate (commercially available) as a photocrosslinking agent, the photocrosslinking agent concentration is 0.003125%, the above water-soluble polymer concentration is 0.0625%, BSA ( 0.5 μL of the solution mixed so that the concentration was 0.125% was dropped onto the chip and dried. Next, BSA was immobilized by UV irradiation (black light for 7 minutes).

3.測定
PBS(0.1% Tween20(登録商標))で洗浄後、抗BSA抗体(30μg/ml)を結合させ、QCMにより周波数の変化を測定した。
3. Measurement
After washing with PBS (0.1% Tween20 (registered trademark)), an anti-BSA antibody (30 μg / ml) was bound, and the change in frequency was measured by QCM.

4.結果
測定の結果、QCM周波数変化(Hz)は1000であった。

4). Result As a result of the measurement, the QCM frequency change (Hz) was 1000.

Claims (19)

1分子中に少なくとも2個の光反応性基を有する光架橋剤と、分子全体として電気的に中性な水溶性ポリマーとを含む、基体上に所望の物質を固定化するための物質固定化剤。  Immobilization of a substance for immobilizing a desired substance on a substrate, comprising a photocrosslinking agent having at least two photoreactive groups in one molecule and a water-soluble polymer that is electrically neutral as a whole molecule Agent. 前記光反応性基がアジド基である請求項1記載の物質固定化剤。  The substance fixing agent according to claim 1, wherein the photoreactive group is an azide group. 前記光架橋剤が水溶性のジアジド化合物である請求項2記載の物質固定化剤。  The substance fixing agent according to claim 2, wherein the photocrosslinking agent is a water-soluble diazide compound. 前記水溶性ポリマーが、ノニオン性ポリマーである請求項1ないし3のいずれか1項に記載の物質固定化剤。  The substance fixing agent according to any one of claims 1 to 3, wherein the water-soluble polymer is a nonionic polymer. 前記ノニオン性ポリマーが、ポリアルキレングリコールである請求項4記載の物質固定化剤物質固定化剤。  The substance fixing agent substance fixing agent according to claim 4, wherein the nonionic polymer is polyalkylene glycol. 前記ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである請求項5記載の物質固定化剤。  6. The substance fixing agent according to claim 5, wherein the polyalkylene glycol is polyethylene glycol. 前記ノニオン性ポリマーが、ポリエチレングリコールモノ(メタ)アクリレートのビニル重合体である請求項4記載の物質固定化剤。  The substance fixing agent according to claim 4, wherein the nonionic polymer is a vinyl polymer of polyethylene glycol mono (meth) acrylate. 前記水溶性ポリマーが、下記一般式[I]で表される構造を有する単位を含む、請求項1ないし3のいずれか1項に記載の物質固定化剤。
Figure 0004630865
(ただし、一般式[I]中、Xは、重合した状態の重合性原子団を表わす)。
The substance fixing agent according to any one of claims 1 to 3, wherein the water-soluble polymer contains a unit having a structure represented by the following general formula [I].
Figure 0004630865
(In the general formula [I], X represents a polymerizable atomic group in a polymerized state).
Xがビニル系モノマー由来である請求項8記載の物質固定化剤。  The substance fixing agent according to claim 8, wherein X is derived from a vinyl monomer. 前記水溶性ポリマーが、下記一般式[I']で表される構造を有する単位を含む、請求項8記載の物質固定化剤。
Figure 0004630865
(ただし、X'は、ビニル部分が付加重合している状態のメタクリルオキシ基、メタクリルアミド基、アクリルオキシ基、アクリルアミド基、スチリルオキシ基又はスチリルアミド基を表し、R1は単結合又は炭素数1〜10のアルキレン基(ただし1個又は2個のヒドロキシル基で置換されていてもよい)を表す)
The substance immobilizing agent according to claim 8, wherein the water-soluble polymer contains a unit having a structure represented by the following general formula [I '].
Figure 0004630865
(However, X ′ represents a methacryloxy group, a methacrylamide group, an acryloxy group, an acrylamide group, a styryloxy group or a styrylamide group in a state where the vinyl moiety is addition-polymerized, and R 1 is a single bond or a carbon number. 1 to 10 alkylene groups (which may be substituted with 1 or 2 hydroxyl groups)
X’を含む単位が、2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、2−アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、N−(2−メタクリルアミド)エチルホスホリルコリン、4−メタクリロイルオキシブチルホスホリルコリン、6−メタクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、10-メタクリロイルオキシデシルホスホリルコリン、ω−メタクリロイルジオキシエチレンホスホリルコリン又は4−スチリルオキシブチルホスホリルコリンに由来する請求項10記載の物質固定化剤。  The unit containing X ′ is 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine, 2-acryloyloxyethyl phosphorylcholine, N- (2-methacrylamide) ethyl phosphorylcholine, 4-methacryloyloxybutylphosphorylcholine, 6-methacryloyloxyhexylphosphorylcholine, 10-methacryloyloxy The substance immobilizing agent according to claim 10, which is derived from decylphosphorylcholine, ω-methacryloyldioxyethylene phosphorylcholine or 4-styryloxybutylphosphorylcholine. 前記一般式[I]で示される単位が、2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンに由来する請求項8記載の物質固定化剤。  The substance fixing agent according to claim 8, wherein the unit represented by the general formula [I] is derived from 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine. 基体に固定化する物質が、ポリペプチド、核酸、脂質並びに細胞及びその構成要素から成る群から選ばれる請求項1ないし12のいずれか1項に記載の物質固定化剤。  The substance immobilizing agent according to any one of claims 1 to 12, wherein the substance to be immobilized on the substrate is selected from the group consisting of polypeptides, nucleic acids, lipids, cells, and components thereof. 基体に固定化すべき物質と、請求項1ないし13のいずれか1項に記載の物質固定化剤とを含む水溶液又は水懸濁液を前記基体に塗布し、光照射することを含む、基体上への物質の固定化方法。  An aqueous solution or a water suspension containing a substance to be immobilized on a substrate and the substance immobilizing agent according to any one of claims 1 to 13 is applied to the substrate and irradiated with light. Method of immobilizing substances on the surface. 基体に固定化する物質が、ポリペプチド、核酸、脂質並びに細胞及びその構成要素から成る群から選ばれる請求項14記載の方法。  The method according to claim 14, wherein the substance immobilized on the substrate is selected from the group consisting of polypeptides, nucleic acids, lipids and cells and components thereof. 前記光を選択照射することにより、物質を固定化する領域をパターニングすることを含む請求項14又は15記載の方法。  The method according to claim 14, further comprising patterning a region where the substance is immobilized by selectively irradiating the light. 請求項14ないし16のいずれか1項に記載の方法により前記物質が固定化された基体。  A substrate on which the substance is immobilized by the method according to any one of claims 14 to 16. 前記基体が樹脂製である請求項17記載の基体。  The substrate according to claim 17, wherein the substrate is made of a resin. 前記基体の平均表面粗さが14μmないし17μmである請求項18記載の基体。  19. The substrate according to claim 18, wherein the average surface roughness of the substrate is 14 μm to 17 μm.
JP2006513624A 2004-05-18 2005-05-18 Substance immobilizing agent, substance immobilizing method using the same, and substance immobilizing substrate using the same Expired - Fee Related JP4630865B2 (en)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2004147237 2004-05-18
JP2004147237 2004-05-18
JP2004231888 2004-08-09
JP2004231888 2004-08-09
JP2004249900 2004-08-30
JP2004249900 2004-08-30
PCT/JP2005/009100 WO2005111618A1 (en) 2004-05-18 2005-05-18 Substance-fixing agents, method of fixing substance with the same, and substrate having substance fixed with the same

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPWO2005111618A1 JPWO2005111618A1 (en) 2008-03-27
JP4630865B2 true JP4630865B2 (en) 2011-02-09

Family

ID=35394278

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2006513624A Expired - Fee Related JP4630865B2 (en) 2004-05-18 2005-05-18 Substance immobilizing agent, substance immobilizing method using the same, and substance immobilizing substrate using the same

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP4630865B2 (en)
WO (1) WO2005111618A1 (en)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007309725A (en) * 2006-05-17 2007-11-29 Girasol Bio Kk Substance fixing agent for functional substance, fixing method for the functional substance using the substance fixing agent, and base substance with the functional substance fixed thereon by the method
JP2008012444A (en) * 2006-07-06 2008-01-24 Ulvac Japan Ltd Method for forming lipid monomolecular film
EP2101975A2 (en) * 2006-11-03 2009-09-23 Trustees of Tufts College Biopolymer sensor and method of manufacturing the same
JP2008157923A (en) * 2006-12-01 2008-07-10 Canon Inc Chemically sensing device and method
JP2008286775A (en) * 2007-01-31 2008-11-27 Fujifilm Corp Manufacturing method of physiologically active substance-immobilized substrate and the substrate
JP4831352B2 (en) * 2007-02-23 2011-12-07 Jsr株式会社 Probe binding particle, method for producing the same, and blocking agent
JP2015072153A (en) * 2013-10-02 2015-04-16 神奈川県 Biosensor and method for manufacturing the same
JP7130919B2 (en) * 2016-03-11 2022-09-06 三菱瓦斯化学株式会社 Biological material immobilization method
JP6747030B2 (en) * 2016-04-15 2020-08-26 東ソー株式会社 Surface modified film and method for producing the same
AU2022245610A1 (en) 2021-03-26 2023-10-12 R-Nanobio Co. Ltd. Substrate for immobilizing substance, and use thereof
CN114904595B (en) * 2022-06-21 2023-07-25 中国科学院长春应用化学研究所 Substrate microarray chip based on gold nanorod-brush double-layer nanostructure and preparation method thereof

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6250656A (en) * 1985-08-29 1987-03-05 Matsushita Electric Ind Co Ltd Biosensor and its production
JP2000500440A (en) * 1995-11-03 2000-01-18 ビーエスアイ コーポレイション Water-soluble crosslinking agent
WO2001086301A1 (en) * 2000-05-11 2001-11-15 Center For Advanced Science And Technology Incubation, Ltd. Polymer composition for forming surface of biosensor
JP2003014767A (en) * 2001-04-26 2003-01-15 Nof Corp Non-particular hybridization inhibitor, clinical examination solution and clinical examination method

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1615034A4 (en) * 2003-03-31 2010-11-24 Rikagaku Kenkyusho Fixing agents, method of fixing substance with the same, and substrate having substance fixed thereto with the same
JP2005181154A (en) * 2003-12-19 2005-07-07 Kanagawa Acad Of Sci & Technol Instrument for measuring and/or identifying blood group antibodies, and method of measuring and/or identifying blood group antibodies using the same

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6250656A (en) * 1985-08-29 1987-03-05 Matsushita Electric Ind Co Ltd Biosensor and its production
JP2000500440A (en) * 1995-11-03 2000-01-18 ビーエスアイ コーポレイション Water-soluble crosslinking agent
WO2001086301A1 (en) * 2000-05-11 2001-11-15 Center For Advanced Science And Technology Incubation, Ltd. Polymer composition for forming surface of biosensor
JP2003014767A (en) * 2001-04-26 2003-01-15 Nof Corp Non-particular hybridization inhibitor, clinical examination solution and clinical examination method

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2005111618A1 (en) 2008-03-27
WO2005111618A1 (en) 2005-11-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4630865B2 (en) Substance immobilizing agent, substance immobilizing method using the same, and substance immobilizing substrate using the same
JP4630817B2 (en) Substance immobilizing agent, substance immobilizing method using the same, and substance immobilizing substrate using the same
JP2006322709A (en) Substance fixing substrate
Eckert et al. Surface-modification of polystyrene-microtitre plates via grafting of glycidylmethacrylate and coating of poly-glycidylmethacrylate
JP4505581B2 (en) Substance immobilization method
Ivanov et al. Interferometric detection of chloramphenicol via its immunochemical recognition at polymer-coated nano-corrugated surfaces
JP4939019B2 (en) Solid phase carrier on which biological material is immobilized, method for producing solid phase carrier on which biological material is immobilized, biological material immobilization kit, and sensor chip
JP2010101661A (en) Method for immobilizing substance
JPWO2014061371A1 (en) Analytical carrier, method for producing and using the same
US20220275243A1 (en) Surface functionalized substrates and methods of making the same
WO2006123737A1 (en) High molecular compound for medical material and biochip substrate using such high molecular compound
JP7120547B2 (en) Substance immobilizing agent and substance immobilizing method using said substance immobilizing agent
JP2006316010A (en) Substance-fixing agent, method for fixing substance and substrate for fixing substance
JP2007139587A (en) Substance fixing agent, substance fixing method and substance fixing substrate
JP5614179B2 (en) Polymer compound for medical material and biochip substrate using the polymer compound
JP7307434B2 (en) SUBSTRATE FOR SUBSTANCE AND USE THEREOF
JP2007309725A (en) Substance fixing agent for functional substance, fixing method for the functional substance using the substance fixing agent, and base substance with the functional substance fixed thereon by the method
JP2005181154A (en) Instrument for measuring and/or identifying blood group antibodies, and method of measuring and/or identifying blood group antibodies using the same
JP2010032504A (en) Composition, particles, and method of manufacturing the same
JP5344438B2 (en) Substrate for fixing substance, substrate for fixing substance, and analysis method
JP2014066532A (en) Sugar chain fixing carrier, manufacturing method thereof and compound carrier in which sugar chain fixing carrier is fixed with sugar chain or sugar chain containing material
JP4866112B2 (en) Biological material structure and manufacturing method of biological material structure, biological material carrier, purification method of target substance, affinity chromatography container, separation chip, target substance analysis method, target substance analysis separation device, And sensor chip
JP2011007785A (en) Target molecular interaction substance-immobilized carrier
JP2014062798A (en) Analyzing carrier, and method for manufacturing and using the same
JP2015025788A (en) Material stabilization agent and substrate

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20080430

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20100323

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20100524

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20101109

A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20101115

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131119

Year of fee payment: 3

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees