JP4624574B2 - Lipid peroxidation inhibitor - Google Patents

Description

【０００４】
〔式中、HO^・はヒドロキシラジカル、LOOHは過酸化脂質、LOはアルコキシアニオン、LOO^・はペルオキシラジカル、HOO^・はヒドロペルオキシラジカル、O₂ ^-・はスーパーオキシドアニオンラジカルをそれぞれ示す。〕
【０００５】
これに対して、生体内にはフェロキシダーゼのような鉄イオン酸化酵素や、トランスフェリンやフェリチン等の鉄結合性蛋白が存在し、鉄イオンを安定化してその反応性を抑制する機構が存在する。
ところが、腸管管腔内にはこうした鉄イオンの不活性化機構が存在せず、反応性の高い２価の鉄イオンが常に発生し易い環境にあり、常時酸化的負荷に晒される独特の環境を呈している。すなわち腸管内においては、血流により腸管粘膜に供給された酸素が２価の鉄イオンにより還元されてスーパーオキシドアニオンラジカルとなり、また腸内細菌からもスーパーオキシドアニオンラジカルが産生され、このスーパーオキシドアニオンラジカルが不均化反応により過酸化水素に変換され、これが腸粘膜表面で更に鉄イオンと反応してヒドロキシラジカルが発生し、脂質の過酸化が進むと考えられており(図１参照、C.F.Babbs,1990,Free Rad.Biol.Med.,12,161-168)、２価の鉄イオンの関与するところが大きい。
【０００６】
従って、腸管粘膜組織の脂質の過酸化を防ぐためには、鉄イオンが関与するフリーラジカル発生機構を制御することが課題となり、例えば、鉄イオンをキレートするフィチン酸を含有する小麦ふすまや米糠等を積極的に投与することも考えられる。
しかし、鉄は、幼児期、思春期の男女、受胎可能年齢の女性にしばしば欠乏症状が認められるミネラルの一つであり、鉄欠乏症は、妊婦においては低体重児や未熟児の出産及び週産期の死亡率の増加の原因となり、幼児及び小児では精神活動や認識動作への傷害、成人では作業能力の低下等を引き起こす。従って、鉄欠乏の人々にとっては鉄イオンを配合した各種飲食品や医薬品により積極的に鉄補給を行うことが不可欠であり、フィチン酸のように鉄イオンの吸収を阻害するような物質を摂取することは好ましくない。
【０００７】
一方、過酸化脂質の生成を防ぐ物質として、抗酸化剤であるビタミンＥ及びその誘導体が用いられているが、これらは水に溶け難いことから水分含量の高い飲食品に使用した場合、加工特性や安定性の面で問題があった。
更に、ラクトバチルス属細菌が肝臓と赤血球の酸化的傷害を抑制する作用を示すことも報告されているが（特開平４−２６４０３４号公報）、消化管における脂質過酸化抑制効果は十分なものとはいえない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、腸管内における鉄イオンの吸収に影響を与えずに過酸化脂質の発生を抑制でき、脂質過酸化に伴う腸管粘膜傷害等の予防若しくは改善効果を有する飲食品又は医薬品を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは過酸化脂質の生成を抑制する物質について種々検討したところ、特定の微生物の菌体又はその構成成分が、遊離鉄イオンには影響を与えず過酸化脂質の生成を抑制でき、飲食品又は医薬品として利用できることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、ビフィドバクテリウム属若しくはストレプトコッカス属に属する微生物の菌体又は菌体構成成分を有効成分とする脂質過酸化抑制剤を提供するものである。
【００１１】
また本発明は、当該脂質過酸化抑制剤を含有する腸管粘膜傷害の予防治療剤を提供するものである。
【００１２】
更に本発明は、当該脂質過酸化抑制剤を含有する飲食品を提供するものである。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明の脂質過酸化抑制剤とは、活性酸素等のフリーラジカルによって引き起こされる生体内脂質の過酸化反応、特に鉄イオンにより惹起される過酸化反応を制御し、過酸化脂質の生成を抑制するものをいう。
【００１４】
本発明において用いられる、ビフィドバクテリウム属に属する微生物としては、例えばビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium. longum）、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Bifidobacterium. adolescentis）、ビフィドバクテリウム・インファンテス（Bifidobacterium. infantis）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium. bifidum）等が挙げられ、このうちビフィドバクテリウム・ビフィダムがより好ましく、特に生命工学工業技術研究所条寄第７９１号（ＦＥＲＭ ＢＰ−７９１号）として寄託されたビフィドバクテリウム・ビフィダムＹＩＴ ４００７が好ましい。
【００１５】
また、ストレプトコッカス属に属する微生物としては、例えばストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Streptococcus salivarius）、ストレプトコッカス・ミティス（Streptococcus mitis）等が挙げられ、このうちストレプトコッカス・サーモフィルスがより好ましく、特に生命工学工業技術研究所菌寄第１１８９１号（ＦＥＲＭ Ｐ−１１８９１号）及び１８１８９号（ＦＥＲＭ Ｐ−１８１８９号）として寄託されたストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ ２００１が好ましい。
斯かる微生物はいずれも発酵乳や生菌製剤として古来より食されているものであり、常時摂取しても安全な微生物である。
【００１６】
本発明における微生物菌体は、上記微生物の菌体をそのまま又は菌体破砕物を使用する他、例えば該微生物菌体の凍結乾燥物、加熱処理を施した死菌体又はそれらの破砕物等の菌体加工物を使用することもできる。
斯かる微生物菌体は、ビフィドバクテリウム属又はストレプトコッカス属に属する微生物をポリプペトンや酵母エキスを含む複合培地あるいはミルク中で培養することにより得ることができる。
【００１７】
菌体構成成分としては、例えば菌体又は菌体破砕物を水その他の溶媒により抽出した画分や細胞壁溶解酵素、核酸分解酵素又は蛋白分解酵素等の酵素処理して得られる画分、具体的には熱水抽出することにより得られる水溶性画分、細胞壁溶解酵素処理することにより細胞壁部分を取り去ったプロトプラスト画分、菌体の細胞壁溶解酵素可溶画分、更には菌体或いは該プロトプラストを有機溶媒で処理することにより得られる細胞膜画分を挙げることができる。
これらの菌体構成成分は、一般に広く用いられている方法により得ることができる。
【００１８】
菌体又は菌体構成成分のうち、菌体又は菌体破砕物、細胞膜成分を含む画分、前記プロトプラスト画分又は菌体若しくはプロトプラストを有機溶媒処理した細胞膜画分が、脂質過酸化抑制効果が高いことから特に好ましい。
【００１９】
かくして得られた菌体又はその菌体構成成分は、後記実施例に示すように鉄イオンに影響を与えることなく、鉄イオンにより惹起される脂質過酸化反応を有意に抑制することから、鉄欠乏症が懸念される妊婦や小児に対しても安心して使用できる。また、当該微生物は常時摂取しても安全なものであることから、脂質過酸化に伴う腸管粘膜傷害や老化等の予防又は治療を目的とする医薬として利用できる他、飲食品として日常的に摂取することができ、鉄イオンを補給しつつ腸粘膜疾患や老化等を予防できる。そして、鉄吸収の抑制を考慮すれば、使用する菌体又は菌体構成成分は、腸管の遊離鉄イオン濃度の低下率が１０％未満、特に５％未満であるものが好ましい。
【００２０】
本発明の脂質過酸化抑制剤は、常法に従って薬学的に許容される担体と共に種々の剤型の医薬組成物とすることができる。例えば上記菌体又は菌体構成成分に、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸等の賦形剤、水、エタノール、プロパノール、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドン等の結合剤、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム等の崩壊剤、グリセリン、デンプン等の保湿剤、精製タルク、ステアリン酸塩、ポリエチレングリコール等の滑沢剤等を加え、常法により顆粒剤、錠剤、カプセル剤等を製造することができる。さらに錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠あるいは二重錠、多層錠とすることができる。
【００２１】
また、菌体又は菌体構成成分を食品に直接添加することにより、又は当該菌株を用いて発酵乳等の発酵食品を製造することによって、飲食品として利用することができる。飲食品の好ましい例としては、発酵乳、乳製品乳酸菌飲料、果汁飲料、スープ、煎餅、クッキー等が例示される。特に、前記の飲食品中に鉄を強化した鉄強化飲食品に、菌体又は菌体構成成分を添加すれば、鉄の吸収を妨げずに、脂質等の過酸化を抑制でき好ましい。また、飲食品の形態としては、継続的に飲用し易く、過酸化脂質抑制効果の高い発酵乳が特に好ましい。なお、飲食品には、動物の飼料も含まれる。
【００２２】
斯かる飲食品には、更に、食品として通常用いられている種々の素材を併用することができる。具体的には、グルコース、シュークロース、フラクトース、蜂蜜等の糖類、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、ラクチトール、パラチニット等の糖アルコール、ショ糖脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、レシチン等の乳化剤、ペクチン、カルボキシメチルセルロース、水溶性大豆多糖類、ジェランガム、アラビアガム、キサンタンガム、カラギーナン、グアーガム等の安定化剤等が挙げられる。この他にも、ビタミンＡ、ビタミンＢ類、ビタミンＣ、ビタミンＥ等の各種ビタミン類や乳酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、パントテン酸カルシウムや各種マグネシウム、亜鉛化合物等のミネラル類、ハーブエキス等を配合することも可能である。
【００２３】
上記の各種製剤又は飲食品中に配合されるべき微生物菌体又は菌体構成成分の量は、用いる菌株又は服用する患者の症状、年齢、体重等によっても異なるので一概には決定できないが、通常成人１日あたり生菌として１０⁹〜１０¹⁴コロニー・フォーミング・ユニット(ＣＦＵ)、乾燥菌体として約０．０１ｇ〜３０ｇ、好ましくは０．１〜５ｇ程度である。
【００２４】
また、鉄を強化した飲食品あるいは医薬組成物に対し配合する場合にも上記の１日摂取量を満たすように菌体又は菌体構成成分の配合量を決定することが望ましい。この場合の鉄の配合量は鉄欠乏の予防を目的とする飲食品の場合１日摂取あたり鉄０．１〜１０mg、貧血等の治療を目的とする医薬組成物の場合、患者の症状により異なるが通常５〜２００mgが望ましい。
【００２５】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
【００２６】
実施例１ 微生物菌体の製造
凍結保存した菌株を乳糖１％添加した変法ＧＡＭブイヨン培地（日水製薬（株）製）に１％接種し、３７℃で２４時間静置培養した。この培養液１０mLを乳糖を２％添加した変法GAMブイヨン培地１Ｌに植え継ぎ、３７℃２４時間静置培養した。なお、ビフィドバクテリウム属の微生物菌体は、アネロパック・ケンキ（酸素吸収・炭酸ガス発生剤、三菱ガス化学（株）製）存在下で嫌気培養した。
培養終了後、４０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により集菌し、生理食塩水で２回洗浄して、微生物菌体（生菌体）を得た。凍結乾燥後の菌体収量は、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＹＩＴ ４００７が１．３ｇ、ストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ ２００１が１．０ｇであった。
【００２７】
実施例２ 生体膜の酸化傷害に対する作用
腸管粘膜における脂質過酸化反応の評価系として、反応基質として生体膜のモデルであるリン脂質のリポソームを用い、これに２価の鉄イオンを添加して過酸化反応を開始させる反応系を採用した。本反応系は、腸管の上皮細胞に管腔側から過酸化水素と２価の鉄イオンが接近し、生体膜の酸化傷害を惹起するという反応スキームを再現したものである（図１）。尚、過酸化水素の産生は腸管粘膜上と同様に２価の鉄による酸素分子の還元とスーパースキシドラジカルの不均化反応に依存する。
本反応系における生体膜の酸化傷害（過酸化脂質産生）の抑制率を測定することにより、各種菌体の腸管粘膜傷害の予防・治療効果を評価した。
【００２８】
（１）試験方法
▲１▼リポソーム液の調製方法
卵黄由来Ｌ−α−ホスファチジルコリン(Type XV-E;シグマ社製)１００mgを１０mLのジエチルエーテルに溶解し、蒸留水０．６mLを加え、超音波処理しながらエバポレーター中でジエチルエーテルを蒸発させた。これに０．１Ｍ Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）緩衝液（pH６．７）を３０mL添加した後、１５分間超音波処理して懸濁液を得た。この懸濁液を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離して残渣を除去し、約２５mLのリポソーム液を調製した。
【００２９】
▲２▼過酸化脂質産生反応の方法
表１に示す微生物菌体（生菌体）を湿重量の４倍量の０．１Ｍ ＡＤＡ緩衝液（pH６．７）に懸濁し、更に同緩衝液で段階的に希釈して異なる菌体濃度（反応液中の終濃度として１０⁷−１０¹⁰CFU/mL）の菌液を調製した。この菌液を１．５mLのリポソーム液に加え、全量で１．９８mLの反応液を調製した。この反応液に０．１mM塩化第一鉄水溶液０．１mLと０．１Ｍアスコルビン酸ナトリウム水溶液０．０２mLを添加して３７℃２時間反応した。反応容器を氷水で冷却することによって反応を終了させ、直ちに過酸化脂質濃度を測定した。
【００３０】
▲３▼過酸化脂質産生量の測定方法
過酸化脂質はＴＢＡＲＳ（チオバルビツール酸反応性物質）として定量した。
以下に測定手順を示す。
酢酸８０mLと蒸留水３２０mLを混合し、１０Ｎ水酸化ナトリウムでpH３．５に調製した溶液をＴＢＡＲＳ測定用緩衝液として使用した。反応液０．１mLをねじ口試験管に分取し、８．１％ドデシル硫酸ナトリウム０．２mL、ＴＢＡＲＳ測定用緩衝液０．５mL、０．８％ブチルヒドロキシトルエン酢酸溶液０．０５mL、０．８％チオバルビツール酸溶液１．０mL、５mMエチレンジアミン四酢酸溶液０．７mL、蒸留水１．５mLを順次混合した。この混合液を４℃で１時間静置した後、沸騰水浴中で１時間加熱し、氷水中で冷却した。これに蒸留水１．０mL、ｎ−ブタノール・ピリジン（１５：１）混液５．０mLを加え、ＴＢＡＲＳをｎ−ブタノール・ピリシン層に抽出し、抽出液の蛍光強度(Ex.515nm,Em.553nm)を測定した。
【００３１】
▲４▼過酸化脂質産生反応の抑制率の求め方
過酸化脂質産生反応の抑制率は、過酸化脂質の産生が微生物菌体の添加によってどの程度抑制されたかをパーセントで表した。計算式を以下に示す。
【００３２】
過酸化脂質産生抑制率（％）＝（Ｃ−Ｔ）／（Ｃ−Ｂ）×１００
〔式中、Ｃは微生物菌体無添加で反応したときの過酸化脂質量（塩化第一鉄添加）、Ｔは微生物菌体を加えて反応したときの過酸化脂質量（塩化第一鉄添加）、Ｂは塩化第一鉄無添加時の過酸化脂質量をそれぞれ示す。〕
【００３３】
反応液中の菌体濃度を変えて過酸化脂質産生抑制率を測定し、抑制率が５０％となったときの菌体濃度を求めＩＣ₅₀(CFU/mL)として表した。ＩＣ₅₀が低いものほど低濃度で作用を発揮し、活性が強いことを示す。なお、菌体濃度は、菌液を塗沫した変法ＧＡＭ寒天培地（日水製薬（株）製）を３７℃で２日間培養し、生じたコロニー数から算出した。
【００３４】
（２）試験結果
表１に示したとおり、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＹＩＴ ４００７ならびにストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ ２００１はそれぞれ２．０×１０⁸CFU/mL及び１．２×１０⁸CFU/mLの菌体濃度で、過酸化脂質の産生を５０％抑制した。これに対して、同じ乳酸菌の一種であるラクトコッカス・ラクティスＡＴＣＣ １９４３５、ラクトバチルス・ブヒネリＹＩＴ ００７７、ラクトバチルス・アシドフィスルＹＩＴ ００７０においては、同等の活性を示すためには約１０倍に当たる１０⁹CFU/mL以上の菌体濃度を必要とした。
【００３５】
【表１】

【００３６】
以上の結果から、各種微生物が鉄イオンによって惹起される過酸化脂質産生を抑制する作用は、菌株間で大きく異なり、本発明微生物の活性は他の微生物に比べてはるかに優れていた。また、ビフィドバクテリウム属よりもストレプトコッカス属、特にストレプトコッカス・サーモフィルスが優れていた。
【００３７】
実施例３ 生体膜の酸化傷害に対する作用（加熱処理菌体）
実施例１で調製した微生物菌体を１０５℃１５分間オートクレーブ処理し、加熱処理菌体を調製した。加熱処理菌体の過酸化脂質産生抑制活性を実施例２と同様の方法で測定し、加熱処理前の生菌体の活性と比較した。結果を表２に示す。
【００３８】
【表２】

【００３９】
表２に示したとおり、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＹＩＴ ４００７及びストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ ２００１の加熱処理菌体は生菌体の８０％以上の過酸化脂質産生抑制活性を保持した。
従って、これらの微生物を用いて医薬組成物又は飲食品を製造する場合、必ずしも菌体を生存せしめておかなければならないわけではなく、より幅広い加工手段を用いて飲食品を製造することができる。
【００４０】
実施例４ 遊離鉄イオン濃度に与える影響
鉄イオンの添加により惹起される過酸化脂質の産生を５０％抑制する濃度の微生物菌体又はコーン由来フィチン酸ナトリウム（シグマ社製）を含む反応液（０．１Ｍ ＡＤＡ緩衝液（pH6.8）、３５ｍＭ メタ重亜硫酸ナトリウム、４８μＭ 塩化第一鉄）を３７℃で１時間反応した後１２０００rpmで１０分間遠心分離して上清を回収した。この上清１mLに２２mMの２−ニトロソ−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）フェノールを２５μL添加し、室温で１５分間静置した後、７５０nmの吸光度を測定することにより溶液中の遊離鉄イオンを測定した。結果を表３示す。
【００４１】
【表３】

【００４２】
表３に示したとおり、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＹＩＴ ４００７及びストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ ２００１は過酸化脂質の産生を５０％抑制する菌体濃度（それぞれ２．０×１０⁸CFU/mL及び１．２×１０⁸CFU/mL）においても遊離鉄イオン濃度には全く影響を与えなかった。一方、フィチン酸ナトリウムはこれらの微生物菌体と同等の活性を示す濃度において鉄キレート作用により遊離鉄イオン濃度を約３０％低下させた。
以上の結果から、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＹＩＴ ４００７及びストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ ２００１には鉄イオンの微生物菌体内への取り込み（又は吸着）作用や鉄キレート作用がないことが判明した。従って、本発明微生物は、フィチン酸とは異なり、鉄イオンの吸収を阻害せずに活性酸素の産生による腸管粘膜傷害のみを抑制することができる。
【００４３】
実施例５ 結腸粘膜傷害に対する作用
（１）試験方法
▲１▼試験飼料
表４に示す組成の試験飼料（飼料Ａ：ＡＩＮ−７６（アメリカ国立栄養研究所の推奨組成）、飼料Ｂ：飼料Ａにフマル酸鉄を０．２％添加した飼料（鉄含量０．０７％））を用意し、飼料Ｂを７週齢のＢＡＬＢ／ｃ雄マウス（日本クレア製）に２週間投与することにより、図２に示したように結腸粘膜の過酸化脂質含量が約３倍に増加した。
【００４４】
【表４】

【００４５】
▲２▼動物及び飼育方法
６週齢のＢＡＬＢ／ｃ雄マウス（日本クレア製）を１週間馴化飼育した後、１群８匹ずつに群分けした。試験群には生理食塩水に懸濁したビフィドバクテリウム・ビフィダムＹＩＴ ４００７の生菌体（１０⁹CFU/日/匹）を胃ゾンデを用いて３週間連日投与した。対照群には生理食塩水を投与した。最初の１週間は飼料Ａを、次の２週間は飼料Ｂを与えた。なお、飼料及び水は試験期間を通じて自由摂取とした。
【００４６】
▲３▼結腸粘膜の過酸化脂質含量の測定
試験開始３週間後にペントバルビタール麻酔下で解剖し、結腸粘膜を採取した。結腸粘膜は生理食塩水で洗浄後、湿重量の１０倍量の１．１５％ＫＣｌ溶液を加え、氷水しながらテフロンホモジナイザーで均質化した。この結腸粘膜ホモジネート０．１mLをねじ口試験管に分取し、実施例２と同様の方法でＴＢＡＲＳを測定した。ＴＢＡＲＳ値は組織蛋白質量あたりのマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）相当量として表した。なお、蛋白質含量はＢＣＡプロテイン・アッセイ・キット（ピアス社製）を用いて測定した。
【００４７】
（２）試験結果
表５に示したように、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＹＩＴ ４００７投与群の結腸粘膜の過酸化脂質含量は対照群に比べ約２０％低値を示した。なお、飼育期間中、両群間の体重には有意な差は認められなかった。
【００４８】
【表５】

【００４９】
以上の結果より、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＹＩＴ ４００７は鉄イオンにより惹起される腸管粘膜の酸化傷害を低減する作用を有していた。
【００５０】
実施例６ 結腸粘膜傷害に対する作用（混餌投与（１））
（１）試験方法
▲１▼試験飼料および群設定
試験群は、ＡＩＮ−７６組成の飼料に鉄を０．０７％負荷した対照群、対照群の飼料にビフィドバクテリウム・ビフィダムＹＩＴ ４００７の凍結乾燥菌体を０．４％又は２．０％添加したビフィドバクテリウム・ビフィダムＹＩＴ ４００７投与群（Ｂ０．４％群及びＢ２．０％群）、鉄を負荷しない普通食群（鉄含量０．００３５％、菌体も含有しない）の４群で、各群１２匹とした。飼料組成を表６に示した。
【００５１】
【表６】

【００５２】
▲２▼動物および飼育方法
６週齢のＢＡＬＢ／ｃ雄マウス（日本クレア製）を１週間馴化飼育（ＭＦ飼料自由摂取）した後、被験飼料を投与した。被験飼料の投与開始時に群間に体重差がないように各個体を各群に振り分けた。被験飼料の投与期間は２週間で飼料、飲料水とも自由摂取とした。飼育環境は、明暗１２時間サイクル、室温２５℃、湿度５５％である。
【００５３】
▲３▼結腸粘膜の過酸化脂質含量の測定
試験開始２週間後にペントバルビタール麻酔下で解剖し、結腸粘膜を採取した。結腸粘膜は生理食塩水で洗浄後、湿重量の１０倍量の１．１５％ＫＣｌ溶液を加え、氷冷しながらテフロンホモジナイザーで均質化した。この結腸粘膜ホモジネート０．１mLをねじ口試験管に分取し、実施例２と同様の方法でＴＢＡＲＳを測定した。ＴＢＡＲＳ値は組織蛋白質量あたりのマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）相当量として表した。なお、蛋白質含量はＢＣＡプロテイン・アッセイ・キット（ピアス社製）を用いて測定した。
【００５４】
▲４▼統計解析
一元配置分散分析を行い、有意差が認められた場合にはチューキー（Tukey）の多重比較を行った。有意水準は５％とした。
【００５５】
（２）試験結果
鉄イオンにより惹起される結腸粘膜の酸化傷害に対してビフィドデクテリウム・ビフィダムＹＩＴ ４００７混餌投与が与える影響を図３に示した。ビフィドバクテリウム・ビフィダムＹＩＴ ４００７菌体の添加量０．４％及び２．０％のいずれの群においても、結腸粘膜の過酸化脂質含量は対照群に比べ有意に低下した。
なお、飼育期間中、４群間の体重に有意な差は認められなかった。
以上の結果より、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＹＩＴ ４００７は鉄イオンにより惹起される腸管粘膜の酸化傷害を低減する作用を有していた。
【００５６】
実施例７ 結腸粘膜傷害に対する作用（混餌投与（２））
（１）試験方法
▲１▼試験飼料および群設定
試験群はＡＩＮ−７６組成の飼料に鉄を０．０７％負荷した対照群、対照群の飼料にストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ ２００１の凍結乾燥菌体を０．１％、０．４％または２．０％添加したストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ ２００１投与群（Ｓ ０．１％群、Ｓ ０．４％群、Ｓ ２．０％群）、鉄を負荷しない普通食群（鉄含量０．００３５％、菌体も含有しない）の５群で、各群１２匹とした。なお、普通食群以外の各飼料には、菌体の凍結乾燥の保護剤に用いた脱脂粉乳が飼料重量の２％ずつ含有されている。飼料組成を表７に示した。
【００５７】
【表７】

【００５８】
▲２▼動物及び飼育方法
６週齢のＢＡＬＢ／ｃ雄マウス（日本クレア製）を１週間馴化飼育（ＭＦ飼料自由摂取）した後、被験飼料を投与した。被験飼料の投与開始時に群間に体重差がないように各個体を各群に振り分けた。被験飼料の投与期間は２週間で飼料、飲料水とも自由摂取とした。飼育環境は、明暗１２時間サイクル、室温２５℃、湿度５５％である。
【００５９】
▲３▼結腸粘膜の過酸化脂質含量の測定
試験開始２週間後にペントバルビタール麻酔下で解剖し、結腸粘膜を採取した。結腸粘膜は生理食塩水で洗浄後、湿重量の１０倍量の１．１５％ＫＣｌ溶液を加え、氷冷しながらテフロンホモジナイザーで均質化した。この結腸粘膜ホモジネート０．１ｍＬをねじ口試験管に分取し、実施例２と同様の方法でＴＢＡＲＳを測定した。ＴＢＡＲＳ値は組織蛋白質量あたりのマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）相当量として表した。なお、蛋白質含量はＢＣＡプロテイン・アッセイ・キット（ピアス社製）を用いて測定した。
【００６０】
▲４▼統計解析
一元配置分散分析を行い、有意差が認められた場合にはチューキー（Ｔｕｋｅｙ）の多重比較を行った。有意水準は５％とした。
（２）試験結果
鉄イオンにより惹起される結腸粘膜の酸化傷害に対してストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ ２００１混餌投与が与える影響を図４に示した。ストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ ２００１菌体の添加量０．４％および２．０％の両群において、結腸粘膜の過酸化脂質含量は対照群に比べて有意に低下し、低下の程度は菌体の投与量に依存的であった。
なお、飼育期間中、群間の体重に有意な差は認められなかった。
以上の結果より、ストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ ２００１は鉄イオンにより惹起される腸管粘膜の酸化傷害を低減する作用を有していた。
【００６１】
実施例８ 飲食品の製造
本発明の微生物を使用し、各種食用組成物を製造した。以下にその処方例を示す。
【００６２】
（１）発酵乳
１０％の脱脂粉乳を滅菌し、本発明の微生物（ビフィドバクテリウム・ビフィダムＹＩＴ ４００７又はストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ ２００１）を２％接種して、３５℃で２４時間培養し、発酵乳を製造した。
【００６３】
（２）果汁飲料
本発明の微生物（ビフィドバクテリウム・ビフィダムＹＩＴ ４００７又はストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ ２００１）を用い、表８の組成により果汁飲料を製造した。
【００６４】
【表８】

【００６５】
（３）健康向け飲料
本発明の微生物（ビフィドバクテリウム・ビフィダムＹＩＴ ４００７又はストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ ２００１）を用い、表９の組成により健康向け飲料を製造した。
【００６６】
【表９】

【００６７】
（４）健康向け食品（錠剤）
本発明の微生物（ビフィドバクテリウム・ビフィダムＹＩＴ ４００７又はストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ ２００１）を用い、表１０の添加物を含有する組成物を打錠し、錠剤とした。
【００６８】
【表１０】

【００６９】
（５）発酵乳飲料の製造
（発酵乳）
水８０重量部に脱脂粉乳２０重量部を溶解し１２０℃で３秒間殺菌した後、ストレプトコッカス・サーモフィルズＹＩＴ ２００１株を２％、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＹＩＴ ４００７株を１．０％接種し２４時間培養した。これを均質化機で１５ＭＰａで均質化し発酵乳とした。
【００７０】
（シロップ液）
表１１に示す各種成分を５０℃の温水に溶解し、１２０℃で３秒間殺菌してシロップ液を調製した。
【００７１】
【表１１】

【００７２】
発酵乳４０重量部とシロップ液６０重量部を混合した後ポリスチレン容器に充填、密封し、発酵乳製品とした。この発酵乳製品を官能評価したところ、良好な風味を有しており、また、１０℃で１週間静置保存した後でも高い安定性を維持していた。
【００７３】
（６）タブレットの製造
表１２に示す処方に従い、各種成分を混合、打錠してタブレットを製造した。
【００７４】
【表１２】

【００７５】
得られたタブレットは良好な風味を有していた。
【００７６】
【発明の効果】
本発明の脂質過酸化抑制剤は、生体内の脂質過酸化、特に鉄イオンにより惹起される脂質過酸化反応を抑制し、腸粘膜等に対する酸化的負荷を低減することから潰瘍性大腸炎、大腸ガン等の腸粘膜傷害や老化等の予防又は治療剤として有用である。また鉄イオンの体内への吸収性を阻害することなく腸管粘膜傷害を抑制でき、且つ安全も高いことから、妊婦や小児についても安心して使用できることは勿論のこと、鉄補給食品や鉄製剤が常用されている今日において、腸疾患や老化を予防・改善し健康増進を図る手段として時代に適合した商品の形態となり得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は腸管粘膜におけるヒドロキシラジカルの産生経路を示した図である。
図中、HO・はヒドロキシラジカル、O₂ ^-・はスーパーオキシドアニオンラジカルをそれぞれ示す。
【図２】図２は、飼料Ａ又は飼料Ｂ（フマル酸鉄添加）を２週間投与した後の結腸粘膜の過酸化脂質含量を示した図である。
【図３】図３は、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＹＩＴ ４００７を混餌投与した場合の結腸粘膜の過酸化脂質含量を示した図である。
【図４】図４は、ストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ ２００１を混餌投与した場合の結腸粘膜の過酸化脂質含量を示した図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a lipid peroxidation inhibitor useful as a food or drink or a pharmaceutical for the purpose of preventing or improving intestinal mucosal injury.
[0002]
[Prior art]
Lipids in the body are peroxidized by active oxygen such as hydroxy radicals, peroxy radicals, hydroperoxy radicals, and cause injuries such as inflammation, cancer, and aging. It is known that a divalent iron ion acts as a catalyst in the reaction for generating such active oxygen as in the following formulas (1) to (5).
[0003]
[Chemical 1]

[0004]
(Where HO^・Is hydroxy radical, LOOH is lipid peroxide, LO is alkoxy anion, LOO^・Is a peroxy radical, HOO^・Is a hydroperoxy radical, O₂ ^-・Represents a superoxide anion radical. ]
[0005]
On the other hand, there are iron ion oxidases such as ferroxidase and iron-binding proteins such as transferrin and ferritin in the living body, and there is a mechanism for stabilizing iron ions and suppressing their reactivity.
However, there is no such inactivation mechanism of iron ions in the intestinal lumen, and there is always an environment in which highly reactive divalent iron ions are likely to be generated, creating a unique environment that is constantly exposed to oxidative loads. Presents. That is, in the intestinal tract, oxygen supplied to the intestinal mucosa by blood flow is reduced by divalent iron ions to become superoxide anion radicals, and superoxide anion radicals are also produced from intestinal bacteria. It is thought that radicals are converted to hydrogen peroxide by the disproportionation reaction, which further reacts with iron ions on the surface of the intestinal mucosa to generate hydroxy radicals, leading to lipid peroxidation (see FIG. 1, CFBabbs). 1990, Free Rad. Biol. Med., 12, 161-168), where divalent iron ions are involved.
[0006]
Therefore, in order to prevent peroxidation of lipids in the intestinal mucosal tissue, it is an issue to control the free radical generation mechanism involving iron ions. For example, wheat bran or rice bran containing phytic acid that chelates iron ions is used. Active administration is also conceivable.
However, iron is one of the minerals that are often deficient in infants, adolescents, and women of fertile age, and iron deficiency is associated with the birth and weekly birth of low-weight and premature babies in pregnant women. Cause increased mortality during childhood, causing injury to mental activity and cognitive activity in infants and children, and reduced work ability in adults. Therefore, it is indispensable for iron deficient people to actively supplement iron with various foods and beverages and pharmaceuticals containing iron ions, and take substances that inhibit the absorption of iron ions, such as phytic acid. That is not preferable.
[0007]
On the other hand, vitamin E, which is an antioxidant, and its derivatives are used as substances that prevent the formation of lipid peroxides, but these are difficult to dissolve in water, so when used in foods and drinks with high water content, processing characteristics There was a problem in terms of stability.
Furthermore, although it has been reported that bacteria belonging to the genus Lactobacillus exhibit an action of suppressing oxidative damage to the liver and erythrocytes (JP-A-4-264034), the effect of inhibiting lipid peroxidation in the digestive tract is sufficient. I can't say that.
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention provides a food or drink or a pharmaceutical product that can suppress the generation of lipid peroxide without affecting the absorption of iron ions in the intestinal tract and has the effect of preventing or improving intestinal mucosal injury associated with lipid peroxidation. With the goal.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
The inventors of the present invention have studied various substances that suppress the production of lipid peroxide, and the cells of the specific microorganism or its constituent components can inhibit the production of lipid peroxide without affecting free iron ions. It discovered that it could utilize as food-drinks or a pharmaceutical, and completed this invention.
[0010]
That is, this invention provides the lipid peroxidation inhibitor which uses the microbial cell of the microorganisms which belong to Bifidobacterium genus or Streptococcus genus, or a microbial cell component as an active ingredient.
[0011]
The present invention also provides a prophylactic / therapeutic agent for intestinal mucosal injury containing the lipid peroxidation inhibitor.
[0012]
Furthermore, this invention provides the food-drinks containing the said lipid peroxidation inhibitor.
[0013]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The lipid peroxidation inhibitor of the present invention controls in vivo lipid peroxidation caused by free radicals such as active oxygen, particularly the peroxidation induced by iron ions, and suppresses the formation of lipid peroxide. Say things.
[0014]
The microorganisms belonging to the genus Bifidobacterium used in the present invention include, for example, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium adrecentis (Bifidobacterium adolescentis), Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium bifidum, etc. Among them, Bifidobacterium bifidum is more preferred, especially biotechnology industry technology Bifidobacterium bifidum YIT 4007 deposited as Research Institute No. 791 (FERM BP-791) is preferred.
[0015]
Examples of the microorganism belonging to the genus Streptococcus include Streptococcus thermophilus, Streptococcus salivarius, Streptococcus mitis, and preferably Streptococcus thermophile, In particular, Streptococcus thermophilus YIT 2001 deposited as Biotechnological Institute of Biotechnology No. 11891 (FERM P-11891) and 18189 (FERM P-18189) is preferred.
All of these microorganisms have been eaten since ancient times as fermented milk and viable bacterial preparations, and are safe microorganisms even when ingested at all times.
[0016]
The microbial cells in the present invention may be the microbial cells of the above microorganisms as they are or using crushed cells, for example, freeze-dried microbial cells, dead cells subjected to heat treatment, or crushed materials thereof. Processed bacterial cells can also be used.
Such a microbial cell can be obtained by culturing a microorganism belonging to the genus Bifidobacterium or Streptococcus in a complex medium or milk containing polypepetone or yeast extract.
[0017]
Examples of bacterial cell constituents include, for example, a fraction obtained by extracting bacterial cells or disrupted bacterial cells with water or other solvents, or a fraction obtained by enzyme treatment such as cell wall lytic enzyme, nucleolytic enzyme, or proteolytic enzyme, The water-soluble fraction obtained by hot water extraction, the protoplast fraction from which the cell wall portion was removed by the cell wall lytic enzyme treatment, the cell wall lytic enzyme soluble fraction of the microbial cell, and the microbial cell or the protoplast A cell membrane fraction obtained by treatment with an organic solvent can be mentioned.
These bacterial cell components can be obtained by methods that are generally widely used.
[0018]
Among bacterial cells or bacterial cell constituents, bacterial cells or disrupted cells, fractions containing cell membrane components, the protoplast fraction or the cell membrane fraction obtained by treating bacterial cells or protoplasts with an organic solvent has an effect of inhibiting lipid peroxidation. It is particularly preferable because it is high.
[0019]
The bacterial cells thus obtained or their bacterial constituents significantly suppress the lipid peroxidation induced by the iron ions without affecting the iron ions as shown in the examples described later. Can be used with confidence even for pregnant women and children who are concerned. In addition, since the microorganism is safe even when ingested at all times, it can be used as a medicine for the prevention or treatment of intestinal mucosal injury or aging associated with lipid peroxidation, and ingested daily as a food or drink. Intestinal mucosal disease and aging can be prevented while supplementing with iron ions. In consideration of suppression of iron absorption, it is preferable that the bacterial cell or the bacterial cell component used has a decrease rate of free iron ion concentration in the intestinal tract of less than 10%, particularly less than 5%.
[0020]
The lipid peroxidation inhibitor of the present invention can be made into pharmaceutical compositions of various dosage forms together with a pharmaceutically acceptable carrier according to a conventional method. For example, the above microbial cells or microbial components include lactose, sucrose, sodium chloride, glucose, urea, starch, calcium carbonate, kaolin, crystalline cellulose, silicic acid and other excipients, water, ethanol, propanol, glucose solution, starch Liquids, gelatin solutions, binders such as carboxymethylcellulose, methylcellulose, potassium phosphate, polyvinylpyrrolidone, sodium alginate, agar powder, sodium bicarbonate, calcium carbonate, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, disintegrants such as sodium lauryl sulfate, A moisturizer such as glycerin and starch, a lubricant such as purified talc, stearate and polyethylene glycol can be added, and granules, tablets, capsules and the like can be produced by conventional methods. Further, the tablets can be made into tablets with ordinary coatings as necessary, for example, sugar-coated tablets, gelatin-encapsulated tablets, enteric-coated tablets, film-coated tablets, double tablets, and multilayer tablets.
[0021]
Moreover, it can utilize as food-drinks by adding a microbial cell or a microbial cell component directly to a foodstuff, or manufacturing fermented foods, such as fermented milk, using the said strain. Preferred examples of the food and drink include fermented milk, dairy lactic acid bacteria beverages, fruit juice beverages, soups, rice crackers, cookies and the like. In particular, it is preferable to add a bacterial cell or a bacterial cell component to the iron-reinforced food / beverage product fortified with iron in the food / beverage product, so that peroxidation of lipids and the like can be suppressed without impeding iron absorption. Moreover, as a form of food / beverage products, fermented milk which is easy to drink continuously and has a high lipid peroxide suppressing effect is particularly preferable. The food and drink includes animal feed.
[0022]
Such foods and drinks can be used in combination with various materials usually used as food. Specifically, sugars such as glucose, sucrose, fructose, honey, sugar alcohols such as sorbitol, xylitol, erythritol, lactitol, and palatinit, emulsifiers such as sucrose fatty acid ester, polyglycerin fatty acid ester, lecithin, pectin, carboxymethylcellulose And stabilizers such as water-soluble soybean polysaccharide, gellan gum, gum arabic, xanthan gum, carrageenan, guar gum and the like. In addition, various vitamins such as vitamin A, vitamin B, vitamin C, vitamin E, etc., minerals such as calcium lactate, calcium gluconate, calcium pantothenate, various magnesium, zinc compounds, herbal extracts, etc. It is also possible.
[0023]
The amount of microbial cells or cell components to be incorporated in the above various preparations or foods and beverages cannot be determined unconditionally because it varies depending on the strain used, the patient's symptoms, age, weight, etc. 10 live bacteria per day for adults⁹-10¹⁴The colony forming unit (CFU) and dry cells are about 0.01 to 30 g, preferably about 0.1 to 5 g.
[0024]
In addition, it is desirable to determine the amount of the fungus body or the constituent component of the fungus body so as to satisfy the above-mentioned daily intake even when blended with a food or drink or pharmaceutical composition fortified with iron. In this case, the amount of iron blended varies depending on the patient's symptoms in the case of foods and drinks for the purpose of preventing iron deficiency. Is usually preferably 5 to 200 mg.
[0025]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples.
[0026]
Example 1 Production of microbial cells
1% inoculated into a modified GAM bouillon medium (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) supplemented with 1% lactose of the cryopreserved strain, followed by stationary culture at 37 ° C. for 24 hours. 10 mL of this culture solution was transplanted to 1 L of a modified GAM bouillon medium supplemented with 2% of lactose and cultured at 37 ° C. for 24 hours. The microbial cells of the genus Bifidobacterium were anaerobically cultured in the presence of Aneropac Kenki (oxygen absorption / carbon dioxide generator, manufactured by Mitsubishi Gas Chemical Co., Ltd.).
After completion of the culture, the cells were collected by centrifugation at 4000 rpm for 10 minutes and washed twice with physiological saline to obtain microbial cells (live cells). The cell yield after lyophilization was 1.3 g for Bifidobacterium bifidum YIT 4007 and 1.0 g for Streptococcus thermophilus YIT 2001.
[0027]
Example 2 Effect on biological membrane oxidative damage
As a system for evaluating lipid peroxidation in the intestinal mucosa, a reaction system that uses a phospholipid liposome, which is a model of a biological membrane, as a reaction substrate and initiates the peroxidation reaction by adding divalent iron ions to it. . This reaction system reproduces the reaction scheme in which hydrogen peroxide and divalent iron ions approach the epithelial cells of the intestinal tract from the luminal side and cause oxidative damage to the biological membrane (FIG. 1). Note that the production of hydrogen peroxide depends on the reduction of oxygen molecules by divalent iron and the disproportionation reaction of superskiside radicals as in the intestinal mucosa.
By measuring the inhibition rate of oxidative damage (lipid peroxide production) of biological membranes in this reaction system, the effect of preventing and treating intestinal mucosal damage of various bacterial cells was evaluated.
[0028]
(1) Test method
(1) Preparation method of liposome solution
100 mg of egg yolk-derived L-α-phosphatidylcholine (Type XV-E; manufactured by Sigma) was dissolved in 10 mL of diethyl ether, 0.6 mL of distilled water was added, and diethyl ether was evaporated in an evaporator while sonicating. To this was added 30 mL of 0.1 M N- (2-acetamido) iminodiacetic acid (ADA) buffer (pH 6.7), followed by sonication for 15 minutes to obtain a suspension. This suspension was centrifuged at 1500 rpm for 5 minutes to remove the residue, and about 25 mL of liposome solution was prepared.
[0029]
(2) Lipid peroxide production reaction method
The microbial cells (live cells) shown in Table 1 are suspended in 0.1 M ADA buffer (pH 6.7) 4 times the wet weight, and further diluted stepwise with the same buffer to obtain different cell concentrations. (The final concentration in the reaction solution is 10⁷-10^TenCFU / mL) was prepared. This bacterial solution was added to 1.5 mL of liposome solution to prepare a total amount of 1.98 mL of a reaction solution. To this reaction solution, 0.1 mL of 0.1 mM ferrous chloride aqueous solution and 0.02 mL of 0.1 M sodium ascorbate aqueous solution were added and reacted at 37 ° C. for 2 hours. The reaction was terminated by cooling the reaction vessel with ice water, and the lipid peroxide concentration was measured immediately.
[0030]
(3) Measuring method of lipid peroxide production
Lipid peroxide was quantified as TBARS (thiobarbituric acid reactive substance).
The measurement procedure is shown below.
A solution prepared by mixing 80 mL of acetic acid and 320 mL of distilled water and adjusting the pH to 3.5 with 10N sodium hydroxide was used as a buffer for TBARS measurement. 0.1 mL of the reaction solution was dispensed into a screw test tube, 0.2 mL of 8.1% sodium dodecyl sulfate, 0.5 mL of TBARS measurement buffer solution, 0.05 mL of 0.8% butylhydroxytoluene acetic acid solution, 1.0 mL of 8% thiobarbituric acid solution, 0.7 mL of 5 mM ethylenediaminetetraacetic acid solution, and 1.5 mL of distilled water were sequentially mixed. The mixture was allowed to stand at 4 ° C. for 1 hour, then heated in a boiling water bath for 1 hour and cooled in ice water. To this was added 1.0 mL of distilled water and 5.0 mL of n-butanol / pyridine (15: 1) mixture, and TBARS was extracted into the n-butanol / pyricin layer, and the fluorescence intensity of the extract (Ex. 515 nm, Em. 553 nm). ) Was measured.
[0031]
(4) How to determine the inhibition rate of lipid peroxide production reaction
The inhibition rate of the lipid peroxide production reaction was expressed as a percentage of how much the production of lipid peroxide was inhibited by the addition of microbial cells. The calculation formula is shown below.
[0032]
Lipid peroxide production inhibition rate (%) = (C−T) / (C−B) × 100
[In the formula, C is the amount of lipid peroxide when reacted without addition of microbial cells (addition of ferrous chloride), T is the amount of lipid peroxide when reacted with addition of microbial cells (addition of ferrous chloride) ), B respectively indicate the amount of lipid peroxide when no ferrous chloride is added. ]
[0033]
Measure the lipid peroxide production inhibition rate by changing the bacterial cell concentration in the reaction solution, and determine the bacterial cell concentration when the inhibition rate is 50%.₅₀Expressed as (CFU / mL). IC₅₀The lower the value, the lower the concentration, and the stronger the activity. The bacterial cell concentration was calculated from the number of colonies produced by culturing a modified GAM agar medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) coated with a bacterial solution at 37 ° C. for 2 days.
[0034]
(2) Test results
As shown in Table 1, Bifidobacterium bifidum YIT 4007 and Streptococcus thermophilus YIT 2001 are each 2.0 × 10⁸CFU / mL and 1.2 × 10⁸Production of lipid peroxide was suppressed by 50% at a cell concentration of CFU / mL. On the other hand, Lactococcus lactis ATCC 19435, Lactobacillus buchnerii YIT 0077, and Lactobacillus acidfisul YIT 0070, which are one of the same lactic acid bacteria, are equivalent to about 10 times in order to show equivalent activity.⁹A cell concentration of CFU / mL or higher was required.
[0035]
[Table 1]

[0036]
From the above results, the action of various microorganisms to suppress the production of lipid peroxide induced by iron ions is greatly different among strains, and the activity of the microorganism of the present invention is far superior to other microorganisms. In addition, Streptococcus, particularly Streptococcus thermophilus, was superior to Bifidobacterium.
[0037]
Example 3 Effect on biological membrane oxidative damage (heat-treated cells)
The microbial cells prepared in Example 1 were autoclaved at 105 ° C. for 15 minutes to prepare heat-treated cells. The lipid peroxide production inhibitory activity of the heat-treated cells was measured by the same method as in Example 2 and compared with the activity of the live cells before the heat treatment. The results are shown in Table 2.
[0038]
[Table 2]

[0039]
As shown in Table 2, the heat-treated cells of Bifidobacterium bifidum YIT 4007 and Streptococcus thermophilus YIT 2001 retained 80% or more lipid peroxide production inhibitory activity of viable cells.
Therefore, when producing a pharmaceutical composition or a food or drink using these microorganisms, it is not always necessary to keep the cells alive, and a food or drink can be produced using a wider range of processing means.
[0040]
Example 4 Influence on Free Iron Ion Concentration
Reaction solution containing 0.1% ADA buffer (pH 6.8) containing microbial cells or corn-derived sodium phytate (manufactured by Sigma) at a concentration that suppresses the production of lipid peroxide induced by addition of iron ions by 50% , 35 mM sodium metabisulfite, 48 μM ferrous chloride) was reacted at 37 ° C. for 1 hour, and then centrifuged at 12000 rpm for 10 minutes to recover the supernatant. 25 mL of 22 mM 2-nitroso-5- (N-propyl-N-sulfopropylamino) phenol was added to 1 mL of this supernatant, allowed to stand at room temperature for 15 minutes, and then the absorbance at 750 nm was measured. Free iron ions were measured. The results are shown in Table 3.
[0041]
[Table 3]

[0042]
As shown in Table 3, Bifidobacterium bifidum YIT 4007 and Streptococcus thermophilus YIT 2001 are cell concentrations that inhibit lipid peroxide production by 50% (each 2.0 × 10 5⁸CFU / mL and 1.2 × 10⁸CFU / mL) did not affect the free iron ion concentration at all. On the other hand, sodium phytate reduced the free iron ion concentration by about 30% by the iron chelate action at a concentration showing the same activity as these microbial cells.
From the above results, it was found that Bifidobacterium bifidum YIT 4007 and Streptococcus thermophilus YIT 2001 do not have an action of taking up (or adsorbing) iron ions into microbial cells or an iron chelating action. Therefore, unlike phytic acid, the microorganism of the present invention can suppress only intestinal mucosal injury caused by the production of active oxygen without inhibiting the absorption of iron ions.
[0043]
Example 5 Effect on colonic mucosal injury
(1) Test method
(1) Test feed
Test feed with composition shown in Table 4 (Feed A: AIN-76 (recommended composition of the National Institute of Nutrition), Feed B: Feed with 0.2% iron fumarate added to Feed A (Fe content 0.07%) )), And diet B is administered to 7-week-old BALB / c male mice (CLEA Japan) for 2 weeks, so that the lipid peroxide content of the colonic mucosa is approximately tripled as shown in FIG. Increased.
[0044]
[Table 4]

[0045]
(2) Animals and breeding methods
6-week-old BALB / c male mice (manufactured by CLEA Japan, Inc.) were acclimated for 1 week and then divided into 8 groups per group. The test group included Bifidobacterium bifidum YIT 4007 viable cells suspended in physiological saline (10⁹CFU / day / animal) was administered daily for 3 weeks using a stomach tube. Saline was administered to the control group. Feed A was given for the first week and feed B was given for the next two weeks. Feed and water were freely consumed throughout the test period.
[0046]
(3) Measurement of lipid peroxide content in colonic mucosa
Three weeks after the start of the test, dissection was performed under pentobarbital anesthesia, and the colonic mucosa was collected. The colonic mucosa was washed with physiological saline, 10 times wet weight of a 1.15% KCl solution was added, and homogenized with a Teflon homogenizer with ice water. 0.1 mL of this colonic mucosa homogenate was dispensed into a screw-cap test tube, and TBARS was measured in the same manner as in Example 2. TBARS values were expressed as malondialdehyde (MDA) equivalents per tissue protein mass. The protein content was measured using a BCA protein assay kit (Pierce).
[0047]
(2) Test results
As shown in Table 5, the lipid peroxide content in the colonic mucosa of the Bifidobacterium bifidum YIT 4007 administration group was about 20% lower than that of the control group. During the breeding period, there was no significant difference in body weight between the two groups.
[0048]
[Table 5]

[0049]
From the above results, Bifidobacterium bifidum YIT 4007 had an action of reducing intestinal mucosa oxidative damage caused by iron ions.
[0050]
Example 6 Action against colonic mucosa injury (mixed administration (1))
(1) Test method
(1) Test feed and group setting
The test group was a control group in which 0.07% of iron was loaded on the AIN-76 composition feed, and the Bifidobacterium bifidum YIT 4007 freeze-dried cells were 0.4% or 2.0% in the control group feed. 4 groups of Bifidobacterium bifidum YIT 4007 administration group (B 0.4% group and B 2.0% group) added, normal diet group not loading iron (0.0035% iron content, no cells) Thus, there were 12 animals in each group. The feed composition is shown in Table 6.
[0051]
[Table 6]

[0052]
(2) Animals and rearing methods
A 6-week-old BALB / c male mouse (manufactured by CLEA Japan, Inc.) was acclimated for 1 week (free feeding of MF feed), and then the test diet was administered. Each individual was assigned to each group so that there was no weight difference between the groups at the start of administration of the test feed. The administration period of the test feed was 2 weeks, and both feed and drinking water were freely consumed. The breeding environment is a 12 hour light / dark cycle, a room temperature of 25 ° C., and a humidity of 55%.
[0053]
(3) Measurement of lipid peroxide content in colonic mucosa
Two weeks after the start of the test, dissection was performed under pentobarbital anesthesia, and the colonic mucosa was collected. The colonic mucosa was washed with physiological saline, added with a 1.15% KCl solution of 10 times the wet weight, and homogenized with a Teflon homogenizer while cooling with ice. 0.1 mL of this colonic mucosa homogenate was dispensed into a screw-cap test tube, and TBARS was measured in the same manner as in Example 2. TBARS values were expressed as malondialdehyde (MDA) equivalents per tissue protein mass. The protein content was measured using a BCA protein assay kit (Pierce).
[0054]
(4) Statistical analysis
A one-way analysis of variance was performed, and if a significant difference was observed, a Tukey multiple comparison was performed. The significance level was 5%.
[0055]
(2) Test results
FIG. 3 shows the effect of Bifidodecterium bifidum YIT 4007 mixed administration on oxidative damage of colonic mucosa induced by iron ions. The lipid peroxide content in the colonic mucosa was significantly lower than that in the control group in both groups of 0.4% and 2.0% of the Bifidobacterium bifidum YIT 4007 added.
During the breeding period, there was no significant difference in body weight between the four groups.
From the above results, Bifidobacterium bifidum YIT 4007 had an action of reducing intestinal mucosa oxidative damage caused by iron ions.
[0056]
Example 7 Action on colonic mucosal injury (mixed administration (2))
(1) Test method
(1) Test feed and group setting
The test group was a control group in which 0.07% iron was loaded on the AIN-76 composition feed, and the control group feed was 0.1%, 0.4%, or 2. Streptococcus thermophilus YIT 2001 lyophilized cells. Streptococcus thermophilus YIT 2001 administration group added with 0% (S 0.1% group, S 0.4% group, S 2.0% group), normal diet group without iron loading (iron content 0.0035%, 5 groups) (with no fungus), each group had 12 animals. In addition, each feed other than the normal food group contains skim milk powder used as a lyophilization protective agent for bacterial cells at 2% of the weight of the feed. The feed composition is shown in Table 7.
[0057]
[Table 7]

[0058]
(2) Animals and breeding methods
A 6-week-old BALB / c male mouse (manufactured by CLEA Japan, Inc.) was acclimated for 1 week (free feeding of MF feed), and then the test diet was administered. Each individual was assigned to each group so that there was no weight difference between the groups at the start of administration of the test feed. The administration period of the test feed was 2 weeks, and both feed and drinking water were freely consumed. The breeding environment is a 12 hour light / dark cycle, a room temperature of 25 ° C., and a humidity of 55%.
[0059]
(3) Measurement of lipid peroxide content in colonic mucosa
Two weeks after the start of the test, dissection was performed under pentobarbital anesthesia, and the colonic mucosa was collected. The colonic mucosa was washed with physiological saline, added with a 1.15% KCl solution of 10 times the wet weight, and homogenized with a Teflon homogenizer while cooling with ice. 0.1 mL of this colonic mucosa homogenate was dispensed into a screw test tube, and TBARS was measured in the same manner as in Example 2. TBARS values were expressed as malondialdehyde (MDA) equivalents per tissue protein mass. The protein content was measured using a BCA protein assay kit (Pierce).
[0060]
(4) Statistical analysis
A one-way analysis of variance was performed, and if a significant difference was observed, a Tukey multiple comparison was performed. The significance level was 5%.
(2) Test results
FIG. 4 shows the effect of Streptococcus thermophilus YIT 2001 mixed administration on the oxidative damage of colonic mucosa induced by iron ions. In both the 0.4% and 2.0% additions of Streptococcus thermophilus YIT 2001 cells, the lipid peroxide content in the colonic mucosa was significantly reduced compared to the control group, and the degree of decrease was It was dose dependent.
During the breeding period, there was no significant difference in body weight between groups.
From the above results, Streptococcus thermophilus YIT 2001 had an action of reducing intestinal mucosa oxidative damage caused by iron ions.
[0061]
Example 8 Manufacture of food and drink
Various edible compositions were produced using the microorganisms of the present invention. The prescription example is shown below.
[0062]
(1) Fermented milk
10% non-fat dry milk was sterilized, inoculated with 2% of the microorganism of the present invention (Bifidobacterium bifidum YIT 4007 or Streptococcus thermophilus YIT 2001) and cultured at 35 ° C. for 24 hours to produce fermented milk .
[0063]
(2) Fruit juice drink
Using the microorganisms of the present invention (Bifidobacterium bifidum YIT 4007 or Streptococcus thermophilus YIT 2001), fruit juice drinks were produced according to the compositions shown in Table 8.
[0064]
[Table 8]

[0065]
(3) Health drink
Using the microorganisms of the present invention (Bifidobacterium bifidum YIT 4007 or Streptococcus thermophilus YIT 2001), health drinks were produced according to the composition shown in Table 9.
[0066]
[Table 9]

[0067]
(4) Health food (tablets)
Using the microorganism of the present invention (Bifidobacterium bifidum YIT 4007 or Streptococcus thermophilus YIT 2001), the composition containing the additives shown in Table 10 was compressed into tablets.
[0068]
[Table 10]

[0069]
(5) Manufacture of fermented milk drinks
(Fermented milk)
After dissolving 20 parts by weight of skim milk in 80 parts by weight of water and sterilizing at 120 ° C. for 3 seconds, 2% of Streptococcus thermophilus YIT 2001 strain and 1.0% of Bifidobacterium bifidum YIT 4007 were inoculated. Incubate for hours. This was homogenized with a homogenizer at 15 MPa to obtain fermented milk.
[0070]
(Syrup solution)
Various components shown in Table 11 were dissolved in warm water at 50 ° C. and sterilized at 120 ° C. for 3 seconds to prepare a syrup solution.
[0071]
[Table 11]

[0072]
After mixing 40 parts by weight of fermented milk and 60 parts by weight of syrup, it was filled in a polystyrene container and sealed to obtain a fermented milk product. When this fermented dairy product was sensory-evaluated, it had a good flavor and maintained high stability even after standing at 10 ° C. for 1 week.
[0073]
(6) Manufacture of tablets
According to the formulation shown in Table 12, various components were mixed and tableted to produce tablets.
[0074]
[Table 12]

[0075]
The resulting tablet had a good flavor.
[0076]
【The invention's effect】
The lipid peroxidation inhibitor of the present invention suppresses lipid peroxidation in vivo, particularly lipid peroxidation caused by iron ions, and reduces oxidative load on the intestinal mucosa, etc. It is useful as a preventive or therapeutic agent for intestinal mucosal injury such as cancer and aging. Intestinal mucosa injury can be suppressed without inhibiting the absorption of iron ions in the body, and it is safe so that it can be used with confidence for pregnant women and children, as well as iron supplements and iron preparations. Today, it can be in the form of products suitable for the times as a means of preventing and improving bowel disease and aging to promote health.
[Brief description of the drawings]
BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS FIG. 1 is a diagram showing a hydroxyl radical production pathway in the intestinal mucosa.
In the figure, HO · is a hydroxy radical, O₂ ^--Represents a superoxide anion radical, respectively.
FIG. 2 is a graph showing the lipid peroxide content of colonic mucosa after administration of feed A or feed B (added with iron fumarate) for 2 weeks.
FIG. 3 is a graph showing the lipid peroxide content in the colonic mucosa when Bifidobacterium bifidum YIT 4007 is administered as a diet.
FIG. 4 is a graph showing the lipid peroxide content in the colonic mucosa when Streptococcus thermophilus YIT 2001 is administered as a diet.

Claims (3)

An agent for inhibiting lipid peroxidation of the intestinal mucosa, comprising as an active ingredient the cells of Streptococcus thermophilus YIT 2001 or the components of the cells. 1 Symbol placement of lipid peroxidation inhibitor claims are those caused by lipid peroxidation iron ions. A prophylactic / therapeutic agent for intestinal mucosal injury comprising the lipid peroxidation inhibitor according to claim 1 or 2 .

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