JP4620396B2 - Streptomyces microorganisms, refractory proteolytic protease, composition for refractory proteolysis, and method for decomposing refractory protein - Google Patents
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Description
本発明は、過塩素酸可溶性蛋白質（ＰＳＰ）、異常プリオン、ケラチン等の難分解性蛋白質を分解可能なプロテアーゼ産生能を有するストレプトミセス属微生物、該ストレプトミセス属微生物により生産され、前記難分解性蛋白質分解を分解可能な難分解性蛋白質分解プロテアーゼ及び難分解性蛋白質分解用組成物、並びに、これらを用いて前記難分解性蛋白質を分解する難分解性蛋白質の分解方法に関する。 The present invention relates to a microorganism belonging to the genus Streptomyces having a protease-producing ability capable of degrading a hardly-degradable protein such as perchloric acid-soluble protein (PSP), abnormal prion, and keratin, and the aforementioned hardly-degradable microorganism. The present invention relates to a hardly degradable proteolytic protease capable of degrading proteolysis, a hardly degradable protein degrading composition, and a method for degrading a hardly degradable protein using these to degrade the hardly degradable protein.
各種の蛋白質をペプチド乃至アミノ酸に分解する技術は、例えば、医薬品や食品等の製造業をはじめとする広い分野で利用されている。前記蛋白質を分解する方法としては、化学的分解方法と、酵素的分解方法とが知られている。
前記化学的分解方法は、塩酸等を用いて前記蛋白質を化学的に分解する方法であり、分解効率に優れてはいるものの、環境汚染や過酷な分解条件により、好ましくない副産物を生成する懸念がある。一方、前記酵素的分解方法は、土壌乃至生物性汚泥など単離した微生物が産生するプロテアーゼ等の酵素を用いて前記蛋白質を酵素分解する方法であり、前記化学的分解方法における前記懸念がないため、医薬品や食品等の製造分野などをはじめとして広く利用されている（特許文献１から２参照）。
Techniques for decomposing various proteins into peptides or amino acids are used in a wide range of fields including manufacturing industries such as pharmaceuticals and foods. As a method for degrading the protein, a chemical degradation method and an enzymatic degradation method are known.
The chemical degradation method is a method of chemically degrading the protein using hydrochloric acid or the like, and although it is excellent in degradation efficiency, there is a concern that undesired by-products may be generated due to environmental pollution or severe degradation conditions. is there. On the other hand, the enzymatic degradation method is a method of enzymatic degradation of the protein using an enzyme such as a protease produced by an isolated microorganism such as soil or biological sludge, and there is no concern about the chemical degradation method. Widely used in fields such as pharmaceuticals and food manufacturing (see Patent Documents 1 and 2).
ところが、前記蛋白質の中には、厨芥、排水、有機廃液、産業廃棄物などに含まれ、公知のプロテアーゼでは完全に分解することができない難分解性蛋白質が存在しており、該難分解性蛋白質としては、近時話題のＢＳＥ（狂牛病）の原因タンパク質である異常プリオンなどが知られている。また、該異常プリオン以外にも、該異常プリオンと類似の構造を持ち、動物から原核生物に至るまで保存され、環境中に広く存在し、本発明者らによって発見され、過塩素酸によって肝臓細胞質画分より抽出され、蛋白質合成阻害活性を有する過塩素酸可溶性蛋白質（以下「ＰＳＰ」と称することがある）なども知られている（非特許文献１から２参照）。 However, among the proteins, there are persistent proteins that are contained in straw, wastewater, organic waste liquids, industrial wastes and the like and cannot be completely degraded by known proteases. For example, an abnormal prion that is a causative protein of BSE (mad cow disease), which has recently been talked about, is known. In addition to the abnormal prion, it has a structure similar to that of the abnormal prion, is preserved from animals to prokaryotes, is widely present in the environment, has been discovered by the present inventors, and has been detected by the present inventors. A perchloric acid-soluble protein (hereinafter sometimes referred to as “PSP”) extracted from a fraction and having protein synthesis inhibitory activity is also known (see Non-Patent Documents 1 and 2).
そこで、前記異常プリオン等の難分解性蛋白質を酵素的に分解可能な各種の組成物が提案されてきている。例えば、中〜高温度以上の温度域での熱安定性と優れた蛋白質低分子化能力とを併せ持ち、難分解性蛋白質を効率よく分解可能なバチルス・ズブチリスに由来する酵素組成物（特許文献３参照）や、難分解性蛋白質の汚れ成分に対して優れた洗浄力を持つ、ピロコッカス属細菌に由来する超耐熱性プロテアーゼを含む蛋白質分解洗剤用組成物（特許文献４参照）などが知られている。
前記異常プリオン等の難分解性蛋白質を分解するには、これらの組成物以外に新規な組成物の提供が望まれており、各種の前記難分解性蛋白質を容易に効率良く、しかも完全に分解可能な酵素的分解方法に関する技術の開発が望まれているのが現状である。
Accordingly, various compositions have been proposed that can enzymatically degrade the hardly degradable proteins such as the abnormal prions. For example, an enzyme composition derived from Bacillus subtilis capable of efficiently degrading a hardly degradable protein, having both heat stability in a temperature range from medium to high temperature and excellent protein molecular weight reduction ability (Patent Document 3) And a composition for proteolytic detergents (see Patent Document 4) containing a super heat-resistant protease derived from Pyrococcus bacteria, which has an excellent detergency against soil components of persistent proteins. Yes.
In order to degrade the hardly degradable proteins such as abnormal prions, it is desired to provide novel compositions in addition to these compositions, and various kinds of the hardly degradable proteins can be easily and efficiently decomposed completely. Currently, it is desired to develop a technology for a possible enzymatic degradation method.
本発明は、従来における問題を解決し、前記要望に応え、厨芥、排水、有機廃液、産業廃棄物などに含まれる、過塩素酸可溶性蛋白質（ＰＳＰ）、異常プリオン、ケラチン等の難分解性蛋白質を効率良く分解可能なプロテアーゼ産生能を有するストレプトミセス属微生物、該ストレプトミセス属微生物により生産され、前記難分解性蛋白質分解を効率良く分解可能な難分解性蛋白質分解プロテアーゼ及び難分解性蛋白質分解用組成物、並びに、これらを用いて前記難分解性蛋白質を効率良く分解する難分解性蛋白質の分解方法を提供することを目的とする。 The present invention solves the conventional problems and responds to the above-mentioned demands, and includes hardly-degradable proteins such as perchloric acid-soluble protein (PSP), abnormal prion, keratin and the like contained in dredging, drainage, organic waste liquid, industrial waste, etc. Streptomyces microorganisms having the ability to produce proteases capable of efficiently degrading, and the hardly degradable proteases produced by the Streptomyces microorganisms and capable of efficiently degrading the hardly degradable proteolysis and It is an object of the present invention to provide a composition and a method for degrading a hardly degradable protein, which efficiently degrades the hardly degradable protein using them.
前記課題を解決するために本発明者らが鋭意検討した結果、土壌中からスクリーニングした新規なストレプトミセス属微生物が産生するプロテアーゼが難分解性蛋白質を分解可能であること見出した。本発明は、本発明者らによるかかる知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段は、以下の通りである。即ち、
＜１＞ プロテイナーゼＫを０．１ｗ／ｖ％、３０℃で１２０分間作用させた場合に溶解することがない難分解性蛋白質を分解可能なプロテアーゼの産生能を有することを特徴とするストレプトミセス属微生物である。
＜２＞ ストレプトミセス・エスピーである前記＜１＞に記載のストレプトミセス属微生物である。
＜３＞ ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９３３６）及びその誘導菌株である前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のストレプトミセス属微生物である。
＜４＞ 下記Ａ〜Ｃの菌学的性質を有する前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載のストレプトミセス属微生物である。
Ａ．形態的性質
（１）分枝した基生菌糸より、比較的長い波状の気菌糸を伸長し、稀にかぎ状あるいはループ状を呈する。
（２）成熟した胞子鎖は１０〜５０個の卵円形の胞子を連鎖し、胞子の大きさは約０.６〜０.７×０.８〜１.０μｍである。
（３）胞子の表面は平滑である。
（４）輪生枝、菌束糸、胞子のう及び運動性胞子は認められない。
Ｂ．細胞壁組成としてＬＬ型の２，６−ジアミノピメリン酸を含有する。
Ｃ．１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子の部分塩基配列（４００〜５００ｂｐ）によるストレプトミセス属放線菌に対する相同性が９０％以上である。
＜５＞ 更に下記Ｄの菌学的性質を有する前記＜４＞に記載のストレプトミセス属微生物である。
Ｄ．各種培地における生育状態
（１）イ−スト・麦芽寒天培地（ＩＳＰ−培地２、２７℃培養）、うす黄［２ｅａ,ＬｔＷｈｅａｔ］の発育上に、灰白［１ｄｃ,Ｐｕｔｔｙ］〜明るいオリーブ灰[１１／２ｇｅ，Ｌｔ Ｏｌｉｖｅ Ｇｒａｙ]の気菌糸を僅かに着生し、可溶性色素は認められない。
（２）オ−トミ−ル寒天培地（ＩＳＰ−培地３、２７℃培養）、無色〜うす黄［１１／２ｃａ,Ｃｒｅａｍ］の発育上に、白の気菌糸を僅かに着生し、可溶性色素は認められない。
（３）スタ−チ・無機塩寒天培地（ＩＳＰ−培地４、２７℃培養）、無色の発育上に、白の気菌糸を僅かに着生し、可溶性色素は認められない。
（４）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ＩＳＰ−培地５、２７℃培養）、発育は無色、気菌糸は着生せず、可溶性色素は認められない。
（５）シュクロ−ス・硝酸塩寒天培地（２７℃培養）、無色の発育上に、白の気菌糸をうっすらと着生し、可溶性色素は認められない。
＜６＞ 難分解性蛋白質が、過塩素酸可溶性蛋白質（ＰＳＰ）、異常プリオン蛋白質、及びケラチンから選択される前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載のストレプトミセス属微生物である。
＜７＞ 前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載のストレプトミセス属微生物を培養することにより得られ、プロテイナーゼＫを０．１ｗ／ｖ％、３０℃で１２０分間作用させた場合に溶解することがない難分解性蛋白質を分解可能であり、至適ｐＨが９〜１２でありかつ至適温度が６０〜７０℃であることを特徴とする難分解性蛋白質分解プロテアーゼである。
＜８＞ Ｎ末端のアミノ酸配列が、ＹＤＬＶＧＧＤＡＹＹＩＧ、で表される前記＜７＞に記載の難分解性蛋白質分解プロテアーゼである。
＜９＞ 難分解性蛋白質が、過塩素酸可溶性蛋白質（ＰＳＰ）、異常プリオン蛋白質、及びケラチンから選択される前記＜７＞から＜８＞のいずれかに記載の難分解性蛋白質分解プロテアーゼである。
＜１０＞ 前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載のストレプトミセス属微生物を培養することにより得られ、プロテイナーゼＫを０．１ｗ／ｖ％、３０℃で１２０分間作用させた場合に溶解することがない難分解性蛋白質を分解可能であることを特徴とする難分解性蛋白質分解用組成物である。
＜１１＞ 難分解性蛋白質を分解可能であり、至適ｐＨが９〜１２でありかつ至適温度が６０〜７０℃である難分解性蛋白質分解プロテアーゼを含む前記＜１０＞に記載の難分解性蛋白質分解用組成物である。
＜１２＞ 難分解性蛋白質分解プロテアーゼのＮ末端のアミノ酸配列が、ＹＤＬＶＧＧＤＡＹＹＩＧ、で表される前記＜１１＞に記載の難分解性蛋白質分解用組成物である。
＜１３＞ 難分解性蛋白質が、過塩素酸可溶性蛋白質（ＰＳＰ）、異常プリオン蛋白質、及びケラチンから選択される前記＜１０＞から＜１２＞のいずれかに記載の難分解性蛋白質分解用組成物である。
＜１４＞ 前記＜１＞から＜６＞に記載のストレプトミセス属微生物を培養し、プロテイナーゼＫを０．１ｗ／ｖ％、３０℃で１２０分間作用させた場合に溶解することがない難分解性蛋白質を分解可能であり、至適ｐＨが９〜１２でありかつ至適温度が６０〜７０℃である難分解性蛋白質分解プロテアーゼを産生させることを特徴とする難分解性蛋白質分解プロテアーゼの製造方法である。
＜１５＞ 難分解性蛋白質分解プロテアーゼを産生させたストレプトミセス属微生物の培養物から、該ストレプトミセス属微生物を除去する前記＜１４＞に記載の難分解性蛋白質分解プロテアーゼの製造方法である。
＜１６＞ 前記＜７＞から＜９＞のいずれか記載の難分解性蛋白質プロテアーゼ及び前記＜１０＞から＜１３＞のいずれかに記載の難分解性蛋白質分解用組成物の少なくともいずれかを用いて、プロテイナーゼＫを０．１ｗ／ｖ％、３０℃で１２０分間作用させた場合に溶解することがない難分解性蛋白質を分解させることを特徴とする難分解性蛋白質の分解方法である。
＜１７＞ 難分解性蛋白質が、過塩素酸可溶性蛋白質（ＰＳＰ）、異常プリオン蛋白質、及びケラチンから選択される前記＜１６＞に記載の難分解性蛋白質の分解方法である。
As a result of intensive studies by the present inventors in order to solve the above problems, it has been found that a protease produced by a novel microorganism belonging to the genus Streptomyces screened from soil can degrade a hardly degradable protein. The present invention is based on such findings by the present inventors, and means for solving the problems are as follows. That is,
<1> Streptomyces genus, which has the ability to produce a protease capable of degrading a hardly degradable protein that does not dissolve when proteinase K is allowed to act at 0.1 w / v% at 30 ° C. for 120 minutes It is a microorganism.
<2> The microorganism belonging to the genus Streptomyces according to <1>, which is Streptomyces sp.
<3> Streptomyces sp. 99-GP-2D-5 strain (FERM P-19336) and the Streptomyces genus microorganism according to any one of <1> to <2>, which is a derivative strain thereof.
<4> The Streptomyces microorganism according to any one of <1> to <3>, which has the following mycological properties of A to C.
A. Morphological properties (1) A relatively long wavy aerial hyphae is elongated from a branched basic hyphae, and rarely has a hook or loop shape.
(2) The mature spore chain links 10 to 50 oval spore, and the size of the spore is about 0.6 to 0.7 × 0.8 to 1.0 μm.
(3) The spore surface is smooth.
(4) No roticular branch, fungal bundle, spore and motility spore are observed.
B. The cell wall composition contains LL-type 2,6-diaminopimelic acid.
C. The homology to Streptomyces genus actinomycetes by the partial base sequence (400 to 500 bp) of the 16S ribosomal RNA gene is 90% or more.
<5> The Streptomyces microorganism according to <4>, further having the following D mycological properties.
D. Growth state in various media (1) On the growth of yeast / malt agar medium (ISP-medium 2, cultured at 27 ° C.) and light yellow [2ea, LtWheat], grayish white [1 dc, Putty] to bright olive ash [11 / 2ge, Lt Olive Gray] slightly aerial hyphae are formed, and no soluble pigment is observed.
(2) Oatmeal agar medium (ISP-medium 3, cultured at 27 ° C.), colorless to light yellow [11 / 2ca, Cream] on the growth of white aerial mycelia slightly, soluble pigment It is not allowed.
(3) On a starch / inorganic salt agar medium (ISP-medium 4, 27 ° C. culture), colorless growth, white aerial mycelia grow slightly, and no soluble pigment is observed.
(4) Glycerin / asparagine agar medium (ISP-medium 5, 27 ° C. culture), growth is colorless, aerial hyphae do not grow, and no soluble pigment is observed.
(5) On a sucrose / nitrate agar medium (27 ° C. culture), colorless growth, white aerial mycelia are slightly formed and no soluble pigment is observed.
<6> The Streptomyces microorganism according to any one of <1> to <5>, wherein the hardly degradable protein is selected from perchloric acid soluble protein (PSP), abnormal prion protein, and keratin.
<7> Obtained by culturing the Streptomyces microorganism according to any one of <1> to <6>, and dissolved when proteinase K is allowed to act at 0.1 w / v% at 30 ° C. for 120 minutes It is a hardly degradable proteolytic protease that can decompose a hardly degradable protein that does not occur, has an optimum pH of 9 to 12, and an optimum temperature of 60 to 70 ° C.
<8> The hardly degradable proteolytic protease according to <7>, wherein the N-terminal amino acid sequence is represented by YDLVGGDYYIG.
<9> The hardly degradable protein degradation protease according to any one of <7> to <8>, wherein the hardly degradable protein is selected from perchloric acid soluble protein (PSP), abnormal prion protein, and keratin .
<10> Obtained by culturing the Streptomyces microorganism according to any one of <1> to <6>, and dissolved when proteinase K is allowed to act at 0.1 w / v% at 30 ° C. for 120 minutes It is a composition for degrading proteolytic protein, which is capable of degrading a hardly degradable protein that does not occur.
<11> The hardly degradable protein according to <10>, comprising a hardly degradable proteolytic protease capable of degrading a hardly degradable protein, having an optimum pH of 9 to 12 and an optimum temperature of 60 to 70 ° C. It is a composition for sex protein degradation.
<12> The hardly degradable proteolytic composition according to <11>, wherein the amino acid sequence at the N-terminal of the hardly degradable proteolytic protease is represented by YDLVGGGDAYYIG.
<13> The composition for persistent protein degradation according to any one of <10> to <12>, wherein the persistent protein is selected from perchloric acid soluble protein (PSP), abnormal prion protein, and keratin. It is.
<14> Refractory property that does not dissolve when the Streptomyces microorganism described in <1> to <6> is cultured and proteinase K is allowed to act on 0.1 w / v% at 30 ° C. for 120 minutes. A method for producing a hardly degradable proteolytic protease, comprising producing a hardly degradable proteolytic protease capable of degrading a protein, having an optimum pH of 9 to 12 and an optimum temperature of 60 to 70 ° C. It is.
<15> The method for producing a hardly degradable proteolytic protease according to <14>, wherein the Streptomyces microorganism is removed from the culture of the Streptomyces microorganism that produced the hardly degradable proteolytic protease.
<16> Using at least one of the hardly degradable protein protease according to any one of <7> to <9> and the hardly degradable protein degrading composition according to any one of <10> to <13> In addition, the present invention provides a method for degrading a hardly degradable protein, comprising degrading a hardly degradable protein that does not dissolve when proteinase K is allowed to act at 0.1 w / v% at 30 ° C. for 120 minutes.
<17> The method for degrading a hardly degradable protein according to <16>, wherein the hardly degradable protein is selected from perchloric acid soluble protein (PSP), abnormal prion protein, and keratin.
本発明によると、従来における問題を解決することができ、厨芥、排水、有機廃液、産業廃棄物などに含まれる、過塩素酸可溶性蛋白質（ＰＳＰ）、異常プリオン、ケラチン等の難分解性蛋白質を効率良く分解可能なプロテアーゼ産生能を有するストレプトミセス属微生物、該ストレプトミセス属微生物により生産され、前記難分解性蛋白質分解を効率良く分解可能な難分解性蛋白質分解プロテアーゼ及び難分解性蛋白質分解用組成物、並びに、これらを用いて前記難分解性蛋白質を効率良く分解する難分解性蛋白質の分解方法を提供することができる。 According to the present invention, conventional problems can be solved. Refractory proteins such as perchloric acid soluble protein (PSP), abnormal prion, keratin and the like contained in dredging, drainage, organic waste liquid, industrial waste, etc. Streptomyces microorganisms having an ability to produce proteases that can be efficiently decomposed, persistently proteolytic proteases produced by the Streptomyces microorganisms and capable of efficiently degrading the persistent proteins, and compositions for the degradation of persistent proteins And a method for degrading a hardly degradable protein, which efficiently degrades the hardly degradable protein using these.
（ストレプトミセス属微生物）
本発明のストレプトミセス属微生物は、難分解性蛋白質を分解可能なプロテアーゼの産生能を有するストレプトミセス属である限り、その種や株等については特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、下記Ａ〜Ｃの菌学的性質を有するものが好適に挙げられ、下記Ａ〜Ｄの菌学的性質を有するものがより好適に挙げられる。なお、本発明においては、前記Ａ〜Ｃ又は前記Ａ〜Ｄの菌学的性質を有するものの中で、後述する、前記難分解性蛋白質の分解能が互いに異なるものは、互いに異なる菌株であるが、これらは、いずれも本発明の前記ストレプトミセス属微生物であることに変わりがない。
(Streptomyces spp.)
As long as the Streptomyces microorganism of the present invention is a Streptomyces genus having the ability to produce a protease capable of degrading a hardly degradable protein, its species and strain are not particularly limited and should be appropriately selected according to the purpose. For example, those having the following mycological properties of A to C are preferably exemplified, and those having the following mycological properties of A to D are more suitably exemplified. In the present invention, among those having the above mycological properties of A to C or A to D, those having different resolutions of the hardly degradable proteins described later are different strains, These are all the Streptomyces microorganisms of the present invention.
Ａ．形態的性質
（１）分枝した基生菌糸より、比較的長い波状の気菌糸を伸長し、稀にかぎ状あるいはループ状を呈する。
（２）成熟した胞子鎖は１０〜５０個の卵円形の胞子を連鎖し、胞子の大きさは約０.６〜０.７×０.８〜１.０μｍである。
（３）胞子の表面は平滑である。
（４）輪生枝、菌束糸、胞子のう及び運動性胞子は認められない。
Ｂ．細胞壁組成としてＬＬ型の２，６−ジアミノピメリン酸を含有する。
Ｃ．１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子の部分塩基配列（４００〜５００ｂｐ）によるストレプトミセス属放線菌に対する相同性が９０％以上である。
A. Morphological properties (1) A relatively long wavy aerial hyphae is elongated from a branched basic hyphae, and rarely has a hook or loop shape.
(2) The mature spore chain links 10 to 50 oval spore, and the size of the spore is about 0.6 to 0.7 × 0.8 to 1.0 μm.
(3) The spore surface is smooth.
(4) No roticular branch, fungal bundle, spore and motility spore are observed.
B. The cell wall composition contains LL-type 2,6-diaminopimelic acid.
C. The homology to Streptomyces genus actinomycetes by the partial base sequence (400 to 500 bp) of the 16S ribosomal RNA gene is 90% or more.
なお、前記形態的性質は、前記ストレプトミセス属微生物を、例えば、以下の組成を有するコロイダル・キチン寒天培地等に接種して培養することにより、好適に調べることができる。
［コロイダル・キチン寒天培地（ｐＨ７．０）組成］
コロイダル・キチン ２ｇ
Ｋ２ＨＰＯ４ ０．７ｇ
ＫＨ２ＰＯ４ ０．３ｇ
ＭｇＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．５ｇ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０１ｇ
ＺｎＳＯ４ ０．００１ｇ
ＭｎＣｌ２ ０．００１ｇ
寒天 ２０ｇ
脱イオン水 １０００ｍｌ
（なお、上記コロイダル・キチンは、微生物実験マニュアル（講談社、協和発酵東京研究所編、１９８６）記載の方法に従って作製した。即ち、粗キチン（和光純薬工業社製）を苛性ソーダ、１Ｎ塩酸で２４時間洗浄した。これを５回ずつ行った後、９５％エタノールで４回洗浄した。こうして得られた白色キチン（１５ｇ）を濃塩酸１００ｍｌ中に入れ、氷で冷やし撹拌した。ガラスウールでろ過したろ液を氷冷水中に注ぎ、キチンの沈殿を形成させた。なお、グラスウール上のものは更に塩酸で処理し、同様な操作を繰り返してキチンを回収した。キチン溶液は一晩放置した後、苛性ソーダでｐＨ７．０に調整し、遠沈で分離、洗浄することによりキチンを回収した。）
The morphological properties can be suitably examined by inoculating the Streptomyces microorganisms, for example, in a colloidal chitin agar medium having the following composition and culturing.
[Composition of colloidal chitin agar medium (pH 7.0)]
Colloidal chitin 2g
K 2 HPO 4 0.7g
KH 2 PO 4 0.3 g
MgSO 4 · 5H 2 O 0.5g
FeSO 4 · 7H 2 O 0.01g
ZnSO 4 0.001 g
MnCl 2 0.001 g
Agar 20g
1000ml deionized water
(The colloidal chitin was prepared according to the method described in the Microbial Experiment Manual (Kodansha, Kyowa Hakko Tokyo Laboratory, 1986), ie, crude chitin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) with caustic soda and 1N hydrochloric acid. This was carried out for 5 times and then 4 times with 95% ethanol, and the white chitin thus obtained (15 g) was put into 100 ml of concentrated hydrochloric acid, cooled with ice and stirred, filtered through glass wool. The filtrate was poured into ice-cold water to form a chitin precipitate.The glass wool was further treated with hydrochloric acid, and the same operation was repeated to recover the chitin. Chitin was recovered by adjusting the pH to 7.0 with caustic soda and separating and washing by centrifugation.
Ｄ．各種培地における生育状態
（１）イ−スト・麦芽寒天培地（ＩＳＰ−培地２、２７℃培養）、うす黄［２ｅａ,ＬｔＷｈｅａｔ］の発育上に、灰白［１ｄｃ,Ｐｕｔｔｙ］〜明るいオリーブ灰[１１／２ｇｅ，Ｌｔ Ｏｌｉｖｅ Ｇｒａｙ]の気菌糸を僅かに着生し、可溶性色素は認められない。
（２）オ−トミ−ル寒天培地（ＩＳＰ−培地３、２７℃培養）、無色〜うす黄［１１／２ｃａ,Ｃｒｅａｍ］の発育上に、白の気菌糸を僅かに着生し、可溶性色素は認められない。
（３）スタ−チ・無機塩寒天培地（ＩＳＰ−培地４、２７℃培養）、無色の発育上に、白の気菌糸を僅かに着生し、可溶性色素は認められない。
（４）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ＩＳＰ−培地５、２７℃培養）、発育は無色、気菌糸は着生せず、可溶性色素は認められない。
（５）シュクロ−ス・硝酸塩寒天培地（２７℃培養）、無色の発育上に、白の気菌糸をうっすらと着生し、可溶性色素は認められない。
D. Growth state in various media (1) On the growth of yeast / malt agar medium (ISP-medium 2, cultured at 27 ° C.) and light yellow [2ea, LtWheat], grayish white [1 dc, Putty] to bright olive ash [11 / 2ge, Lt Olive Gray] slightly aerial hyphae are formed, and no soluble pigment is observed.
(2) Oatmeal agar medium (ISP-medium 3, cultured at 27 ° C.), colorless to light yellow [11 / 2ca, Cream] on the growth of white aerial mycelia slightly, soluble pigment It is not allowed.
(3) On a starch / inorganic salt agar medium (ISP-medium 4, 27 ° C. culture), colorless growth, white aerial mycelia grow slightly, and no soluble pigment is observed.
(4) Glycerin / asparagine agar medium (ISP-medium 5, 27 ° C. culture), growth is colorless, aerial hyphae do not grow, and no soluble pigment is observed.
(5) On a sucrose / nitrate agar medium (27 ° C. culture), colorless growth, white aerial mycelia are slightly formed and no soluble pigment is observed.
これらのストレプトミセス属微生物の中でも、難分解性蛋白質を分解可能なプロテアーゼ産生能に優れる点で、ストレプトミセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ）が好ましい。該ストレプトミセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ.）は、土壌に多く存在し、病原性は確認されていない。
前記ストレプトミセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ.）の中でも、ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９３３６）、ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−３株、これらの誘導菌株などがより好ましく、ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９３３６）及びその誘導菌株が特に好ましい。
Among these microorganisms belonging to the genus Streptomyces, Streptomyces sp is preferable in that it has an excellent ability to produce a protease capable of degrading a hardly degradable protein. The Streptomyces sp. Is abundant in soil, and its pathogenicity has not been confirmed.
Among the Streptomyces sp. (Streptomyces sp.), Streptomyces sp. 99-GP-2D-5 strain (FERM P-19336), Streptomyces sp. 99-GP-2D-3 strain, and derivatives thereof, etc. Is more preferable, and Streptomyces sp. 99-GP-2D-5 strain (FERM P-19336) and its derivative strain are particularly preferable.
なお、前記ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株は、独立行政法人産業技術総合研究所に寄託されており（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１９３３６）、入手可能である。該ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株及びストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−３株は、例えば、以下のようにして、土壌から分離することができる。即ち、例えば、採取した土壌１ｇを滅菌した９ｍｌの脱イオン水で希釈し、それを更に１０２、１０３倍に希釈する。次に、各希釈液の０.１ｍｌを後述のColloidal chitin agar培地の寒天平面に撒き、２７℃で培養する。そして、微生物の識別はコロニーの形状、微生物菌体の顕微鏡観察及び生化学試験により、また、複数の菌株が混じっているときは更に希釈法によって、上述したＡ〜Ｄの菌学的性質を有する菌株を分離することにより、土壌から分離することができる。 The Streptomyces sp. 99-GP-2D-5 strain has been deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (accession number: FERM P-19336) and is available. The Streptomyces sp. 99-GP-2D-5 strain and Streptomyces sp. 99-GP-2D-3 strain can be separated from soil, for example, as follows. That is, for example, 1 g of the collected soil is diluted with 9 ml of sterilized deionized water and further diluted 10 2 , 10 3 times. Next, 0.1 ml of each diluted solution is spread on an agar plane of Colloidal chitin agar medium described later and cultured at 27 ° C. And the identification of microorganisms has the above-mentioned mycological properties by the colony shape, microscopic observation of microbial cells and biochemical tests, and further by dilution method when multiple strains are mixed. By separating the strain, it can be separated from the soil.
前記誘導菌株としては、前記難分解性蛋白質を分解可能なプロテアーゼの産生能を有する限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９３３６）等の子孫、変異株、などが挙げられる。
前記子孫としては、例えば、前記難分解性蛋白質を分解可能なプロテアーゼ産生能を有する前記ストレプトミセス属微生物を系代培養することにより得られた菌株、などが挙げられる。
前記変異株としては、前記難分解性蛋白質を分解可能なプロテアーゼの産生能を有する前記ストレプトミセス属微生物の変異株であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、変異の原因としては、人工的であってもよいし、自然発生的であってもよく、前者の原因による変異株を人工変異株（人工変異体）を称し、後者の原因による変異株を自然変異株（自然変異体）と称することがある。前記変異の原因の具体例としては、紫外線、エックス線等の電離放射線、薬剤、遺伝子組換え、などが挙げられる。前記変異の原因は、１種単独である場合もあれば、２種以上の組合せによる場合もある。
なお、前記ストレプトミセス属微生物、特に、前記前記ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９３３６）等の菌株は、その性状が変化し易く、例えば、紫外線、エックス線、薬剤等により、容易に変異し、変異株（変異体）となる。
The derived strain is not particularly limited as long as it has the ability to produce a protease capable of degrading the hardly degradable protein, and can be appropriately selected according to the purpose. For example, the Streptomyces sp. 99-GP-2D Descendants such as -5 strain (FERM P-19336), mutant strains and the like.
Examples of the progeny include a strain obtained by subculturing the Streptomyces microorganism having the ability to produce a protease capable of degrading the hardly degradable protein.
The mutant strain is not particularly limited as long as it is a mutant strain of the microorganism belonging to the genus Streptomyces having the ability to produce a protease capable of degrading the persistent protein, and can be appropriately selected according to the purpose. The cause may be artificial or naturally occurring. The former cause is referred to as an artificial mutant (artificial mutant), and the latter cause is referred to as a natural mutant. Sometimes referred to as (natural mutant). Specific examples of the cause of the mutation include ionizing radiation such as ultraviolet rays and X-rays, drugs, and gene recombination. The cause of the mutation may be a single species or a combination of two or more species.
Note that the properties of the microorganism belonging to the genus Streptomyces, in particular, the strain such as the Streptomyces sp. 99-GP-2D-5 strain (FERM P-19336) are likely to change. For example, ultraviolet rays, X-rays, drugs, etc. Can be easily mutated into a mutant strain (mutant).
前記難分解性蛋白質とは、プロテイナーゼＫを０．１ｗ／ｖ％、３０℃で１２０分間作用させた場合にも溶解しない蛋白質を意味し、特に制限はなく、公知のものが挙げられ、例えば、過塩素酸可溶性蛋白質（ＰＳＰ）、異常プリオン蛋白質、ケラチン、などが挙げられる。
なお、これらの難分解性蛋白質は、例えば、厨芥、排水、有機廃液、産業廃棄物などに含まれている。
The persistent protein means a protein that does not dissolve even when proteinase K is allowed to act at 0.1 w / v% at 30 ° C. for 120 minutes, and is not particularly limited, and examples thereof include known ones. Examples include perchloric acid soluble protein (PSP), abnormal prion protein, keratin, and the like.
These hardly degradable proteins are contained in, for example, soot, waste water, organic waste liquid, industrial waste, and the like.
本発明において、前記難分解性蛋白質を「分解可能」とは、ブタ肝臓由来の過塩素酸可溶性蛋白質（ＰＳＰ）０．６ｍｇ/ｍｌと、前記ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９３３６）の培養液中のプロテアーゼ０．００３ｍｇ/ｍｌとを混合し、３７℃で６０分間反応させた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって、前記ＰＳＰバンドの消失乃至残存を観察する蛋白質分解試験において該ＰＳＰバンドが消失したことを意味する（なお、前記ＰＳＰバンドの消失乃至残存については、前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で電気泳動させたサンプルをウエスタン・ブロティングしたものを目視にて観察することができる）。 In the present invention, the term “degradable” for the hardly degradable protein means that 0.6 mg / ml of perchloric acid soluble protein (PSP) derived from pig liver and the Streptomyces sp. 99-GP-2D-5 strain ( Proteolysis test for observing disappearance or remaining of the PSP band by SDS-PAGE method after mixing with 0.003 mg / ml protease in the culture solution of FERM P-19336) and reacting at 37 ° C. for 60 minutes (The disappearance or remaining of the PSP band can be observed visually by western blotting of the sample electrophoresed by the SDS-PAGE method.) it can).
また、本発明において、前記過塩素酸可溶性蛋白質（ＰＳＰ）を「分解可能」とは、ブタ肝臓由来の過塩素酸可溶性蛋白質（ＰＳＰ）０．６ｍｇ/ｍｌと、前記ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９３３６）の培養液中のプロテアーゼ０．００３ｍｇ/ｍｌとを混合し、３７℃で６０分間反応させた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって、前記ＰＳＰバンドの消失乃至残存を観察する蛋白質分解試験において該ＰＳＰバンドが消失したことを意味し、また、前記異常プリオン蛋白質を「分解可能」とは、クロイツフェルト・ヤコブ病由来又はスクレイピー由来の異常プリオン蛋白質０．６ｍｇ/ｍｌと、前記ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９３３６）の培養液中のプロテアーゼ０．００３ｍｇ/ｍｌとを混合し、３７℃で６０分間反応させた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって、前記異常プリオン蛋白質バンドの消失乃至残存を観察する蛋白質分解試験において該異常プリオン蛋白質バンドが消失したことを意味し、また、前記ケラチンを「分解可能」とは、ケラチン０．６ｍｇ/ｍｌと、前記ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９３３６）の培養液中のプロテアーゼ０．００３ｍｇ/ｍｌとを混合し、３７℃で６０分間反応させた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって、ケラチンバンドの消失乃至残存を観察する蛋白質分解試験において該ケラチンバンドが消失したことを意味する。なお、前記ＰＳＰバンド、前記異常プリオンバンド、又は前記ケラチンバンドの消失乃至残存については、前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で電気泳動させたサンプルをウエスタン・ブロティングしたものを目視にて観察することができる。 In the present invention, the term “degradable” of the perchloric acid-soluble protein (PSP) means that 0.6 mg / ml of perchloric acid-soluble protein (PSP) derived from pig liver and the Streptomyces sp. 99-GP. -2D-5 strain (FERM P-19336) was mixed with 0.003 mg / ml of protease and reacted at 37 ° C. for 60 minutes, and then the disappearance or remaining of the PSP band was detected by SDS-PAGE. Means that the PSP band has disappeared in the proteolysis test, and that the abnormal prion protein is “degradable” means that the abnormal prion protein derived from Creutzfeldt-Jakob disease or scrapie is 0.6 mg / ml And Protea in the culture solution of Streptomyces sp. 99-GP-2D-5 strain (FERM P-19336) After mixing with 0.003 mg / ml and reacting at 37 ° C. for 60 minutes, the abnormal prion protein band was detected in a proteolysis test for observing disappearance or residual of the abnormal prion protein band by SDS-PAGE. This means that the keratin was “degradable” means that the keratin 0.6 mg / ml and the Streptomyces sp. 99-GP-2D-5 strain (FERM P-19336) were cultured. It means that the keratin band disappeared in a proteolysis test in which the disappearance or the remaining of the keratin band was observed by SDS-PAGE method after mixing with 0.003 mg / ml of protease and reacted at 37 ° C. for 60 minutes. To do. In addition, about the loss | disappearance thru | or residual of the said PSP band, the said abnormal prion band, or the said keratin band, what carried out the Western blotting of the sample electrophoresed by the said SDS-PAGE method can be observed visually.
なお、前記培養液における培地組成は、ＳＡ培地（ｐＨ７.０）＜肉エキス（極東製薬工業社製）：０．３ｇ、トリプトース（Ｄｉｆｃｏ社製）：０．５ｇ、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）：０．５ｇ、グルコース（和光純薬工業社製）：０．１ｇ、溶性でんぷん（和光純薬工業社製）：２．４ｇ、ＣａＣＯ３：０．２ｇ、脱イオン水：１００ｍｌ＞であり、前記ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９３３６）の接種量は、１〜２質量％であり、培養条件は、三角フラスコ内で２０℃〜４０℃、４〜６日間、１８０ｒｐｍの液体振とう培養である。 The medium composition in the culture solution was as follows: SA medium (pH 7.0) <meat extract (manufactured by Kyokuto Pharmaceutical Co., Ltd.): 0.3 g, tryptose (manufactured by Difco): 0.5 g, yeast extract (manufactured by Difco) : 0.5 g, glucose (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.): 0.1 g, soluble starch (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.): 2.4 g, CaCO 3 : 0.2 g, deionized water: 100 ml> The inoculum of the Streptomyces sp. 99-GP-2D-5 strain (FERM P-19336) is 1 to 2% by mass, and the culture conditions are 20 ° C. to 40 ° C. for 4 to 6 days in an Erlenmeyer flask. , 180 rpm liquid shaking culture.
前記蛋白質分解試験においては、３７℃で６０分間反応させた後における前記ＰＳＰバンドの消失を確認することにより、前記難分解性蛋白質が「分解可能」であると判定するが、このことは、前記ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９３３６）の培養液が、前記難分解性蛋白質を分解可能なプロテアーゼ活性を有することを意味し、前記ＰＳＰバンドの消失に要する時間が短い程、前記ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９３３６）の培養液における、前記難分解性蛋白質を分解可能なプロテアーゼ活性が高いことを意味する（例えば、前記ＰＳＰバンドの消失までに要する時間が６０分間よりも２０分間の方が前記プロテアーゼ活性が高く、２０分間よりも５分間の方が前記プロテアーゼ活性が高い）。なお、本発明においては、前記プロテアーゼ活性が異なる菌株どうしは、互いに異なる菌株であるが、該プロテアーゼ活性を有する限り、前記難分解性蛋白質を「分解可能」であることに変わりがない。 In the proteolysis test, it is determined that the persistent protein is “degradable” by confirming the disappearance of the PSP band after reacting at 37 ° C. for 60 minutes. This means that the culture solution of Streptomyces sp. 99-GP-2D-5 strain (FERM P-19336) has protease activity capable of degrading the persistent protein, and the time required for disappearance of the PSP band The shorter the value, the higher the protease activity capable of degrading the persistent protein in the culture solution of the Streptomyces sp. 99-GP-2D-5 strain (FERM P-19336) (for example, the PSP band). The protease activity is higher in 20 minutes than in 60 minutes, and 5 minutes in 20 minutes. The protease activity is higher). In the present invention, the strains having different protease activities are different strains from each other. However, as long as the protease activity is present, the persistent protein is still “degradable”.
前記ストレプトミセス属微生物は培養することにより、前記難分解性蛋白質を分解可能なプロテアーゼを産生するが、該培養としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記培養の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、液体培養法、寒天培養法、固体培養法、などが挙げられる。これらは、１種単独で採用してもよいし、２種以上組合せて採用してもよい。
前記液体培養法としては、例えば、振とう培養、静置培養、などが挙げられる。
前記寒天培養法としては、例えば、スラント培養、プレート培養、などが挙げられる。
前記固体培養法としては、例えば、前記寒天培地以外の培地上で培養する方法などが挙げられる。
これらの中でも、前記難分解性蛋白質を分解可能なプロテアーゼが培養液中に分泌され、該プロテアーゼが効率的に得られる点で、液体培養が好ましく、その中でも、振とう培養がより好ましい。
The Streptomyces microorganism produces a protease capable of degrading the hardly degradable protein by culturing, but the culturing is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose.
The culture method is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include a liquid culture method, an agar culture method, and a solid culture method. These may be employed singly or in combination of two or more.
Examples of the liquid culture method include shaking culture and stationary culture.
Examples of the agar culture method include slant culture and plate culture.
Examples of the solid culture method include a method of culturing on a medium other than the agar medium.
Among these, the liquid culture is preferable in that the protease capable of degrading the hardly degradable protein is secreted into the culture solution and the protease can be obtained efficiently, and among them, the shaking culture is more preferable.
前記培養の条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、その温度としては、２０℃〜４０℃が好ましく、そのｐＨとしては、弱酸性乃至アルカリ性（具体的にはｐＨ６〜１１）が好ましく、その培養日数としては、前記プロテアーゼの産生量に応じて適宜決定すればよいが、例えば液体培養の場合には４〜６日間が好ましい。通常は、この程度の期間の培養で、培養液中に前記プロテアーゼの十分な量が生成蓄積される。 The culture conditions are not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose. For example, the temperature is preferably 20 ° C. to 40 ° C., and the pH is weakly acidic to alkaline (specifically PH is preferably 6 to 11), and the culture period may be appropriately determined according to the production amount of the protease. For example, in the case of liquid culture, 4 to 6 days is preferable. Usually, a sufficient amount of the protease is produced and accumulated in the culture medium by culturing for such a period.
前記培養のための培地としては、特に制限はなく、公知の放線菌培養培地、ストレプトミセス属微生物の培養培地として使用されているものなどが挙げられる。
前記培地の炭素源としては、例えば、グルコ−ス、ポテトスタ−チ、デキストリンなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。前記培地の無機窒素源及び有機窒素源としては、例えば、酵母エキス、トリプトース、コーン・スチープ・リカー、大豆粉、肉エキス、トマトピューレなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。前記培地には、その他必要に応じて、食塩、炭酸カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸銅、硫酸鉄、硫酸亜鉛、塩化マンガン、塩化コバルト、燐酸塩などの無機塩類を添加してもよいし、アミノ酸類、ビタミン類、核酸類などの有機物などを添加してもよい。
There is no restriction | limiting in particular as a culture medium for the said culture | cultivation, What is used as a culture medium of well-known actinomycete culture medium, Streptomyces microorganisms, etc. are mentioned.
Examples of the carbon source of the medium include glucose, potato starch, dextrin and the like. These may be used individually by 1 type and may use 2 or more types together. Examples of the inorganic nitrogen source and the organic nitrogen source in the medium include yeast extract, tryptose, corn stee liquor, soy flour, meat extract, tomato puree and the like. These may be used individually by 1 type and may use 2 or more types together. The medium may be supplemented with inorganic salts such as sodium chloride, calcium carbonate, magnesium sulfate, copper sulfate, iron sulfate, zinc sulfate, manganese chloride, cobalt chloride, and phosphate as required, and amino acids. Organic substances such as vitamins and nucleic acids may be added.
例えば、前記ストレプトミセス属微生物を、前記ＳＡ培地１００ｍｌに１〜２ｍｌだけ接種し、３０℃で５日間、振とう培養（１８０ｒｐｍ）すると、その培養液中には、前記難分解性蛋白質を分解可能なプロテアーゼが産生される。
前記ストレプトミセス属微生物の前記培養液は、前記難分解性蛋白質を分解可能なプロテアーゼを含有しているので、そのままで又は前記ストレプトミセス属微生物をろ別乃至除去することにより、後述する本発明の難分解性蛋白質分解用組成物が得られ、また、該培養液から前記難分解性蛋白質を分解可能なプロテアーゼを分離することにより、後述する本発明の難分解性蛋白質分解プロテアーゼが得られる。
For example, when 1-2 ml of the Streptomyces microorganism is inoculated into 100 ml of the SA medium and cultured at 30 ° C. for 5 days with shaking (180 rpm), the hardly degradable protein can be degraded in the culture solution. Proteases are produced.
Since the culture solution of the microorganism belonging to the genus Streptomyces contains a protease capable of degrading the hardly degradable protein, it can be used as it is or by filtering or removing the microorganism belonging to the genus Streptomyces as described later. A composition for degrading proteolytic protein degradation is obtained, and the proteolytic protease of the present invention described later is obtained by separating a protease capable of degrading the hardly degradable protein from the culture solution.
本発明のストレプトミセス属微生物は、培養することにより、後述する、本発明の難分解性蛋白質分解用組成物又は本発明の難分解性蛋白質分解プロテアーゼの製造に好適に使用することができ、また、厨芥、排水、有機廃液、産業廃棄物等に含まれる前記難分解性蛋白質を効率的に分解する目的で、これらに直接付与されて使用することができる。
後者の場合には、本発明の前記ストレプトミセス属微生物をそのまま付与してもよいし、その培養物（培養液等）を付与してもよく、該培養物（培養液等）を付与する場合には、該培養物（培養液等）をそのまま散布してもよいし、常法により製剤化、粉末化等してから付与してもよい。
The microorganism belonging to the genus Streptomyces of the present invention can be suitably used for the production of the composition for degrading proteolytic degradation of the present invention described later or the hardly degradable proteolytic protease of the present invention by culturing. For the purpose of efficiently decomposing the hardly degradable protein contained in slag, waste water, organic waste liquid, industrial waste, etc., it can be directly applied to these.
In the latter case, the microorganism of the genus Streptomyces of the present invention may be applied as it is, or a culture (a culture solution or the like) thereof may be applied, or a culture (a culture solution or the like) is applied. For example, the culture (eg, culture solution) may be sprayed as it is, or may be applied after being formulated or powdered by a conventional method.
（難分解性蛋白質分解用組成物及び難分解性蛋白質分解プロテアーゼ）
本発明の難分解性蛋白質分解用組成物は、本発明の前記ストレプトミセス属微生物を培養することにより得られる。該難分解性蛋白質分解用組成物としては、例えば、前記ストレプトミセス属微生物の培養物（培養液など）をそのまま使用してもよいし、該培養物から前記ストレプトミセス属微生物を除去（例えば、ろ別等）して得た培養上清を使用してもよい。なお、前記培養上清に対しては、更に不純物等の除去等を行い、精製処理等を行ってもよい。
なお、前記ストレプトミセス属微生物の培養等の詳細にについては、上述した通りである。
(Resistant protein-degrading composition and persistent protein-degrading protease)
The composition for degrading proteolytic protein of the present invention can be obtained by culturing the Streptomyces microorganism of the present invention. As the hardly degradable composition for proteolysis, for example, the culture of Streptomyces microorganisms (culture solution, etc.) may be used as it is, or the Streptomyces microorganisms are removed from the culture (for example, The culture supernatant obtained by filtration, etc.) may be used. The culture supernatant may be further subjected to purification treatment or the like after removing impurities and the like.
The details of the culture of the microorganism belonging to the genus Streptomyces are as described above.
前記難分解性蛋白質分解用組成物としては、プロテイナーゼＫを０．１質量％、３０℃で１２０分間作用させた場合に溶解することがない難分解性蛋白質を分解可能であれば、その組成等については特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記難分解性蛋白質を分解可能な本発明の難分解性蛋白質分解プロテアーゼを含有するものが好適に挙げられる。 The composition for degrading proteolytic protein is composed of, for example, a composition capable of degrading a hardly degradable protein that is not dissolved when proteinase K is allowed to act at 0.1% by mass at 30 ° C. for 120 minutes. There is no particular limitation on the above, and it can be appropriately selected depending on the purpose. Preferred examples include those containing the hardly degradable proteolytic protease of the present invention capable of degrading the hardly degradable protein.
前記難分解性蛋白質分解用組成物における前記難分解性蛋白質分解プロテアーゼの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、該難分解性蛋白質分解用組成物が前記難分解性蛋白質を分解可能な程度であればよく、０．０２〜０．３ｗ／ｖ％などが挙げられる。 There is no restriction | limiting in particular as content of the said hardly degradable proteolytic protease in the said hardly degradable protein decomposing composition, According to the objective, it can select suitably, For example, this said hardly degradable proteolytic composition However, 0.02 to 0.3 w / v% may be used.
本発明の前記難分解性蛋白質分解プロテアーゼは、例えば、前記難分解性蛋白質分解用組成物を精製することにより好適に得られ、また、本発明の前記ストレプトミセス属微生物を上述のように培養し、難分解性蛋白質分解プロテアーゼを産生させること、好ましくは更に産生した該難分解性蛋白質分解プロテアーゼを分離乃至精製することにより得られる。 The hardly degradable proteolytic protease of the present invention is preferably obtained by, for example, purifying the hardly degradable proteolytic composition, and the Streptomyces microorganism of the present invention is cultured as described above. It can be obtained by producing a hardly degradable proteolytic protease, preferably by further separating or purifying the produced hardly degradable proteolytic protease.
前記精製の方法、前記分離乃至精製の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、エタノール沈殿、酸抽出、透析、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、などの方法が好適に挙げられる。これらは、単独で行ってもよいし、２以上を併用してもよい。これらの中でも、前記高速液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどが好ましく、該アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、本発明の前記難分解性蛋白質分解プロテアーゼに対するモノクローナル抗体等の抗体を結合させたカラムや、本発明の前記難分解性蛋白質分解プロテアーゼに通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラム、などが好適に挙げられる。 The purification method and the separation or purification method are not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include ammonium sulfate precipitation, ethanol precipitation, acid extraction, dialysis, anion or cation exchange chromatography, Preferable methods include phosphocellulose chromatography, hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography, hydroxyapatite chromatography, lectin chromatography, and high performance liquid chromatography (HPLC). These may be performed alone or in combination of two or more. Among these, the high performance liquid chromatography, affinity chromatography and the like are preferable, and the column used for the affinity chromatography is, for example, a column to which an antibody such as a monoclonal antibody against the hardly proteolytic protease of the present invention is bound. In addition, when a normal peptide tag is added to the hardly degradable proteolytic protease of the present invention, a column in which a substance having an affinity for the peptide tag is preferably used.
前記難分解性蛋白質分解プロテーゼの純度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、０．３質量％以上が好ましく、純品（１００％）であるのが特に好ましい。 The purity of the hardly degradable proteolytic prosthesis is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. For example, it is preferably 0.3% by mass or more, particularly a pure product (100%). preferable.
前記難分解性蛋白質分解プロテアーゼの物性としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、そのｐＨとしては、例えば、９〜１２であるのが好ましく、その至適温度としては、６０〜７０℃であるのが好ましい。
前記難分解性蛋白質分解プロテアーゼの中でも、Ｎ末端のアミノ酸配列が、ＹＤＬＶＧＧＤＡＹＹＩＧ、で表されるアミノ酸配列（後掲のアミノ酸配列表リスト参照）を有するものが、前記難分解性蛋白質の分解活性等の点で、特に好ましい。
なお、前記難分解性蛋白質としては、上述した通りであり、過塩素酸可溶性蛋白質（ＰＳＰ）、異常プリオン蛋白質、ケラチン、などが挙げられる。これらの難分解性蛋白質は、例えば、厨芥、排水、有機廃液、産業廃棄物などに含まれている。
There is no restriction | limiting in particular as a physical property of the said hardly degradable proteolytic protease, According to the objective, it can select suitably, For example, as its pH, it is preferable that it is 9-12, for example, the optimal temperature As, it is preferable that it is 60-70 degreeC.
Among the hardly degradable proteolytic proteases, those having an amino acid sequence represented by YDLVGGDAYYIG (see the list of amino acid sequence table below) have an N-terminal amino acid sequence such as the degrading activity of the hardly degradable protein. In particular, it is preferable.
The persistent protein is as described above, and examples thereof include perchloric acid soluble protein (PSP), abnormal prion protein, keratin, and the like. These persistent proteins are contained in, for example, soot, waste water, organic waste liquid, industrial waste, and the like.
本発明の前記難分解性蛋白質分解用組成物及び前記難分解性蛋白質分解プロテアーゼは、前記難分解性蛋白質の分解に使用することができ、後述する本発明の難分解性蛋白質の分解方法に特に好適に使用することができる。前記難分解性蛋白質又はそれを含む対象に対し、本発明の前記難分解性蛋白質分解用組成物及び前記難分解性蛋白質分解プロテアーゼの少なくともいずれかを作用させると、前記難分解性蛋白質を確実に分解させることができる点で有利である。 The composition for degrading proteolytic protein and the proteolytic protein-degrading protease of the present invention can be used for degrading the non-degradable protein, and particularly in the method for degrading the hardly degradable protein of the present invention described later. It can be preferably used. When the hardly degradable protein or the object containing the same is reacted with at least one of the hardly degradable protein decomposing composition of the present invention and the hardly degradable proteolytic protease, the hardly degradable protein is surely obtained. This is advantageous in that it can be decomposed.
（難分解性蛋白質の分解方法）
本発明の難分解性蛋白質の分解方法は、上述した、本発明の前記難分解性蛋白質プロテアーゼ及び本発明の前記難分解性蛋白質分解用組成物の少なくともいずれかを用いて、前記難分解性蛋白質を分解させることを含み、更に必要に応じて適宜選択したその他の処理を含む。
前記難分解性蛋白質の分解の条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｐＨとしては９〜１２などが好ましく、温度としては６０〜７０℃が好ましい。
なお、前記分解の際には、反応を効率的にすることができる点で、攪拌等を行うのが好ましい。
また、前記難分解性蛋白質に対し、作用させる前記難分解性蛋白質分解プロテアーゼの量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．０２〜０．３ｗ／ｖ％が好ましく、０．６ｗ／ｖ％以上がより好ましい。
(Method of degrading persistent proteins)
The method for degrading a hardly degradable protein according to the present invention comprises using at least one of the above hardly degradable protein protease according to the present invention and the above hardly degradable protein degrading composition according to the present invention. In addition to other processes appropriately selected as necessary.
There is no restriction | limiting in particular as conditions for decomposition | disassembly of the said hardly degradable protein, According to the objective, it can select suitably, For example, 9-12 etc. are preferable as pH, and 60-70 degreeC is preferable as temperature.
In the decomposition, it is preferable to perform stirring or the like from the viewpoint that the reaction can be made efficient.
Further, the amount of the hardly degradable proteolytic protease to be acted on the hardly degradable protein is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is 0.02 to 0.3 w / v. % Is preferable, and 0.6 w / v% or more is more preferable.
前記難分解性蛋白質としては、上述した通りであり、過塩素酸可溶性蛋白質（ＰＳＰ）、異常プリオン蛋白質、ケラチン、などが挙げられる。これらの難分解性蛋白質は、例えば、厨芥、排水、有機廃液、産業廃棄物などに含まれている。
本発明の前記難分解性蛋白質の分解方法は、前記難分解性蛋白質の分解に特に好適に使用することができる。
Examples of the hardly degradable protein are as described above, and examples include perchloric acid soluble protein (PSP), abnormal prion protein, and keratin. These persistent proteins are contained in, for example, soot, waste water, organic waste liquid, industrial waste, and the like.
The method for degrading a hardly degradable protein of the present invention can be used particularly preferably for degrading the hardly degradable protein.
以下、本発明の実施例について説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。 Examples of the present invention will be described below, but the present invention is not limited to these examples.
（実施例１）
−ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株の単離−
採取した土壌１ｇを滅菌した９ｍｌの脱イオン水で希釈し、それを更に１０２、１０３倍に希釈した。次に、各希釈液の０.１ｍｌを後述のコロイダル・キチン寒天培地（Colloidal chitin agar 培地）のプレートに撒き、２７℃で培養した。なお、微生物の識別はコロニーの形状、微生物菌体の顕微鏡観察及び生化学試験により、また、複数の菌株が混じっているときは更に希釈法によって、上述したＡ〜Ｄの菌学的性質を有する菌株を分離した。なお、上述したＡ．形態的性質を観察した際の電子顕微鏡写真を図１に示し、上述したＤ．生育状態を観察した際の電子顕微鏡写真を図２に示した。前記電子顕微鏡写真は、常法に従い、試料を臨界点で乾燥後に金蒸着してから走査型顕微鏡を用いて撮影したものである。
分離した微生物菌株の諸性質は、ストレプトミセス属微生物が所有する諸性質とよく対応したが、従来公知のストレプトミセス属微生物とは、その１６Ｓリボゾーム遺伝子の部分塩基配列（４５９ｂｐ）による相同性が９５％であり、完全に一致しなかったので、この分離微生物菌株を新規微生物と判断し、ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株と命名した。得られたストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株は、平成１５年５月７日に本出願人によって独立行政法人産業技術総合研究所にて寄託され、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３３６が付与された。
Example 1
-Isolation of Streptomyces sp. 99-GP-2D-5 strain-
1 g of the collected soil was diluted with 9 ml of sterilized deionized water, which was further diluted 10 2 , 10 3 times. Next, 0.1 ml of each diluted solution was spread on a plate of a colloidal chitin agar medium (Colloidal chitin agar medium) described later and cultured at 27 ° C. In addition, microorganism identification has the above-mentioned mycological properties by colony shape, microscopic observation of microbial cells and biochemical tests, and further by dilution method when multiple strains are mixed. The strain was isolated. In addition, A. mentioned above. An electron micrograph when morphological properties are observed is shown in FIG. The electron micrograph at the time of observing a growth state was shown in FIG. The electron micrograph is taken using a scanning microscope after the sample is dried at a critical point and then gold is deposited according to a conventional method.
The properties of the isolated microbial strain corresponded well with the properties possessed by the microorganism belonging to the genus Streptomyces, but the homology with the previously known Streptomyces microorganism was 95 by the partial base sequence (459 bp) of the 16S ribosomal gene. % And did not completely match. Therefore, this isolated microbial strain was judged as a novel microorganism and named Streptomyces sp. 99-GP-2D-5. The obtained Streptomyces sp. 99-GP-2D-5 strain was deposited at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology on May 7, 2003 by the present applicant and assigned the accession number FERM P-19336. It was done.
［コロイダル・キチン寒天培地（ｐＨ７．０）組成］
コロイダル・キチン ２ｇ
Ｋ２ＨＰＯ４ ０．７ｇ
ＫＨ２ＰＯ４ ０．３ｇ
ＭｇＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．５ｇ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０１ｇ
ＺｎＳＯ４ ０．００１ｇ
ＭｎＣｌ２ ０．００１ｇ
寒天 ２０ｇ
脱イオン水 １０００ｍｌ
（なお、上記コロイダル・キチンは、微生物実験マニュアル（講談社、協和発酵東京研究所編、１９８６）記載の方法に従って作製した。即ち、粗キチン（和光純薬工業社製）を苛性ソーダ、１Ｎ塩酸で２４時間洗浄した。これを５回ずつ行った後、９５％エタノールで４回洗浄した。こうして得られた白色キチン（１５ｇ）を濃塩酸１００ｍｌ中に入れ、氷で冷やし撹拌した。ガラスウールでろ過したろ液を氷冷水中に注ぎ、キチンの沈殿を形成させた。なお、グラスウール上のものは更に塩酸で処理し、同様な操作を繰り返してキチンを回収した。キチン溶液は一晩放置した後、苛性ソーダでｐＨ７．０に調整し、遠沈で分離、洗浄することによりキチンを回収した。）
[Composition of colloidal chitin agar medium (pH 7.0)]
Colloidal chitin 2g
K 2 HPO 4 0.7g
KH 2 PO 4 0.3 g
MgSO 4 · 5H 2 O 0.5g
FeSO 4 · 7H 2 O 0.01g
ZnSO 4 0.001 g
MnCl 2 0.001 g
Agar 20g
1000ml deionized water
(The colloidal chitin was prepared according to the method described in the Microbial Experiment Manual (Kodansha, Kyowa Hakko Tokyo Laboratory, 1986), ie, crude chitin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) with caustic soda and 1N hydrochloric acid. This was carried out for 5 times and then 4 times with 95% ethanol, and the white chitin thus obtained (15 g) was put into 100 ml of concentrated hydrochloric acid, cooled with ice and stirred, filtered through glass wool. The filtrate was poured into ice-cold water to form a chitin precipitate.The glass wool was further treated with hydrochloric acid, and the same operation was repeated to recover the chitin. Chitin was recovered by adjusting the pH to 7.0 with caustic soda and separating and washing by centrifugation.
（実施例２）
−難分解性蛋白質分解用組成物の調製及び難分解性蛋白質の分解−
ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株を以下のＳＡ培地で２７℃、５日間、液体振とう培養（１８０ｒｐｍ）した。
［ＳＡ培地（ｐＨ７.０）組成］
肉エキス（極東製薬工業社製） ０．３ｇ
トリプトース（Ｄｉｆｃｏ社製） ０．５ｇ
酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製） ０．５ｇ
グルコース（和光純薬工業社製） ０．１ｇ
溶性でんぷん（和光純薬工業社製） ２．４ｇ
ＣａＣＯ３ ０．２ｇ
脱イオン水 １００ｍｌ
(Example 2)
-Preparation of a composition for degradation of persistent proteins and degradation of persistent proteins-
Streptomyces sp. 99-GP-2D-5 strain was subjected to liquid shaking culture (180 rpm) in the following SA medium at 27 ° C. for 5 days.
[SA medium (pH 7.0) composition]
Meat extract (Kyokuto Pharmaceutical Co., Ltd.) 0.3g
Tryptose (Difco) 0.5g
Yeast extract (Difco) 0.5g
Glucose (Wako Pure Chemical Industries) 0.1g
Soluble starch (Wako Pure Chemical Industries) 2.4g
CaCO 3 0.2g
100ml deionized water
培養終了後、前記ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株の菌体を遠心分離により除いた後、培養上清を５５℃で１時間加熱し、前記プロテアーゼ以外の蛋白質を失活させた。こうしてストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株の培養液による本発明の難分解性蛋白質分解用組成物を調製した。
ここで、調製した難分解性蛋白質分解用組成物の、前記難分解性蛋白質の分解活性を以下のようにして調べた。即ち、前記難分解性蛋白質分解用組成物としての、ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株の培養液２０μｌ（０．００３ｍｇ/ｍｌ）と、前記難分解性蛋白質として、文献（J. Biol. Chem., 270, 30060, 1995）記載の方法に準じて調製したブタ肝臓由来蛋白質ＰＳＰ２０μｌ（０．６ｍｇ/ｍｌ）とを混合し、３７℃で６０分間反応させた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって、前記ＰＳＰバンドの消失乃至残存を観察する蛋白質分解試験において該ＰＳＰバンドが消失したかどうかを観察した（なお、前記ＰＳＰバンドの消失乃至残存については、前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で電気泳動させたサンプルをウエスタン・ブロティングしたものを目視にて観察した）。
After completion of the culture, the cells of Streptomyces sp. 99-GP-2D-5 were removed by centrifugation, and then the culture supernatant was heated at 55 ° C. for 1 hour to inactivate proteins other than the protease. . Thus, the composition for degrading proteolytic protein of the present invention using the culture solution of Streptomyces sp. 99-GP-2D-5 was prepared.
Here, the degradation activity of the hardly-degradable protein of the prepared composition for degrading proteolysis was examined as follows. That is, 20 μl (0.003 mg / ml) of the culture solution of Streptomyces sp. 99-GP-2D-5 as the composition for degrading proteolytic degradation, and the literature (J. Biol. Chem., 270, 30060, 1995) was mixed with 20 μl (0.6 mg / ml) of porcine liver-derived protein PSP prepared according to the method described in the method, and reacted at 37 ° C. for 60 minutes, followed by SDS-PAGE. By the SDS-PAGE method, it was observed whether or not the PSP band disappeared in a proteolysis test for observing the disappearance or remaining of the PSP band (in addition, the disappearance or remaining of the PSP band was determined by the SDS-PAGE). Western blotting of the sample electrophoresed by the method was observed visually).
結果を図３（右）に示した。また、対照として、既知のプロテアーゼであるプロテイナーゼＫ（和光純薬工業社製）を用いて同様の蛋白質分解試験を行った結果を図３（左）に示した。図３に示す結果からも明らかなように、前記難分解性蛋白質分解用組成物としての、前記ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株の培養液の場合、ＰＳＰバンドが反応開始から５分間で完全に消失し、該ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株が前記難分解性蛋白質である前記ＰＳＰに対して優れた分解能を有し、難分解性蛋白質分解プロテアーゼの産生能に優れた菌株であることが判った。なお、このことは、前記ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株が、前記難分解性蛋白質を分解可能なプロテアーゼの産生能を有していたことを意味する。
一方、対照である前記プロテイナーゼＫの場合では、３７℃で６０分間反応させた場合にはＢＳＡ（牛血清アルブミン；シグマ社製）は分解できたものの前記ＰＳＰについては分解することができなかった。
The results are shown in FIG. 3 (right). As a control, the results of a similar protein degradation test using proteinase K (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), which is a known protease, are shown in FIG. 3 (left). As is clear from the results shown in FIG. 3, in the case of the culture solution of Streptomyces sp. 99-GP-2D-5 as the composition for persistent protein degradation, the PSP band was 5 from the start of the reaction. The Streptomyces sp. 99-GP-2D-5 strain has an excellent resolution with respect to the PSP, which is the hardly degradable protein, and has the ability to produce a hardly degradable proteolytic protease. It was found to be an excellent strain. This means that the Streptomyces sp. 99-GP-2D-5 strain had the ability to produce a protease capable of degrading the hardly degradable protein.
On the other hand, in the case of the proteinase K as a control, when the reaction was carried out at 37 ° C. for 60 minutes, BSA (bovine serum albumin; manufactured by Sigma) could be decomposed but the PSP could not be decomposed.
上記同様に、前記難分解性蛋白質分解用組成物としての、ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株の培養液２０μｌ（０．００３ｍｇ/ｍｌ）と、前記難分解性蛋白質として、クロイツフェルト・ヤコブ病由来異常プリオン蛋白質（ＣＪＤ）若しくはスクレイピー由来異常プリオン蛋白質２０μｌ（３ｍｇ/ｍｌ）又は４０μｌ（３ｍｇ／ｍｌ）とを混合し、３７℃で６０分間反応させた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって、前記異常プリオン蛋白質バンドの消失乃至残存を観察する蛋白質分解試験において該異常プリオン蛋白質バンドが消失したかどうかを観察した（なお、前記異常プリオン蛋白質バンドの消失乃至残存については、前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で電気泳動させたサンプルをウエスタン・ブロティングしたものを目視にて観察した）。 Similarly to the above, 20 μl (0.003 mg / ml) of the culture solution of Streptomyces sp. 99-GP-2D-5 as the composition for persistent protein degradation, and Creutzfeld as the persistent protein・ Mixed with Jacob disease-derived abnormal prion protein (CJD) or scrapie-derived abnormal prion protein 20 μl (3 mg / ml) or 40 μl (3 mg / ml), reacted at 37 ° C. for 60 minutes, and then by SDS-PAGE method, In a proteolysis test for observing the disappearance or remaining of the abnormal prion protein band, it was observed whether or not the abnormal prion protein band had disappeared (the disappearance or remaining of the abnormal prion protein band was determined by the SDS-PAGE method). Western blotting of electrophoresed sample visually The observed).
結果を４（右）に示した。また、対照として、既知のプロテアーゼであるプロテイナーゼＫ（和光純薬工業社製）を、濃度を変更して（２μｇ／２０μｌ、４μｇ／２０μｌ、１０μｇ/２０μｌ）用いて同様の蛋白質分解試験を行った結果を図４（左）に示した。図４に示す結果からも明らかなように、前記難分解性蛋白質分解用組成物としての、前記ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株の培養液の場合、前記異常プリオン蛋白質バンドが反応開始から５分間で完全に消失し、該ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株が前記難分解性蛋白質である前記異常プリオン蛋白質に対して優れた分解能を有し、難分解性蛋白質分解プロテアーゼの産生能に優れた菌株であることが判った。なお、このことは、前記ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株が、前記難分解性蛋白質を分解可能なプロテアーゼの産生能を有していたことを意味する。
一方、対照である前記プロテイナーゼＫの場合では、３７℃で６０分間反応させても異常プリオン蛋白質を分解することができなかった。
The results are shown in 4 (right). As a control, the same proteolysis test was performed using proteinase K (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), which is a known protease, at different concentrations (2 μg / 20 μl, 4 μg / 20 μl, 10 μg / 20 μl). The results are shown in FIG. 4 (left). As is clear from the results shown in FIG. 4, in the case of the culture solution of Streptomyces sp. 99-GP-2D-5 as the composition for persistent protein degradation, the abnormal prion protein band reacted. It disappears completely within 5 minutes from the start, and the Streptomyces sp. 99-GP-2D-5 strain has an excellent resolution with respect to the abnormal prion protein, which is the persistent protein, and is resistant to proteolysis. It was found that the strain was excellent in protease production ability. This means that the Streptomyces sp. 99-GP-2D-5 strain had the ability to produce a protease capable of degrading the hardly degradable protein.
On the other hand, in the case of the proteinase K as a control, the abnormal prion protein could not be decomposed even when reacted at 37 ° C. for 60 minutes.
上記同様に、前記難分解性蛋白質分解用組成物としての、ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株の培養液２０μｌ（０．００３ｍｇ/ｍｌ）と、前記難分解性蛋白質として、ケラチン２０μｌ（０．６ｍｇ/ｍｌ）とを混合し、３７℃で６０分間反応させた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって、前記ケラチンバンドの消失乃至残存を観察する蛋白質分解試験において該ケラチンバンドが消失したかどうかを観察した（なお、前記ケラチンバンドの消失乃至残存については、前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で電気泳動させたサンプルをウエスタン・ブロティングしたものを目視にて観察した）。 Similarly to the above, 20 μl (0.003 mg / ml) of the culture solution of Streptomyces sp. 99-GP-2D-5 as the composition for degrading proteolytic protein, and 20 μl of keratin as the hardly degradable protein. (0.6 mg / ml) was mixed and reacted at 37 ° C. for 60 minutes, and then whether or not the keratin band disappeared in a proteolysis test for observing disappearance or remaining of the keratin band by SDS-PAGE method (The disappearance or remaining of the keratin band was observed by Western blotting of the sample electrophoresed by the SDS-PAGE method).
結果としては、前記難分解性蛋白質分解用組成物としての、前記ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株の培養液の場合、前記ケラチンバンドが反応開始から５分間で完全に消失し、該ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株が前記難分解性蛋白質である前記ケラチンに対して優れた分解能を有し、難分解性蛋白質分解プロテアーゼの産生能に優れた菌株であることが判った。なお、このことは、前記ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株が、前記難分解性蛋白質を分解可能なプロテアーゼの産生能を有していたことを意味する。
一方、対照である前記プロテイナーゼＫの場合では、３７℃で６０分間反応させてもケラチンを分解することができなかった。
As a result, in the case of the culture solution of the Streptomyces sp. 99-GP-2D-5 strain as the composition for persistent protein degradation, the keratin band completely disappears in 5 minutes from the start of the reaction, The Streptomyces sp. 99-GP-2D-5 strain has an excellent resolution with respect to the keratin, which is the hardly degradable protein, and is a strain excellent in the ability to produce a hardly degradable proteolytic protease. understood. This means that the Streptomyces sp. 99-GP-2D-5 strain had the ability to produce a protease capable of degrading the hardly degradable protein.
On the other hand, in the case of the proteinase K as a control, keratin could not be decomposed even when reacted at 37 ° C. for 60 minutes.
（実施例３）
−難分解性蛋白質分解プロテアーゼの調製−
実施例２で調製した難分解性蛋白質分解用組成物に対し、２０％硫酸アンモニウム沈殿を行い、その沈殿物を除去し、残りの上清に対し、８０％硫酸アンモニウムで飽和し、遠心分離により粗精製酵素を得た。この粗精製酵素を０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に対し透析し、透析内液をＳｅｐｈａｄｅｘ−ＳＰイオン交換により精製した。以上により、実施例２で調製した難分解性蛋白質分解用組成物から難分性蛋白質分解プロテアーゼを得た。
(Example 3)
-Preparation of refractory proteolytic protease-
The hardly degradable proteolytic composition prepared in Example 2 is subjected to 20% ammonium sulfate precipitation, the precipitate is removed, the remaining supernatant is saturated with 80% ammonium sulfate, and is roughly purified by centrifugation. The enzyme was obtained. This crudely purified enzyme was dialyzed against 0.05M phosphate buffer (pH 6.8), and the dialyzed internal solution was purified by Sephadex-SP ion exchange. As described above, a refractory proteolytic protease was obtained from the composition for proteolytic degradation prepared in Example 2.
得られた前記難分解性蛋白質分解プロテアーゼについて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって、前記ＰＳＰ、前記異常プリオン蛋白質、又は前記ケラチンの各バンドの消失乃至残存を観察する蛋白質分解試験を実施例２において、前記難分解性蛋白質分解用組成物としての、ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株の培養液に代えて、得られた前記難分解性蛋白質分解プロテアーゼに代えた以外は、実施例２と同様にして行ったところ、実施例２における前記難分解性蛋白質分解用組成物と同様に、実施例３の難分解性蛋白質分解プロテアーゼも前記難分解性蛋白質の分解活性を有していることが判った。 For the obtained hardly proteolytic proteolytic protease, a proteolytic test for observing disappearance or residual of each band of the PSP, the abnormal prion protein, or the keratin by SDS-PAGE method in Example 2 was performed. The same as in Example 2 except that instead of the culture solution of Streptomyces sp. 99-GP-2D-5 as a degradable protein degrading composition, the obtained hardly degradable proteolytic protease was used. In the same manner as in the composition for degrading proteolytic degradation in Example 2, it was found that the hardly degradable proteolytic protease in Example 3 also has the degrading activity of the hardly degradable protein. It was.
（実施例４）
−難分解性蛋白質分解プロテアーゼの理化学的性質−
実施例３で調製した難分解性蛋白質分解プロテアーゼの至適ｐＨ、至適温度、分子量、末端アミノ酸配列について、以下のようにして調べた。
即ち、実施例３で得られた難分解性蛋白質分解プロテアーゼの至適温度は、ｐＨ１１．５の緩衝液に、前記ＰＳＰと、前記難分解性蛋白質分解プロテアーゼとを加えて５０μｌとし（前記ＰＳＰの濃度は０．６ｍｇ／ｍｌ、前記難分解性蛋白質分解プロテアーゼの濃度は０．００３ｍｇ／ｍｌ）、種々の温度で１０分間インキュベートした後、フェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ：１ｍＭ）を含む２倍希釈のサンプルバッファーを加えて１００℃で５分間加熱し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタンブロットとを行い、イメージアナライザー（富士写真フィルム社製）を用いて得られたバンドをスキャンすることにより調べた。結果を図５（左）示した。
Example 4
-Physicochemical properties of persistent proteolytic proteases-
The optimum pH, optimum temperature, molecular weight, and terminal amino acid sequence of the hardly degradable proteolytic protease prepared in Example 3 were examined as follows.
That is, the optimum temperature of the hardly degradable proteolytic protease obtained in Example 3 was 50 μl by adding the PSP and the hardly degradable proteolytic protease to a pH 11.5 buffer solution (the PSP The concentration is 0.6 mg / ml, the concentration of the hardly proteolytic protease is 0.003 mg / ml), incubated at various temperatures for 10 minutes, and then diluted 2-fold with phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF: 1 mM) The sample buffer was added, heated at 100 ° C. for 5 minutes, subjected to SDS-PAGE and Western blotting, and examined by scanning the band obtained using an image analyzer (Fuji Photo Film Co., Ltd.). The results are shown in FIG. 5 (left).
また、実施例３で得られた難分解性蛋白質分解プロテアーゼの至適ｐＨは、ｐＨ３〜１２までの緩衝液に、前記ＰＳＰと、前記難分解性蛋白質分解プロテアーゼとを加えて５０μｌとし（前記ＰＳＰの濃度は０．６ｍｇ／ｍｌ、前記難分解性蛋白質分解プロテアーゼの濃度は０．００３ｍｇ／ｍｌ）、フェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ：１ｍＭ）を含む２倍希釈のサンプルバッファーを加えて１００℃で５分間加熱し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタンブロットとを行い、イメージアナライザー（富士写真フィルム社製）を用いて得られたバンドをスキャンすることにより調べた。結果を図５（右）に示した。 The optimum pH of the hardly degradable proteolytic protease obtained in Example 3 is 50 μl by adding the PSP and the hardly degradable proteolytic protease to a buffer solution of pH 3 to 12 (the PSP). Concentration of 0.6 mg / ml, the concentration of the hardly proteolytic protease is 0.003 mg / ml), and 2-fold diluted sample buffer containing phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF: 1 mM) is added at 100 ° C. The sample was heated for 5 minutes, subjected to SDS-PAGE and Western blotting, and examined by scanning bands obtained using an image analyzer (Fuji Photo Film Co., Ltd.). The results are shown in FIG. 5 (right).
また、実施例３で得られた難分解性蛋白質分解プロテアーゼの分子量は、マススペクトル分析器（日本電子社製）を用いた質量分析により測定したところ、１９，３２７であった。
また、実施例３で得られた難分解性蛋白質分解プロテアーゼのＮ末端のアミノ酸配列は、ＨＰ Ｇ１００５Ａ プロテイン・シークエンシング・システム（ヒューレット・パッカード社製）を用いたエドマン分解法により測定したところ、ＹＤＬＶＧＧＤＡＹＹＩＧ、で表されるアミノ酸配列（後掲のアミノ酸配列表リスト参照）を有していることが判った。
The molecular weight of the hardly degradable proteolytic protease obtained in Example 3 was 19,327 as measured by mass spectrometry using a mass spectrum analyzer (manufactured by JEOL Ltd.).
Further, the amino acid sequence at the N-terminal of the hardly proteolytic protease obtained in Example 3 was measured by Edman degradation method using HP G1005A protein sequencing system (manufactured by Hewlett-Packard Company). YDLVGGGDAYYIG It has been found that it has an amino acid sequence represented by (see the amino acid sequence table list below).
実施例３で調製した難分解性蛋白質分解プロテアーゼは、Ｎ末端のアミノ酸配列が、Tyr Asp Leu Val Gly Gly Asp Ala Tyr Tyr Ile Gly （ＹＤＬＶＧＧＤＡＹＹＩＧ）（配列番号１）で表される点で、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ. ＹＳＡ−１３０により産生され、ＣＭ−セファデックス・カラムクロマトグラフィー及び結晶化により均一に精製された細胞外アルカリ性セリンプロテアーゼであり、Ｎ末端アミノ酸配列が、Tyr Asp Leu Val Gly Gly Asp Ala Tyr Tyr Met Gly Gly Gly Asp（ＹＤＬＶＧＧＤＡＹＹＭＧＧＧＤ）（配列番号２）で表される既知のＳＡＰとは異なることが判った。
なお、前記ＳＡＰは、分子量が１９，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びゲル濾過で測定）の単量体タンパク質であり、そのアミノ産組成物及びＮ末端配列は、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓプロテアーゼＡ及びＢ、Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ ｅｎｘｙｍｏｇｅｎｅｓ α−溶解プロテアーゼ、及びＮｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ ｓｕｂｓｐ． ｐｒａｓｉｎａ ＯＰＣ−２１０ アルカリ性セリンプロテアーゼＮＤＰ−Ｉなどのその他の細菌性セリンプロテアーゼのアミノ産組成物及びＮ末端配列に酷似し、その至適温度及び至適ｐＨは６０℃及びｐＨ１１．５であり、温度５０℃までｐＨ４〜１２の間で安定的であり、その活性は、Ａｇ＋、Ｈｇ＋、Ｃｏ２＋、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｎ−ブロモこはく酸イミド、ＤＦＰ（diisopropyl N-ethylmaleimide）、ＤＴＮＢ（2,3-ブタンジオン, 5,5'-ジチオビス-(２-nitrobenzonic acid)）、ヨード酢酸、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）、フェニルメタンスルフォニルフルオライド（ＰＭＳＦ）及びフェニルグリオキサールにより阻害されることが報告されている（Biosci. Biotech. Biochem., 58(3), 470-474, 1994参照）。
The hardly degradable proteolytic protease prepared in Example 3 is that the N-terminal amino acid sequence is represented by Tyr Asp Leu Val Gly Gly Asp Ala Tyr Tyr Ile Gly (YDLVGGDAYYIG) (SEQ ID NO: 1). An extracellular alkaline serine protease produced by YSA-130 and purified to homogeneity by CM-Sephadex column chromatography and crystallization, wherein the N-terminal amino acid sequence is Tyr Asp Leu Val Gly Gly Asp Ala Tyr Tyr Met It was found to be different from the known SAP represented by Gly Gly Gly Asp (YDLVGGGDAYYMGGGGD) (SEQ ID NO: 2).
The SAP is a monomeric protein having a molecular weight of 19,000 (measured by SDS-PAGE and gel filtration), and its amino composition and N-terminal sequence are, for example, Streptomyces griseus protease A and B, Lysobacter enzymogenes α-lytic protease, and Nocardiopsis dassonvillei subsp. prasina OPC-210 Amino product of other bacterial serine proteases such as alkaline serine protease NDP-I and the N-terminal sequence closely resembles the optimum temperature and pH of 60 ° C. and pH 11.5. It is stable between pH 4-12 up to 50 ° C. and its activity is Ag + , Hg + , Co 2+ , sodium dodecyl sulfate, N-bromosuccinimide, DFP (diisopropyl N-ethylmaleimide), DTNB (2, Inhibited by 3-butanedione, 5,5'-dithiobis- (2-nitrobenzonic acid)), iodoacetic acid, N-ethylmaleimide (NEM), phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) and phenylglyoxal (See Biosci. Biotech. Biochem., 58 (3), 470-474, 1994).
本発明のストレプトミセス属微生物、難分解性蛋白質分解プロテアーゼ、難分解性蛋白質分解用組成物、及び難分解性蛋白質の分解方法は、厨芥、排水、有機廃液、産業廃棄物などに含まれる、過塩素酸可溶性蛋白質（ＰＳＰ）、異常プリオン、ケラチン等の難分解性蛋白質を効率良く分解し、発生する残渣の発生量を大幅に低減させるのに好適に使用することができる。 The Streptomyces microorganism of the present invention, a hardly degradable proteolytic protease, a hardly degradable protein decomposing composition, and a hardly degradable protein decomposing method are included in waste, waste water, organic waste liquid, industrial waste, etc. It can be suitably used for efficiently degrading hardly degradable proteins such as chloric acid soluble protein (PSP), abnormal prion, keratin and the like, and greatly reducing the amount of generated residue.
Claims (13)
Ａ．形態的性質A. Morphological properties
（１）分枝した基生菌糸より、比較的長い波状の気菌糸を伸長し、稀にかぎ状あるいはループ状を呈する。(1) A relatively long wavy aerial hyphae is elongated from the branched basic hyphae and rarely has a hook or loop shape.
（２）成熟した胞子鎖は１０〜５０個の卵円形の胞子を連鎖し、胞子の大きさは約０.６〜０.７×０.８〜１.０μｍである。(2) The mature spore chain links 10 to 50 oval spore, and the size of the spore is about 0.6 to 0.7 × 0.8 to 1.0 μm.
（３）胞子の表面は平滑である。(3) The spore surface is smooth.
（４）輪生枝、菌束糸、胞子のう及び運動性胞子は認められない。(4) No roticular branch, fungal bundle, spore and motility spore are observed.
Ｂ．細胞壁組成としてＬＬ型の２，６−ジアミノピメリン酸を含有する。B. The cell wall composition contains LL-type 2,6-diaminopimelic acid.
Ｃ．１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子の部分塩基配列（４００〜５００ｂｐ）によるストレプトミセス属放線菌に対する相同性が９０％以上である。C. The homology to Streptomyces genus actinomycetes by the partial base sequence (400 to 500 bp) of the 16S ribosomal RNA gene is 90% or more.
Ｄ．各種培地における生育状態D. Growth conditions in various media
（１）イ−スト・麦芽寒天培地（ＩＳＰ−培地２、２７℃培養）、うす黄［２ｅａ,ＬｔＷｈｅａｔ］の発育上に、灰白［１ｄｃ,Ｐｕｔｔｙ］〜明るいオリーブ灰[１１／２ｇｅ，Ｌｔ Ｏｌｉｖｅ Ｇｒａｙ]の気菌糸を僅かに着生し、可溶性色素は認められない。(1) On the development of yeast malt agar medium (ISP-medium 2, cultured at 27 ° C.) and light yellow [2ea, LtWheat], gray white [1dc, Putty] to bright olive ash [11 / 2ge, Lt Olive] Gray] aerial hyphae are slightly grown, and no soluble pigment is observed.
（２）オ−トミ−ル寒天培地（ＩＳＰ−培地３、２７℃培養）、無色〜うす黄［１１／２ｃａ,Ｃｒｅａｍ］の発育上に、白の気菌糸を僅かに着生し、可溶性色素は認められない。(2) Oatmeal agar medium (ISP-medium 3, cultured at 27 ° C.), colorless to light yellow [11 / 2ca, Cream] on the growth of white aerial mycelia slightly, soluble pigment It is not allowed.
（３）スタ−チ・無機塩寒天培地（ＩＳＰ−培地４、２７℃培養）、無色の発育上に、白の気菌糸を僅かに着生し、可溶性色素は認められない。(3) On a starch / inorganic salt agar medium (ISP-medium 4, 27 ° C. culture), colorless growth, white aerial mycelia grow slightly, and no soluble pigment is observed.
（４）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ＩＳＰ−培地５、２７℃培養）、発育は無色、気菌糸は着生せず、可溶性色素は認められない。(4) Glycerin / asparagine agar medium (ISP-medium 5, 27 ° C. culture), growth is colorless, aerial hyphae do not grow, and no soluble pigment is observed.
（５）シュクロ−ス・硝酸塩寒天培地（２７℃培養）、無色の発育上に、白の気菌糸をうっすらと着生し、可溶性色素は認められない。(5) On a sucrose / nitrate agar medium (27 ° C. culture), colorless growth, white aerial mycelia are slightly formed and no soluble pigment is observed.
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