JP4613318B2 - Utilization of genes involved in silicon absorption - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、植物の生育および硬さを調節するケイ素の吸収に関与する遺伝子の利用に関するものである。 The present invention relates to the use of genes involved in silicon absorption that regulate plant growth and hardness.
多くの植物は、ケイ素（Ｓｉ）を多量に吸収する機能を有していないのに対し、イネやコムギなどの単子葉植物は、ケイ素を多量に吸収する代表的な植物である。ケイ素は、植物の必須元素ではないものの、ケイ素の蓄積量の違いによって、植物の性質は大きく異なる。 Many plants do not have a function of absorbing a large amount of silicon (Si), whereas monocotyledons such as rice and wheat are typical plants that absorb a large amount of silicon. Although silicon is not an essential element of plants, plant properties vary greatly depending on the amount of silicon accumulated.
例えば、ケイ素は、植物の生育に関与しており、ケイ素の蓄積量が多くなると、
（i）病害および虫害に対する抵抗性（例えば、イネのいもち病、紋枯病、および、ごま葉枯病に対する抵抗性）
（ii）耐塩性および耐乾性の向上
（iii）ミネラルストレスに対する耐性（例えば、アルミニウム、および、マンガンなどの無機物による毒性の軽減、または、植物体内でのリン酸の有効利用度の向上など）
等の性質を、植物に与える。
For example, silicon is involved in plant growth, and when the amount of silicon accumulated increases,
(I) Resistance to disease and insect damage (for example, resistance to rice blast, coat blight and sesame leaf blight)
(Ii) Improvement of salt resistance and drought resistance (iii) Resistance to mineral stress (for example, reduction of toxicity due to inorganic substances such as aluminum and manganese, or improvement of effective utilization of phosphoric acid in plants)
And so on.
とりわけ、ケイ素の蓄積量の増加によって、病害や虫害に対する抵抗性が強化されることは、植物の生育が促進される大きな原因となっている。 In particular, the enhancement of resistance to disease and insect damage due to an increase in the amount of accumulated silicon is a major cause of promoting the growth of plants.
従って、ケイ素の蓄積量を増加させることは、植物の健全的な生育、および、安定した収量の確保のために、有効であるといえる。また、ケイ素蓄積量の増加は、生物的ストレス、および、非生物的ストレスなどの種々のストレスの軽減にも、有効であるといえる。 Therefore, it can be said that increasing the amount of accumulated silicon is effective for healthy growth of the plant and ensuring a stable yield. Moreover, it can be said that the increase in the amount of accumulated silicon is also effective in reducing various stresses such as biological stress and abiotic stress.
なお、このような複合ストレスに対する耐性は、葉、茎、または果実の表面などの組織（地上部の組織）に、大量に蓄積したケイ素によって、発揮されるとされている。 In addition, it is said that the tolerance with respect to such a composite stress is exhibited by the silicon | silicone accumulated in large quantities in structures, such as a leaf, a stem, or the surface of a fruit (tissue of a ground part).
また、ケイ素は、植物の硬さにも関与しており、ケイ素の蓄積量が少なくなると、植物は、やわらかくなる。例えば、やわらかいイネは、ケイ素の蓄積量が低い。これは、細胞のケイ素蓄積量が増加するとポリマー（シリカ）が形成され、このポリマーが、細胞を硬くするためである。 Silicon is also involved in the hardness of the plant, and the plant becomes soft when the amount of accumulated silicon is reduced. For example, soft rice has a low silicon accumulation. This is because a polymer (silica) is formed when the silicon accumulation amount of the cells increases, and this polymer hardens the cells.
従って、ケイ素の蓄積量を減少させることは、植物の硬さを変える（やわらかくする）ために、有効であるといえる。 Therefore, it can be said that reducing the amount of accumulated silicon is effective for changing (softening) the hardness of the plant.
このように、植物のケイ素吸収を促進してケイ素の含有量を高くすれば、複合ストレスに対する耐性を植物に付与し、植物の生育を促進することができる。一方、植物のケイ素吸収を抑制してケイ素の含有量を低くすれば、硬い植物をやわらかくすることができる。 Thus, if the silicon absorption of a plant is accelerated | stimulated and silicon content is made high, the tolerance with respect to a composite stress can be provided to a plant and the growth of a plant can be accelerated | stimulated. On the other hand, hard plants can be softened by suppressing the silicon absorption of the plant to lower the silicon content.
本発明者は、ケイ素（ケイ酸）集積性植物であるイネから、既にいくつかのケイ素吸収に関与する遺伝子を同定することに成功している（特許文献１および２）。具体的には、本発明者は、互いにケイ素吸収メカニズムの異なるＬｓｉ１遺伝子およびＬｓｉ２遺伝子を取得している。Ｌｓｉ１遺伝子は、細胞内にケイ素を取り込むトランスポーターとして機能するＬｓｉ１タンパク質をコードしている。一方、Ｌｓｉ２は、細胞の中から外へケイ素を輸送するトランスポーターとして機能するＬｓｉ２タンパク質をコードしている。
しかしながら、特許文献１および２に記載のＬｓｉ１遺伝子およびＬｓｉ２遺伝子だけでは、複雑な植物のケイ素吸収メカニズムを解明することはできない。また、Ｌｓｉ１遺伝子およびＬｓｉ２遺伝子は、いずれもイネから取得されたものであり、イネ以外の植物からはケイ素吸収に関与する遺伝子は知られていない。 However, the Lsi1 gene and Lsi2 gene described in Patent Documents 1 and 2 alone cannot elucidate the silicon absorption mechanism of complex plants. Further, the Lsi1 gene and the Lsi2 gene are both obtained from rice, and no gene involved in silicon absorption is known from plants other than rice.
さらに、Ｌｓｉ１遺伝子およびＬｓｉ２遺伝子は、いずれも根のケイ素吸収を促進することによって、前述のような種々のストレスに対して、ある程度の抵抗性（耐性）を付与することができる。この抵抗性（耐性）をさらに高めるには、根以外の部分（特に地上部）にケイ素を蓄積させることが有効であると考えられる。しかし、Ｌｓｉ１遺伝子およびＬｓｉ２遺伝子は、根以外の部分（特に地上部）にケイ素を蓄積させる機能は有していない。従って、種々のストレスに対して高い抵抗性（耐性）を付与した植物を生産するには、まだまだ改善の余地がある。 Furthermore, both the Lsi1 gene and the Lsi2 gene can impart a certain degree of resistance (resistance) to various stresses as described above by promoting root silicon absorption. In order to further increase the resistance (resistance), it is considered effective to accumulate silicon in parts other than the roots (particularly the above-ground part). However, the Lsi1 gene and the Lsi2 gene do not have a function of accumulating silicon in parts other than the root (particularly the above-ground part). Therefore, there is still room for improvement in order to produce plants with high resistance (resistance) to various stresses.
本発明は、上記従来の問題に鑑みたものであり、その目的は、新規なケイ素吸収に関与するポリヌクレオチドの利用方法を提供することにある。 The present invention has been made in view of the above-described conventional problems, and an object thereof is to provide a novel method for using a polynucleotide involved in silicon absorption.
本発明者等は、イネＬｓｉ１遺伝子を利用して、イネでの相同遺伝子Ｌｓｉ６遺伝子、トウモロコシでの相同遺伝子ＺｍＬｓｉ１遺伝子およびＺｍＬｓｉ６遺伝子を、それぞれ、クローニングするとともに、各遺伝子の機能を明らかにすることに成功し、本発明を完成させるに至った。 Using the rice Lsi1 gene, the present inventors have cloned the homologous gene Lsi6 gene in rice, the homologous genes ZmLsi1 gene and the ZmLsi6 gene in maize, and clarified the function of each gene. It was successful and the present invention was completed.
すなわち、本発明のケイ素吸収が促進された形質転換体の生産方法は、上記の課題を解決するために、下記の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを、発現可能に導入することを特徴としている。 That is, the method for producing a transformant with enhanced silicon absorption according to the present invention introduces any of the following polynucleotides (a) to (d) in an expressible manner in order to solve the above problems. It is characterized by that.
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列からなり、根からケイ素を吸収する活性と根から地上部へケイ素を輸送する活性とを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｄ）以下の（１）または（２）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、根からケイ素を吸収する活性と根から地上部へケイ素を輸送する活性とを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（２）配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
(A) a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
(B) The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted, or added. A polynucleotide encoding a polypeptide having activity to transport silicon;
(C) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1;
(D) an activity of hybridizing under stringent conditions with any of the following polynucleotides (1) or (2) and absorbing silicon from the root and transporting silicon from the root to the ground: A polynucleotide encoding a polypeptide having:
(1) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1;
(2) A polynucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
また、本発明のケイ素吸収が促進された形質転換体の生産方法は、上記の課題を解決するために、下記の（ｅ）〜（ｈ）のいずれかのポリヌクレオチドを、発現可能に導入することを特徴とするものであってもよい。 Moreover, in order to solve said subject, the production method of the transformant by which the silicon absorption of this invention was promoted introduce | transduces the polynucleotide in any one of following (e)-(h) so that expression is possible. It may be characterized by that.
（ｅ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列からなり、根からケイ素を吸収する活性と根から地上部へケイ素を輸送する活性とを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｈ）以下の（３）または（４）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、根からケイ素を吸収する活性と根から地上部へケイ素を輸送する活性とを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
（３）配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（４）配列番号３に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
(E) a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4;
(F) The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted, or added, and has an activity of absorbing silicon from the root and from the root to the aerial part. A polynucleotide encoding a polypeptide having activity to transport silicon;
(G) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 3;
(H) an activity that hybridizes with a polynucleotide of any one of the following (3) and (4) under stringent conditions, absorbs silicon from the root, and transports silicon from the root to the ground part A polynucleotide encoding a polypeptide having:
(3) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 3;
(4) A polynucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 3.
本発明のケイ素吸収が促進された形質転換体の生産方法は、上記の課題を解決するために、下記の（ｉ）〜（ｌ）のいずれかのポリヌクレオチドを、トウモロコシに発現可能に導入することを特徴とするものであってもよい。 In order to solve the above problems, the method for producing a transformant with enhanced silicon absorption according to the present invention introduces any one of the following polynucleotides (i) to (l) so as to be expressed in corn. It may be characterized by that.
（ｉ）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列からなり、表皮に局在化し根のケイ素吸収を促進するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｋ）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｌ）以下の（５）または（６）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、表皮に局在化し根のケイ素吸収を促進するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
（５）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（６）配列番号５に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
(I) a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6;
(J) a polyamino acid sequence consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted, or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, and is localized in the epidermis and promotes root silicon absorption A polynucleotide encoding the peptide;
(K) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 5;
(L) a polynucleotide that hybridizes with a polynucleotide of any one of the following (5) and (6) under a stringent condition and encodes a polypeptide that is localized in the epidermis and promotes root silicon absorption :
(5) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 5;
(6) A polynucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 5.
本発明の形質転換体の生産方法では、上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを、イネに発現可能に導入することが好ましい。 In the method for producing a transformant of the present invention, it is preferable that any one of the polynucleotides (a) to (d) is introduced into rice so that it can be expressed.
本発明の形質転換体の生産方法では、上記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかのポリヌクレオチドを、トウモロコシに発現可能に導入することが好ましい。 In the method for producing a transformant of the present invention, it is preferable that any one of the polynucleotides (e) to (h) is introduced into maize so that it can be expressed.
本発明のケイ素吸収が抑制された形質転換体の生産方法は、上記の課題を解決するために、下記の（ｍ）〜（ｐ）のいずれかのポリヌクレオチドの発現を抑制することを特徴としている。 The method for producing a transformant in which silicon absorption is suppressed according to the present invention is characterized in that the expression of any one of the following polynucleotides (m) to (p) is suppressed in order to solve the above problems. Yes.
（ｍ）配列番号２または４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｎ）配列番号２または４に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列からなり、根からケイ素を吸収する活性と根から地上部へケイ素を輸送する活性とを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｏ）配列番号１または３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｐ）以下の（７）または（８）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、根からケイ素を吸収する活性と根から地上部へケイ素を輸送する活性とを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
（７）配列番号１または３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または、
（８）配列番号１または３に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
(M) a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4;
(N) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4, it consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted or added, and has an activity to absorb silicon from the root and the ground to the ground A polynucleotide encoding a polypeptide having an activity to transport silicon to a moiety;
(O) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3;
(P) an activity to hybridize with a polynucleotide of any one of the following (7) or (8) under stringent conditions, and to absorb silicon from the root and to transport silicon from the root to the ground part A polynucleotide encoding a polypeptide having:
(7) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3, or
(8) A polynucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3.
本発明の飼料用イネの生産方法は、上記の課題を解決するために、下記の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドの発現を抑制することを特徴としている。 The method for producing feed rice of the present invention is characterized in that the expression of any one of the following polynucleotides (a) to (d) is suppressed in order to solve the above problems.
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列からなり、根からケイ素を吸収する活性と根から地上部へケイ素を輸送する活性とを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｄ）以下の（１）または（２）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、根からケイ素を吸収する活性と根から地上部へケイ素を輸送する活性とを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または、
（２）配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
(A) a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
(B) The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted, or added. A polynucleotide encoding a polypeptide having activity to transport silicon;
(C) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1;
(D) an activity of hybridizing under stringent conditions with any of the following polynucleotides (1) or (2) and absorbing silicon from the root and transporting silicon from the root to the ground: A polynucleotide encoding a polypeptide having:
(1) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, or
(2) A polynucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
本発明のバイオマス燃料製造用トウモロコシの生産方法は、上記の課題を解決するために、下記の（ｅ）〜（ｈ）のいずれかのポリヌクレオチドの発現を抑制することを特徴としている。 The method for producing corn for producing biomass fuel according to the present invention is characterized by suppressing the expression of any one of the following polynucleotides (e) to (h) in order to solve the above problems.
（ｅ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列からなり、根からケイ素を吸収する活性と根から地上部へケイ素を輸送する活性とを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｈ）以下の（３）または（４）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、根からケイ素を吸収する活性と根から地上部へケイ素を輸送する活性とを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
（３）配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または、
（４）配列番号３に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
(E) a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4;
(F) The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted, or added, and has an activity of absorbing silicon from the root and from the root to the aerial part. A polynucleotide encoding a polypeptide having activity to transport silicon;
(G) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 3;
(H) an activity that hybridizes with a polynucleotide of any one of the following (3) and (4) under stringent conditions, absorbs silicon from the root, and transports silicon from the root to the ground part A polynucleotide encoding a polypeptide having:
(3) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 3; or
(4) A polynucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 3.
本発明のケイ素吸収が抑制された形質転換体の生産方法は、上記の課題を解決するために、トウモロコシに対し、下記の（ｉ）〜（ｌ）のいずれかのポリヌクレオチドの発現抑制することを特徴としている。 In order to solve the above problems, the method for producing a transformant with suppressed silicon absorption according to the present invention suppresses the expression of any of the following polynucleotides (i) to (l) with respect to corn: It is characterized by.
（ｉ）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列からなり、表皮に局在化し根のケイ素吸収を促進するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｋ）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｌ）以下の（５）または（６）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、表皮に局在化し根のケイ素吸収を促進するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
（５）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（６）配列番号５に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
(I) a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6;
(J) a polyamino acid sequence consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted, or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, and is localized in the epidermis and promotes root silicon absorption A polynucleotide encoding the peptide;
(K) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 5;
(L) a polynucleotide that hybridizes with a polynucleotide of any one of the following (5) and (6) under a stringent condition and encodes a polypeptide that is localized in the epidermis and promotes root silicon absorption :
(5) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 5;
(6) A polynucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 5.
このように、（ａ）〜（ｌ）の遺伝子は、ケイ素吸収を促進する遺伝子である。これにより、（ａ）〜（ｌ）のいずれかの遺伝子を導入し、その遺伝子を発現させれば、ケイ素吸収が促進される。従って、ケイ素蓄積量の高い形質転換体を生産することができる。 Thus, the genes (a) to (l) are genes that promote silicon absorption. Thus, if any of the genes (a) to (l) is introduced and the gene is expressed, silicon absorption is promoted. Therefore, a transformant having a high silicon accumulation amount can be produced.
特に、（ａ）〜（ｈ）の遺伝子は、根から吸収したケイ素を地上部に蓄積させる機能を有する。すなわち、（ａ）〜（ｈ）の遺伝子は、根からケイ素を吸収する活性と根から地上部へケイ素を輸送する活性とを有する。これにより、形質転換体のケイ素蓄積量を高めることができる。ケイ素蓄積量の増加は、植物に病害および虫害などの種々のストレスに対する耐性（抵抗性）を付与し、生育を促進させる。このため、ケイ素吸収を促進した形質転換体を利用すれば、農薬および化学肥料を極力使用せずに、より安全性の高い形質転換体を栽培することができる。また、より安全性の高い食料として提供することができる。 In particular, the genes (a) to (h) have a function of accumulating silicon absorbed from roots in the above-ground part. That is, the genes (a) to (h) have an activity of absorbing silicon from the root and an activity of transporting silicon from the root to the above-ground part. Thereby, the silicon accumulation amount of a transformant can be raised. An increase in the amount of silicon accumulation imparts resistance (resistance) to various stresses such as disease and insect damage to plants and promotes growth. For this reason, if the transformant which accelerated | stimulated silicon absorption is utilized, a more safe transformant can be cultivated, without using an agricultural chemical and a chemical fertilizer as much as possible. It can also be provided as safer food.
一方、（ａ）〜（ｌ）の遺伝子の発現を抑制すれば、ケイ素吸収を抑制することができる。これにより、形質転換体のケイ素蓄積量を低下させることができる。ケイ素蓄積量の減少は、硬い植物をやわらかくする。このため、ケイ素吸収を抑制した形質転換植物は、家畜飼料に利用することができる。さらに、バイオエタノールをはじめとするバイオマス燃料製造用の資源としても利用することができる。 On the other hand, if the expression of the genes (a) to (l) is suppressed, silicon absorption can be suppressed. Thereby, the silicon accumulation amount of a transformant can be reduced. Decreasing silicon accumulation softens hard plants. For this reason, the transformed plant which suppressed silicon absorption can be utilized for livestock feed. Furthermore, it can be used as a resource for producing biomass fuel including bioethanol.
本発明によれば、ケイ素吸収に関与するポリペプチドを、発現させるまたは発現を抑制することによって、ケイ素吸収が促進または抑制された形質転換体を生産することができる。 According to the present invention, a transformant in which silicon absorption is promoted or suppressed can be produced by expressing or suppressing expression of a polypeptide involved in silicon absorption.
従って、ケイ素蓄積量を増加させることにより、植物に病害および虫害などの種々のストレスに対する耐性（抵抗性）を付与し、生育を促進させた形質転換体を生産することができる。 Therefore, by increasing the silicon accumulation amount, it is possible to produce a transformant that imparts resistance (resistance) to various stresses such as disease and insect damage to plants and promotes growth.
一方、ケイ素蓄積量を減少させることにより、植物体をやわらかくし、家畜飼料やバイオマス燃料用の原料資源として利用できる形質転換体を生産することができる。 On the other hand, by reducing the silicon accumulation amount, it is possible to soften the plant body and produce a transformant that can be used as a raw material resource for livestock feed or biomass fuel.
本発明は、イネまたはトウモロコシから新たに取得した、ケイ素吸収に関与するポリヌクレオチド（Ｌｓｉ６遺伝子，ＺｍＬｓｉ６遺伝子，ＺｍＬｓｉ１遺伝子）の利用方法に関するものである。以下では、ケイ素吸収に関与する遺伝子の発現を制御することによって、ケイ素吸収機能が促進または抑制された形質転換体を生産する方法と、その利用方法について説明する。 The present invention relates to a method of using a polynucleotide (Lsi6 gene, ZmLsi6 gene, ZmLsi1 gene) newly obtained from rice or corn and involved in silicon absorption. Hereinafter, a method for producing a transformant in which the silicon absorption function is promoted or suppressed by controlling the expression of a gene involved in silicon absorption and a method for using the transformant will be described.
Ａ．本発明の形質転換体の生産方法
本発明の形質転換体の生産方法は、（ｉ）ケイ素吸収に関与するポリヌクレオチドを発現させることによる、ケイ素吸収が促進された形質転換体の生産と、（ｉｉ）ケイ素吸収に関与するポリヌクレオチドの発現を抑制することによる、ケイ素吸収が抑制された形質転換体の生産とを含んでいる。
A. Method for producing transformant of the present invention The method for producing the transformant of the present invention comprises: (i) production of a transformant in which silicon absorption is promoted by expressing a polynucleotide involved in silicon absorption; ii) production of transformants in which silicon absorption is suppressed by suppressing expression of polynucleotides involved in silicon absorption.
＜Ａ−１＞ケイ素吸収が促進された形質転換体の生産方法
ケイ素吸収が促進された形質転換体の生産方法は、下記の（ａ）〜（ｌ）のいずれかのポリヌクレオチドを、発現可能に導入する工程を含んでいる。
<A-1> Method for producing transformant with enhanced silicon absorption The method for producing a transformant with enhanced silicon absorption can express any one of the following polynucleotides (a) to (l): The process to introduce in is included.
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列からなり、根からケイ素を吸収する活性と根から地上部へケイ素を輸送する活性とを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｄ）以下の（１）または（２）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、根からケイ素を吸収する活性と根から地上部へケイ素を輸送する活性とを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（２）配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
(A) a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
(B) The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted, or added. A polynucleotide encoding a polypeptide having activity to transport silicon;
(C) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1;
(D) an activity of hybridizing under stringent conditions with any of the following polynucleotides (1) or (2) and absorbing silicon from the root and transporting silicon from the root to the ground: A polynucleotide encoding a polypeptide having:
(1) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1;
(2) A polynucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
（ｅ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列からなり、根からケイ素を吸収する活性と根から地上部へケイ素を輸送する活性とを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｈ）以下の（３）または（４）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、根からケイ素を吸収する活性と根から地上部へケイ素を輸送する活性とを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
（３）配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（４）配列番号３に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
(E) a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4;
(F) The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted, or added, and has an activity of absorbing silicon from the root and from the root to the aerial part. A polynucleotide encoding a polypeptide having activity to transport silicon;
(G) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 3;
(H) an activity that hybridizes with a polynucleotide of any one of the following (3) and (4) under stringent conditions, absorbs silicon from the root, and transports silicon from the root to the ground part A polynucleotide encoding a polypeptide having:
(3) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 3;
(4) A polynucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 3.
（ｉ）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列からなり、表皮に局在化し根のケイ素吸収を促進するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｋ）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｌ）以下の（５）または（６）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、表皮に局在化し根のケイ素吸収を促進するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
（５）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（６）配列番号５に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
(I) a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6;
(J) a polyamino acid sequence consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted, or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, and is localized in the epidermis and promotes root silicon absorption A polynucleotide encoding the peptide;
(K) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 5;
(L) a polynucleotide that hybridizes with a polynucleotide of any one of the following (5) and (6) under a stringent condition and encodes a polypeptide that is localized in the epidermis and promotes root silicon absorption :
(5) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 5;
(6) A polynucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 5.
上記のポリヌクレオチドのうち、配列番号１、３、５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、イネまたはトウモロコシから本発明者等によって新たに同定された、ケイ素吸収に関与する（ケイ素吸収を促進する）遺伝子である。また、配列番号２、４、６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、配列番号１、３、５の遺伝子の翻訳産物である。すなわち、配列番号２、４、６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、イネまたはトウモロコシから本発明者等によって新たに同定された、ケイ素吸収に関与する（ケイ素吸収を促進する）タンパク質である。 Among the above-mentioned polynucleotides, the polynucleotide consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1, 3, and 5 is involved in silicon absorption newly identified by the present inventors from rice or maize (promoting silicon absorption). It is a gene. Moreover, the polypeptide consisting of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 2, 4, and 6 is a translation product of the genes of SEQ ID NOs: 1, 3, and 5. That is, the polypeptide consisting of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 2, 4, and 6 is a protein newly involved in silicon absorption (promoting silicon absorption) newly identified by the present inventors from rice or maize. .
なお、配列番号と、配列表中の配列表中の塩基配列またはアミノ酸配列との対応関係は、下記の通りである。
・配列番号１は、イネ由来のＬｓｉ６遺伝子（ｃＤＮＡ）の塩基配列である。
・配列番号２は、配列番号１のＬｓｉ６遺伝子にコードされるポリペプチド（Ｌｓｉ６タンパク質）のアミノ酸配列である。
・配列番号３は、トウモロコシ由来のＺｍＬｓｉ６遺伝子(ｃＤＮＡ)の塩基配列である。
・配列番号４は、配列番号３のＺｍＬｓｉ６遺伝子にコードされるポリペプチド（ＺｍＬｓｉ６タンパク質）のアミノ酸配列である。
・配列番号５は、トウモロコシ由来のＺｍＬｓｉ１遺伝子(ｃＤＮＡ)の塩基配列である。
・配列番号６は、配列番号５のＺｍＬｓｉ１遺伝子にコードされるポリペプチド（ＺｍＬｓｉ１タンパク質）のアミノ酸配列である。
・配列番号７は、イネ由来のＬｓｉ１遺伝子（ｃＤＮＡ）の塩基配列である。
・配列番号８は、配列番号７のＬｓｉ１遺伝子にコードされるポリペプチド（Ｌｓｉ１タンパク質）のアミノ酸配列である。
・配列番号９は、イネ由来のＬｓｉ２遺伝子（ｃＤＮＡ）の塩基配列である。
・配列番号１０は、配列番号９のＬｓｉ２遺伝子にコードされるポリペプチド（Ｌｓｉ２タンパク質）のアミノ酸配列である。
The correspondence between the SEQ ID No. and the base sequence or amino acid sequence in the sequence listing in the sequence listing is as follows.
SEQ ID NO: 1 is the base sequence of the rice-derived Lsi6 gene (cDNA).
SEQ ID NO: 2 is an amino acid sequence of a polypeptide (Lsi6 protein) encoded by the Lsi6 gene of SEQ ID NO: 1.
-SEQ ID NO: 3 is the base sequence of ZmLsi6 gene (cDNA) derived from corn.
SEQ ID NO: 4 is an amino acid sequence of a polypeptide (ZmLsi6 protein) encoded by the ZmLsi6 gene of SEQ ID NO: 3.
SEQ ID NO: 5 is the base sequence of the corn-derived ZmLsi1 gene (cDNA).
SEQ ID NO: 6 is the amino acid sequence of the polypeptide (ZmLsi1 protein) encoded by the ZmLsi1 gene of SEQ ID NO: 5.
SEQ ID NO: 7 is the base sequence of rice-derived Lsi1 gene (cDNA).
SEQ ID NO: 8 is an amino acid sequence of a polypeptide (Lsi1 protein) encoded by the Lsi1 gene of SEQ ID NO: 7.
SEQ ID NO: 9 is the base sequence of rice-derived Lsi2 gene (cDNA).
SEQ ID NO: 10 is an amino acid sequence of a polypeptide (Lsi2 protein) encoded by the Lsi2 gene of SEQ ID NO: 9.
なお、本発明において、「ケイ素吸収」とは、ケイ素およびケイ素を含む化合物（ケイ酸など）を吸収することを示すものとする。例えば、植物は、通常、ケイ酸としてケイ素を吸収する。 In the present invention, “silicon absorption” means absorption of silicon and a compound containing silicon (such as silicic acid). For example, plants typically absorb silicon as silicic acid.
また、上記「ポリヌクレオチド」は、「核酸」または「核酸分子」とも換言でき、ヌクレオチドの重合体が意図されている。また、「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」とも換言でき、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。また、「配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド」とは、配列番号１の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃおよび／またはＴによって示される配列からなるポリヌクレオチドを示している。 The “polynucleotide” can also be referred to as “nucleic acid” or “nucleic acid molecule”, and is intended to be a polymer of nucleotides. The “base sequence” can also be referred to as “nucleic acid sequence” or “nucleotide sequence”, and is indicated as a sequence of deoxyribonucleotides (abbreviated as A, G, C, and T). The “polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1” indicates a polynucleotide consisting of the sequence shown by each deoxynucleotide A, G, C and / or T of SEQ ID NO: 1.
上記「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であっても、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であってもよい。また、ＤＮＡには例えばクローニングや化学合成技術またはそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。 The “polynucleotide” may be present in the form of RNA (eg, mRNA) or in the form of DNA (eg, cDNA or genomic DNA). The DNA may be double-stranded or single-stranded. Single-stranded DNA or RNA may be the coding strand (also known as the sense strand) or the non-coding strand (also known as the antisense strand). Further, DNA includes, for example, cDNA and genomic DNA obtained by cloning, chemical synthesis techniques, or a combination thereof.
上記ポリヌクレオチドを取得する方法は、特に限定されるものではないが、公知の技術により、上記ポリヌクレオチドまたはその一部の配列を含むオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングする方法が挙げられる。例えば、上記ポリヌクレオチドの塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、上記ポリヌクレオチドの塩基配列またはその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列および／または長さのものを用いてもよい。 The method for obtaining the polynucleotide is not particularly limited, and examples thereof include a method for isolating and cloning a DNA fragment containing an oligonucleotide containing the polynucleotide or a partial sequence thereof by a known technique. . For example, a probe that specifically hybridizes with a part of the base sequence of the polynucleotide may be prepared, and a genomic DNA library or cDNA library may be screened. Such a probe may be of any sequence and / or length as long as it specifically hybridizes to at least a part of the base sequence of the polynucleotide or its complementary sequence.
また、上記ポリヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法によっても取得することができる。例えば、上記（ａ）〜（ｈ）のポリヌクレオチドのｃＤＮＡのうち、５’側および３’側の配列（またはその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することによって、上記のポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。また、例えば、公知の日本晴またはトウモロコシの配列情報に基づいて、Ｌｓｉ６遺伝子、ＺｍＬｓｉ６遺伝子、ＺｍＬｓｉ１遺伝子領域を増幅できるようなプライマーを設計し、そのプライマーを用いて、ゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）またはＲＴ−ＰＣＲ産物を鋳型にして、各遺伝子領域を増幅することによっても、取得することができる。 The polynucleotide can also be obtained by a method using amplification means such as PCR. For example, among the cDNAs of the polynucleotides (a) to (h) above, primers are prepared from 5 ′ side and 3 ′ side sequences (or their complementary sequences), and genomic DNA ( Alternatively, a large amount of DNA fragments containing the above-mentioned polynucleotide can be obtained by performing PCR or the like using a cDNA) or the like as a template and amplifying a DNA region sandwiched between both primers. Further, for example, a primer capable of amplifying the Lsi6 gene, ZmLsi6 gene, and ZmLsi1 gene region is designed based on known Nipponbare or maize sequence information, and genomic DNA (or cDNA) or RT- It can also be obtained by amplifying each gene region using the PCR product as a template.
上記ポリヌクレオチドを取得するための供給源としては、特に限定されないが、イネ科植物（イネ、トウモロコシなど）であることが好ましい。 Although it does not specifically limit as a supply source for acquiring the said polynucleotide, It is preferable that it is a gramineous plant (rice, corn, etc.).
また、上記「ストリンジェントな条件」とは、少なくとも90％の同一性、好ましくは少なくとも95％の同一性、最も好ましくは少なくとも97％の同一性が配列間に存在するときにのみハイブリダイゼーションが起こることを意味し、例えば、60℃で2×SSC 洗浄条件下で結合することを意味する。上記ハイブリダイゼーションは、「Molecular Cloning (Third Edition)」 (J. Sambrook & D. W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001) に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる。 Also, the above “stringent conditions” means that hybridization occurs only when at least 90% identity, preferably at least 95% identity, most preferably at least 97% identity exists between sequences. For example, binding at 60 ° C. under 2 × SSC wash conditions. The hybridization can be performed by a conventionally known method such as the method described in “Molecular Cloning (Third Edition)” (J. Sambrook & D. W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001). Generally, the higher the temperature and the lower the salt concentration, the higher the stringency.
また、上記「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」とも換言できる。なお、配列番号２、４、６に示されるポリペプチドは、配列番号１、３、５に示されるポリヌクレオチドの翻訳産物であり、少なくともケイ素吸収に関与するものである。 The “polypeptide” can also be referred to as “peptide” or “protein”. The polypeptides shown in SEQ ID NOs: 2, 4, and 6 are translation products of the polynucleotides shown in SEQ ID NOs: 1, 3, and 5, and are at least involved in silicon absorption.
さらに、上記「ポリペプチド」は、天然供給源より単離されても、化学合成されてもよい。ここで、「単離された」ポリペプチドは、その天然の環境から取り出されたポリペプチドを示す。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生されたポリペプチドは、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリペプチドと同様に、単離されたものとする。 Furthermore, the “polypeptide” may be isolated from natural sources or chemically synthesized. Here, an “isolated” polypeptide refers to a polypeptide that has been removed from its natural environment. For example, a recombinantly produced polypeptide expressed in a host cell shall be isolated as well as a natural or recombinant polypeptide that has been substantially purified by any suitable technique.
従って、上記「ポリペプチド」は、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。組換え産生手順において用いられる宿主によっては、上記ポリペプチドは、グリコシル化など、糖鎖修飾される場合もある。つまり、上記ポリペプチドには、このような修飾されたポリペプチドも含まれる。 Thus, the “polypeptide” refers to natural purified products, products of chemical synthesis procedures, and prokaryotic or eukaryotic hosts (eg, bacterial cells, yeast cells, higher plant cells, insect cells, and mammalian cells). Product) produced by recombinant technology. Depending on the host used in the recombinant production procedure, the polypeptide may be glycosylated such as glycosylation. That is, the polypeptide includes such a modified polypeptide.
上記「１または数個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ポリペプチド作製法により欠失、置換、または付加ができる程度の数（例えば２０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下、特に好ましくは３個以下）のアミノ酸が置換、欠失、または付加されることを意味する。このような変異ポリペプチドは、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するポリペプチドに限定されるものではなく、天然に存在する同様の変異ポリペプチドを単離精製したものであってもよい。 The above “one or several amino acids are deleted, substituted, or added” means that deletion, substitution, or addition can be performed by a known mutant polypeptide production method such as site-directed mutagenesis. It means that several (for example, 20 or less, preferably 10 or less, more preferably 7 or less, more preferably 5 or less, particularly preferably 3 or less) amino acids are substituted, deleted, or added. . Such a mutant polypeptide is not limited to a polypeptide having a mutation artificially introduced by a known mutant polypeptide production method, but is a product obtained by isolating and purifying a similar naturally occurring mutant polypeptide. It may be.
ここで、ケイ素吸収が促進された形質転換体の生産方法は、（ａ）〜（ｌ）のいずれかのポリヌクレオチド、または、そのポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターが導入されており、かつ、ケイ素吸収に関与するポリペプチドを発現させるものであれば、特に限定されるものではない。 Here, in the method for producing a transformant in which silicon absorption is promoted, the polynucleotide of any one of (a) to (l) or a recombinant expression vector containing the polynucleotide is introduced, and There is no particular limitation as long as it can express a polypeptide involved in silicon absorption.
ここで、上記「形質転換体」は、細胞・組織・器官のみならず、生物個体を含む意味である。また、本発明では、「形質転換体」は主として植物であり、この植物の範疇には、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれる。 Here, the “transformant” means not only cells / tissues / organs but also individual organisms. In the present invention, the “transformant” is mainly a plant, and the category of this plant includes various forms of plant cells, such as suspension culture cells, protoplasts, leaf sections, and callus.
上記「組換え発現ベクター」は、（ａ）〜（ｌ）のいずれかのポリヌクレオチドを含むものであれば、その種類は特に限定されるものではない。例えば、配列番号１、３、または５に示すｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクターが挙げられる。組換え発現ベクターの作製には、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いることができるが特に限定されるものではない。また、作製方法も公知の方法を用いて行えばよい。 The type of the “recombinant expression vector” is not particularly limited as long as it includes any of the polynucleotides (a) to (l). For example, a recombinant expression vector into which the cDNA shown in SEQ ID NO: 1, 3, or 5 is inserted can be mentioned. For the production of a recombinant expression vector, a plasmid, phage, cosmid or the like can be used, but is not particularly limited. In addition, a manufacturing method may be performed using a known method.
すなわち、上記「組換え発現ベクター」は、ホスト細胞（対象細胞または宿主細胞）の種類に応じて、（ａ）〜（ｌ）のいずれかのポリヌクレオチドを確実に発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、選択したプロモーターと（ａ）〜（ｌ）のいずれかのポリヌクレオチドとを各種プラスミド等に組み込んだベクターを組換え発現ベクターとして用いればよい。 That is, the above-mentioned “recombinant expression vector” has an appropriate promoter sequence for reliably expressing any one of the polynucleotides (a) to (l) according to the type of host cell (target cell or host cell). A vector in which the selected promoter and the selected promoter (a) to (l) are incorporated into various plasmids may be used as the recombinant expression vector.
なお、植物体の形質転換に用いられる組換え発現ベクターは、当該植物細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば、特に限定されるものではない。特に、植物体へのベクターの導入法がアグロバクテリウムを用いる方法である場合には、ｐＢＩ系等のバイナリーベクターを用いることが好ましい。バイナリーベクターとしては、具体的には、例えば、ｐＢＩＧ、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ２２１等を挙げることができる。また、植物体内で遺伝子を発現させることが可能なプロモーターを有するベクターであることが好ましい。プロモーターとしては公知のプロモーターを好適に用いることができ、具体的には、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ）、ユビキチンプロモーターやアクチンプロモーターを挙げることができる。 In addition, the recombinant expression vector used for transformation of a plant body will not be specifically limited if an insertion gene can be expressed in the said plant cell. In particular, when the method of introducing a vector into a plant is a method using Agrobacterium, it is preferable to use a binary vector such as pBI. Specific examples of the binary vector include pBIG, pBIN19, pBI101, pBI121, pBI221, and the like. A vector having a promoter capable of expressing a gene in a plant is preferable. A known promoter can be preferably used as the promoter, and specific examples include cauliflower mosaic virus 35S promoter (CaMV35S), ubiquitin promoter and actin promoter.
ここで、「ポリヌクレオチドまたは組換え発現ベクターが導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、ホスト細胞内に発現可能に導入されることを意味する。 Here, “the polynucleotide or the recombinant expression vector has been introduced” means that it is introduced into a host cell so as to be expressed by a known genetic engineering technique (gene manipulation technique).
上記ポリヌクレオチドまたは組換え発現ベクターをホスト細胞に導入する方法、すなわち形質転換方法も特に限定されるものではなく、アグロバクテリウム感染法、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、リン酸カルシウム法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、およびパーティクルガン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。 A method for introducing the polynucleotide or the recombinant expression vector into a host cell, that is, a transformation method is not particularly limited. Agrobacterium infection method, electroporation method (electroporation method), calcium phosphate method, protoplast method Conventionally known methods such as lithium acetate method and particle gun method can be preferably used.
上記ポリヌクレオチドがホスト細胞に導入されたか否か、さらにはホスト細胞中で確実に発現しているか否かを確認するために、各種マーカーを用いてもよい。例えば、ハイグロマイシンのような抗生物質に抵抗性を与える薬剤耐性遺伝子をマーカーとして用い、このマーカーと本発明にかかるポリヌクレオチドとを含むプラスミド等を発現ベクターとしてホスト細胞に導入する。これによってマーカー遺伝子の発現から本発明の遺伝子の導入を確認することができる。 Various markers may be used to confirm whether or not the polynucleotide has been introduced into the host cell, and whether or not the polynucleotide is reliably expressed in the host cell. For example, a drug resistance gene that gives resistance to antibiotics such as hygromycin is used as a marker, and a plasmid containing this marker and the polynucleotide according to the present invention is introduced into a host cell as an expression vector. Thus, the introduction of the gene of the present invention can be confirmed from the expression of the marker gene.
上記ホスト細胞は、ケイ素吸収能を有する細胞、生物であれば、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、イネ，トウモロコシ，きゅうり，アブラナ，またはトマト等の植物細胞を挙げることができるが、特に限定されるものではない。また、植物細胞に限らず、例えば、大腸菌等の細菌細胞、酵母細胞、線虫、アフリカツメガエルの卵母細胞、哺乳類由来の細胞等を適用してもよい。上記のホスト細胞のための適切な培養培地および条件は当分野で周知であり、特に限定されるものではない。 The host cell is not particularly limited as long as it is a cell or organism having silicon absorption ability, and various conventionally known cells can be suitably used. Specific examples include plant cells such as rice, corn, cucumber, rape, or tomato, but are not particularly limited. Further, not limited to plant cells, for example, bacterial cells such as E. coli, yeast cells, nematodes, Xenopus oocytes, mammalian cells, and the like may be applied. Suitable culture media and conditions for the above host cells are well known in the art and are not particularly limited.
なお、Ｌｓｉ６遺伝子はイネ由来であるため、上記（ａ）〜（ｄ）のポリペプチドを導入するホスト細胞もイネであることが好ましいが、当然イネ以外のホスト細胞にも適用してもよい。同様に、ＺｍＬｓｉ１遺伝子およびＺｍＬｓｉ１遺伝子はトウモロコシ由来であるため、上記（ｅ）〜（ｌ）のいずれかのポリヌクレオチドを導入するホスト細胞もトウモロコシであることが好ましいが、当然トウモロコシ以外のホスト細胞にも適用してもよい。 In addition, since the Lsi6 gene is derived from rice, it is preferable that the host cell into which the polypeptides (a) to (d) are introduced is also rice, but naturally it may be applied to host cells other than rice. Similarly, since the ZmLsi1 gene and the ZmLsi1 gene are derived from corn, the host cell into which any of the polynucleotides (e) to (l) described above is preferably introduced is also corn. May also be applied.
このようにして生産された形質転換体は、上記（ａ）〜（ｌ）のいずれかのポリヌクレオチドまたは上記の組換え発現ベクターが導入されており、かつ、ケイ素吸収に関与するポリペプチドを発現しているものである。すなわち、生産された形質転換体に、上記（ａ）〜（ｄ）のポリヌクレオチドが導入さていれば、イネ由来のＬｓｉ６関連遺伝子を発現し、上記（ｅ）〜（ｈ）のポリヌクレオチドが導入されていれば、トウモロコシ由来のＺｍＬｓｉ６関連遺伝子を発現し、、上記（ｉ）〜（ｌ）のポリヌクレオチドが導入されれば、トウモロコシ由来のＺｍＬｓｉ１関連遺伝子を発現する。これにより、ケイ素吸収を促進するポリペプチドが発現する。その結果、形質転換体のケイ素の蓄積量を増加させることができる。 The transformant produced as described above is introduced with the polynucleotide of any one of (a) to (l) above or the above recombinant expression vector, and expresses a polypeptide involved in silicon absorption. It is what you are doing. That is, if the polynucleotides (a) to (d) are introduced into the produced transformant, the Lsi6-related gene derived from rice is expressed, and the polynucleotides (e) to (h) are introduced. If so, the corn-derived ZmLsi6-related gene is expressed, and if the polynucleotides (i) to (l) are introduced, the corn-derived ZmLsi1-related gene is expressed. Thereby, a polypeptide that promotes silicon absorption is expressed. As a result, the amount of silicon accumulated in the transformant can be increased.
このように、ケイ素吸収が促進された形質転換体は、ケイ素蓄積量の増加により、病害や虫害に対する抵抗性、耐塩性および耐乾性、およびミネラルストレスに対する耐性が向上する。従って、複合ストレス（例えば、病害や虫害に対する抵抗性、耐塩性および耐乾性、およびミネラルストレス）に対する耐性が向上し、生育を促進させることができる。 Thus, the transformant in which silicon absorption has been promoted is improved in resistance to diseases and insects, salt resistance and drought resistance, and resistance to mineral stress due to an increase in silicon accumulation. Accordingly, resistance to complex stress (for example, resistance to disease and insect damage, salt resistance and drought resistance, and mineral stress) is improved, and growth can be promoted.
特に、上記（ａ）〜（ｈ）に示すイネ由来のＬｓｉ６関連遺伝子およびトウモロコシ由来のＺｍＬｓｉ６関連遺伝子は、地上部にケイ素を蓄積させる機能を有している。すなわち、根からケイ素を吸収する活性と、根から地上部へケイ素を輸送する活性とを有している。 In particular, the Lsi6-related genes derived from rice and the ZmLsi6-related genes derived from corn shown in the above (a) to (h) have a function of accumulating silicon in the above-ground part. That is, it has an activity of absorbing silicon from the root and an activity of transporting silicon from the root to the above-ground part.
このような機能（活性）を有するのは、Ｌｓｉ６タンパク質およびＺｍＬｓｉ６タンパク質の機能と、特許文献１および２に記載のＬｓｉ１タンパク質およびＬｓｉ２タンパク質の機能とが大きく異なるためである。すなわち、Ｌｓｉ６タンパク質およびＺｍＬｓｉ６タンパク質が、根のみではなく、地上部にも発現するためである。一方、特許文献１および２に記載のＬｓｉ１タンパク質およびＬｓｉ２タンパク質は、根にしか発現しない。 The reason for having such a function (activity) is that the functions of the Lsi6 protein and the ZmLsi6 protein are significantly different from the functions of the Lsi1 protein and the Lsi2 protein described in Patent Documents 1 and 2. That is, this is because the Lsi6 protein and the ZmLsi6 protein are expressed not only in the root but also in the above-ground part. On the other hand, the Lsi1 protein and Lsi2 protein described in Patent Documents 1 and 2 are expressed only in the roots.
従って、より高いケイ素吸収が促進された形質転換体を生産するには、上記（ａ）〜（ｌ）のうち、上記（ａ）〜（ｈ）のいずれかのポリヌクレオチドを発現させることが好ましい。これにより、前述のような複合ストレスに対する耐性を、顕著に高い形質転換体を取得することができる。 Therefore, in order to produce a transformant in which higher silicon absorption is promoted, it is preferable to express any one of the polynucleotides (a) to (h) among the above (a) to (l). . Thereby, a transformant with remarkably high resistance to the complex stress as described above can be obtained.
一方、上記（ｉ）〜（ｌ）に示すトウモロコシ由来のＺｍＬｓｉ１関連遺伝子は、表皮に局在化するのに対し、イネＬｓｉ１遺伝子は、外皮および内皮に局在化する。つまり、ＺｍＬｓｉ１遺伝子およびＬｓｉ１遺伝子の発現部位は異なる。これにより、ＺｍＬｓｉ１遺伝子は、外皮細胞に取り込まれたケイ素を、原形質連絡によって、導管まで輸送される。一方、Ｌｓｉ１遺伝子は、ケイ素を外部から導管まで、輸送することができる。このため、ＺｍＬｓｉ１遺伝子を発現させれば、イネＬｓｉ１遺伝子や（ａ）〜（ｈ）のＬｓｉ６遺伝子およびＺｍＬｓｉ６遺伝子とは異なるルートによって、ケイ素吸収を促進することができる。 On the other hand, the corn-derived ZmLsi1-related genes shown in (i) to (l) above are localized in the epidermis, whereas the rice Lsi1 gene is localized in the outer skin and endothelium. That is, the expression sites of the ZmLsi1 gene and the Lsi1 gene are different. As a result, the ZmLsi1 gene transports the silicon taken up by the integument cell to the conduit by protoplasmic communication. On the other hand, the Lsi1 gene can transport silicon from the outside to the conduit. For this reason, if the ZmLsi1 gene is expressed, silicon absorption can be promoted by a route different from the rice Lsi1 gene and the Lsi6 gene and the ZmLsi6 gene of (a) to (h).
ここで、近年、食の安全性に関心が寄せられており、より安全性の高い食品が、望まれている。このため、農薬を全くまたは極力使用せずに栽培する有機栽培および無農薬（減農薬）栽培によって生産された農産物が、注目されている。 Here, in recent years, there has been an interest in food safety, and foods with higher safety are desired. For this reason, agricultural products produced by organic cultivation and pesticide-free (reduced pesticide) cultivation, which are cultivated with little or as little pesticide use, are drawing attention.
コメは、日本ばかりではなく、世界各地で主食とされている消費量の多い植物である。また、果物や野菜も、生産量および消費量が多い。このため、これらの農作物は、特に安全性が重要視される。 Rice is a highly consumed plant that is used as a staple food not only in Japan but around the world. Fruits and vegetables are also high in production and consumption. For this reason, safety is especially important for these crops.
前述のように、ケイ素吸収が促進された形質転換体は、病害や虫害に対する抵抗性等の複合ストレスに対する耐性（抵抗性）が向上する。このため、この形質転換体は、農薬および化学肥料を極力使用せずに、栽培することができる。従って、有機栽培および無農薬栽培などが可能となり、より安全性の高い形質転換体を、食料として提供することができる。つまり、上記の形質転換体は、食品として利用することができる。このような食品としては、コメ、野菜、および果物のような農産物であることが好ましい。これにより、安全性が高く、有用な米（イネ）、野菜、および果物の栽培を実現できる。 As described above, the transformant in which silicon absorption is promoted has improved resistance (resistance) to complex stress such as resistance to disease and insect damage. For this reason, this transformant can be cultivated without using agricultural chemicals and chemical fertilizers as much as possible. Therefore, organic cultivation and agricultural chemical-free cultivation can be performed, and a safer transformant can be provided as food. That is, the above transformant can be used as a food. Such food is preferably agricultural products such as rice, vegetables, and fruits. Thereby, cultivation of rice (rice), vegetables, and fruits which are highly safe and useful can be realized.
特に、Ｌｓｉ６タンパク質またはＺｍＬｓｉ６タンパク質が発現した形質転換体は、根のケイ素吸収が向上するとともに、地上部にケイ素を蓄積する。このため、複合ストレスに対して、特に高い抵抗性を示す。従って、形質転換体を食品として利用する場合も、Ｌｓｉ６タンパク質またはＺｍＬｓｉ６タンパク質が発現した形質転換体を適用することが好ましい。 In particular, a transformant expressing Lsi6 protein or ZmLsi6 protein improves root silicon absorption and accumulates silicon in the above-ground part. For this reason, especially high resistance is shown with respect to compound stress. Therefore, even when the transformant is used as a food, it is preferable to apply a transformant expressing Lsi6 protein or ZmLsi6 protein.
なお、上記（ａ）〜（ｈ）のいずれかのポリヌクレオチドは、単独で発現させてもよいし、複数を発現させてもよい。つまり、（ａ）〜（ｈ）のうち少なくとも１つのポリヌクレオチドを発現させればよい。さらに、Ｌｓｉ６遺伝子、ＺｍＬｓｉ６遺伝子、およびＺｍＬｓｉ１遺伝子を適宜組合わせて発現させてもよい。この場合、ケイ素吸収メカニズムの異なるケイ素吸収を促進するポリペプチドを複数導入し、ケイ素吸収が促進することが好ましい。これにより、取得した形質転換体は、ケイ素吸収メカニズムが異なるケイ素吸収を促進するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入されており、かつ、ケイ素吸収を促進するポリペプチドを発現している。このため、ケイ素の蓄積量を、より増加させることができる。従って、ケイ素蓄積量を一層高めることができ、複合ストレスに対して強い耐性を示す形質転換体を取得することができる。 In addition, the polynucleotide in any one of said (a)-(h) may be expressed independently, and multiple may be expressed. That is, at least one polynucleotide among (a) to (h) may be expressed. Furthermore, Lsi6 gene, ZmLsi6 gene, and ZmLsi1 gene may be expressed in appropriate combination. In this case, it is preferable to introduce a plurality of polypeptides that promote silicon absorption having different silicon absorption mechanisms to promote silicon absorption. As a result, the obtained transformant is introduced with a polynucleotide encoding a polypeptide that promotes silicon absorption having a different silicon absorption mechanism, and expresses a polypeptide that promotes silicon absorption. For this reason, the amount of accumulated silicon can be further increased. Therefore, the amount of silicon accumulation can be further increased, and a transformant exhibiting strong resistance to complex stress can be obtained.
なお、本発明者は、既に、イネにおけるケイ素吸収に関与する別の遺伝子およびタンパク質（Ｌｓｉ１遺伝子・タンパク質（配列番号７・８），Ｌｓｉ２遺伝子・タンパク質（配列番号９・１０））を単離し、その配列を特定している（特許文献１および２）。 In addition, the present inventors have already isolated another gene and protein (Lsi1 gene / protein (SEQ ID NO: 7-8), Lsi2 gene / protein (SEQ ID NO: 9/10)) involved in silicon absorption in rice, The arrangement is specified (Patent Documents 1 and 2).
図１は、Ｌｓｉ１タンパク質、Ｌｓｉ６タンパク質、ＺｍＬｓｉ１タンパク質、ＺｍＬｓｉ６タンパク質のアミノ配列を比較した図である。図１のように、これらの各タンパク質の相同性は高い。このため、ケイ素吸収を促進する機能は共通であるものの、その機能は全く異なる。 FIG. 1 is a diagram comparing amino sequences of Lsi1 protein, Lsi6 protein, ZmLsi1 protein, and ZmLsi6 protein. As shown in FIG. 1, the homology between these proteins is high. For this reason, although the function which promotes silicon absorption is common, the function is completely different.
すなわち、Ｌｓｉ６タンパク質およびＺｍＬｓｉ６タンパク質は、根のみではなく、地上部にも発現している。一方、Ｌｓｉ１タンパク質は、細胞内にケイ素を取り込むトランスポーターであるのに対し、Ｌｓｉ２タンパク質は、細胞の中から細胞外へ、ケイ素を輸送するトランスポーターである。このため、Ｌｓｉ６タンパク質およびＺｍＬｓｉ６タンパク質は、根に発現するものの地上部に発現しないＬｓｉ１タンパク質およびＬｓｉ２タンパク質とは、全く異なる機能を有している。 That is, the Lsi6 protein and the ZmLsi6 protein are expressed not only in the root but also in the above-ground part. On the other hand, the Lsi1 protein is a transporter that incorporates silicon into cells, whereas the Lsi2 protein is a transporter that transports silicon from inside the cell to outside the cell. For this reason, the Lsi6 protein and the ZmLsi6 protein have completely different functions from the Lsi1 protein and the Lsi2 protein that are expressed in the roots but not expressed in the above-ground part.
従って、Ｌｓｉ６遺伝子、ＺｍＬｓｉ６遺伝子、およびＺｍＬｓｉ１遺伝子を適宜組み合わせて使用する場合には、少なくともＬｓｉ６遺伝子およびＺｍＬｓｉ６遺伝子の一方とともに、これらＬｓｉ１遺伝子およびＬｓｉ２遺伝子も組み合わせてもよい。 Therefore, when the Lsi6 gene, the ZmLsi6 gene, and the ZmLsi1 gene are used in appropriate combination, at least one of the Lsi6 gene and the ZmLsi6 gene may be combined with the Lsi1 gene and the Lsi2 gene.
また、Ｌｓｉ６遺伝子（タンパク質）の改変または発現量を制御することにより、ケイ素の有益効果をある程度維持したまま、地上部のケイ素分布のみを、制御することが可能となる。 Further, by controlling the modification or expression level of the Lsi6 gene (protein), it becomes possible to control only the silicon distribution on the ground while maintaining the beneficial effect of silicon to some extent.
なお、図１において、ＴＭ１〜ＴＭ６は、膜貫通ドメインを示している。また、図１において、△で示す部位のアミノ酸は、ケイ素吸収を促進する機能を維持する上で重要な部分である。具体的には、△部位は、Ｈ２およびＨ５（へリックス）、および、ＬＥ１およびＬＥ２（ループ）を示している。このため、各タンパク質を変異（改変）するときには、△で示す部位のアミノ酸を保持することが好ましい。 In FIG. 1, TM1 to TM6 indicate transmembrane domains. In FIG. 1, the amino acid at the site indicated by Δ is an important part for maintaining the function of promoting silicon absorption. Specifically, the Δ site represents H2 and H5 (helix), and LE1 and LE2 (loop). For this reason, when each protein is mutated (modified), it is preferable to retain the amino acid at the site indicated by Δ.
＜Ａ−２＞ケイ素吸収が抑制された形質転換体の生産方法
一方、ケイ素吸収が抑制された形質転換体の生産方法は、ケイ素吸収を促進するポリヌクレオチドの発現を抑制することによって、ケイ素吸収を促進するポリペプチドの発現を抑制する工程を含んでいればよい。
<A-2> Method for producing transformant in which silicon absorption is suppressed On the other hand, a method for producing a transformant in which silicon absorption is suppressed is that silicon absorption is suppressed by suppressing the expression of a polynucleotide that promotes silicon absorption. It is only necessary to include a step of suppressing the expression of the polypeptide that promotes.
例えば、ケイ素吸収が抑制された形質転換体の生産方法は、（ｍ）〜（ｐ）のいずれかのポリヌクレオチドの発現を抑制する工程を含んでいればよい。この方法によれば、Ｌｓｉ６遺伝子またはＺｍＬｓｉ６遺伝子の発現を抑制した形質転換体が生産される。 For example, the method for producing a transformant in which silicon absorption is suppressed may include a step of suppressing the expression of any one of (m) to (p). According to this method, a transformant in which the expression of the Lsi6 gene or the ZmLsi6 gene is suppressed is produced.
（ｍ）配列番号２または４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｎ）配列番号２または４に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列からなり、根からケイ素を吸収する活性と根から地上部へケイ素を輸送する活性とを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｏ）配列番号１または３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｐ）以下の（７）または（８）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、根からケイ素を吸収する活性と根から地上部へケイ素を輸送する活性とを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
（７）配列番号１または３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または、
（８）配列番号１または３に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
(M) a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4;
(N) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4, it consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted or added, and has an activity to absorb silicon from the root and the ground to the ground A polynucleotide encoding a polypeptide having an activity to transport silicon to a moiety;
(O) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3;
(P) an activity to hybridize with a polynucleotide of any one of the following (7) or (8) under stringent conditions, and to absorb silicon from the root and to transport silicon from the root to the ground part A polynucleotide encoding a polypeptide having:
(7) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3, or
(8) A polynucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3.
また、ケイ素吸収が抑制された形質転換トウモロコシ（形質転換体）の生産方法は、トウモロコシに対し、下記の（ｉ）〜（ｌ）のいずれかのポリヌクレオチドの発現抑制するものであってもよい。この方法によれば、トウモロコシ由来のＺｍＬｓｉ１遺伝子の発現を抑制した形質転換トウモロコシ（形質転換体）が生産される。 In addition, the method for producing a transformed corn (transformant) in which silicon absorption is suppressed may be one that suppresses the expression of any of the following polynucleotides (i) to (l) with respect to corn. . According to this method, a transformed corn (transformant) in which the expression of the corn-derived ZmLsi1 gene is suppressed is produced.
（ｉ）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列からなり、表皮に局在化し根のケイ素吸収を促進するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｋ）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｌ）以下の（５）または（６）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、表皮に局在化し根のケイ素吸収を促進するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
（５）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（６）配列番号５に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
(I) a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6;
(J) a polyamino acid sequence consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted, or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, and is localized in the epidermis and promotes root silicon absorption A polynucleotide encoding the peptide;
(K) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 5;
(L) a polynucleotide that hybridizes with a polynucleotide of any one of the following (5) and (6) under a stringent condition and encodes a polypeptide that is localized in the epidermis and promotes root silicon absorption :
(5) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 5;
(6) A polynucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 5.
上記ポリヌクレオチドの発現の抑制は、例えば、アンチセンスＲＮＡの導入、ＲＮＡ干渉などの手法による遺伝子発現操作によって行うことができる。例えば、アンチセンスＲＮＡ技術は、標的遺伝子に対して相補的なＲＮＡ転写体を生成するキメラ遺伝子の導入を基本原理とする。その結果として得られる表現型は、内因性遺伝子に由来する遺伝子産物の減少である。つまり、ケイ素吸収を促進するポリヌクレオチドの部分配列に対するアンチセンスＲＮＡを導入すれば、ケイ素吸収を促進するタンパク質の発現が抑制される。これにより、ケイ素吸収の機能が低下し、植物中のケイ素の含量を低下させることができる。 Suppression of the expression of the polynucleotide can be performed by gene expression manipulation by a technique such as introduction of antisense RNA or RNA interference, for example. For example, antisense RNA technology is based on the introduction of chimeric genes that generate RNA transcripts that are complementary to the target gene. The resulting phenotype is a reduction of the gene product derived from the endogenous gene. That is, if an antisense RNA for a partial sequence of a polynucleotide that promotes silicon absorption is introduced, expression of a protein that promotes silicon absorption is suppressed. Thereby, the function of silicon absorption is reduced, and the silicon content in the plant can be reduced.
ケイ素は、植物の硬さに関与しており、植物のケイ素蓄積量が低下すると、植物はやわらかくなる。従って、ケイ素吸収を抑制することによって、形質転換体をやわらかくすることができる。 Silicon is involved in plant hardness, and when the amount of silicon accumulated in the plant decreases, the plant becomes softer. Therefore, transformants can be softened by suppressing silicon absorption.
家畜は、硬い飼料を食べずに残す傾向にあるため、硬い植物を飼料に適用することは好ましくない。ケイ素吸収が抑制された形質転換体は、ケイ素蓄積量の減少により、やわらかくなる。従って、ケイ素吸が抑制された形質転換体は、家畜飼料として好適に利用することができる。つまり、ケイ素吸収を抑制してケイ素の含有量を低くすれば、軟らかく飼料に適した植物（飼料用イネ，飼料用トウモロコシ等）を作製できる。つまり、上記の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドの発現を抑制すれば、飼料用イネを生産することができる。 Since livestock tends to leave the hard feed without eating, it is not preferable to apply hard plants to the feed. A transformant in which silicon absorption is suppressed becomes soft due to a decrease in silicon accumulation. Therefore, the transformant in which silicon absorption is suppressed can be suitably used as livestock feed. That is, if silicon absorption is suppressed and the silicon content is lowered, plants that are soft and suitable for feed (such as feed rice and feed corn) can be produced. That is, rice for feed can be produced by suppressing the expression of any of the polynucleotides (a) to (d).
さらに、近年、植物資源から製造されるバイオマス燃料が注目を浴びている。バイオマス燃料の代表的な例は、自動車用燃料として利用されるバイオエタノールである。バイオエタノールは、燃やしても二酸化炭素の総量が増えないため、二酸化炭素などの排出量の抑制に有用である。それに加え、バイオエタノールは、ガソリンの半分程度と安価である。このように、環境にやさしい上、経済的にも非常に優れていることが、バイオエタノールをはじめとするバイオマス燃料が注目を浴びる最大の要因である。 Furthermore, in recent years, biomass fuel produced from plant resources has attracted attention. A typical example of biomass fuel is bioethanol used as a fuel for automobiles. Since bioethanol does not increase the total amount of carbon dioxide even when burned, it is useful for suppressing emissions of carbon dioxide and the like. In addition, bioethanol is about half as cheap as gasoline. In this way, it is environmentally friendly as well as being economically superior, which is the biggest factor that attracts attention for biomass fuels such as bioethanol.
バイオマス燃料は、トウモロコシやサトウキビなどの大量の植物原料を発酵させて製造される。しかし、バイオマス燃料の植物原料となるトウモロコシやサトウキビは、ケイ素を多量に吸収する植物である。このため、これらの植物原料は、ケイ素によって硬いものとなっている。その結果、発酵が遅くなり、バイオマス燃料の生産効率も低くなる。 Biomass fuel is produced by fermenting a large amount of plant materials such as corn and sugarcane. However, corn and sugarcane, which are plant materials for biomass fuel, are plants that absorb a large amount of silicon. For this reason, these plant raw materials are hardened by silicon. As a result, fermentation is slowed down and the production efficiency of biomass fuel is also lowered.
前述のように、ケイ素吸収を抑制した形質転換体はやわらかくなる。従って、ケイ素吸収が抑制された形質転換体は、バイオマス燃料の原料としても好適に利用することができる。つまり、上記の（ｅ）〜（ｈ）のいずれかのポリヌクレオチドの発現を抑制すれば、バイオマス燃料製造用トウモロコシを生産することができる。 As described above, a transformant that suppresses silicon absorption becomes soft. Therefore, the transformant in which silicon absorption is suppressed can be suitably used as a raw material for biomass fuel. That is, if the expression of any of the polynucleotides (e) to (h) is suppressed, corn for biomass fuel production can be produced.
本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。すなわち、請求項に示した範囲で適宜変更した技術的手段を組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。 The present invention is not limited to the above-described embodiments, and various modifications can be made within the scope shown in the claims. That is, embodiments obtained by combining technical means appropriately changed within the scope of the claims are also included in the technical scope of the present invention.
〔実施例１〕ケイ酸輸送活性
アフリカツメガエルの卵母細胞（Xenopus laevis oocyte）を用いて、対象遺伝子（Ｌｓｉ１遺伝子，Ｌｓｉ６遺伝子，ＺｍＬｓｉ１遺伝子，ＺｍＬｓｉ６遺伝子）のｃＲＮＡのＵＴＲをできるだけ除去し、βグロビン遺伝子の３’ＵＴＲを含むプラスミドベクターに組み込んだ（挿入した）。目的遺伝子の挿入と方向を確認したプラスミドの３’末端側を制限酵素で切断し、これを鋳型としてＴ３ポリメラーゼを用いてＲＮＡを合成した（Ambion社製 mMESSAGE mMACHINE High Yield Capped RNA Transcription Kit）。
[Example 1] Silicate transport activity Using Xenopus laevis oocyte, the UTR of cRNA of the target gene (Lsi1, Lsi6, ZmLsi1, and ZmLsi6) was removed as much as possible, and β-globin It was integrated (inserted) into a plasmid vector containing the 3 ′ UTR of the gene. The 3 ′ end of the plasmid whose insertion and direction of the target gene were confirmed was cleaved with a restriction enzyme, and RNA was synthesized using this as a template using T3 polymerase (Ambion's mMESSAGE mMACHINE High Yield Capped RNA Transcription Kit).
次に、アフリカツメガエル卵母細胞を腹部から取り出した後、0.1％Collagenase B(Roche社製)を含むModified Birth's Saline-Ca (MBS-Ca:88mM NaCl, 1mM KCl, 2.4mM NaHCO3, 15mM Tris-HCl(pH7.6), 0.82mM MgSO4, 10μg/ml sodium penicillin,および10μg/ml streptomycin sulfate)で３〜４回洗浄した。顕微鏡下で色、形、大きさなどによって洗浄後の卵母細胞を選抜し、１８℃のインキュベータ内で一晩インキュベートさせた。 Next, after removing Xenopus oocytes from the abdomen, Modified Birth's Saline-Ca (MBS-Ca: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 2.4 mM NaHCO 3 , 15 mM Tris- containing 0.1% Collagenase B (Roche) It was washed 3 to 4 times with HCl (pH 7.6), 0.82 mM MgSO 4 , 10 μg / ml sodium penicillin, and 10 μg / ml streptomycin sulfate). The oocytes after washing were selected according to color, shape, size, etc. under a microscope and incubated overnight in an incubator at 18 ° C.
翌日、合成されたｃＲＮＡ（1ng/nl）とコントロール用の水とを、電動マイクロインジェクター（Dramond社製 NanojetII）を用いて、各々50nLずる顕微注入した。さらに一晩インキュベートした試料について、ケイ酸輸送活性を評価した。 On the next day, the synthesized cRNA (1 ng / nl) and water for control were injected microscopically by 50 nL each using an electric microinjector (Dramond Nanojet II). Furthermore, the silicate transport activity was evaluated about the sample incubated overnight.
卵母細胞を入れたチューブに６８Ｇｅ（約2MBq）で標識された１ｍＭケイ酸入りＭＢＳを処理液として１ｍＬずつ加え、１８℃で３０分間処理した。３０分後、処理液を丁寧に取り除き、ケイ酸および６８Ｇｅを含まないＭＢＳで５回洗浄した。洗浄後、卵母細胞に0.1Ｎ硝酸50μLを加えて破砕し、0.1Ｎ水酸化ナトリウムで中和した後、全量が５ｍＬとなるようクリアゾルＩ（ナカライ社製）を加えた。そして、２４時間後に液体シンチレーションカウンタ（Pharmacia社製 WALL 1410E LIQUID SCINTILLATION COUNTER）で６８Ｇｅの放射活性を測定した。その結果、図２のように、Ｌｓｉ６遺伝子，ＺｍＬｓｉ１遺伝子，ＺｍＬｓｉ６遺伝子の発現によって、Ｌｓｉ１遺伝子と同様に、ケイ酸輸送活性を示した。 1 mL of 1 mM silicic acid MBS labeled with 68 Ge (about 2 MBq) was added to the tube containing the oocytes as a treatment solution and treated at 18 ° C. for 30 minutes. After 30 minutes, the treatment solution was carefully removed and washed 5 times with MBS containing no silicic acid and 68 Ge. After washing, 50 μL of 0.1 N nitric acid was added to the oocytes to crush them, neutralized with 0.1 N sodium hydroxide, and then Clearsol I (manufactured by Nacalai) was added so that the total volume became 5 mL. After 24 hours, the radioactivity of 68 Ge was measured with a liquid scintillation counter (WALL 1410E LIQUID SCINTILLATION COUNTER manufactured by Pharmacia). As a result, as shown in FIG. 2, the expression of Lsi6 gene, ZmLsi1 gene, and ZmLsi6 gene showed silicic acid transport activity in the same manner as Lsi1 gene.
〔実施例２〕Ｌｓｉ６遺伝子，ＺｍＬｓｉ１遺伝子，ＺｍＬｓｉ６遺伝子の発現部位
水耕栽培したイネおよびトウモロコシの根、葉鞘、葉身から、全ＲＮＡを調製し、１μｇのＲＮＡから、oligo dT(18)プライマーを用いてｃＤＮＡを合成した。そのｃＤＮＡを鋳型として、Ｌｓｉ６遺伝子，ＺｍＬｓｉ１遺伝子，ＺｍＬｓｉ６遺伝子に特異的なプライマーペアを用いてＰＣＲを行った。その後、ＰＣＲ産物の増幅を、アガロースゲル電気泳動により確認した。
[Example 2] Expression sites of Lsi6 gene, ZmLsi1 gene, and ZmLsi6 gene Total RNA was prepared from roots, leaf sheaths and leaf blades of hydroponically cultivated rice and corn, and oligo dT (18) primer was prepared from 1 μg of RNA. Was used to synthesize cDNA. PCR was performed using the cDNA as a template and a primer pair specific to the Lsi6 gene, the ZmLsi1 gene, and the ZmLsi6 gene. Thereafter, amplification of the PCR product was confirmed by agarose gel electrophoresis.
その結果、図３のように、イネ由来のＬｓｉ６およびトウモロコシ由来のＺｍＬｓｉ６は、Ｌｓｉ１およびＬｓｉ２とは異なり、根に加えて葉鞘および葉身にも発現していた。一方、トウモロコシ由来のＺｍＬｓｉ１は、イネＬｓｉ１と同様に、根に発現したものの、葉鞘および葉身には発現していなかった。 As a result, as shown in FIG. 3, rice-derived Lsi6 and corn-derived ZmLsi6 were expressed in leaf sheath and leaf blades in addition to roots, unlike Lsi1 and Lsi2. On the other hand, although corn-derived ZmLsi1 was expressed in the roots, it was not expressed in the leaf sheath and leaf blades, like rice Lsi1.
〔実施例３〕Ｌｓｉ６タンパク質，ＺｍＬｓｉ１タンパク質，ＺｍＬｓｉ６タンパク質の局在部位
イネおよびトウモロコシの幼植物を、４％パラホルムアルデヒド溶液で固定し、５％寒天に包埋した。次に、包埋した幼植物を、マイクロスライサーを用いて、厚さ１００μｍの切片とした。その切片を、Ｌｓｉ６タンパク質，ＺｍＬｓｉ１タンパク質およびＺｍＬｓｉ６タンパク質の各タンパク質の部分ペプチドで免疫したウサギ抗ペプチド抗体で処理した後、赤色蛍光標識した二次抗体を用いて検出した。
[Example 3] Localized sites of Lsi6 protein, ZmLsi1 protein, and ZmLsi6 protein Rice and corn seedlings were fixed with 4% paraformaldehyde solution and embedded in 5% agar. Next, the embedded seedlings were cut into sections having a thickness of 100 μm using a micro slicer. The section was treated with a rabbit anti-peptide antibody immunized with a partial peptide of each of Lsi6 protein, ZmLsi1 protein and ZmLsi6 protein, and then detected using a secondary antibody labeled with red fluorescence.
その結果、図４のように、Ｌｓｉ６タンパク質およびＺｍＬｓｉ６タンパク質は、木部柔組織（導管の周囲）の細胞に局在化しており、ＺｍＬｓｉ１は、根の表皮に局在化していることが確認された。 As a result, as shown in FIG. 4, it was confirmed that the Lsi6 protein and the ZmLsi6 protein were localized in the cells of the xylem soft tissue (around the conduit), and ZmLsi1 was localized in the root epidermis. It was.
以上のように、Ｌｓｉ６遺伝子、ＺｍＬｓｉ６遺伝子、およびＺｍＬｓｉ６遺伝子は、ケイ素吸収を促進する遺伝子である。このため、これらの遺伝子の発現を抑制すれば、ケイ素蓄積量が減少し、硬い植物をやわらかくすることができる。一方、これらの遺伝子の発現を促進すれば、ケイ素蓄積量が増加し、複合ストレスに対する耐性（抵抗性）を付与し、生育を促進させることができる。それゆえ、本発明は、特に農業、および食品産業に、好適に利用することができる。 As described above, the Lsi6 gene, the ZmLsi6 gene, and the ZmLsi6 gene are genes that promote silicon absorption. For this reason, if the expression of these genes is suppressed, the amount of silicon accumulation can be reduced and the hard plant can be softened. On the other hand, if the expression of these genes is promoted, the amount of silicon accumulation increases, resistance to complex stress (resistance) can be imparted, and growth can be promoted. Therefore, the present invention can be suitably used particularly for agriculture and the food industry.
Claims (3)
（ｍ）配列番号２または４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｎ）配列番号２または４に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列からなり、細胞内へのケイ酸輸送活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｏ）配列番号１または３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｐ）以下の（７）または（８）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、細胞内へのケイ酸輸送活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
（７）配列番号１または３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または、
（８）配列番号１または３に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。 A method for suppressing silicon absorption in a leaf sheath and leaf blades, wherein the expression of any one of the following polynucleotides (m) to (p) is suppressed.
(M) a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4;
(N) a polyamino acid sequence having an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4, and having a silicate transport activity into cells A polynucleotide encoding the peptide;
(O) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3;
(P) a polynucleotide that hybridizes with any of the following polynucleotides (7) or (8) under a stringent condition and encodes a polypeptide having a silicate transport activity into cells:
(7) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3, or
(8) A polynucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3.
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列からなり、細胞内へのケイ酸輸送活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｄ）以下の（１）または（２）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、細胞内へのケイ酸輸送活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または、
（２）配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。 A method for suppressing silicon absorption in a leaf sheath and a blade of rice for feed characterized by suppressing the expression of a polynucleotide of any one of (a) to (d) below.
(A) a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
(B) a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having a silicate transport activity into a cell; The encoding polynucleotide;
(C) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1;
(D) a polynucleotide that hybridizes with any of the following polynucleotides (1) or (2) under a stringent condition and encodes a polypeptide having a silicate transport activity into cells:
(1) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, or
(2) A polynucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
（ｅ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列からなり、細胞内へのケイ酸輸送活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｈ）以下の（３）または（４）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、細胞内へのケイ酸輸送活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
（３）配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または、
（４）配列番号３に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。 A method for suppressing silicon absorption in leaf sheaths and blades of corn for biomass fuel production, wherein the expression of any one of the following polynucleotides (e) to (h) is suppressed.
(E) a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4;
(F) a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 and having a silicate transport activity into a cell; The encoding polynucleotide;
(G) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 3;
(H) a polynucleotide that hybridizes with any of the following polynucleotides (3) or (4) under a stringent condition and encodes a polypeptide having a silicate transport activity into cells:
(3) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 3; or
(4) A polynucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 3.
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