JP4606523B2 - Biological production method of 25th-position hydroxide of steroids - Google Patents

Description

【０００５】
（式中、Ｒ₁ は水素原子または保護されていてもよい水酸基を、Ｒ₂ は水素原子または水酸基が保護されていてもよいヒドロキシ低級アルコキシ基を示すか、またはＲ₁ とＲ₂ で二重結合を形成するかエポキシ環を形成することを示す。Ｒ₃ は水素原子または保護基を示し、Ｒ₄ 、Ｒ₅ 、Ｒ₆ 、Ｒ₇ は、それぞれ水素原子を示すか、Ｒ₄ とＲ₅ 、Ｒ₆ とＲ₇ の一方もしくは両方が二重結合を形成しているか、Ｒ₅ とＲ₆ で二重結合を形成し、Ｒ₄ とＲ₇ で共役二重結合を保護し得るジエノファイルと結合していることを示す。ＸはＣＨ₂ または酸素原子を示す。、但し、ＸがＣＨ₂ である場合には、Ｒ₁ 、Ｒ₂ 、Ｒ₆ 及びＲ₇ が水素原子であり、Ｒ₄ とＲ₅ で二重結合を形成している場合を除く。）
【０００６】
式中の保護基としては、例えば、アセチル基、ピバロイル基、メトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、ｐ−トルエンスルホニル基などのアシル基、メチル基、メトキシメチル基などの置換されていてもよいアルキル基、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基などの置換シリル基などがあげられ、好ましくはトリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基などがあげられる。
また、共役二重結合を保護し得るジエノファイルとしては、一般式（ＩＩ）で示される化合物が用いられる。
【０００７】
【化２】

【０００８】
（式中ＡおよびＢは、同一または異なる基で１〜４個の炭素原子を有するアルコキシ基を表すか、あるいはＡとＢとは一緒にフェニルイミノ基またはｏ−フェニレン基を表す。Ｙは窒素原子またはメチン基（＝ＣＨ−）を表す。）。このうち、好ましくは、４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン、マレイン酸ジエチルなどが用いられる。
本発明で対象とするステロイド類として、具体的には、１α，３β−ジヒドロキシ−５，７−コレスタジエン、２β−（３−ヒドロキシプロピルオキシ）−１α，３β−ジヒドロキシ−５，７−コレスタジエン、５α，８α−（３，５−ジオキソ−４−フェニル−１，２，４−トリアゾリジノ）−１，６−コレスタジエン−３β−オール、３β−ヒドロキシ−１，５，７−コレスタトリエン、１α，２α−エポキシ−５α，８α−（３，５−ジオキソ−４−フェニル−１，２，４−トリアゾリジノ）−６−コレステン−３β−オール，１α，２α−エポキシ−３β−ヒドロキシ−５，７−コレスタジエン、２０（Ｓ）−（３−メチルブチルオキシ）−プレグナ−５，７−ジエン−１α，３β−ジオール、２０（Ｓ）−（３−メチルブチルオキシ）−プレグナ−５−エン−１α，３β−ジオール等があげられる。
【０００９】
本発明の方法によるとステロイド中の水酸基の位置あるいは水酸基の数に関係なく２５位を水酸化しさらに二重結合の位置あるいは数に関係なく２５位を直接水酸化することができる。
本発明で用いるステロイド類の２５位を水酸化することができる能力を有するアミコーラタ（Amycolata)属に属する微生物としては、アミコラータ・サツルネア（Amycolata saturnea）Ａ−１２４６株、アミコラータ・サツルネア（Amycolata saturnea） ＦＥＲＭ ＢＰ−２３０７、アミコラータ・オートトロヒカ（Amycolata autotrophica）ＡＴＣＣ３３７９６などの菌株をあげることができるが、アミコラータ属に属し、ステロイド類の２５位を水酸化することができる能力を有する菌株であればいずれも使用可能である。又、スフィンゴモナス(Sphingomonas)属に属する微生物としては、スフィンゴモナス・パラパウシモビリス(Sphingomonas parapaucimobilis) IFO 15100 などがあげられ、ステロイド類の２５位を水酸化することができる能力を有する菌株であればいずれも使用可能である。
これらのうち、アミコラータ・オートトロヒカ（Amycolata autotrophica）ＡＴＣＣ３３７９６及びアミコラータ・サツルネア（Amycolata saturnea）Ａ−１２４６株が好ましい。このアミコラータ・サツルネア（Amycolata saturnea）Ａ−１２４６株は、本発明者らが土壌中より分離したものであって、次の菌学的性状を示す。
【００１０】
（１）形態
栄養菌糸は合成寒天培地および天然寒天培地においてよく発達し、不規則的に分岐する。また隔壁は認められない。胞子はグリセリン・アスパラギン寒天培地およびスターチ無機塩寒天培地などで良好に形成される。顕微鏡で観察すると、胞子形成菌糸の分岐方法は、単純分岐で胞子は直線状に形成される。胞子は通常３個以上の連鎖が認められ、培養の後期には長い鎖上を呈し、表面は平滑である。胞子の形状は円筒形で、その大きさは0.５〜0.８×2.５〜4.３μｍである。菌核、胞子のう、鞭毛胞子は観察されない。
【００１１】
（２）各種培地における生育状態（３０℃）
（２−１）シュークロース・硝酸塩寒天培地
培地上での生育状態は、中程度であり、コロニー裏面の色調は、淡褐色である。気菌糸の形成は中程度であり、クリーム色を呈する。可溶性色素は産生しない。
（２−２）グルコース・アスパラギン寒天培地
培地上での生育状態は、やや不良であり、コロニー裏面の色調は、クリーム色である。気菌糸の形成は中程度であり、白色を呈する。可溶性色素は産生しない。
（２−３）グリセリン・アスパラギン寒天培地
培地上での生育状態は、良好であり、コロニー裏面の色調は、淡黄色である。気菌糸の形成は良好であり、白色を呈する。可溶性色素は産生しない。
（２−４）スターチ・無機塩寒天培地
培地上での生育状態は、中程度であり、コロニー裏面の色調は、クリーム色である。気菌糸の形成は良好であり、白色を呈する。可溶性色素は産生しない。
【００１２】
（２−５）チロシン寒天培地
培地上での生育状態は、中程度であり、コロニー裏面の色調は、赤褐色である。気菌糸の形成は良好であり、クリーム色を呈する。淡赤褐色の可溶性色素を産生する。
（２−６）栄養寒天培地
培地上での生育状態は、良好であり、コロニー裏面の色調は、淡黄色である。気菌糸の形成は良好であり、白色を呈する。可溶性色素は産生しない。
（２−７）イースト・麦芽寒天培地
培地上での生育状態は、良好であり、コロニー裏面の色調は、淡黄色である。気菌糸の形成はやや不良であり、白色を呈する。可溶性色素は産生しない。
（２−８）オートミール寒天培地
培地上での生育状態は、中程度であり、コロニー裏面の色調は、クリーム色である。気菌糸の形成はやや不良であり、白色を呈する。可溶性色素は産生しない。
（２−９）ペプトン・イースト・鉄寒天培地
培地上での生育状態は、中程度であり、コロニー裏面の色調は、淡褐色である。気菌糸の形成は中程度であり、クリーム色を呈する。可溶性色素は産生しない。
【００１３】
（３）生理的性質
（３−１）生育温度範囲：栄養寒天培地を使用した場合、２０〜３０℃の温度範囲で良好な生育が認められる。１０℃以下および４０℃以上では生育しない。
（３−２）好気性・嫌気性の区別：好気性である。
（３−３）ゼラチンの液化：陽性である。
（３−３）スターチの加水分解：陰性である。
（３−４）脱脂牛乳の凝固、ペプトン化：いずれも陰性である。
（３−５）メラニン様色素の生成：陰性である。
（３−６）硝酸還元能：陰性である。
【００１４】
（４）各種炭素源の利用性：フリドハム・ゴトリーブ寒天培地上に各種の炭素源を加え、生育を見た場合、Ｄ−グルコース、シュークロース、Ｄ−キシロース、イノシトール、Ｄ−マンニット、Ｄ−フルクトースのいずれの炭素源も利用することができる。Ｌ−アラビノース、Ｌ−ラムノースおよびラフィノースは利用できない。
（５）細胞壁成分
細胞壁成分を全菌体の分解物を用いて調べた結果、ルシェバリエの分類（インターナショナル・ジャーナル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（International Journal of Systematic Bacteriology）vol. ２０，ｐ４３５〜４４３（１９７０））によるタイプＩＩＩ細胞壁に属した。またミコール酸は含まれていない。
【００１５】
以上の菌学的性状から本菌株が放線菌に属することは明確であり、インターナショナル・ジャーナル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（International Journal of Systematic Bacteriology）vol. ３６，ｐ２９〜３７（１９８６）に報告されている既知微生物の性状と比較したところ、本菌株は、アミコラータ・サツルネア（Amycolata saturnea）とほぼ一致した。以上の結果から、本菌株はアミコラータ・サツルネア（Amycolata saturnea）に属するものと判断し、アミコラータ・サツルネア（Amycolata saturnea）Ａ−１２４６株と命名した。本菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている（平成７年８月７日、ＦＥＲＭ ＢＰ−５５４４）。
本発明のコレステロール以外のステロイド類の２５位を生物学的に水酸化する方法は、アミコラータ（Amycolata)属又スフィンゴモナス(Sphingomonas)属に属する微生物を含有する溶液中で、基質であるコレステロール以外のステロイド類を好気的条件下で水酸化させるものである。反応に必要な微生物菌体は、上記菌株を栄養源含有培地に接種し、好気的に培養することにより製造される。上記微生物の培養方法は、原則的には一般微生物の培養方法に準ずるが、通常は液体培養による振盪培養、通気撹拌培養などの好気的条件下で実施するのが好ましい。
【００１６】
培養に用いられる培地としては、アミコラータ（Amycolata)属又スフィンゴモナス(Sphingomonas)属に属する微生物が利用できる栄養源を含有する培地であればよく、各種の合成、半合成培地、天然培地などいずれも利用可能である。培地組成としては炭素源としてのグルコース、マルトース、キシロース、フルクトース、シュークロース等を単独または組み合わせて用いることができる。窒素源としては、ペプトン、肉エキス、大豆粉、カゼイン、アミノ酸、酵母エキス、尿素等の有機窒素源、硝酸ナトリウム、硫酸アンモニウム等の無機窒素源を、単独または組み合わせて用いることができる。その他、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、炭酸カルシウム、硫酸マグネシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化コバルト等の塩類、重金属類塩、ビタミン類も必要に応じ添加使用することができる。なお、培養中発泡が著しい場合には、公知の各種消泡剤を適宜培地中に添加することもできる。
【００１７】
培養条件は、該菌株が良好に生育し得る範囲内で適宜選択することができる。通常、ｐＨ６〜7.５、２８〜３０℃で２〜８日程度培養する。上述した各種の培養条件は、使用微生物の種類や特性、外部条件等に応じて適宜変更でき、最適条件を選択できる。
このように調製した微生物菌体を含有する反応溶液にステロイド類を添加し、２５位にヒドロキシ基を有するステロイド類を生産させる。すなわち培養中の微生物菌体を含む培養液をそのまま用いるか、培養終了後、遠心分離または濾過により分離した菌体を懸濁させた溶液を用いる。菌体の懸濁に使用できる溶液は、前記した培地であるか、あるいはトリス−酢酸、トリス−塩酸、コハク酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウムなどの緩衝液を単独または混合したものである。緩衝液のｐＨは、7.０〜8.５が好ましい。
【００１８】
基質となるステロイド類は、粉末のままか、あるいは水溶性有機溶媒、例えばエタノールなどに溶解して微生物菌体を含有する反応溶液に添加すればよく、その添加量は、反応溶液１ｍｌ当り0.１５〜0.６０ｍｇが好ましい。添加量を0.６０ｍｇ／ｍｌより多くすると、変換速度が遅くなり好ましくない。基質添加後は、２７〜３１℃で１〜３日間、好ましくは約１日間、振とうあるいは通気撹拌などの操作を行い、好気的条件下で反応を進行させることにより２５位にヒドロキシ基を有するステロイド類を生産することができる。
【００１９】
以上述べたとおり、アミコラータ（Amycolata)属又はスフィンゴモナス(Sphingomonas)属に属する微生物を用いることによりステロイド類を原料として２５位にヒドロキシ基を有するステロイド類を製造することができるが、さらに、その微生物反応の際の反応溶液中にステロイド類と共にシクロデキストリン又はシクロデキストリン誘導体を共存させることにより、２５位にヒドロキシ基を有するステロイド類への変換率を飛躍的に増大できる。
【００２０】
本発明で使用するシクロデキストリンとしては、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリンが挙げられる。またシクロデキストリン誘導体としては、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、マルトシル−β−シクロデキストリン、グリコシル−β−シクロデキストリンやメチル化シクロデキストリンなとがあげられる。これらのうち、メチル化シクロデキストリンが好ましい。ここで、メチル化シクロデキストリンとは、シクロデキストリンの２，３または６位の水酸基の水素原子がメチル基で置換された化合物をいい、２および６位が完全にメチル化されたα−シクロデキストリン由来のヘキサキス−（２，６−Ｏ−ジメチル）−α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン由来のヘプタキス−（２，６−Ｏ−ジメチル）−β−シクロデキストリンおよびγ−シクロデキストリン由来のオクタキス−（２，６−Ｏ−ジメチル）−γ−シクロデキストリン、あるいは２，３および６位が完全にメチル化されたα−シクロデキストリン由来のヘキサキス−（２，３，６−Ｏ−トリメチル）−α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン由来のヘプタキス−（２，３，６−Ｏ−トリメチル）−β−シクロデキストリンおよびγ−シクロデキストリン由来のオクタキス−（２，３，６−Ｏ−トリメチル）−γ−シクロデキストリン、あるいは２，３，６位の各６個、７個もしくは８個の水素基が部分的にメチル化された部分メチル化シクロデキストリン（以下、ＰＭＣＤと略称することがある）を挙げることができる。メチル化率は５０〜７０％であるのが好ましく、最も好ましくは約６１％である。本発明においては、上記メチル化シクロデキストリンの中から任意の一種または二種以上が選択されて用いられるが、特にβ−シクロデキストリン由来の部分メチル化シクロデキストリンが好適に用いられる。
【００２１】
シクロデキストリン又はその誘導体の添加量は、反応溶液１ｍｌ当り0.１〜１０ｍｇが好ましく、より好ましい範囲は、0.５〜５ｍｇである。シクロデキストリン又はその誘導体の添加量が反応溶液１ｍｌ当り0.１ｍｇ未満の場合は、２５位にヒドロキシ基を有するステロイド類への変換率の改善効果が十分でなく、１０ｍｇを越えると、変換反応の反応速度が遅くなり、また反応溶液の発泡が著しくなり、微生物反応の継続が困難になる。
本発明では、シクロデキストリン類と同時に界面活性剤を共存することが有効な手段である。界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤としてポリオキシエチレン・ソルビタン脂肪酸エステル（例えば Tween８０（シグマ社製）、ソルビタン脂肪酸エステル（例えば Span ８５（シグマ社製））、ポリオキシエチレンエーテル（例えば Brij ９６（シグマ社製））や Triton Ｘ−１００（シグマ社製）、ノニルフェノール（例えばノニポール４５（三洋化成工業（株））製）、酸化エチレン−酸化プロピレンのブロック共重合物（例えば Pluronic Ｌ−６１（旭電化工業（株）製）、および陰イオン性界面活性剤としてダイレックス（日本油脂（株）製）、トラックス（日本油脂（株）製）などを用いることができる。使用する非イオン界面活性剤の量は、0.１〜0.５％程度とするのが好ましい。
【００２２】
これらの反応により製造された２５位にヒドロキシ基を有するステロイド類を反応溶液から単離するには、既知の種々の方法を選択、組み合わせて行うことができる。例えば、酢酸エチル、ｎ−ブタノール等を用いた溶媒抽出、シリカゲル等によるカラム法あるいは薄層クロマトグラフィー、液々分配クロマトグラフィー、逆相カラムを用いた分取用高速液体クロマトグラフィー、合成吸着樹脂を用いたカラムクロマトグラフィー等を、単独あるいは適宜組み合わせ、場合により反復使用することにより分離精製することができる。
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、これによって本発明が限定されるものではない。なお、下記の例中の％は特に断らない限り重量％を示す。
【００２３】
【実施例】
実施例１
グルコース1.５％、バクトソイトン（ディフコ社製）1.５％、コーンスチープリカー（日本食品加工社製）0.５％、塩化ナトリウム0.４％、炭酸カルシウム0.２％（ｐＨ7.０）及び残部が水からなる種母用培地（以下、培地Ａという）１００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに入れ、１２０℃、２０分間加熱滅菌した。これにアミコラータ・オートトロヒカ（Amycolata autotrophica）ＡＴＣＣ３３７９６の凍結種母２ｍｌを接種し、２８℃、２２０ｒｐｍ（振幅７０mm）で２日間振とう培養し、種母培養液を調製した。
【００２４】
次にグルコース2.０％、酵母エキス（オリエンタル酵母（株）製）0.２％、ペプトン（極東製薬（株）製）0.５％、大豆粉（エスサンミート：味の素（株）製）1.０％、コーンスチープリカー0.５％、第二リン酸カリウム0.０４％、塩化ナトリウム0.０４％、炭酸カルシウム0.２％（ｐＨ7.４）及び残部が水からなる変換培養用培地（以下、培地Ｂという）５０ｍｌを２５０ｍｌ容三角フラスコに入れ、１２０℃、２０分間加熱滅菌した。これに先に調製した種母培養液２ｍｌを接種し、２８℃、２日間ロータリーシェーカーで培養し、３ｍｌづつ培養液を試験管に分注する。
この３ｍｌの培養液それぞれに、部分メチル化β−シクロデキストリン（メチル化率５5.８％）を濃度０、0.５及び1.０重量％となるように添加し、ついで、下記のステロイドａ、ｂ、ｃ又はｄを２５０μg/mlになるようにエタノール溶液として添加した。ついで、３０℃、ロータリーシェーカーにて１７時間反応させた。
【００２５】
【化３】

【００２６】
反応後、得られた培養液１ｍｌを供栓付き遠心沈殿管に移し９ｍｌのメタノールを加え密栓をした後、１５分間混合した。混合液を３０００rpm 、１０分間遠心分離し、上清をＨＰＬＣ分析した。ＨＰＬＣ装置はＬ−６０００システム（日立製作所製）を用い、カラムはＹＭＣ Ａ５０３ＣＮ（内径4.６ｍｍ、全長２５０ｍｍ；山村化学製）、溶離液はアセトニトリル：水＝５５：４５を用い、流速1.０ｍｌ／分、カラム温度４０℃で分析を行い、検出は２０５又は２６５ｎｍにおける紫外吸収で行った。定量は化学合成で得たステロイドａ、ｂ、ｃ又はｄの２５位水酸化体標品のＨＰＬＣ上での面積値と比較して行った。
【００２７】
【表１】
表−１（変換反応１７時間後の分析値（単位μg/ml））

【００２８】
上記の結果から、本発明によればステロイド類から効率よく２５位にヒドロキシ基を有するステロイド類を製造することができ、又部分メチル化シクロデキストリンが共存すると、ステロイド類の２５位の水酸化率が向上することがわかる。
実施例２
基質として、ステロイドａを用い、ＰＭＣＤの濃度を変化させた以外は、実施例１と同様にして６時間反応を行い、２５位にヒドロキシ基を有するステロイド類の生成量を求めた。結果を表−２に示す。
【００２９】
【表２】
表−２（反応６時間後の２５位水酸化体生成量）

上記の結果から、部分メチル化シクロデキストリンの至適濃度が１％であることがわかる。
実施例３
基質として、ステロイドａを用い、ＰＭＣＤの濃度１％とし、基質の濃度を変化させた以外は、実施例１と同様にして６時間反応を行い、２５位にヒドロキシ基を有するステロイド類の生成量を求めた。結果を表−３に示す。
【００３０】
【表３】
表−３（反応６時間後の２５位水酸化体生成量（単位μg/ml））

上記の結果から、ステロイド類の至適濃度が２５０μg/mlであることがわかる。
実施例４
基質として、ステロイドａを用い、種々のシクロデキストリン又はその誘導体を1.０％の濃度で用い、Ｔｗｅｅｎ８０を０又は0.２％用いた以外は、実施例１と同様にして６時間又は２４時間反応を行い、２５位にヒドロキシ基を有するステロイド類の生成量を求めた。結果を表−４及び５に示す。
【００３１】
尚、用いたシクロデキストリン（ＣＤ）又はその誘導体は、以下のものである。
α−ＣＤ、β−ＣＤ、γ−ＣＤ、ヒドロキシプロピル−β−ＣＤ、マルトシル−β−ＣＤ
ＰＭＣＤ−ａ：部分メチル化シクロデキストリン（メチル化率 ７2.１％）
ＰＭＣＤ−ｂ：部分メチル化シクロデキストリン（メチル化率 ６9.０％）
ＰＭＣＤ−ｃ：部分メチル化シクロデキストリン（メチル化率 ５5.８％）
混合ＰＭＣＤ−１：ＰＭＣＤ−ａ／ＰＭＣＤ−ｃ＝１／２混合物（メチル化率６1.２％）
混合ＰＭＣＤ−２：ＰＭＣＤ−ａ／ＰＭＣＤ−ｃ＝２／１混合物（メチル化率６6.７％）
ＤＭＣＤ：２，６−ジ−Ｏ−メチル−β−シクロデキストリン（メチル化率 ６6.６％）
ＴＭＣＤ：２，３，６−トリ−Ｏ−メチル−β−シクロデキストリン（メチル化率１００ ％）
混合ＰＭＣＤ−３：ＤＭＣＤ／ＴＭＣＤ＝１／２混合物（メチル化率 ８8.９％）
混合ＰＭＣＤ−４：ＤＭＣＤ／ＴＭＣＤ＝２／１混合物（メチル化率 ７7.７％）
【００３２】
【表４】
表−４（反応６及び２４時間後の２５位水酸化体生成量（単位μg/ml））

α−ＣＤ以外は添加効果が認められた。添加効果がもっとも高いのはＰＭＣＤ−ｃであったが、その他のＣＤもTween80 との併用によって添加効果が増幅された（反応６時間）。Tween80 のみでは添加効果はわずかであった。
【００３３】
【表５】
表−５（２５位水酸化体生成量（単位μg/ml））

【００３４】
上記の結果からメチル化シクロデキストリンにおいてはそれぞれ添加効果が認められた。特にメチル化シクロデキストリンにおいては、平均メチル化率が６１％でもっとも促進効果が高かった。
実施例５
基質として、ステロイドａを用い、ＰＭＣＤ非共存下又は１％共存下、各種微生物を用いた以外は、実施例１と同様にして６時間又は２４時間反応を行い、２５位にヒドロキシ基を有するステロイド類の生成量を求めた。結果を表−６に示す。
使用した菌を次に示す。
アミコラータ・サツルネア（Amycolata saturnea）Ａ−１２４６株 FERM BP 5544
アミコラータ・オートトロヒカ（Amycolata autotrophica）ＡＴＣＣ33796
ストレプトマイセス・ロゼオスプロス(Streptomyces roseosprous) FERM BP 1574
スフィンゴモナス・パラパウシモビリス(Sphingomonas parapaucimobilis) IFO 15100
ストレプトマイセス・スペシーズＨＢ−１０３(Streptomyces species ＨＢ−１０３) FERM BP 4318
【００３５】
【表６】
表−６（２５位水酸化体生成量（単位μg/ml））

【００３６】
実施例６
培地Ａ１００ｍｌを５００ｍｌ容量の三角フラスコに入れ、綿栓をした後１２１℃で２０分間蒸気滅菌した。冷却後、アミコラータ・オウトトロフィカＡＴＣＣ３３７９６を１白金耳無菌的に植菌し、２８℃、２１０ｒｐｍで３日間振とう培養した。培地ＢにＰＭＣＤ（メチル化率５5.８％）を1.０％になるように添加した培地５０ｍｌを２５０ｍｌ容量の三角フラスコに入れ、綿栓をした後１２１℃で２０分間高圧蒸気滅菌したものを４本用意し、上記培地Ａの培養液1.０ｍｌを無菌的に移し、２８℃、２２０ｒｐｍ（振幅７０ｍｍ）で２日間培養した。対照としてＰＭＣＤを含まない培地Ｂで同様に培養した。これらの培養液に各々２５ｍｇのステロイドａを１ｍｌのエタノールに溶解して各々添加し、さらに２４時間上記条件で培養した。この培養液に、さらに２５ｍｇのステロイドａを１ｍｌのエタノールに溶解して追加し、同様に２４時間上記条件で培養した（ステロイドａの添加濃度１ｇ／Ｌ）。反応後、得られた培養液１ｍｌを共栓付き遠心沈殿管に移し９ｍｌのメタノールを加え、密栓をした後、１５分間混合した。混合液を３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、上清をＨＰＬＣ分析した。ＨＰＬＣ装置はＬ−６０００システム（日立（株）製）を用い、カラムはＹＭＣ Ａ５０３ＣＮ（内径4.６ｍｍ、全長２５０ｍｍ；山村化学製）、溶離液はアセトニトリル：水＝５５：４５を用い、流速1.０ｍｌ／分、カラム温度４０℃で分析を行い、検出は２０５又は２６５ｎｍにおける紫外吸収で行った。定量は化学合成で得たステロイドａの２５位水酸化体標品とのＨＰＬＣ上の面積値と比較して行った。その結果、７８０ｍｇ／Ｌのステロイドａの２５位水酸化体の生成を確認した。培地にＰＭＣＤを添加しない場合のステロイドａの２５位水酸化体の生成量は9.１ｍｇ／Ｌであった。
【００３７】
ＰＭＣＤを含む培地Ｂで得た反応液２００ｍｌを３０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を行い、上清を得た後、アンバーライトＸＡＤ−７カラム（内径３０ｍｍ、長さ１４０ｍｍ；オルガノ製）を通過させステロイドａ及びその２５位水酸化体を吸着させた。水洗及び５０％メタノールでカラムを洗浄した後、１００％メタノールで溶出し、溶出液を減圧濃縮乾固した。
次に、５０ｇのワコーゲルＣ−３００（和光純薬製）をｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝３：１で充填したカラムに濃縮乾固物を少量のｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝３：１に溶解し、カラム上端に吸着させ、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝３：１を５００ｍｌ通過させた後、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝３：２で溶出した。溶出画分をＨＰＬＣで分析しステロイドａの２５位水酸化体画分を減圧濃縮乾固した。
次にＨＰＬＣにて乾固物を分離した。ＨＰＬＣ分離条件は、カラム；Inertsil Prep-ODS （２０×２５０ｍｍ；ジーエルサイエンス社製）、溶出液；９０％メタノール、流速；１０ｍｌ／ｍｉｎ、検出；２６５ｎｍにおける紫外吸収で行った。その結果、９７ｍｇのステロイドａの２５位水酸化体を得た。この分離物の核磁気共鳴、赤外吸収、及びマススペクトルを測定し構造解析を行った結果、ステロイドａの２５位水酸化体であることが確認された。
得られた２５位水酸化体の特性値を次に示す。
m.p.：１６９〜１７１℃
［α］_D :-１6.０（ｃ0.５，MeOH, ２1.８℃）
FAB-MS(M/Z):
414(M+H) ⁺ (Matrix;m-Nitrobenzyl Alcohol)
( 計算値413:Ｃ₂₇Ｈ₄₁Ｏ₃)
IRν_max cm^-1:
3382,2959,2870,1449,1377,1267,1151,1047,930
UVλ_max nm（ε) ：
260(8860 sh),269(12300),280(12750),291(7210)
【００３８】
¹H-NMR(CDCl₃) δ(ppm) ：
5.72(1H,d,J=4Hz),5.40(1H,m),3.91(1H,m),3.33(1H,d,J=4Hz),
3.05(1H,d,J=4Hz),2.4〜2.5(2H,m),2.24(1H,t,J=11Hz),
2.1 〜2.15(1H,m),2.01(1H,d,J=5Hz),1.88〜1.95(2H,m),
1.78〜1.85(2H,m),1.66 〜1.71(1H,m),1.22 〜1.5(11H,m),
1.22(6H,s),1.05(3H,s),0.97(3H,d,J=7Hz),0.64(3H,s)
¹³C-NMR(CDCl₃)δ(ppm) ：
141.5(s), 133.7(s), 122.0(d), 115.9(d), 71.1(s), 67.2(d), 60.9(d),
60.2(d), 55.7(d), 54.5(d), 44.4(t), 42.7(s), 39.7(d), 38.8(t),
38.4(s), 36.9(t), 36.4(t), 36.1(d), 29.4(q), 29.2(q), 28.0(t),
23.0(t), 20.8(t), 20.6(t), 18.8(q), 15.2(q), 11.9(q)
【００３９】
実施例７
基質として、ステロイドｂを用い、実施例２と同様にして６時間反応を行い、２５位にヒドロキシ基を有するステロイド類の定量を行った。結果を表−７に示す。
【表７】
表−７ 反応６時間後の２５位水酸化体生成量

上記の結果から部分メチル化シクロデキストリンの至適濃度が0.５％であることがわかる。
【００４０】
実施例８
基質としてステロイドｂを用い、実施例３と同様にして６時間反応を行い、２５位にヒドロキシ基を有するステロイド類の定量を行った。結果を表−８に示す。
【表８】
表−８ 反応６時間後の２５位水酸化体生成量

上記の結果からステロイド類の至適濃度が２５０μｇ／ｍｌであることがわかる。
【００４１】
実施例９ ステロイドｂの２５位水酸化体の合成
実施例６と同様にしてＰＭＣＤを含む培地Ｂでアミコラータ オートトロヒカＡＴＣＣ３３７９６株を培養し２００ｍｌの培養液をえた（フラスコ４本分）。これらの培養液に各々２５ｍｇのステロイドｂを１ｍｌのエタノールに溶解して各々添加し、２４時間で培養した。この培養液に、さらに２５ｍｇのステロイドｂを１ｍｌのエタノールに溶解して追加し、同様に２４時間で培養した（ステロイドｂの添加濃度１ｇ／Ｌ）。その結果、ＰＭＣＤを含む培地Ｂにおいて７７８ｍｇ／Ｌのステロイドｂの２５位水酸化体を蓄積した。ＰＭＣＤを含まない培地Ｂでの蓄積量は4.０ｍｇ／Ｌであった。
ＰＭＣＤを含む培地Ｂで得た反応液２００ｍｌを３０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を行い上清を得た後、アンバーライトＸＡＤ−７カラム（内径３０ｍｍ、長さ１４０ｍｍ；オルガノ製）に通過させステロイドｂ及びその２５位水酸化体を吸着させた。水洗及び５０％メタノールでカラムを洗浄した後、１００％メタノールで溶出し、溶出液を減圧濃縮乾固した。
【００４２】
次に、５０ｇのワコーゲルＣ−３００（和光純薬製）をジクロロメタン：エタノール＝１９：１で充填したカラムに濃縮乾固物を少量のジクロロメタン：エタノール＝１９：１に溶解し、カラム上端に吸着させジクロロメタン：エタノール＝１９：１で溶出した。溶出画分をＨＰＬＣで分析しステロイドｂの２５位水酸化体画分を減圧濃縮乾固した。その結果１０３ｍｇのステロイドｂの２５位水酸化体を得た。
m.p.：１５５〜１５７℃（クロロホルムからの結晶）
〔α〕_D ：44.6（c 0.5, MeOH,２２℃)
FAB-MS(m/z):
490(M)⁺ （マトリックス；m-ニトロベンジルアルコール Pos.)
489(M-H)（マトリックス；m-ニトロベンジルアルコール Neg.)(490: C₃₀H₅₀₆についての計算値）
【００４３】
IRν_max cm^-1：
3385, 2938, 2870, 1468, 1379, 1136, 1096, 1055, 910
UVλ_max nm (ε) ：
262(6570 sh), 272(9400), 282(10010), 294(5850)
¹H-NMR(CDCl₃) δ(ppm) ：
5.71(1H,m,J=5.5,2.2Hz),5.40(1H,m,J=5.5,2.6Hz), 3.6〜4.0(7H,m),
2.5 〜2.7(2H,m),2.32(1H,dd,J=14,5Hz),2.10(1H,m),1.23〜2.0(22H,m),
1.22(6H,s),1.07(3H,s),0.96(3H,d,J=6.6Hz), 0.63(3H,s)
¹³C-NMR(CDCl₃)δ(ppm)：
141.0(s), 136.1(s), 124.6(d), 115.4(d), 82.3(d), 71.8(d), 71.1(s),
68.9(t), 67.0(d), 60.8(t), 55.9(d), 54.6(d), 44.4(t), 43.1(s),41.8(s),
39.2(t), 38.7(d), 36.4(t), 36.1(d), 35.2(t), 32.3(t), 29.4(q),29.2(q),
28.1(t), 23.0(t), 21.1(t), 20.8(t), 18.8(q), 15.9(q), 11.9(q)[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for biologically hydroxylating position 25 of steroids other than cholesterol.
[Prior art]
As a method of biologically hydroxylating the 25th position of steroids, a method using a Streptomyces microorganism having the ability to hydroxylate the 25th position of steroids is already known (Japanese Patent Laid-Open No. 7-1993). -123997). Specifically, Streptomyces species microorganisms include Streptomyces species HB-103. (Streptomyces species HB-103). When this bacterium is used, the 25-position of a steroid having a complicated structure can be directly and easily hydroxylated.
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a method for biologically hydroxylating the 25th position of steroids other than cholesterol using microorganisms other than the genus Streptomyces.
[0002]
[Means for Solving the Problems]
The present invention has been made based on the knowledge that among many microorganisms, microorganisms belonging to the genus Amycolata or the genus Sphingomonas have the ability to hydroxylate the 25th position of steroids. It is.
That is, the present invention relates to a microbial cell or culture solution belonging to the genus Amycolata or Sphingomonas having the ability to hydroxylate position 25 of steroids (however, cholesterol is excluded). ) Is added to convert the hydrogen atom bonded to the carbon at the 25th position of the steroid to a hydroxyl group, and a method for biologically producing the 25th position hydroxide of the steroid is provided.
[0003]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The steroids targeted in the present invention are steroids other than cholesterol, and other carbon atoms may be any element as long as the 25th position is a carbon atom and a hydrogen atom is bonded thereto. It is. For example, the carbon atom at the 22-position may be an oxygen atom, a sulfur atom, a nitrogen atom, or the like. Further, as a substituent other than the 25-position, a lower alkyl group, a cyclic hydrocarbon group, a heterocyclic group such as triazoline, a hydroxyl group, an amino group, a hydroxy lower alkyl group, a hydroxy lower alkoxy group, an acyl group, which may be protected And so on. In addition, the steroid skeleton may have one or more unsaturated bonds, and the unsaturated bonds may have an oxidized epoxy ring.
In the present invention, the target steroid is preferably a compound represented by the following general formula (I).
[0004]
[Chemical 1]

[0005]
(Wherein R ₁ Is a hydrogen atom or an optionally protected hydroxyl group, R ₂ Represents a hydrogen atom or a hydroxy lower alkoxy group in which the hydroxyl group may be protected, or R ₁ And R ₂ To form a double bond or to form an epoxy ring. R _Three Represents a hydrogen atom or a protecting group, R _Four , R _Five , R ₆ , R ₇ Each represents a hydrogen atom or R _Four And R _Five , R ₆ And R ₇ One or both of them form a double bond, or R _Five And R ₆ To form a double bond and R _Four And R ₇ It shows that it is bound to a dienofile that can protect the conjugated double bond. X is CH ₂ Or an oxygen atom is shown. Where X is CH ₂ Is R ₁ , R ₂ , R ₆ And R ₇ Is a hydrogen atom and R _Four And R _Five Except when a double bond is formed. )
[0006]
Examples of the protecting group in the formula include an acyl group such as an acetyl group, a pivaloyl group, a methoxycarbonyl group, a benzyloxycarbonyl group, and a p-toluenesulfonyl group, an alkyl group that may be substituted such as a methyl group and a methoxymethyl group. Group, trimethylsilyl group, triethylsilyl group, substituted silyl group such as t-butyldimethylsilyl group, and the like, preferably trimethylsilyl group, triethylsilyl group, t-butyldimethylsilyl group and the like.
Moreover, the compound shown by general formula (II) is used as a dienofile which can protect a conjugated double bond.
[0007]
[Chemical 2]

[0008]
(In the formula, A and B are the same or different groups and represent an alkoxy group having 1 to 4 carbon atoms, or A and B together represent a phenylimino group or an o-phenylene group. Y represents nitrogen. Represents an atom or a methine group (= CH-). Of these, 4-phenyl-1,2,4-triazoline-3,5-dione, diethyl maleate and the like are preferably used.
Specific examples of steroids to be used in the present invention include 1α, 3β-dihydroxy-5,7-cholestadiene, 2β- (3-hydroxypropyloxy) -1α, 3β-dihydroxy-5,7-cholestadiene, 5α. , 8α- (3,5-dioxo-4-phenyl-1,2,4-triazolidino) -1,6-cholestadien-3β-ol, 3β-hydroxy-1,5,7-cholestatriene, 1α, 2α -Epoxy-5α, 8α- (3,5-dioxo-4-phenyl-1,2,4-triazolidino) -6-cholesten-3β-ol, 1α, 2α-epoxy-3β-hydroxy-5,7-cholestadiene 20 (S)-(3-methylbutyloxy) -pregna-5,7-diene-1α, 3β-diol, 20 (S)-(3-methylbutyloxy) -preg 5-ene -1α, 3β- diol, and the like.
[0009]
According to the method of the present invention, the 25-position can be hydroxylated regardless of the position or number of hydroxyl groups in the steroid, and the 25-position can be directly hydroxylated regardless of the position or number of double bonds.
As a microorganism belonging to the genus Amycolata having the ability to hydroxylate the 25th position of the steroids used in the present invention, Amycolata saturnea ( Amycolata saturnea ) A-1246 strain, Amycolata Saturnea ( Amycolata saturnea ) FERM BP-2307, Amiko Lata Auto Troika ( Amycolata autotrophica ) Although strains such as ATCC 33796 can be mentioned, any strain can be used as long as it belongs to the genus Amycolata and has the ability to hydroxylate position 25 of steroids. In addition, the microorganism belonging to the genus Sphingomonas includes Sphingomonas and Parapausobibilis. (Sphingomonas parapaucimobilis ) IFO 15100 and the like, and any strain having the ability to hydroxylate the 25th position of steroids can be used.
Of these, Amicolata Autotroika ( Amycolata autotrophica ) ATCC 33796 and Amycolata Saturnea ( Amycolata saturnea ) A-1246 strain is preferred. This Amikolata Saturnea ( Amycolata saturnea ) A-1246 strain was isolated from the soil by the present inventors and exhibits the following mycological properties.
[0010]
(1) Form
Vegetative mycelium develops well on synthetic and natural agar and diverges irregularly. Moreover, the partition is not recognized. Spores are well formed on glycerin / asparagine agar and starch mineral salt agar. When observed with a microscope, the method of branching the spore-forming mycelium is simple branching, and the spores are formed in a straight line. Spores usually have 3 or more linkages, have a long chain on the later stage of culture, and have a smooth surface. The spore shape is cylindrical, and its size is 0.5 to 0.8 × 2.5 to 4.3 μm. No sclerotia, spores, or flagella spores are observed.
[0011]
(2) Growth state in various media (30 ° C)
(2-1) Sucrose / nitrate agar medium
The growth state on the medium is moderate, and the color tone on the back side of the colony is light brown. The formation of aerial hyphae is moderate and takes on a cream color. No soluble pigment is produced.
(2-2) Glucose / asparagine agar medium
The growth state on the medium is slightly poor, and the color tone on the back side of the colony is cream. The formation of aerial hyphae is moderate and white. No soluble pigment is produced.
(2-3) Glycerin / asparagine agar medium
The growth state on the medium is good, and the color tone on the back side of the colony is light yellow. The formation of aerial hyphae is good and white. No soluble pigment is produced.
(2-4) Starch / inorganic salt agar medium
The growth state on the medium is moderate, and the color tone on the back side of the colony is cream. The formation of aerial hyphae is good and white. No soluble pigment is produced.
[0012]
(2-5) Tyrosine agar medium
The growth state on the medium is medium, and the color tone of the back side of the colony is reddish brown. The formation of aerial hyphae is good and exhibits a cream color. It produces a pale red-brown soluble pigment.
(2-6) Nutrient agar medium
The growth state on the medium is good, and the color tone on the back side of the colony is light yellow. The formation of aerial hyphae is good and white. No soluble pigment is produced.
(2-7) Yeast / malt agar medium
The growth state on the medium is good, and the color tone on the back side of the colony is light yellow. The formation of aerial hyphae is somewhat poor and appears white. No soluble pigment is produced.
(2-8) Oatmeal agar medium
The growth state on the medium is moderate, and the color tone on the back side of the colony is cream. The formation of aerial hyphae is somewhat poor and appears white. No soluble pigment is produced.
(2-9) Peptone, yeast, iron agar medium
The growth state on the medium is moderate, and the color tone on the back side of the colony is light brown. The formation of aerial hyphae is moderate and takes on a cream color. No soluble pigment is produced.
[0013]
(3) Physiological properties
(3-1) Growth temperature range: When a nutrient agar medium is used, good growth is observed in the temperature range of 20-30 ° C. It does not grow below 10 ° C or above 40 ° C.
(3-2) Distinguishing between aerobic and anaerobic: aerobic.
(3-3) Gelatin liquefaction: positive.
(3-3) Starch hydrolysis: negative.
(3-4) Coagulation and peptoneization of skim milk: Both are negative.
(3-5) Production of melanin-like pigment: negative.
(3-6) Nitric acid reducing ability: negative.
[0014]
(4) Availability of various carbon sources: When various carbon sources are added to Friedham Gotley's agar medium and growth is observed, D-glucose, sucrose, D-xylose, inositol, D-mannitol, D- Any carbon source of fructose can be utilized. L-arabinose, L-rhamnose and raffinose are not available.
(5) Cell wall components
As a result of investigating cell wall components using degradation products of whole cells, the type according to the classification of Luchevalier (International Journal of Systematic Bacteriology vol. 20, p435-443 (1970)) It belonged to the III cell wall. It does not contain mycolic acid.
[0015]
From the above bacteriological properties, it is clear that this strain belongs to actinomycetes, and is reported in International Journal of Systematic Bacteriology vol. 36, p29-37 (1986). When compared with the properties of known microorganisms, this strain almost coincided with Amycolata saturnea. Based on the above results, this strain was identified as Amycolata Saturnea ( Amycolata saturnea ) And amicolatata saturnea ( Amycolata saturnea ) It was named A-1246 strain. This strain has been deposited with the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (August 7, 1995, FERM BP-5544).
The method for biologically hydroxylating the 25th position of steroids other than cholesterol according to the present invention is a solution containing a microorganism belonging to the genus Amycolata or Sphingomonas except for the substrate cholesterol. Steroids are hydroxylated under aerobic conditions. The microbial cells necessary for the reaction are produced by inoculating the above strains on a nutrient source-containing medium and culturing aerobically. The method for culturing microorganisms is basically the same as the method for culturing general microorganisms, but is usually preferably performed under aerobic conditions such as shaking culture by liquid culture and aeration and agitation culture.
[0016]
The medium used for the culture may be any medium containing a nutrient source that can be used by microorganisms belonging to the genus Amycolata or Sphingomonas, including various synthetic, semi-synthetic and natural media. Is available. As the medium composition, glucose, maltose, xylose, fructose, sucrose, etc. as a carbon source can be used alone or in combination. As the nitrogen source, peptone, meat extract, soybean powder, casein, amino acid, yeast extract, organic nitrogen sources such as urea, and inorganic nitrogen sources such as sodium nitrate and ammonium sulfate can be used alone or in combination. In addition, for example, salts such as sodium chloride, potassium chloride, calcium carbonate, magnesium sulfate, sodium phosphate, potassium phosphate, and cobalt chloride, heavy metal salts, and vitamins can be added and used as necessary. In addition, when foaming is remarkable during culture, various known antifoaming agents can be appropriately added to the medium.
[0017]
The culture conditions can be appropriately selected within a range where the strain can grow well. Usually, it is cultured for about 2 to 8 days at pH 6 to 7.5 and 28 to 30 ° C. The various culture conditions described above can be appropriately changed according to the type and characteristics of microorganisms used, external conditions, etc., and optimal conditions can be selected.
Steroids are added to the reaction solution containing the microbial cells thus prepared to produce steroids having a hydroxy group at the 25th position. That is, a culture solution containing microbial cells in culture is used as it is, or after culturing, a solution in which cells separated by centrifugation or filtration are suspended is used. The solution that can be used for suspending the cells is the above-mentioned medium, or a buffer such as Tris-acetic acid, Tris-hydrochloric acid, sodium succinate, sodium citrate, sodium phosphate, potassium phosphate or the like alone or in combination. It is a thing. The pH of the buffer is preferably 7.0 to 8.5.
[0018]
The steroid used as a substrate may be powdered or dissolved in a water-soluble organic solvent such as ethanol and added to a reaction solution containing microbial cells. The addition amount is 0 per ml of the reaction solution. 15 to 0.60 mg is preferred. If the amount added is more than 0.60 mg / ml, the conversion rate becomes slow, which is not preferable. After the addition of the substrate, the hydroxy group is added to the 25-position by performing the reaction under aerobic conditions by performing an operation such as shaking or aeration stirring at 27 to 31 ° C. for 1 to 3 days, preferably about 1 day. Steroids can be produced.
[0019]
As described above, by using a microorganism belonging to the genus Amycolata or the genus Sphingomonas, a steroid having a hydroxy group at the 25-position can be produced using a steroid as a raw material. By allowing cyclodextrin or a cyclodextrin derivative to coexist with the steroid in the reaction solution during the reaction, the conversion rate to a steroid having a hydroxy group at the 25-position can be dramatically increased.
[0020]
Examples of the cyclodextrin used in the present invention include β-cyclodextrin and γ-cyclodextrin. Examples of the cyclodextrin derivative include hydroxypropyl-β-cyclodextrin, maltosyl-β-cyclodextrin, glycosyl-β-cyclodextrin, and methylated cyclodextrin. Of these, methylated cyclodextrins are preferred. Here, the methylated cyclodextrin is a compound in which the hydrogen atom of the hydroxyl group at the 2nd, 3rd or 6th position of the cyclodextrin is replaced with a methyl group, and α-cyclodextrin in which the 2nd and 6th positions are completely methylated Derived from hexakis- (2,6-O-dimethyl) -α-cyclodextrin, β-cyclodextrin-derived heptakis- (2,6-O-dimethyl) -β-cyclodextrin and γ-cyclodextrin-derived octakis- Hexakis- (2,3,6-O-trimethyl) -α derived from (2,6-O-dimethyl) -γ-cyclodextrin or α-cyclodextrin fully methylated at positions 2, 3 and 6. Cyclodextrin, heptakis- (2,3,6-O-trimethyl) -β-cyclodextri derived from β-cyclodextrin And γ-cyclodextrin-derived octakis- (2,3,6-O-trimethyl) -γ-cyclodextrin, or 6, 7, or 8 hydrogen groups in the 2, 3, 6 positions, respectively. A methylated partially methylated cyclodextrin (hereinafter sometimes abbreviated as PMCD) can be mentioned. The methylation rate is preferably 50-70%, most preferably about 61%. In the present invention, any one or two or more of the above methylated cyclodextrins are selected and used. In particular, a partially methylated cyclodextrin derived from β-cyclodextrin is preferably used.
[0021]
The addition amount of cyclodextrin or a derivative thereof is preferably 0.1 to 10 mg per 1 ml of the reaction solution, and more preferably 0.5 to 5 mg. When the addition amount of cyclodextrin or a derivative thereof is less than 0.1 mg per 1 ml of the reaction solution, the effect of improving the conversion rate to a steroid having a hydroxy group at the 25-position is not sufficient. The reaction rate becomes slow and the foaming of the reaction solution becomes remarkable, making it difficult to continue the microbial reaction.
In the present invention, coexistence of a surfactant simultaneously with cyclodextrins is an effective means. As the surfactant, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester (for example, Tween 80 (manufactured by Sigma), sorbitan fatty acid ester (for example, Span 85 (manufactured by Sigma)), polyoxyethylene ether (for example, Brij) is used as a nonionic surfactant. 96 (manufactured by Sigma)), Triton X-100 (manufactured by Sigma), nonylphenol (for example, Nonipol 45 (manufactured by Sanyo Chemical Industries)), ethylene oxide-propylene oxide block copolymer (for example, Pluronic L-61) (Asahi Denka Kogyo Co., Ltd.) and anionic surfactants such as Dairex (Nippon Yushi Co., Ltd.), Trax (Nippon Yushi Co., Ltd.), etc. Nonionic surfactant used The amount of the agent is preferably about 0.1 to 0.5%.
[0022]
In order to isolate steroids having a hydroxy group at the 25-position produced by these reactions from the reaction solution, various known methods can be selected and combined. For example, solvent extraction using ethyl acetate, n-butanol, etc., silica gel column method or thin layer chromatography, liquid-liquid partition chromatography, high-performance liquid chromatography for fractionation using reverse phase column, synthetic adsorption resin Separation and purification can be performed by using the column chromatography or the like alone or in combination as appropriate, and repeatedly using the column chromatography in some cases.
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention in detail, this invention is not limited by this. In the following examples, “%” means “% by weight” unless otherwise specified.
[0023]
【Example】
Example 1
Glucose 1.5%, Bacto Soyton (Difco) 1.5%, Corn steep liquor (Japan Food Processing) 0.5%, Sodium chloride 0.4%, Calcium carbonate 0.2% (pH 7.0) In addition, 100 ml of a seed mother medium (hereinafter referred to as medium A) consisting of water as the balance was placed in a 500 ml Erlenmeyer flask and sterilized by heating at 120 ° C. for 20 minutes. And Amicolata Autotrohika ( Amycolata autotrophica ) 2 ml of a frozen seed mother of ATCC 33796 was inoculated and cultured with shaking at 28 ° C. and 220 rpm (amplitude 70 mm) for two days to prepare a seed mother culture.
[0024]
Next, glucose 2.0%, yeast extract (produced by Oriental Yeast Co., Ltd.) 0.2%, peptone (produced by Kyokuto Pharmaceutical Co., Ltd.) 0.5%, soybean flour (Essanmeet: produced by Ajinomoto Co., Inc.) 1 Conversion culture medium consisting of 0.0%, corn steep liquor 0.5%, dibasic potassium phosphate 0.04%, sodium chloride 0.04%, calcium carbonate 0.2% (pH 7.4) and the balance water 50 ml (hereinafter referred to as medium B) was placed in a 250 ml Erlenmeyer flask and sterilized by heating at 120 ° C. for 20 minutes. This is inoculated with 2 ml of the previously prepared seed culture, and cultured on a rotary shaker at 28 ° C. for 2 days, and 3 ml of the culture is dispensed into test tubes.
Partially methylated β-cyclodextrin (methylation rate of 55.8%) was added to each of 3 ml of the culture solution so as to have concentrations of 0, 0.5 and 1.0% by weight, and then the following steroid a , B, c or d was added as an ethanol solution to a concentration of 250 μg / ml. Subsequently, it was made to react for 17 hours with a 30 degreeC rotary shaker.
[0025]
[Chemical 3]

[0026]
After the reaction, 1 ml of the obtained culture solution was transferred to a centrifuge tube with a stopper, 9 ml of methanol was added and sealed, and then mixed for 15 minutes. The mixture was centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was analyzed by HPLC. The HPLC apparatus uses an L-6000 system (manufactured by Hitachi, Ltd.), the column uses YMC A503CN (inner diameter 4.6 mm, total length 250 mm; manufactured by Yamamura Chemical), the eluent is acetonitrile: water = 55: 45, and the flow rate is 1.0 ml. The analysis was performed at a column temperature of 40 ° C./min, and the detection was performed by ultraviolet absorption at 205 or 265 nm. The quantification was performed by comparing with the area value on HPLC of the 25-position hydroxide preparation of steroid a, b, c or d obtained by chemical synthesis.
[0027]
[Table 1]
Table 1 (Analysis value after 17 hours of conversion reaction (unit: μg / ml))

[0028]
From the above results, according to the present invention, steroids having a hydroxy group at the 25th position can be efficiently produced from steroids, and when a partially methylated cyclodextrin coexists, the hydroxylation rate at the 25th position of the steroids. Can be seen to improve.
Example 2
A reaction was performed for 6 hours in the same manner as in Example 1 except that steroid a was used as a substrate and the concentration of PMCD was changed, and the amount of steroids having a hydroxy group at the 25th position was determined. The results are shown in Table-2.
[0029]
[Table 2]
Table-2 (25-position hydroxide production amount after 6 hours of reaction)

From the above results, it can be seen that the optimal concentration of partially methylated cyclodextrin is 1%.
Example 3
The amount of steroids having a hydroxy group at the 25th position was reacted in the same manner as in Example 1 except that steroid a was used as the substrate, the concentration of PMCD was changed to 1%, and the concentration of the substrate was changed. Asked. The results are shown in Table-3.
[0030]
[Table 3]
Table-3 (25-position hydroxide production amount after 6 hours of reaction (unit: μg / ml))

From the above results, it can be seen that the optimum concentration of steroids is 250 μg / ml.
Example 4
6 hours or 24 hours in the same manner as in Example 1 except that steroid a was used as a substrate, various cyclodextrins or derivatives thereof were used at a concentration of 1.0%, and Tween 80 was used at 0 or 0.2%. Reaction was performed, and the amount of steroids having a hydroxy group at the 25th position was determined. The results are shown in Tables 4 and 5.
[0031]
The cyclodextrin (CD) or its derivative used is as follows.
α-CD, β-CD, γ-CD, hydroxypropyl-β-CD, maltosyl-β-CD
PMCD-a: partially methylated cyclodextrin (methylation rate: 72.1%)
PMCD-b: partially methylated cyclodextrin (methylation rate: 69.0%)
PMCD-c: Partially methylated cyclodextrin (methylation rate 55.8%)
Mixed PMCD-1: PMCD-a / PMCD-c = 1/2 mixture (methylation ratio 61.2%)
Mixed PMCD-2: PMCD-a / PMCD-c = 2/1 mixture (methylation rate 66.7%)
DMCD: 2,6-di-O-methyl-β-cyclodextrin (methylation rate 66.6%)
TMCD: 2,3,6-tri-O-methyl-β-cyclodextrin (methylation rate 100%)
Mixed PMCD-3: DMCD / TMCD = 1/2 mixture (methylation rate 88.9%)
Mixed PMCD-4: DMCD / TMCD = 2/1 mixture (methylation rate: 77.7%)
[0032]
[Table 4]
Table 4 (Production amount of 25-position hydroxide after reaction 6 and 24 hours (unit: μg / ml))

Additive effects were observed except for α-CD. PMCD-c had the highest addition effect, but the addition effect of other CDs was also amplified by the combined use with Tween 80 (reaction 6 hours). With Tween 80 alone, the effect of addition was slight.
[0033]
[Table 5]
Table-5 (25-position hydroxide production amount (unit: μg / ml))

[0034]
From the above results, the addition effect was recognized in each of methylated cyclodextrins. In particular, methylated cyclodextrin had the highest acceleration effect at an average methylation rate of 61%.
Example 5
A steroid having a hydroxy group at the 25th position was reacted for 6 or 24 hours in the same manner as in Example 1 except that steroid a was used as a substrate and various microorganisms were used in the absence of PMCD or in the presence of 1%. The amount of product produced was determined. The results are shown in Table-6.
The bacteria used are shown below.
Amikolata Saturnea ( Amycolata saturnea ) A-1246 strain FERM BP 5544
Amikolata Autotro Hika ( Amycolata autotrophica ATCC33796
Streptomyces roseospros (Streptomyces roseosprous) FERM BP 1574
Sphingomonas palapaushi mobilis (Sphingomonas parapaucimobilis ) IFO 15100
Streptomyces species HB-103 (Streptomyces species HB-103) FERM BP 4318
[0035]
[Table 6]
Table 6 (25-position hydroxide production amount (unit: μg / ml))

[0036]
Example 6
100 ml of medium A was placed in a 500 ml Erlenmeyer flask, sealed with a cotton plug and steam sterilized at 121 ° C. for 20 minutes. After cooling, 1 platinum loop was aseptically inoculated with Amycolata autotrophica ATCC 33796 and cultured with shaking at 28 ° C. and 210 rpm for 3 days. 50 ml of medium with PMCD (methylation rate 55.8%) added to medium B to 1.0% is placed in a 250 ml Erlenmeyer flask, capped and then autoclaved at 121 ° C for 20 minutes 4 were prepared, 1.0 ml of the culture medium A was transferred aseptically and cultured at 28 ° C. and 220 rpm (amplitude 70 mm) for 2 days. As a control, the same culture was performed in medium B containing no PMCD. To each of these culture solutions, 25 mg of steroid a was dissolved in 1 ml of ethanol and added, and further cultured under the above conditions for 24 hours. To this culture broth, 25 mg of steroid a was further dissolved in 1 ml of ethanol and added, and similarly cultured under the above conditions for 24 hours (addition concentration of steroid a 1 g / L). After the reaction, 1 ml of the obtained culture broth was transferred to a centrifugal sedimentation tube with a stopper, 9 ml of methanol was added, the stopper was sealed, and the mixture was mixed for 15 minutes. The mixture was centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was analyzed by HPLC. The HPLC apparatus is an L-6000 system (manufactured by Hitachi), the column is YMC A503CN (inner diameter 4.6 mm, total length 250 mm; manufactured by Yamamura Chemical), the eluent is acetonitrile: water = 55: 45, and the flow rate is 1. Analysis was performed at 0.0 ml / min and a column temperature of 40 ° C., and detection was performed by ultraviolet absorption at 205 or 265 nm. The quantification was performed by comparing the area value on HPLC with the 25-position hydroxide preparation of steroid a obtained by chemical synthesis. As a result, it was confirmed that a 780 mg / L steroid a 25-position hydroxide was produced. When PMCD was not added to the medium, the amount of steroid a 25th hydroxylated product produced was 9.1 mg / L.
[0037]
200 ml of the reaction solution obtained in the medium B containing PMCD was centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes to obtain a supernatant, and then passed through an Amberlite XAD-7 column (inner diameter 30 mm, length 140 mm; manufactured by Organo) to give a steroid a and its 25-position hydroxide were adsorbed. The column was washed with water and 50% methanol, and eluted with 100% methanol. The eluate was concentrated to dryness under reduced pressure.
Next, the concentrated dry solid was dissolved in a small amount of n-hexane: ethyl acetate = 3: 1 in a column packed with 50 g of Wakogel C-300 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) with n-hexane: ethyl acetate = 3: 1. After adsorbing to the upper end of the column and passing 500 ml of n-hexane: ethyl acetate = 3: 1, elution was performed with n-hexane: ethyl acetate = 3: 2. The eluted fraction was analyzed by HPLC, and the 25th hydroxylated fraction of steroid a was concentrated to dryness under reduced pressure.
Next, the dried solid was separated by HPLC. HPLC separation conditions were as follows: column; Inertsil Prep-ODS (20 × 250 mm; manufactured by GL Sciences Inc.), eluent: 90% methanol, flow rate: 10 ml / min, detection; ultraviolet absorption at 265 nm. As a result, 97 mg of steroid a 25-position hydroxide was obtained. As a result of measuring the nuclear magnetic resonance, infrared absorption, and mass spectrum of this isolate and analyzing the structure, it was confirmed to be a 25-position hydroxide of steroid a.
The characteristic values of the obtained 25th-position hydroxide are shown below.
mp: 169-171 ° C.
[Α] _D : -16.0 (c0.5, MeOH, 21.8 ° C)
FAB-MS (M / Z):
414 (M + H) ⁺ (Matrix; m-Nitrobenzyl Alcohol)
(Calculated value 413: C ₂₇ H ₄₁ O _Three )
IRν _max cm ^-1 :
3382,2959,2870,1449,1377,1267,1151,1047,930
UVλ _max nm (ε):
260 (8860 sh), 269 (12300), 280 (12750), 291 (7210)
[0038]
¹ H-NMR (CDCl _Three ) δ (ppm):
5.72 (1H, d, J = 4Hz), 5.40 (1H, m), 3.91 (1H, m), 3.33 (1H, d, J = 4Hz),
3.05 (1H, d, J = 4Hz), 2.4-2.5 (2H, m), 2.24 (1H, t, J = 11Hz),
2.1 to 2.15 (1H, m), 2.01 (1H, d, J = 5Hz), 1.88 to 1.95 (2H, m),
1.78 to 1.85 (2H, m), 1.66 to 1.71 (1H, m), 1.22 to 1.5 (11H, m),
1.22 (6H, s), 1.05 (3H, s), 0.97 (3H, d, J = 7Hz), 0.64 (3H, s)
¹³ C-NMR (CDCl _Three ) δ (ppm):
141.5 (s), 133.7 (s), 122.0 (d), 115.9 (d), 71.1 (s), 67.2 (d), 60.9 (d),
60.2 (d), 55.7 (d), 54.5 (d), 44.4 (t), 42.7 (s), 39.7 (d), 38.8 (t),
38.4 (s), 36.9 (t), 36.4 (t), 36.1 (d), 29.4 (q), 29.2 (q), 28.0 (t),
23.0 (t), 20.8 (t), 20.6 (t), 18.8 (q), 15.2 (q), 11.9 (q)
[0039]
Example 7
Using steroid b as a substrate, the reaction was carried out for 6 hours in the same manner as in Example 2 to quantify steroids having a hydroxy group at the 25-position. The results are shown in Table-7.
[Table 7]
Table 7 Amount of 25-position hydroxide produced after 6 hours of reaction

The above results show that the optimal concentration of partially methylated cyclodextrin is 0.5%.
[0040]
Example 8
Using steroid b as a substrate, the reaction was carried out for 6 hours in the same manner as in Example 3 to quantify steroids having a hydroxy group at the 25-position. The results are shown in Table-8.
[Table 8]
Table-8 Amount of 25-position hydroxide produced after 6 hours of reaction

The above results show that the optimum concentration of steroids is 250 μg / ml.
[0041]
Example 9 Synthesis of Hydroxide of Position 25 of Steroid b
In the same manner as in Example 6, Amycholata autotrophica ATCC 33796 strain was cultured in medium B containing PMCD to obtain a 200 ml culture solution (for 4 flasks). To each of these culture solutions, 25 mg of steroid b was dissolved in 1 ml of ethanol and added, and cultured for 24 hours. To this culture broth, 25 mg of steroid b was further dissolved in 1 ml of ethanol and added, and cultured in the same manner for 24 hours (concentration of steroid b added: 1 g / L). As a result, 778 mg / L of the steroid b hydroxyl group at position 25 was accumulated in medium B containing PMCD. The accumulation amount in the medium B not containing PMCD was 4.0 mg / L.
200 ml of the reaction solution obtained in the medium B containing PMCD was centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes to obtain a supernatant, and then passed through an Amberlite XAD-7 column (inner diameter 30 mm, length 140 mm; manufactured by Organo) to give steroid b And its 25-position hydroxide was adsorbed. The column was washed with water and 50% methanol, and eluted with 100% methanol. The eluate was concentrated to dryness under reduced pressure.
[0042]
Next, the concentrated dry solid was dissolved in a small amount of dichloromethane: ethanol = 19: 1 in a column packed with 50 g of Wakogel C-300 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) with dichloromethane: ethanol = 19: 1 and adsorbed on the top of the column. And eluted with dichloromethane: ethanol = 19: 1. The eluted fraction was analyzed by HPLC, and the 25th hydroxylated fraction of steroid b was concentrated to dryness under reduced pressure. As a result, 103 mg of steroid b 25-position hydroxide was obtained.
mp: 155-157 ° C. (crystal from chloroform)
[Α] _D : 44.6 (c 0.5, MeOH, 22 ° C)
FAB-MS (m / z):
490 (M) ⁺ (Matrix; m-nitrobenzyl alcohol Pos.)
489 (MH) (matrix; m-nitrobenzyl alcohol Neg.) (490: C ₃₀ H ₅₀₆ Calculated value)
[0043]
IRν _max cm ^-1 :
3385, 2938, 2870, 1468, 1379, 1136, 1096, 1055, 910
UVλ _max nm (ε):
262 (6570 sh), 272 (9400), 282 (10010), 294 (5850)
¹ H-NMR (CDCl _Three ) δ (ppm):
5.71 (1H, m, J = 5.5,2.2Hz), 5.40 (1H, m, J = 5.5,2.6Hz), 3.6 ~ 4.0 (7H, m),
2.5 to 2.7 (2H, m), 2.32 (1H, dd, J = 14,5Hz), 2.10 (1H, m), 1.23 to 2.0 (22H, m),
1.22 (6H, s), 1.07 (3H, s), 0.96 (3H, d, J = 6.6Hz), 0.63 (3H, s)
¹³ C-NMR (CDCl _Three ) δ (ppm):
141.0 (s), 136.1 (s), 124.6 (d), 115.4 (d), 82.3 (d), 71.8 (d), 71.1 (s),
68.9 (t), 67.0 (d), 60.8 (t), 55.9 (d), 54.6 (d), 44.4 (t), 43.1 (s), 41.8 (s),
39.2 (t), 38.7 (d), 36.4 (t), 36.1 (d), 35.2 (t), 32.3 (t), 29.4 (q), 29.2 (q),
28.1 (t), 23.0 (t), 21.1 (t), 20.8 (t), 18.8 (q), 15.9 (q), 11.9 (q)

Claims (15)

  2β- (3-hydroxypropyloxy) -1α, 3β-dihydroxy-5,7- is added to a microbial cell belonging to the genus Amycolata having the ability to hydroxylate position 25 of steroids or a culture solution thereof. In the presence of β-cyclodextrin, γ-cyclodextrin, or methylated cyclodextrin by adding steroids selected from the group consisting of cholestadiene and 1α, 2α-epoxy-3β-hydroxy-5,7-cholestadiene A method for biologically producing a 25th-position hydroxide of a steroid, wherein a hydrogen atom bonded to the 25th-position carbon of the steroid is changed to a hydroxyl group.   The method according to claim 1, wherein the steroid is 2β- (3-hydroxypropyloxy) -1α, 3β-dihydroxy-5,7-cholestadiene.   The method according to claim 1, wherein the steroid is 1α, 2α-epoxy-3β-hydroxy-5,7-cholestadiene.   The method according to claim 1, wherein the microorganism belonging to the genus Amycolata is Amycolata saturnea.   The method according to claim 1, wherein the microorganism belonging to the genus Amycolata is Amycolata Saturnea A-1246 strain (FERM BP 5544).   The method according to claim 1, wherein the microorganism belonging to the genus Amycolata is Amycolata autotrohica.   The production method according to claim 1, wherein the microorganism belonging to the genus Amycolata is Amycolata autotrophica ATCC 33796 strain. The process according to claim 1, wherein methylated cyclodextrin methylation rate is 50 to 70%. The process according to claim 8 , wherein the methylation rate of the methylated cyclodextrin is 61%. The production method according to any one of claims 1 to 9, wherein the addition amount of β-cyclodextrin, γ -cyclodextrin or methylated cyclodextrin is 0.1 to 10 mg per 1 ml of the reaction solution. The production method according to claim 10, wherein the addition amount of β-cyclodextrin, γ -cyclodextrin or methylated cyclodextrin is 0.5 to 5 mg per 1 ml of the reaction solution.   The method according to claim 1, wherein a surfactant is allowed to coexist.   The method according to claim 12, wherein the surfactant is a nonionic surfactant.   One or more nonionic surfactants selected from the group consisting of polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, sorbitan fatty acid ester, polyoxyethylene ether, Triton X-100, nonylphenol and ethylene oxide-propylene oxide block copolymer The manufacturing method according to claim 13.   The production method according to claim 13 or 14, wherein the addition amount of the nonionic surfactant is 0.1 to 0.5%.