JP4595575B2 - 親和性ポリアクリルアミド電気泳動法 - Google Patents
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Description
本発明は（ポリ）ペプチド間の相互作用をポリアクリルアミド電気泳動法によって検出する方法に関する。
近年、ヒトも含めて様々な生物種のゲノムが解読され、ゲノムデータベース解析、ゲノム構造解析、ゲノムシーケンス解析など様々な形で解析が行われている。しかし、ゲノムの塩基配列から見いだされる情報は単なる生物を構成する部品の設計にすぎない。実際に、ヒトのゲノムを形成する遺伝子は、独立して存在し、単独で作用するわけではなく、個体の中で系統的に、時間的かつ空間的に調節を受けながら発現している。つまり、これらの遺伝子から発現した多数のタンパク質は互いに複合体を形成して複雑に相互作用することで、その機能を発揮し、生命を維持している。つまり、生命を理解するためにはタンパク質相互作用を解析することは極めて重要である。ゲノム生物学の急速なる発展をしているものの、ヒトゲノム解析遺伝子から発現されるタンパク質の相互作用を解析することもゲノム機能を解析する上でも必要である。そのためにタンパク質の相互作用を解析する技術も進展しているものの、従来のタンパク質の発現・相互作用解析技術では、細胞内の多数のタンパク質を再現性及び効率性良く分離することが難しく、また、極微量のタンパク質を高感度に検出する技術、機能を持った多数のタンパク質を発現させる技術、迅速に多数タンパク質の相互作用を解析する技術などはほとんど開発されておらず、これらタンパク質の発現・相互作用を解析する技術開発が急務である。
タンパク質の複合体形成は細胞内外シグナルにより制御されている。前述したように現在の生化学はこれらのシグナルおよび複合体の解析にあると言って過言でない。タンパク質複合体の形成の原因となるタンパク質間の相互作用を検出することが極めて重要である。
現在、生化学的な相互作用検出技術としては、１）ＢＩＡ−ｃｏｒｅ法 (非特許文献１)、２)ＧＳＴプルダウン法 (非特許文献２)、３)Ｗｅｓｔ−Ｗｅｓｔｅｒｎ法（プロテインチップ）（非特許文献３）等多岐にわたっている。相互作用を検出する技術は開発が進んでいるが高価な装置を必要とするもの（１）や、条件設定が困難であるもの（２，３）等一長一短である。
一方、生化学の実験では欠かせない技術としてＤＮＡやタンパク質を分離する電気泳動法がある。
電気泳動法は、荷電粒子あるいは分子が電場（電界）中を移動する現象であり、電気の力で生体物質、例えばＤＮＡやタンパク質を分離する手法として、ＤＮＡの分画にはアガロースゲル電気泳動、タンパク質の分画にはＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-polyaclylamidegel electrophoresis：ＳＤＳ−ＰＡＧＥと略す）、等電点電気泳動など非常によく使われる操作である。現在、分子生物学、生化学の分野で用いられるタンパク質の電気泳動技術は下記の３つに大別される（新生化学実験講座１，タンパク質I, 第１２章, 東京化学同人）。
１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＤＳ−Ｕｒｅａゲル電気泳動
２）Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ、アガロース電気泳動
タンパク質を変性させずに、タンパク質の持つ電気的特性および分子の大きさにより分離する。
３）等電点電気泳動
タンパク質の電気的性質により分離する。
電気泳動は、荷電粒子や分子はその荷電と反対の極に向かって移動する原理を利用している。担体を用いる場合には、ＤＮＡやタンパク質などの高分子が担体分子に遮られ分子量の大きい物ほど移動しにくくなる「分子ふるい効果」が働く。タンパク質の荷電は種類によって大きく異なるが、陰イオン系界面活性剤であるドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）存在下ではＳＤＳ分子がタンパク質分子に付着するため、タンパク質分子は陽極に向かって移動する。この方法がＳＤＳ−ＰＡＧＥである。また、荷電粒子や分子が極に向かって移動中にｐＨ勾配があると、荷電が０となる点（等電点）で停止する。これが等電点電気泳動である。さらに上記の電気泳動を組み合わせることによる２次元電気泳動も存在する。
我々はその電気泳動技術を利用し、簡易にタンパク質の相互作用を検出する方法を提供する。特に、我々の提供する（ポリ）ペプチド間の相互作用の検出方法に電気泳動を用いた例は今までにみられない。
生体物質相互作用のリアルタイム解析実験法、シュプリンガー・フェアラーク東京 Short Protocols in Molecular Biology, 4th edition, p19-26, Wiley バイオマニュアルシリーズ7、タンパク質実験法 p186-187、羊土社
タンパク質の複合体形成は細胞内外シグナルにより制御されている。前述したように現在の生化学はこれらのシグナルおよび複合体の解析にあると言って過言でない。タンパク質複合体の形成の原因となるタンパク質間の相互作用を検出することが極めて重要である。
現在、生化学的な相互作用検出技術としては、１）ＢＩＡ−ｃｏｒｅ法 (非特許文献１)、２)ＧＳＴプルダウン法 (非特許文献２)、３)Ｗｅｓｔ−Ｗｅｓｔｅｒｎ法（プロテインチップ）（非特許文献３）等多岐にわたっている。相互作用を検出する技術は開発が進んでいるが高価な装置を必要とするもの（１）や、条件設定が困難であるもの（２，３）等一長一短である。
一方、生化学の実験では欠かせない技術としてＤＮＡやタンパク質を分離する電気泳動法がある。
電気泳動法は、荷電粒子あるいは分子が電場（電界）中を移動する現象であり、電気の力で生体物質、例えばＤＮＡやタンパク質を分離する手法として、ＤＮＡの分画にはアガロースゲル電気泳動、タンパク質の分画にはＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-polyaclylamidegel electrophoresis：ＳＤＳ−ＰＡＧＥと略す）、等電点電気泳動など非常によく使われる操作である。現在、分子生物学、生化学の分野で用いられるタンパク質の電気泳動技術は下記の３つに大別される（新生化学実験講座１，タンパク質I, 第１２章, 東京化学同人）。
１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＤＳ−Ｕｒｅａゲル電気泳動
２）Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ、アガロース電気泳動
タンパク質を変性させずに、タンパク質の持つ電気的特性および分子の大きさにより分離する。
３）等電点電気泳動
タンパク質の電気的性質により分離する。
電気泳動は、荷電粒子や分子はその荷電と反対の極に向かって移動する原理を利用している。担体を用いる場合には、ＤＮＡやタンパク質などの高分子が担体分子に遮られ分子量の大きい物ほど移動しにくくなる「分子ふるい効果」が働く。タンパク質の荷電は種類によって大きく異なるが、陰イオン系界面活性剤であるドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）存在下ではＳＤＳ分子がタンパク質分子に付着するため、タンパク質分子は陽極に向かって移動する。この方法がＳＤＳ−ＰＡＧＥである。また、荷電粒子や分子が極に向かって移動中にｐＨ勾配があると、荷電が０となる点（等電点）で停止する。これが等電点電気泳動である。さらに上記の電気泳動を組み合わせることによる２次元電気泳動も存在する。
我々はその電気泳動技術を利用し、簡易にタンパク質の相互作用を検出する方法を提供する。特に、我々の提供する（ポリ）ペプチド間の相互作用の検出方法に電気泳動を用いた例は今までにみられない。
生体物質相互作用のリアルタイム解析実験法、シュプリンガー・フェアラーク東京 Short Protocols in Molecular Biology, 4th edition, p19-26, Wiley バイオマニュアルシリーズ7、タンパク質実験法 p186-187、羊土社
生化学的な相互作用を検出する技術はBIAcore法やGSTプルダウン法、免役沈降法、West-Western法、Two-Hybridシステム法などがある。しかしながら定量性や簡便性に欠け、また条件設定が困難なものや高価な装置を必要とするものなど一長一短である。特にこれらの技術は、タンパク質に比べて小さく、分子量の変化が少ないうえに電気的性質が変化するほど構造変化をしていないというようなリガンド等の低分子化合物や（ポリ）ペプチドなどの複合体などには適用できない。現在、このような微妙な変化を検出する電気泳動法はない。現在、前述のように複合体を形成する作用機構の解明や細胞内外でのシグナル制御機構など、複合体タンパク質の相互作用の解明が重要な課題となっており、そのためには生化学分野で広く使用可能な技術が要求されている。
本発明は（ポリ）ペプチド間の相互作用を生化学分野において一般的に広く用いられている電気泳動法という簡易な方法により相互作用検出することを目的とする。
本発明は（ポリ）ペプチド間の相互作用を生化学分野において一般的に広く用いられている電気泳動法という簡易な方法により相互作用検出することを目的とする。
電気泳動法では特に、アガロースやポリアクリルアミドなどのゲルを使用した場合「分子ふるい効果」が顕著なため、よく用いられる手法である。
ＳＤＳ―ＰＡＧＥは、アクリルアミドとN,N'-メチレンビスアクリルアミドの混合溶液を重合させたポリアクリルアミドゲルを用いて、異なる荷電をもつタンパク質を振り分けることによって分子量により分離させる。我々はこのアクリルアミドがシステインによりマイケル付加反応を受ける性質を利用し、Ｎ末端あるいはＣ末端にシステインを持つペプチドをポリアクリルアミドゲル中に固定化する技術により、Native-PAGE電気泳動の際にアフィニティーに応じた移動度の差を検出する方法を見いだした。
本発明は、アクリルアミド（Ａ）、メチレンビスアクリルアミド（Ｂ）、および一般式（Ｉ）：
ＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣＨ２ＮＨＣＯＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ２ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯ−Ｐ
（式中、Ｐはペプチド鎖またはポリペプチド鎖を表す）
または、一般式（ＩＩ）：
ＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣＨ２ＮＨＣＯＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ２ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＮＨ−Ｐ
（式中、Ｐはペプチド鎖またはポリペプチド鎖を表す）
で表されるアクリルアミド誘導体（Ｃ）の共重合体を含む親和性ポリアクリルアミドゲルであって、
Ａ：Ｂ：Ｃのモル比が、１００：１〜２：０．００１〜０．００５であるゲルを要旨とする。
本発明において「ペプチド」とは分子量が５０００以下のものを言い、「ポリペプチド」とは分子量が５０００以上のものを言う。本明細書で「（ポリ）ペプチド」と言う場合はペプチドまたはポリペプチドを指す。
本発明は上記の(ポリ)ペプチドを含む親和性ポリアクリルアミドゲルを媒体として用い、他の（ポリ）ペプチドを電気泳動し、両（ポリ）ペプチド間の相互作用の有無を検出する親和性ポリアクリルアミド電気泳動法をも要旨とする。
ＳＤＳ―ＰＡＧＥは、アクリルアミドとN,N'-メチレンビスアクリルアミドの混合溶液を重合させたポリアクリルアミドゲルを用いて、異なる荷電をもつタンパク質を振り分けることによって分子量により分離させる。我々はこのアクリルアミドがシステインによりマイケル付加反応を受ける性質を利用し、Ｎ末端あるいはＣ末端にシステインを持つペプチドをポリアクリルアミドゲル中に固定化する技術により、Native-PAGE電気泳動の際にアフィニティーに応じた移動度の差を検出する方法を見いだした。
本発明は、アクリルアミド（Ａ）、メチレンビスアクリルアミド（Ｂ）、および一般式（Ｉ）：
ＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣＨ２ＮＨＣＯＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ２ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯ−Ｐ
（式中、Ｐはペプチド鎖またはポリペプチド鎖を表す）
または、一般式（ＩＩ）：
ＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣＨ２ＮＨＣＯＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ２ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＮＨ−Ｐ
（式中、Ｐはペプチド鎖またはポリペプチド鎖を表す）
で表されるアクリルアミド誘導体（Ｃ）の共重合体を含む親和性ポリアクリルアミドゲルであって、
Ａ：Ｂ：Ｃのモル比が、１００：１〜２：０．００１〜０．００５であるゲルを要旨とする。
本発明において「ペプチド」とは分子量が５０００以下のものを言い、「ポリペプチド」とは分子量が５０００以上のものを言う。本明細書で「（ポリ）ペプチド」と言う場合はペプチドまたはポリペプチドを指す。
本発明は上記の(ポリ)ペプチドを含む親和性ポリアクリルアミドゲルを媒体として用い、他の（ポリ）ペプチドを電気泳動し、両（ポリ）ペプチド間の相互作用の有無を検出する親和性ポリアクリルアミド電気泳動法をも要旨とする。
本発明により（ポリ）ペプチド間の相互作用を電気泳動法により検出できることになった。生化学の基本的ツールである電気泳動法はほとんどの生化学の分野の当業者が行う方法であり、本発明により提供される（ポリ）ペプチド間の相互作用を電気泳動法により検出する技術はあらゆる生化学で使用可能な技術である。また、２次元電気泳動、ウエスタン法やマススペクトル解析と組み合わせることにより新規タンパク質の同定や創薬におけるスクリーニング方法として応用可能である。
（１）一般式（Ｉ）で表されるアクリルアミド誘導体の製造方法
Ｎ末端にシステイン残基を有する（ポリ）ペプチドとメチレンビスアクリルアミドを次のような条件で反応させる。溶媒に水を用い、１０ｍＭのビスアクリルアミドに対しＮ−末端にシステイン残基を有する（ポリ）ペプチドを最終濃度２００μＭになるように加え、室温で３０分放置する事でマイケル付加反応によりビスアクリルアミドにペプチドが共有結合し、一般式（Ｉ）で表されるアクリルアミド誘導体が得られる。
Ｎ末端にシステイン残基を有する（ポリ）ペプチドとメチレンビスアクリルアミドを次のような条件で反応させる。溶媒に水を用い、１０ｍＭのビスアクリルアミドに対しＮ−末端にシステイン残基を有する（ポリ）ペプチドを最終濃度２００μＭになるように加え、室温で３０分放置する事でマイケル付加反応によりビスアクリルアミドにペプチドが共有結合し、一般式（Ｉ）で表されるアクリルアミド誘導体が得られる。
（２）一般式（ＩＩ）で表されるアクリルアミド誘導体の製造方法
Ｃ末端にシステイン残基を有する（ポリ）ペプチドとメチレンビスアクリルアミドを次のような条件で反応させる。溶媒に水を用い、１０ｍＭのビスアクリルアミドに対しペプチドを最終濃度２００μＭになるように加え、室温で３０分放置する事でマイケル付加反応によりビスアクリルアミドにペプチドが共有結合し、一般式（ＩＩ）で表されるアクリルアミド誘導体が得られる。
Ｃ末端にシステイン残基を有する（ポリ）ペプチドとメチレンビスアクリルアミドを次のような条件で反応させる。溶媒に水を用い、１０ｍＭのビスアクリルアミドに対しペプチドを最終濃度２００μＭになるように加え、室温で３０分放置する事でマイケル付加反応によりビスアクリルアミドにペプチドが共有結合し、一般式（ＩＩ）で表されるアクリルアミド誘導体が得られる。
（３）アクリルアミド（Ａ）、メチレンビスアクリルアミド（Ｂ）、および一般式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるアクリルアミド誘導体（Ｃ）の共重合体ゲルの製造方法
アクリルアミド（Ａ）、メチレンビスアクリルアミド（Ｂ）、および一般式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるアクリルアミド誘導体（Ｃ）を例えば次のように行う。
Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ用のゲルを作成する方法はよく知られている（Bollag, D. M. and Edelstein, S. J., Protein Methods, p143-160, 1991, NY, Wiley-Liss, Inc.）。例えば、７．５％のＮａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ用のゲルを作成する際にペプチドの結合した一般式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるアクリルアミド誘導体（Ｃ）を加えた後、ラジカル重合開始剤を添加して水中で重合反応を行う。Ａ：Ｂ：Ｃのモル比は１００：１〜２：０．００１〜０．００５とするのが好ましい。重合用溶液の組成の一例を示せば以下のようである。
２．５ｍｌ ３０％アクリルアミド・ビスアクリルアミド溶液（２９：１）
２．５ｍｌ １．５Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．８
４ｍｌ 蒸留水
１ｍｌ ペプチド（200 uM）を結合したビスアクリルアミド(10 mM)
１００μｌ １０％過硫酸アンモニウム
１０μｌ テトラメチルエチレンジアミン
アクリルアミド（Ａ）、メチレンビスアクリルアミド（Ｂ）、および一般式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるアクリルアミド誘導体（Ｃ）を例えば次のように行う。
Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ用のゲルを作成する方法はよく知られている（Bollag, D. M. and Edelstein, S. J., Protein Methods, p143-160, 1991, NY, Wiley-Liss, Inc.）。例えば、７．５％のＮａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ用のゲルを作成する際にペプチドの結合した一般式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるアクリルアミド誘導体（Ｃ）を加えた後、ラジカル重合開始剤を添加して水中で重合反応を行う。Ａ：Ｂ：Ｃのモル比は１００：１〜２：０．００１〜０．００５とするのが好ましい。重合用溶液の組成の一例を示せば以下のようである。
２．５ｍｌ ３０％アクリルアミド・ビスアクリルアミド溶液（２９：１）
２．５ｍｌ １．５Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．８
４ｍｌ 蒸留水
１ｍｌ ペプチド（200 uM）を結合したビスアクリルアミド(10 mM)
１００μｌ １０％過硫酸アンモニウム
１０μｌ テトラメチルエチレンジアミン
この溶液を、隙間が約１ｍｍの２枚のガラス板の間に流し込み、１０〜３５℃で、１０分〜１０時間重合させ、板状のゲルを得る。
（４）上記ゲルを用いた親和性アクリルアミド電気泳動方法
各サンプルに対し５×サンプルバッファー（３１２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ６．８， ５０％ グリセロール，０．０５％ ブロモフェノールブルーを１ｘになるように加える。泳動バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．８，１９２ｍＭ グリシンを用いて１０ｍＡの定電流下に４℃で（ポリ）ペプチドの電気泳動を行う。ゲルをクマシーブリリアントブルーを用いて染色し、酢酸・メタノール混合液で脱色し、タンパク質を検出する。
対照としてはアクリルアミド（Ａ）、およびメチレンビスアクリルアミド（Ｂ）の共重合体ゲルを用いてＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥを行い比較する。本発明の親和性アクリルアミドゲルに結合した（ポリ）ペプチドと電気泳動する（ポリ）ペプチドの間に相互作用がある場合には、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥに比べ本発明の親和性ポリアクリルアミド電気泳動では泳動に遅れを生ずる（図１）
各サンプルに対し５×サンプルバッファー（３１２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ６．８， ５０％ グリセロール，０．０５％ ブロモフェノールブルーを１ｘになるように加える。泳動バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．８，１９２ｍＭ グリシンを用いて１０ｍＡの定電流下に４℃で（ポリ）ペプチドの電気泳動を行う。ゲルをクマシーブリリアントブルーを用いて染色し、酢酸・メタノール混合液で脱色し、タンパク質を検出する。
対照としてはアクリルアミド（Ａ）、およびメチレンビスアクリルアミド（Ｂ）の共重合体ゲルを用いてＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥを行い比較する。本発明の親和性アクリルアミドゲルに結合した（ポリ）ペプチドと電気泳動する（ポリ）ペプチドの間に相互作用がある場合には、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥに比べ本発明の親和性ポリアクリルアミド電気泳動では泳動に遅れを生ずる（図１）
本発明は２つの（ポリ）ペプチドの内の１つに別の化合物が結合することによって、該（ポリ）ペプチド間の相互作用に変化を生ずるか否かを決定することに適している。その例は核内受容体とコアクティベーターとの相互作用である。本発明の１実施態様によれば、本発明の親和性ポリアクリルアミドに含まれる(ポリ)ペプチドがコアクティベーターの核内受容体結合部分である親和性ポリアクリルアミドを用い、核内受容体をリガンド（候補物）と電気泳動させる。
核内受容体はＰＰＡＲγ（Peroxisome Proliferator-activated receptor gamma）とＲＸＲα（Retinoic acid X receptor alpha）の２つのポリペプチドよりなるヘテロダイマーである。核内受容体はリガンド依存性の転写因子であり、リガンド（アゴニスト）が結合すると核内受容体の構造が変化しコアクティベーターと結合し遺伝子の転写を活性化する（図２参照）。コアクティベーター内の核内受容体と結合する部分のアミノ酸配列はＬＸＸＬＬモチーフを有することが知られている（図２参照）。従ってその配列を有する（ポリ）ペプチドを上記方法によりアクリルアミドゲルに導入し、核内受容体をアゴニストと共に本発明の親和性ポリアクリルアミド電気泳動法を用いて電気泳動を行えば、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥに比べて、電気泳動の遅れが検出される（図３および図４）。この事実を利用すれば、核内受容体のアゴニストを探索することができる。またコアクティベーターの代わりにコリプレッサー（Nature 415:813-817, 2002）を用いれば核内受容体のアンタゴニストを探索することができる。
核内受容体はＰＰＡＲγ（Peroxisome Proliferator-activated receptor gamma）とＲＸＲα（Retinoic acid X receptor alpha）の２つのポリペプチドよりなるヘテロダイマーである。核内受容体はリガンド依存性の転写因子であり、リガンド（アゴニスト）が結合すると核内受容体の構造が変化しコアクティベーターと結合し遺伝子の転写を活性化する（図２参照）。コアクティベーター内の核内受容体と結合する部分のアミノ酸配列はＬＸＸＬＬモチーフを有することが知られている（図２参照）。従ってその配列を有する（ポリ）ペプチドを上記方法によりアクリルアミドゲルに導入し、核内受容体をアゴニストと共に本発明の親和性ポリアクリルアミド電気泳動法を用いて電気泳動を行えば、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥに比べて、電気泳動の遅れが検出される（図３および図４）。この事実を利用すれば、核内受容体のアゴニストを探索することができる。またコアクティベーターの代わりにコリプレッサー（Nature 415:813-817, 2002）を用いれば核内受容体のアンタゴニストを探索することができる。
上記の態様に依れば、（ポリ）ペプチドをポリアクリルアミドゲルに導入し、（ポリ）ペプチドを電気泳動し、ポリペプチド間の相互作用を検出したが、本発明の別の態様に依ればＤＮＡをポリアクリルアミドゲルに導入し、（ポリ）ペプチドを電気泳動し、（ポリ）ペプチドとＤＮＡ間の相互作用を検出できる。この場合ＤＮＡにチオール基を導入しておけば、上記（ポリ）ペプチドをポリアクリルアミドゲルに導入した場合と同様に、マイケル付加により、メチレンビスアクリルアミドをチオール基を導入したＤＮＡと反応させることができる。反応生成物をアクリルアミド、メチレンビスアクリルアミドと共重合すれば親和性ポリアクリルアミドゲルを製造できる。
本発明の更なる態様によれば、リガンドをポリアクリルアミドゲルに導入し、受容体を電気泳動し、受容体とリガンド間の相互作用を検出できる。この場合リガンドにチオール基を導入しておけば、マイケル付加により、メチレンビスアクリルアミドをチオール基を導入したリガンドと反応させることができる。反応生成物をアクリルアミド、メチレンビスアクリルアミドと共重合すれば親和性ポリアクリルアミドゲルを製造できる。
実施例１
親和性ポリアクリルアミドに導入するペプチドの配列の合成
SRC1-1 YSQTSHKLLQLLTTTAEQQC （配列番号１）
SRC1-2 CLTARHKILHRLLQEGSPSD （配列番号２）
SRC1-3 ESKDHQLLRYLLDKDEKDLC （配列番号３）
これらの配列はコアクチベーターＳＲＣ−１(steroid receptor coactivator-1)内の、核内受容体と結合する部分（ＮＲボックス）を含む配列である。上記配列を持つペプチドをＡＢｉ社製ペプチド合成機Ｍｏｄｅｌ４３３Ａで合成し、脱保護の後ＨＰＬＣを用いた逆相クロマトグラフィーで精製した。目的のペプチドはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いた分子量により確認した。
実施例２
親和性ポリアクリルアミドの合成
１０ｍＭのビスアクリルアミドに対し上記ペプチドを最終濃度２００μＭになるように加え、室温で３０分放置する事でビスアクリルアミドにペプチドを共有結合した。７．５％のＮａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ用のゲルを作成する際にペプチドの結合したビスアクリルアミドを１／１０量加えた後、重合反応を行った。
ゲルの組成は以下の通り。
２．５ｍｌ ３０％アクリルアミド・ビスアクリルアミド溶液（２９：１）
２．５ｍｌ １．５ Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．８
４ｍｌ 蒸留水
１ｍｌ ペプチド（200 uM）を結合したビスアクリルアミド(10 mM)
１００μｌ １０％過硫酸アンモニウム
１０μｌ テトラメチルエチレンジアミン
この溶液を、隙間が約１ｍｍの２枚のガラス板の間に流し込み、室温で、３時間重合させ、板状のゲルを得た。
親和性ポリアクリルアミドに導入するペプチドの配列の合成
SRC1-1 YSQTSHKLLQLLTTTAEQQC （配列番号１）
SRC1-2 CLTARHKILHRLLQEGSPSD （配列番号２）
SRC1-3 ESKDHQLLRYLLDKDEKDLC （配列番号３）
これらの配列はコアクチベーターＳＲＣ−１(steroid receptor coactivator-1)内の、核内受容体と結合する部分（ＮＲボックス）を含む配列である。上記配列を持つペプチドをＡＢｉ社製ペプチド合成機Ｍｏｄｅｌ４３３Ａで合成し、脱保護の後ＨＰＬＣを用いた逆相クロマトグラフィーで精製した。目的のペプチドはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いた分子量により確認した。
実施例２
親和性ポリアクリルアミドの合成
１０ｍＭのビスアクリルアミドに対し上記ペプチドを最終濃度２００μＭになるように加え、室温で３０分放置する事でビスアクリルアミドにペプチドを共有結合した。７．５％のＮａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ用のゲルを作成する際にペプチドの結合したビスアクリルアミドを１／１０量加えた後、重合反応を行った。
ゲルの組成は以下の通り。
２．５ｍｌ ３０％アクリルアミド・ビスアクリルアミド溶液（２９：１）
２．５ｍｌ １．５ Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．８
４ｍｌ 蒸留水
１ｍｌ ペプチド（200 uM）を結合したビスアクリルアミド(10 mM)
１００μｌ １０％過硫酸アンモニウム
１０μｌ テトラメチルエチレンジアミン
この溶液を、隙間が約１ｍｍの２枚のガラス板の間に流し込み、室温で、３時間重合させ、板状のゲルを得た。
実施例３
核内受容体の調製
（ＰＰＡＲγタンパク質の調製法）
Ｎｏｖａｇｅｎ社製のｐＥＴ２８ｂのＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ部位にヒトＰＰＡＲγＬＢＤ（ａａ．１９５−４７７）(配列番号４) をクローニングし、シーケンスにより塩基配列を確認した。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、１ＬのＬＢで３７℃でＯＤ６００が０．８に達するまで培養を行った後に、１８℃に移し、１ｍＭ ＩＰＴＧを加え１８時間培養を行った。大腸菌は遠心により回収し、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４，２００ｍＭ ＮａＣｌ，２５ｍＭ イミダゾールに懸濁し、−２０℃に保存した。
細胞を超音波破砕し、遠心により不溶性タンパク質を取り除いた後ニッケルカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーによりＰＰＡＲγＬＢＤの精製を行った。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ８．０，１５０ｍＭ ＮａＣｌの透析液５Ｌで透析した後に、新たな透析液５Ｌに移すと同時にトロンビンを添加し、ヒスチジンタグを除去した。再度ニッケルカラムに通し、フロースルーを回収した。濃縮後、さらにＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲル濾過クロマトグラフィーにより精製した。
核内受容体の調製
（ＰＰＡＲγタンパク質の調製法）
Ｎｏｖａｇｅｎ社製のｐＥＴ２８ｂのＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ部位にヒトＰＰＡＲγＬＢＤ（ａａ．１９５−４７７）(配列番号４) をクローニングし、シーケンスにより塩基配列を確認した。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、１ＬのＬＢで３７℃でＯＤ６００が０．８に達するまで培養を行った後に、１８℃に移し、１ｍＭ ＩＰＴＧを加え１８時間培養を行った。大腸菌は遠心により回収し、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４，２００ｍＭ ＮａＣｌ，２５ｍＭ イミダゾールに懸濁し、−２０℃に保存した。
細胞を超音波破砕し、遠心により不溶性タンパク質を取り除いた後ニッケルカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーによりＰＰＡＲγＬＢＤの精製を行った。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ８．０，１５０ｍＭ ＮａＣｌの透析液５Ｌで透析した後に、新たな透析液５Ｌに移すと同時にトロンビンを添加し、ヒスチジンタグを除去した。再度ニッケルカラムに通し、フロースルーを回収した。濃縮後、さらにＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲル濾過クロマトグラフィーにより精製した。
（ＲＸＲαタンパク質の調製法）
タグのないＲＸＲαＬＢＤは、Ｎｏｖａｇｅｎ社製のｐＥＴ２８ｂのＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ部位に核内受容体ＲＸＲα（ａａ．２２２−４６２）(配列番号５)をクローニングし作成した。配列はクローニングの後、シーケンスにより確認した。ポリヒスチジンタグを持つＣＡＲ（constitutive androstane receptor）は、Ｎｏｖａｇｅｎ社製ｐＥＴ３０ａにＣＡＲ（ａａ．７７−３４８）(配列番号６)をクローニングし作成した。ｐＥＴ３０−ＣＡＲからヒスチジンタグを持つＣＡＲをＸｂａＩ／ＳｐｅＩで切り出し、上記ｐＥＴ２８ｂ−ＲＸＲαのＸｂａＩサイトにクローニングし、ＣＡＲとＲＸＲαの共発現ベクターｐＥＴ２８−ＣＡＲ−ＲＸＲαとした。
ｐＥＴ２８−ＣＡＲ−ＲＸＲαを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、１ＬのＬＢで３７℃でＯＤ６００が０．８に達するまで培養を行った後に、１８℃に移し、１ｍＭ ＩＰＴＧを加え１８時間培養を行った。大腸菌は遠心により回収し、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４，２００ｍＭ ＮａＣｌ，２５ｍＭ イミダゾールに懸濁し、−２０℃に保存した。
細胞を超音波破砕し、遠心により不溶性タンパク質を取り除いた後ニッケルカラム（Amersham Bioscience社製、ＨｉＴｒａｐカラム）にロードした。２５ｍＭ イミダゾールで洗浄した後、６８ｍＭのイミダゾールによりＲＸＲαＬＢＤを溶出した。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ８．０，１５０ｍＭ ＮａＣｌの透析液５Ｌで透析し、濃縮後、さらにＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲル濾過クロマトグラフィーにより精製した。
タグのないＲＸＲαＬＢＤは、Ｎｏｖａｇｅｎ社製のｐＥＴ２８ｂのＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ部位に核内受容体ＲＸＲα（ａａ．２２２−４６２）(配列番号５)をクローニングし作成した。配列はクローニングの後、シーケンスにより確認した。ポリヒスチジンタグを持つＣＡＲ（constitutive androstane receptor）は、Ｎｏｖａｇｅｎ社製ｐＥＴ３０ａにＣＡＲ（ａａ．７７−３４８）(配列番号６)をクローニングし作成した。ｐＥＴ３０−ＣＡＲからヒスチジンタグを持つＣＡＲをＸｂａＩ／ＳｐｅＩで切り出し、上記ｐＥＴ２８ｂ−ＲＸＲαのＸｂａＩサイトにクローニングし、ＣＡＲとＲＸＲαの共発現ベクターｐＥＴ２８−ＣＡＲ−ＲＸＲαとした。
ｐＥＴ２８−ＣＡＲ−ＲＸＲαを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、１ＬのＬＢで３７℃でＯＤ６００が０．８に達するまで培養を行った後に、１８℃に移し、１ｍＭ ＩＰＴＧを加え１８時間培養を行った。大腸菌は遠心により回収し、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４，２００ｍＭ ＮａＣｌ，２５ｍＭ イミダゾールに懸濁し、−２０℃に保存した。
細胞を超音波破砕し、遠心により不溶性タンパク質を取り除いた後ニッケルカラム（Amersham Bioscience社製、ＨｉＴｒａｐカラム）にロードした。２５ｍＭ イミダゾールで洗浄した後、６８ｍＭのイミダゾールによりＲＸＲαＬＢＤを溶出した。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ８．０，１５０ｍＭ ＮａＣｌの透析液５Ｌで透析し、濃縮後、さらにＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲル濾過クロマトグラフィーにより精製した。
（ヘテロダイマーの形成）
精製したＰＰＡＲγおよびＲＸＲαを様々な濃度比で混合した後、Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥを行うことで、ヘテロダイマーを効率よく形成する濃度比を決定した。
精製したＰＰＡＲγおよびＲＸＲαを様々な濃度比で混合した後、Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥを行うことで、ヘテロダイマーを効率よく形成する濃度比を決定した。
実施例４
ＰＰＡＲγとＲＸＲαの２つのポリペプチドよりなるヘテロダイマーに、リガンドＢＲＬ４９６５３（J. Biol. Chem., 270: 12953-12956, 1995），シグリタゾン（New Current, 14 (26), p2-8, 2003年12月1日号），またはＭＣＣ−５５５（J. Biol. Chem., 273: 32679-32684, 1998）を濃度を変化させて加え、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥと本発明の親和性ポリアクリルアミド電気泳動法を行った。親和性ポリアクリルアミドゲルの製造に用いたペプチドは実施例１で製造した配列番号２のアミノ酸配列を有するものである。
各サンプルに対し５ｘサンプルバッファー（３１２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ６．８，５０％グリセロール，０．０５％ ブロモフェノールブルー）を１ｘになるように加える。
泳動バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．８，１９２ｍＭ グリシン）を用いて１０ｍＡの低電流下に４℃で電気泳動を行った。ゲルをクマシーブリリアントブルーを用いて染色し、酢酸・メタノール混合液で脱色し、タンパク質を検出した。
結果を図３および図４に示す。Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥにおいては、ヘテロダイマーはリガンドの添加により電気泳動に変化は見られない（図３）。一方、ＳＲＣ１−２，２０μＭ）を固定化した本発明の親和性−ＰＡＧＥにおいては、リガンドの種類と濃度に応じた電気泳動の遅れが検出される（図４）。
ＰＰＡＲγとＲＸＲαの２つのポリペプチドよりなるヘテロダイマーに、リガンドＢＲＬ４９６５３（J. Biol. Chem., 270: 12953-12956, 1995），シグリタゾン（New Current, 14 (26), p2-8, 2003年12月1日号），またはＭＣＣ−５５５（J. Biol. Chem., 273: 32679-32684, 1998）を濃度を変化させて加え、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥと本発明の親和性ポリアクリルアミド電気泳動法を行った。親和性ポリアクリルアミドゲルの製造に用いたペプチドは実施例１で製造した配列番号２のアミノ酸配列を有するものである。
各サンプルに対し５ｘサンプルバッファー（３１２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ６．８，５０％グリセロール，０．０５％ ブロモフェノールブルー）を１ｘになるように加える。
泳動バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．８，１９２ｍＭ グリシン）を用いて１０ｍＡの低電流下に４℃で電気泳動を行った。ゲルをクマシーブリリアントブルーを用いて染色し、酢酸・メタノール混合液で脱色し、タンパク質を検出した。
結果を図３および図４に示す。Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥにおいては、ヘテロダイマーはリガンドの添加により電気泳動に変化は見られない（図３）。一方、ＳＲＣ１−２，２０μＭ）を固定化した本発明の親和性−ＰＡＧＥにおいては、リガンドの種類と濃度に応じた電気泳動の遅れが検出される（図４）。
実施例５
実施例１で製造した３つのペプチドを用いて実施例２の方法で３種のゲルを製造した。またリガンドとして、ＢＲＬ４９６５３（Ａ），15-デオキシ-Δ12,14-プロスタグランジン J2（Ｂ）（Cell, 83: 803-812, 1995, Cell, 83: 813-819, 1995）, 13-オキソ-オクタデカジエン酸（Ｃ）（Cell, 93: 229-240, 1998）, T007907（Ｄ）（J. Biol. Chem., 277: 19649-19657, 2002）, オレオイルリソホスホスファチド酸（oleoyl lysophosphatidic acid）（Ｅ）（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100: 131-136, 2003）, シグリタゾン（ciglitazone）（Ｆ）, MCC-555（Ｇ）を用い、実施例４と同様の方法で本発明の親和性ポリアクリルアミド電気泳動法を行い、タンパク質を検出した。結果を図５に示す。親和性−ＰＡＧＥにおいてＰＰＡＲγに対するリガンドの種類、ペプチドの種類に応じて異なるアフィニティーが検出された。
実施例１で製造した３つのペプチドを用いて実施例２の方法で３種のゲルを製造した。またリガンドとして、ＢＲＬ４９６５３（Ａ），15-デオキシ-Δ12,14-プロスタグランジン J2（Ｂ）（Cell, 83: 803-812, 1995, Cell, 83: 813-819, 1995）, 13-オキソ-オクタデカジエン酸（Ｃ）（Cell, 93: 229-240, 1998）, T007907（Ｄ）（J. Biol. Chem., 277: 19649-19657, 2002）, オレオイルリソホスホスファチド酸（oleoyl lysophosphatidic acid）（Ｅ）（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100: 131-136, 2003）, シグリタゾン（ciglitazone）（Ｆ）, MCC-555（Ｇ）を用い、実施例４と同様の方法で本発明の親和性ポリアクリルアミド電気泳動法を行い、タンパク質を検出した。結果を図５に示す。親和性−ＰＡＧＥにおいてＰＰＡＲγに対するリガンドの種類、ペプチドの種類に応じて異なるアフィニティーが検出された。
本発明によれば（ポリ）ペプチド間の相互作用を簡易な方法により検出する。
Claims (4)
- アクリルアミド（Ａ）、メチレンビスアクリルアミド（Ｂ）、および一般式（Ｉ）：
ＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣＨ２ＮＨＣＯＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ２ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯ−Ｐ
（式中、Ｐは(ポリ）ペプチド鎖を表す）
または、一般式（ＩＩ）：
ＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣＨ２ＮＨＣＯＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ２ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＮＨ−Ｐ
（式中、Ｐは（ポリ）ペプチド鎖を表す）
で表されるアクリルアミド誘導体（Ｃ）の共重合体を含む親和性ポリアクリルアミドゲルであって、
Ａ：Ｂ：Ｃのモル比が、１００：１〜２：０．００１〜０．００５である親和性ポリアクリルアミドゲル。 - 請求項１に記載の(ポリ）ペプチドを含む親和性ポリアクリルアミドゲルを媒体として用い、他の（ポリ）ペプチドを電気泳動し、両（ポリ）ペプチド間の相互作用の有無を検出する親和性ポリアクリルアミド電気泳動法。
- 請求項１に記載の(ポリ）ペプチドがコアクチベーターの核内受容体結合部分であり、他の（ポリ）ペプチドが核内受容体である請求項２に記載の親和性ポリアクリルアミド電気泳動法。
- 核内受容体とリガンド候補化合物との混合物を、（ポリ）ペプチドがコアクチベーターの核内受容体結合部分である請求項１に記載の親和性ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動して、核内受容体とコアクチベーターとの相互作用の有無を確認することを含む、核内受容体のリガンドの探索方法。
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| JP2001161361A (ja) * | 1999-12-06 | 2001-06-19 | Mitsubishi Rayon Co Ltd | 生体高分子チップのハイブリダイゼーション法 |
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