JP4592772B2 - δPKCの活性化および阻害のためのペプチド - Google Patents
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Description
プロテインキナーゼC(PKC)は、種々の細胞性機能(細胞増殖、遺伝子発現およびイオンチャネル活性の調節を含む)に関するシグナル伝達において重要な酵素である。PKCファミリーのアイソザイムは、少なくとも11の異なるプロテインキナーゼを含み、これらのプロテインキナーゼは、その相同性およびアクチベーターに対する感受性に基づいて少なくとも3つのサブファミリーに分割され得る。古典的サブファミリー、すなわちcPKCサブファミリーのメンバーである、αPKC、βIPKC、βIIPKC、およびγPKCは、アイソザイム独自領域(可変領域、すなわちV領域)の間に位置する、4つの相同性領域(C1、C2、C3およびC4)を含み、カルシウム、ホスファチジルセリン(PS)、およびジアシルグリセロール(DG)またはホルボールエステルを、活性化のために必要とする。新規サブファミリー、すなわち、nPKCサブファミリーのメンバーである、δPKC、εPKC、ηPKC、およびθPKCは、C2相同性領域を欠いており、かつ、活性化のためにカルシウムを必要としない。最終的に、異型サブファミリー、すなわちαPKCサブファミリーのメンバーである、ζPKCおよびλ/lPKCは、C2相同性領域およびC1相同性領域の半分の両方を欠いており、そして、DG,ホルボールエステル、およびカルシウムに対して非感受性である。
、1989;Papadopoulos and Hall,1989;Mochly−Rosenら,1990)。
(1) δV1−1(配列番号4)、δV1−2(配列番号5)、ψδRACK(配列番号6)、δV1−5(配列番号7)ならびにそれらの誘導体およびフラグメントからなる群より選択される、ペプチド。
(2) 前記誘導体が、配列番号34〜48で示されるδV1−1誘導体からなる群より選択される、項目1に記載のペプチド。
(3) 前記誘導体が、配列番号65〜71で示されるδV1−2誘導体からなる群より選択される、項目1に記載のペプチド。
(4) 前記誘導体が、配列番号11〜19、22〜33で示されるψδRACK誘導体からなる群より選択される、項目1に記載のペプチド。
(5) 前記フラグメントが、配列番号49〜64で示される群から選択される配列を有する、項目1に記載のペプチド。
(6) 前記フラグメントが、配列番号20および配列番号21で示される群から選択される配列を有する、項目1に記載のペプチド。
(7) 前記ペプチドが組換え生成される、項目1〜6のいずれか1項に記載のペプチド。
(8) 前記ペプチドが化学的に合成される、項目1〜6のいずれか1項に記載のペプチド。
(9) 前記ペプチドがポリヌクレオチドによりコードされる、項目1〜6のいずれか1項に記載のペプチド。
(10) 前記ペプチドが、細胞膜を通じた輸送を容易にするのに有効な部分に連結されている、項目1〜6のいずれか1項に記載のペプチド。
(11) 前記ペプチドが、Tat由来ペプチド、Antennapediaキャリアペプチド、およびポリアルギニンペプチドから選択される部分に連結されている、項目10に記載のペプチド。
(12) 第2のペプチドに連結されて融合ペプチドを形成している、項目1〜6のいずれか1項に記載のペプチド。
(13)低酸素状態に曝された細胞または組織に対する虚血性損傷を低減するのに使用するための組成物であって、δPKCアンタゴニストを含む、組成物。
(14) 前記細胞または組織が前記低酸素状態に曝される前に、前記δPKCアンタゴニストが投与される、項目13に記載の組成物。
(15) 前記組織が前記低酸素状態に曝されている間に、前記δPKCアンタゴニストが投与される、項目13に記載の組成物。
(16) 前記組織が前記低酸素状態に曝された後に、前記δPKCアンタゴニストが投与される、項目13に記載の組成物。
(17) 前記δPKCアンタゴニストが、δV1−1(配列番号4)、δV1−2(配列番号5)、δV1−5(配列番号7)、δV1−1(配列番号4)の誘導体、δV1−2(配列番号5)の誘導体、δV1−5(配列番号7)の誘導体、δV1−1(配列番号4)のフラグメント、δV1−2(配列番号5)のフラグメント、およびδV1−5(配列番号7)のフラグメントである、項目13〜16のいずれか1項に記載の組成物。
(18) 前記δV1−1誘導体アンタゴニストが、配列番号34〜48で示されるペプチドである、項目17に記載の組成物。
(19) 前記δV1−2誘導体アンタゴニストが、配列番号65〜71で示されるペプチドである、項目17に記載の組成物。
(20) 前記ペプチドフラグメントが、配列番号49〜64で示される、項目17に記載の組成物。
(21) 前記δPKCアンタゴニストペプチドが、細胞膜を通じた輸送を容易にするのに有効な部分に連結されている、項目13〜20のいずれか1項に記載の組成物。
(22) 前記部分が、Tat由来ペプチド、Antennapediaキャリアペプチド、またはポリアルギニンペプチドである、項目21に記載の組成物。
(23) 前記δPKCアンタゴニストペプチドが、冠状動脈を通じた注入により組織に送達される、項目13〜22のいずれか1項に記載の組成物。
(24)発作に起因する低酸素現象から細胞または組織に対する損傷を低減するための組成物であって、δPKCアンタゴニストを含む、組成物。
(25) 前記細胞または組織が前記低酸素状態に曝される前に、前記δPKCアンタゴニストが投与される、項目24に記載の組成物。
(26) 前記組織が前記低酸素状態に曝されている間に、前記δPKCアンタゴニストが投与される、項目24に記載の組成物。
(27) 前記組織が前記低酸素状態に曝された後に、前記δPKCアンタゴニストが投与される、項目24に記載の組成物。
(28) 前記δPKCアンタゴニストが、δV1−1(配列番号4)、δV1−2(配列番号5)、δV1−5(配列番号7)、δV1−1(配列番号4)の誘導体、δV1−2(配列番号5)の誘導体、δV1−5(配列番号7)の誘導体、δV1−1(配列番号4)のフラグメント、δV1−2(配列番号5)のフラグメント、およびδV1−5(配列番号7)のフラグメントである、項目24〜27のいずれか1項に記載の組成物。
(29) 前記δV1−1誘導体アンタゴニストが、配列番号34〜48で示されるペプチドである、項目28に記載の組成物。
(30) 前記δV1−2誘導体アンタゴニストが、配列番号65〜71で示されるペプチドである、項目28に記載の組成物。
(31) 前記ペプチドフラグメントが、配列番号49〜64で示される、項目28に記載の組成物。
(32) 前記δPKCアンタゴニストペプチドが、細胞膜を通じた輸送を容易にするのに有効な部分に連結されている、項目24〜31のいずれか1項に記載の組成物。
(33) 前記部分が、Tat由来ペプチド、Antennapediaキャリアペプチド、またはポリアルギニンペプチドである、項目32に記載の組成物。
(34)低酸素状態に曝された細胞に対する損傷を増強するための組成物であって、δPKCアゴニストを含む、組成物。
(35) 前記アゴニストが、配列番号6で示されるψδRACK、配列番号6の誘導体、またはそのフラグメントである、項目34に記載の組成物。
(36) 前記アゴニストが、配列番号11〜19および配列番号22〜29から選択されるペプチドである、項目34に記載の組成物。
(37) 前記アゴニストが、配列番号20〜21から選択されるペプチドである、項目34に記載の組成物。
(38) 前記細胞が腫瘍細胞である、項目34〜37のいずれか1項に記載の組成物。
(39) 前記アゴニストが、細胞膜を通じた輸送を容易にするのに有効な部分に連結されている、項目34〜38のいずれか1項に記載の組成物。
(40) 低酸素性損傷または虚血性損傷からの細胞の保護を誘導するのに有効な化合物を同定する方法であって、
試験化合物の存在下および非存在下で、δRACK結合部位を含むδPKCペプチドを、δRACK結合部位を有するδPKCアンタゴニストペプチドと接触させる工程、および
(i)該試験化合物の存在下での結合が、該試験化合物の非存在下での結合と比較して減少している場合、または(ii)該試験化合物の触媒活性が、該試験化合物の非存在下での活性と比較して増大している場合に、保護を誘導するのに有効であると該試験化合物を同定する工程、
を包含する、方法。
(41) 前記接触工程が、δV1−1(配列番号4)、δV1−2(配列番号5)、δV1−5(配列番号7)ならびにそれらの誘導体およびフラグメントからなる群より選択されるδPKCペプチドと接触させる工程を包含する、項目40に記載の方法。
(42) 前記接触工程が、配列番号34〜48からなる群より選択されるδPKCアンタゴニストペプチドと接触させる工程を包含する、項目39に記載の方法。
(43) 前記接触工程が、配列番号49〜64からなる群より選択されるδPKCアンタゴニストペプチドと接触させる工程を包含する、項目39に記載の方法。
(44) 前記接触工程が、配列番号65〜71からなる群より選択されるδPKCアンタゴニストペプチドと接触させる工程を包含する、項目39に記載の方法。
(45) 前記δRACK結合部位を含むδPKCペプチドが、配列番号72で示される、項目39に記載の方法。
(46) 細胞における低酸素性損傷または虚血性損傷を増強するのに有効な化合物を同定する方法であって、
試験化合物の存在下および非存在下で、ψδRACKアゴニストペプチドを、RACK結合部位を含むδPKCペプチドと接触させる工程、および
(i)該試験化合物の存在下での結合が、該試験化合物の非存在下での結合と比較して減少している場合、または(ii)該試験化合物の存在下での該δPKCの触媒活性が、該試験化合物の非存在下での触媒活性と比較して増大している場合に、虚血性損傷を増大するのに有効であると該試験化合物を同定する工程、
を包含する、方法。
(47) 前記接触工程が、配列番号6、そのフラグメントおよび誘導体からなる群より選択されるψδRACKペプチドと接触させる工程を包含する、項目46に記載の方法。
(48) 前記接触工程が、配列番号11〜19および配列番号22〜29で示されるペプチドからなる群より選択される配列を有するψδRACKペプチドと接触させる工程を包含する、項目46に記載の方法。
(49) 前記接触工程が、配列番号20〜21で示されるペプチドからなる群より選択される配列を有するψδRACKペプチドフラグメントと接触させる工程を包含する、項目46に記載の方法。
(50) 虚血現象または低酸素現象により引き起こされる損傷から組織を保護するための組成物であって、配列番号4、配列番号5、配列番号7で示されるペプチド、それらの誘導体およびフラグメントから選択されるペプチドを含む、組成物。
(51) 前記ペプチドが、配列番号34〜47で示される誘導体から選択されるδV1−1ペプチド誘導体である、項目50に記載の組成物。
(52) 前記ペプチドが、配列番号65〜71で示される誘導体から選択されるδV1−2ペプチド誘導体である、項目50に記載の組成物。
(53) 前記ペプチドが、配列番号49〜64で示されるペプチドから選択されるフラグメントである、項目50に記載の組成物。
(54) 前記ペプチドが、細胞膜を通じた輸送を容易にするのに有効な部分に連結されている、項目50〜53のいずれか1項に記載の組成物。
(55) 前記部分が、Tat由来ペプチド、Antennapediaキャリアペプチド、またはポリアルギニンペプチドである、項目54に記載の組成物。
(56) 前記ペプチドが、静脈内経路、非経口経路、皮下経路、吸入経路、鼻腔内経路、舌下経路、粘膜経路、および経皮経路から選択される経路によって前記組織に投与される、項目50〜55のいずれか1項に記載の組成物。
(57) 前記ペプチドが再灌流の間に投与される、項目50〜55のいずれか1項に記載の組成物。
(58) 前記ペプチドが、脳、心臓、目、および腎臓からなる群より選択される組織の虚血に対する保護を提供するのに有効である、項目50〜57のいずれか1項に記載の組成物。
(発明の要旨)
従って、虚血現象に起因する損傷から組織を保護する方法を提供することが本発明の目的である。
される。
配列番号1は、εPKC由来の8アミノ酸のペプチド(εV1−2と称され、そして米国特許第6,165,977号に記載されている)である。
配列番号2は、ラットδPKC(登録番号KIRTCD)のV1ドメイン由来のアミノ酸1〜141に対応する。
配列番号3は、マウスθPKC(登録番号Q02111)のV1ドメインのアミノ酸1〜124に対応する。
配列番号4は、δPKCの第一可変領域由来のアミノ酸配列(アミノ酸8〜17)、δV1−1である。
配列番号5は、δPKCの第一可変領域由来のアミノ酸配列(アミノ酸35〜44)、δV1−2である。
配列番号6は、δPKC由来のアミノ酸配列(アミノ酸74〜81)であり、そして本明細書中において、「偽δ」RACK、またはψδRACKと称される。
配列番号7は、δPKCの領域由来のアミノ酸配列(アミノ酸619〜676)であり、本明細書中において、δV1−5と称される。
配列番号8は、Drosophila Antennapediaホメオドメイン由来のキャリアペプチドである。
配列番号9は、Tat由来のキャリアペプチド(Tat47〜57)である。
配列番号10は、βPKC選択的アクチベーターペプチドである。
配列番号11は、配列番号6(ψδRACK)の改変である。
配列番号12は、配列番号6(ψδRACK)の改変である。
配列番号13は、配列番号6(ψδRACK)の改変である。
配列番号14は、配列番号6(ψδRACK)の改変である。
配列番号15は、配列番号6(ψδRACK)の改変である。
配列番号16は、配列番号6(ψδRACK)の改変である。
配列番号17は、配列番号6(ψδRACK)の改変である。
配列番号18は、配列番号6(ψδRACK)の改変である。
配列番号19は、配列番号6(ψδRACK)の改変である。
配列番号20は、配列番号6(ψδRACK)のフラグメントである。
配列番号21は、配列番号6(ψδRACK)のフラグメントである。
配列番号22は、配列番号6(ψδRACK)の改変である。
配列番号23は、配列番号6(ψδRACK)の改変である。
配列番号24は、配列番号6(ψδRACK)の改変である。
配列番号25は、配列番号6(ψδRACK)の改変である。
配列番号26は、配列番号6(ψδRACK)の改変である。
配列番号27は、配列番号6(ψδRACK)の改変である。
配列番号28は、配列番号6(ψδRACK)の改変である。
配列番号29は、配列番号6(ψδRACK)の改変である。
配列番号30は、配列番号6(ψδRACK)の改変である。
配列番号31は、配列番号6(ψδRACK)の改変である。
配列番号32は、配列番号6(ψδRACK)の改変である。
配列番号33は、配列番号6(ψδRACK)の改変である。
配列番号34は、配列番号4(δV1−1)の改変である。
配列番号35は、配列番号4(δV1−1)の改変である。
配列番号36は、配列番号4(δV1−1)の改変である。
配列番号37は、配列番号4(δV1−1)の改変である。
配列番号38は、配列番号4(δV1−1)の改変である。
配列番号39は、配列番号4(δV1−1)の改変である。
配列番号40は、配列番号4(δV1−1)の改変である。
配列番号41は、配列番号4(δV1−1)の改変である。
配列番号42は、配列番号4(δV1−1)の改変である。
配列番号43は、配列番号4(δV1−1)の改変である。
配列番号44は、配列番号4(δV1−1)の改変である。
配列番号45は、配列番号4(δV1−1)の改変である。
配列番号46は、配列番号4(δV1−1)の改変である。
配列番号47は、配列番号4(δV1−1)の改変である。
配列番号48は、配列番号4(δV1−1)の改変である。
配列番号49は、配列番号4(δV1−1)のフラグメントである。
配列番号50は、配列番号4(δV1−1)の改変されたフラグメントである。
配列番号51は、配列番号4(δV1−1)の改変されたフラグメントである。
配列番号52は、配列番号4(δV1−1)の改変されたフラグメントである。
配列番号53は、配列番号4(δV1−1)の改変されたフラグメントである。
配列番号54は、配列番号4(δV1−1)の改変されたフラグメントである。
配列番号55は、配列番号4(δV1−1)の改変されたフラグメントである。
配列番号56は、配列番号4(δV1−1)の改変されたフラグメントである。
配列番号57は、配列番号4(δV1−1)の改変されたフラグメントである。
配列番号58は、δV1−1のフラグメントである。
配列番号59は、δV1−1のフラグメントである。
配列番号60は、δV1−1のフラグメントである。
配列番号61は、δV1−1のフラグメントである。
配列番号62は、δV1−1のフラグメントである。
配列番号63は、δV1−1のフラグメントである。
配列番号64は、δV1−1のフラグメントである。
配列番号65は、配列番号5(δV1−2)の改変である。
配列番号66は、配列番号5(δV1−2)の改変である。
配列番号67は、配列番号5(δV1−2)の改変である。
配列番号68は、配列番号5(δV1−2)の改変である。
配列番号69は、配列番号5(δV1−2)の改変である。
配列番号70は、配列番号5(δV1−2)の改変である。
配列番号71は、配列番号5(δV1−2)の改変である。
配列番号72は、アネキシンVの配列である。
(I.定義)
他に示されない限り、本明細書中の全ての用語は、本発明の分野の当業者に対するものと同じ意味を有する。開業医は、特に、当該分野の定義および用語について、Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel,F.M.ら、John Wiley and Sons,Inc.,Media Pa.)に注目する。
972)第5巻、National Biomedical Research Foundation,101−110頁、およびこの巻の補遺2、1−10頁)を使用して5より大きいアライメントスコアを有する場合に、相同(この用語が本明細書中において好ましく使用される場合に)であるとみなされる。より好ましくは、2つの配列(またはその部分)は、それらのアミノ酸が、上述のALIGNプログラムを使用して最適に整列された場合に、50%以上、より好ましくは70%、なおより好ましくは80%同一である場合に、相同である。
1つの局面において、本発明は、δPKCを活性化するのに効果的なペプチドおよびδPKCを阻害するのに効果的なペプチドを包含する。δPKCに対するRACKの配列は、未知である。なぜなら、このRACKが、未だ同定されていないからである。従って、δRACK配列についてのいかなる情報も存在しない下で、δPKC選択的なアクチベーターペプチドおよびインヒビターペプチドを同定することは困難である。さらに、虚血に応答するδPKCの正確な役割もまた、当該分野で未知である。δPKC(εPKCのような)が、ラットにおける虚血前条件付けの際にトランスロケーションを受けることが公知である(Gray,M.O.ら;Chen,C.−H.ら)。しかし、δPKCのトランスロケーションが虚血からの保護を生じるか否かは、本発明まで未知であった。
仮定された。δPKCの第1の可変(V1)ドメインは、RACK結合部位を含むので(Johnsonら、1996a)、θPKCに最も類似性の低い領域が、RACK結合に関与し得る。図1は、ラットδPKCのV1ドメイン(配列番号2;登録番号KIRTCD)およびマウスθPKC V1ドメイン(配列番号3;登録番号Q02111)の配列を比較する。δPKC V1ドメインにおける3つの領域が、θPKCに対してわずか約10%の同一性を有するものとして同定された。これらの領域は、δPKC配列の上側の棒によって図1において示され、本明細書中でδV1−1(配列番号4として本明細書中で同定された配列(SFNSYELGSL)を有する)、δV1−2(配列番号5として本明細書中で同定された配列(ALTTDRGKLV)を有する)、およびψδRACK(配列番号6として本明細書中で同定された配列(MRAAEDPM)を有する)と呼ばれる。図1に示されないが、δPKCの活性化または阻害を試験するためにδPKC配列から同定された、なお別の配列が存在する。この配列は、配列番号7として同定され、そして本明細書中でδV1−5と呼ばれる。
細胞についての結果を示す。粒子性画分におけるδPKCの基礎的な分配は、δV1−1によって阻害され、そしてψδRACKの存在は、このδV1−1の効果を反転させた。
別の研究において、δPKCアクチベーターペプチドψδRACKおよびδPKCインヒビターペプチドδV1−1を、単離されたラット心筋細胞に投与し、虚血からの保護におけるδPKCの役割を決定した。実施例2に記載されるように、δV1−1および/またはψδRACKのAntennapediaキャリアペプチド結合体を、長期の虚血の10分前に、単離された成体ラット心筋細胞に導入した。細胞損傷を、トリパンブルーの取り込みを測定することによる、浸透圧脆弱性試験を使用して評価した。結果を、図5A〜5Cに示す。
本発明を支持して行われた別の研究において、δPKC選択的インヒビターペプチドδV1−1、またはアクチベーターペプチドψδRACKを、エキソビボで心臓全体に送達し、これらのペプチドが器官全体に細胞外導入された場合に、活性を有するか否かを決定した。実施例3に示されるように、δV1−1ペプチドおよびψδRACKペプチドを、キャリアペプチドであるTat由来ペプチドに結合体化した。これらのペプチドを、虚血期間の導入前に、Langendorff灌流したラット心臓に送達した。ペプチドを灌流した後、全体的な虚血が、30分間もたらされた。この30分間の虚血期間後、放出されたクレアチンホスホキナーゼ(CPK)の量を、30分間の再灌流期間中モニターした。結果を、図6A〜6Bに示す。
mHg/秒)および冠動脈灌流圧(PP、mmHg)を示す。図7Bは、未処置の心臓に
ついての同様のプロットである。δV1−1で処置した心臓(図7A)および未処置の心臓(図7B)についてのトレースを比較することによって理解されるように、δV1−1を再灌流の最初の20分間中に送達した場合、虚血後の機能的回復に有意な改善が存在した。特に、LVP回復およびその一次導関数(dP/dt)の両方における有意な改善が、虚血発作後にδV1−1を投与することによって達成された。δV1−1ペプチドは、その上昇されたLVP拡張末期圧および冠動脈灌流圧(PP)を減少させた。さらに、ビヒクルコントロールで処置した心臓と比較して、クレアチンホスホキナーゼ放出における約50%の減少が存在した(示さず)。
LVDPを有した。
本発明を支持する別の研究において、虚血性または低酸素症性の現象に起因する損傷から組織を保護するδV1−1ペプチドの能力を、成体雌性ブタにインビボでペプチドを投与することによって評価した。実施例5に詳述されるように、δV1−1ペプチドを、30分間の虚血発作の最後の10分間の間、ブタに投与した。5日後、心臓を、組織損傷について分析した。これらの結果を、図9A〜9Bに示す。
た:(1)バルーンカテーテルによる左前方下行動脈の閉塞前(虚血前);(2)2.5μM/10mLのδV1−1を用いる再灌流直後(虚血後);および(3)6フレンチのブタ尾部カテーテルを使用する、5日後の屠殺前(虚血後5日)。LVGを、2つの視点(右斜め前方および左斜め前方)によって記録した。放出分率(EF)(最大収縮の間の、左心室に存在する総最大量のうち、1心拍数で放出された血液の割合)を、ソフトウェア(Plus Plus(Sanders Data Systems))によって分析し、そして2つの視点の平均を評価した。放出分率を、左心室の寸法に基づいて算定し、そして結果を図10に示す。放出分率を、心臓が十分に機能しているかどうかの測定であり、より高い放出分率は、心臓がより良く機能していることを示す。短時間での50%未満の放出分率は、心不全状態への進行を示唆し得る。δV1−1処置動物(黒丸)は、スクランブルペプチドで処置したコントロール動物(白丸)が示したものよりも、放出分率において、より顕著でない減少を示し、このことは、このペプチドが、虚血に起因する細胞および組織に対する損傷を減少または予防するために有効であることを示唆する。このことはまた、虚血後5日目のデータポイントから明らかである。ここで、δV1−1処置された動物は、虚血前に測定された基準値に対して、未処置動物よりも有意により高い放出分率を有した。
本発明を支持するためにさらに実行された別の研究において、δV1−1ペプチド(配列番号4)が発作の結果としての脳に対する損傷を阻害する能力を試験した。実施例6に記載されるこの研究において、ラット大脳虚血モデルを使用した。虚血を、中大脳動脈の口を閉塞するための腔内縫合を使用して誘導した。Tatペプチド(配列番号9)に結合体化したδV1−1またはTatペプチド単独を、2時間の閉塞時間の前または後に、頚動脈に注射した。各動物由来の脳を、24時間後に収集し、染色し、そして試験した。結果を、図11A〜11Bに示す。
上記のように、本発明のペプチド(δV1−1、δV1−2、δV1−5およびψδRACK)は、δPKCの転移インヒビターまたはアクチベーターとして作用する。ψδR
ACKは、δPKC転移を誘導して、虚血および/または低酸素症に起因する細胞損傷を促進する、アゴニストである。δV1−1、δV1−2およびδV1−5は、δPKC転移を阻害して、虚血および結果として生じる低酸素症に起因する細胞損傷を予防する、アンタゴニストである。
胞においてこのフラグメントからmRNAを発現し得るプロモーターに、作動可能に連結される。
別の局面において、本発明は、低酸素症/虚血損傷からの細胞もしくは組織の保護を誘導するか、または細胞もしくは組織における低酸素症損傷もしくは虚血損傷を増強するに有効な化合物を同定する方法を包含する。
護を誘導するための治療剤としての用途を見出す。この化合物はまた、他のペプチドを同定するためのスクリーニングツールとして、または他のペプチドを同定するために適切な
化合物としての用途を見出す。
るその効果が、閾値レベルを超える場合)、その試験化合物を活性とみなす。より詳細には、結合の減少が、コントロールサンプルと実験サンプルとの間で数倍異なる場合、その化合物を、結合活性を有するものとみなす。代表的には、試験サンプルとコントロールサンプルとの間の結合において、2倍または4倍の閾値差が求められる。
以下の実施例は、本明細書中に記載の本発明をさらに例示し、そして本発明の範囲を限定することを全く意図されない。
(δV1−1、δV1−2およびψδRACKの活性)
(A.ペプチド調製)
δV1−1(配列番号4)およびψδRACK(配列番号6)を、Stanford Protein and Nucleic Acid Facilityで合成および精製(>95%)した。これらのペプチドを、Drosophila Antennapediaホメオドメイン(配列番号8;Theodore,L.ら;Johnson,J.A.ら、1996b)へのN末端Cys−Cys結合を介する架橋によって、キャリアペプチドを用いて改変した。本明細書中で報告されないいくつかの研究において、これらのペプチドを、Tat由来ペプチド(配列番号9)に整列させた。
初代心筋細胞培養物(90〜95%純度)を、新生仔ラットから調製した(Gray,
M.O.ら;Disatnik M.−H.ら)。ペプチドδV1−1およびψδRACKを、500nMの適用濃度にて、それぞれ、3nmおよび10nmの濃度のホルボール12−ミリスチレート13−アセテート(PMA)の存在下および非存在下で、10〜20分間、細胞に導入した。第3のセットの細胞において、ペプチドδV1−1を、500nMのψδRACKの存在下および非存在下で、500nMの濃度で適用した。
(単離された心筋細胞へのペプチド投与)
ペプチドδV1−1およびψδRACKを、実施例1に記載のように調製した。
(心臓全体へのエキソビボペプチド投与および細胞損傷に対する効果)
成体雄性ラットを、静脈内アベルチン(avertin)で麻酔し、そしてそれらの心臓を迅速に取り出し、そしてランゲンドルフ装置を使用する当該分野で記載されるような(Colbert,M.C.ら)灌流のために、大動脈を介してカニューレ挿入した。除去の90秒以内に心臓を灌流するように注意した。心臓を、酸素付加したKrebs−H
enseleit溶液で灌流した。この溶液は、以下から構成される(nmol/L):NaCl 120;KCl 5.8;NaHCO3 25;NaH2CO4 1.2;MgSO4 1.2;CaCl2 1.0;およびデキストロース 10、pH7.4、37℃。
(心臓全体へのエキソビボペプチド投与および機能回復に対する効果)
ラット心臓を、実施例3に記載のように単離した。左心室圧およびその実時間導関数(dP/dt)を、心室内腔中に配置したラテックスバルーンを介し、ペーシング(3.3Hz)によって一定の心拍数で、そして一定の冠状流速(10ml/分)で、モニターした。心臓を、20分間の虚血および30分間の再灌流に供した。再灌流の最初の20分間中、500nMのδV1−1またはビヒクルコントロールを送達した。結果を、図7A〜7Bに示す。
(虚血後のδV1−1のインビボ投与)
成体雌性ブタ(35〜40kg体重)を麻酔し、そしてカテーテルを、頸動脈を通して心臓へ導入した。従来の介入心臓学的技術を使用して、ワイヤを、カテーテルを通して、そして左前室間動脈に配置した。バルーンを、このワイヤ上で、閉塞部位に対して作動させ、その後、30分間膨張させて、血流をブロックした。この30分間の閉塞の最後の10分間中、キャリアペプチド単独または実施例3に記載されるようなキャリアTatペプチドを結合体化したδV1−1ペプチドのいずれかから構成されるコントロールを、ゆっくりとした拡散(1mL/分)で、閉塞部の下流に直接送達した。約20μgのδV1−1ペプチド(約400ng/kg体重)を、投与した。
(発作損傷保護のためのラットへのδV1−1のインビボ投与)
(A.大脳虚血モデル)
成体雄性Sprague−Dawleyラット(280〜320g体重)を、使用した。動物を、全ての外科手順中、イソフルランでの麻酔下に維持した。生理学的パラメーターをモニターし、そして正常範囲に維持した。直腸温度もまた、測定した。実験の完了時に、動物を、過剰用量のバルビツレートで安楽死させ、そして組織学的分析のために調製した。
虚血を、閉塞管内縫合を使用して誘導した。炎処理によって先端を丸くした、3−0ナイロンモノフィラメント縫合糸のコートされていない30mm長のセグメントを、総頸動脈の断端に挿入し、分岐部から約19〜20mm、内頸動脈内に前進させ、中大脳動脈の入口を閉塞させた。偽コントロール動物は、同様の麻酔および外科操作を受けたが、虚血を受けなかった。2時間の虚血期間後、縫合糸を除去し、動物を回復させた。24時間の再灌流後、脳を収集した。
Tatペプチドに結合体化したδV1−1(配列番号4)(0.05mL、配列番号8)またはTatキャリアコントロールペプチド(50μLの生理食塩水中の10μM溶液)を、2時間の閉塞の直前または直前および直後のいずれかに、頸動脈に注射した。δV1−1の最終血液濃度は、1μMであった。
動物を、ヘパリン処理した生理食塩水で灌流し、そして脳を取り出し、2mmの厚のスライスに切片化した。虚血損傷を評価するために、脳切片を、クレシルバイオレットまたはトリフェニルテトラゾリウムクロリド(梗塞領域を示すための生組織染料)で染色した。次いで、梗塞領域(白色)を、以前に記載された画像分析システム(Yenari、M.A.ら、1998;Maier,C.ら、1998)を使用して測定した。結果を、図11A〜11Bに示す。
Claims (9)
- 発作または心臓虚血によって生じる損傷から細胞または組織を保護するために使用するための組成物であって、該組成物は、(i)配列番号4として同定されるアミノ酸配列、または(ii)1もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失および/もしくは付加により(i)から誘導され、かつ配列番号4の生物学的活性を有するアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列はTat−キャリアペプチドに連結されている、組成物。
- 前記アミノ酸配列が配列番号4である、請求項1に記載の組成物。
- 前記Tat−キャリアペプチドは、配列番号9として同定されるアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の組成物。
- 前記アミノ酸配列は末端システインを含み、ここで該末端システインは前記Tat−キャリアペプチドに連結されている、請求項1、2または3のいずれかに記載の組成物。
- 発作または心臓虚血によって生じる損傷から細胞または組織を保護するために使用するための組成物であって、該組成物は、配列番号4のアミノ酸配列を含む第1ペプチドと、配列番号9のアミノ酸配列を含むTat−キャリアペプチドと、適切な送達ビヒクルとを含む、組成物。
- 前記組成物は、非経口投与される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記組成物は、静脈内投与される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記組成物は、冠状動脈を通じた注入により投与される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の組成物。
- (i)配列番号4として同定されるアミノ酸配列、または(ii)1もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失および/もしくは付加により(i)から誘導され、かつ配列番号4の生物学的活性を有するアミノ酸配列を、患者から取り出された器官に投与する工程を包含するエクスビボの方法であって、ここで該アミノ酸配列はTat−キャリアペプチドに連結されており、そしてここで該組成物は、該器官への損傷または傷害を減少させるに有効な量で投与される、方法。
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