JP4590629B2 - Psf1 gene-deficient animal and method of using the same - Google Patents
Psf1 gene-deficient animal and method of using the same Download PDFInfo
- Publication number
- JP4590629B2 JP4590629B2 JP2004242022A JP2004242022A JP4590629B2 JP 4590629 B2 JP4590629 B2 JP 4590629B2 JP 2004242022 A JP2004242022 A JP 2004242022A JP 2004242022 A JP2004242022 A JP 2004242022A JP 4590629 B2 JP4590629 B2 JP 4590629B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- psf1
- gene
- animal
- cells
- deficient
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 101150046368 PSF1 gene Proteins 0.000 title claims description 113
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title claims description 73
- 230000002950 deficient Effects 0.000 title claims description 60
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 63
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 32
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 29
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 25
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 18
- 230000001629 suppression Effects 0.000 claims description 14
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 13
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 11
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 claims description 11
- 206010065553 Bone marrow failure Diseases 0.000 claims description 9
- 230000003039 myelosuppressive effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 9
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 8
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 7
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 7
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 4
- 230000013011 mating Effects 0.000 claims description 2
- 101150043258 gins1 gene Proteins 0.000 description 42
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 40
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 35
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 20
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 14
- 101100031386 Mus musculus Gins1 gene Proteins 0.000 description 13
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 13
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 9
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 8
- WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N BROMODEOXYURIDINE Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 8
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 7
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 7
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 101100289995 Caenorhabditis elegans mac-1 gene Proteins 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 6
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 6
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 6
- 102100026754 DNA topoisomerase 2-binding protein 1 Human genes 0.000 description 5
- 101000762969 Homo sapiens DNA topoisomerase 2-binding protein 1 Proteins 0.000 description 5
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 5
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 5
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 5
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 5
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 5
- 101150095280 GINS4 gene Proteins 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 4
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 4
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 4
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 238000011714 129 mouse Methods 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 241000235343 Saccharomycetales Species 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 3
- 230000037308 hair color Effects 0.000 description 3
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 3
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 3
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 3
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 101100465853 Caenorhabditis elegans psf-2 gene Proteins 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 102100027564 DNA replication complex GINS protein PSF1 Human genes 0.000 description 2
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 2
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 2
- 101800000585 Diphtheria toxin fragment A Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101001080484 Homo sapiens DNA replication complex GINS protein PSF1 Proteins 0.000 description 2
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 2
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 2
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 2
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 2
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 2
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 102000006822 Agouti Signaling Protein Human genes 0.000 description 1
- 108010072151 Agouti Signaling Protein Proteins 0.000 description 1
- 208000032467 Aplastic anaemia Diseases 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000484025 Cuniculus Species 0.000 description 1
- 206010011732 Cyst Diseases 0.000 description 1
- 102000010567 DNA Polymerase II Human genes 0.000 description 1
- 108010063113 DNA Polymerase II Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 102100030380 DNA replication complex GINS protein SLD5 Human genes 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101001091269 Escherichia coli Hygromycin-B 4-O-kinase Proteins 0.000 description 1
- 241000702191 Escherichia virus P1 Species 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 230000010190 G1 phase Effects 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 101000702463 Homo sapiens DNA replication complex GINS protein SLD5 Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 241000581650 Ivesia Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 102000016971 Proto-Oncogene Proteins c-kit Human genes 0.000 description 1
- 108010014608 Proto-Oncogene Proteins c-kit Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 101001091268 Streptomyces hygroscopicus Hygromycin-B 7''-O-kinase Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 1
- 230000005983 bone marrow dysfunction Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 210000004670 early embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011134 hematopoietic stem cell transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000004960 subcellular localization Effects 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 210000002993 trophoblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 210000004340 zona pellucida Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0276—Knock-out vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
本発明は、Psf1遺伝子の機能が欠損した非ヒト哺乳動物とその利用方法に関する。 The present invention relates to a non-human mammal deficient in the function of the Psf1 gene and a method for using the same.
真核細胞におけるDNA複製の開始は、複製開始点への種々のタンパク質の作用によって制御されている。Ｍ期後期、複製開始点には６種のタンパク質（Orc1-6）が結合しているが、ここにCdc6とMcm複合体が結合して複製前複合体を形成し、さらにCdc6のリン酸化と分解を経て細胞はＧ１期からＳ期に移行する。そして、この複製前複合体にCdc7/Dbf4複合体が結合し、続くCdc45の結合がシグナルとなって、DNAポリメラーゼが動員され、DNA複製が開始される。 The initiation of DNA replication in eukaryotic cells is controlled by the action of various proteins at the origin of replication. In the late M phase, 6 kinds of proteins (Orc1-6) are bound to the replication origin. Cdc6 and Mcm complex bind to each other to form a pre-replication complex. After degradation, the cells transition from the G1 phase to the S phase. Then, the Cdc7 / Dbf4 complex binds to this pre-replication complex, and the subsequent binding of Cdc45 serves as a signal to mobilize DNA polymerase and initiate DNA replication.
Dpb11はDNAポリメラーゼεの補助因子として、複製開始機構（特にS期のチェックポイント）に関与するタンパクである。出芽酵母を用いた研究で、Dpb11と相互作用する因子として、Sld1/Dpb3、Sld2、Sld3、Sld4/ Cdc45、Sld5、Sld6/Rad53等が同定されており、さらにSld3-Cdc45複合体とDpb11との結合がDNAポリメラーゼの動員に不可欠であることが報告されている（非特許文献１参照）。 Dpb11 is a protein involved in the replication initiation mechanism (especially the S phase checkpoint) as a cofactor for DNA polymerase ε. In a study using Saccharomyces cerevisiae, Sld1 / Dpb3, Sld2, Sld3, Sld4 / Cdc45, Sld5, Sld6 / Rad53, etc. have been identified as factors that interact with Dpb11, and the Sld3-Cdc45 complex and Dpb11 It has been reported that binding is essential for the mobilization of DNA polymerase (see Non-Patent Document 1).
Psf1は、Dpb11に関する研究で、Sld5に結合する因子（Partner of Sld Five）として見出された遺伝子である。Arakiらは、Sld5、Psf1、Psf2、Psf3からなる複合体が出芽酵母におけるDNA複製に不可欠であることを報告している（非特許文献２および３参照）。
Psf1 is a gene found as a factor that binds to Sld5 (Partner of Sld Five) in research on Dpb11. Araki et al. Have reported that a complex consisting of Sld5, Psf1, Psf2, and Psf3 is essential for DNA replication in budding yeast (see
一方、Psf1は、ヒト、マウス等の哺乳動物にも広くそのオーソログの存在が確認されている。しかしながら、それらは単に配列の相同性から酵母Psf1のオーソログとして同定されただけで、当該哺乳動物における機能は全く解明されていない。そればかりか、酵母においても、Psf1の詳細な機能はほとんど解明されていない。 On the other hand, the existence of orthologs of Psf1 has been widely confirmed in mammals such as humans and mice. However, they were merely identified as orthologs of yeast Psf1 based on sequence homology, and their function in the mammal has not been elucidated at all. Moreover, the detailed function of Psf1 has not been clarified in yeast.
本発明の課題は、Psf1の個体レベルでの機能を解明し、Psf1が関与する種々の病態を解明するとともに、Psfを利用した新たな研究ツールを提供することにある。 An object of the present invention is to elucidate the function of Psf1 at the individual level, to elucidate various pathological conditions related to Psf1, and to provide a new research tool using Psf.
発明者らは、Psf1の個体レベルでの機能を解明する目的で、Psf1遺伝子欠損マウスを樹立した。そして、このマウスを解析した結果、Psf1遺伝子はホモで欠損すると致死的であるが、ヘテロで欠損した場合は、骨髄抑制疾患に良く似た重篤な骨髄抑制がみられることを見出し、本発明を完成させた。 The inventors established Psf1 gene-deficient mice for the purpose of elucidating the function of Psf1 at the individual level. As a result of analyzing this mouse, it was found that the Psf1 gene is lethal when it is homozygous, but when it is heterozygous, severe myelosuppression similar to myelosuppressive disease is observed. Was completed.
すなわち、本発明は、染色体上のPsf1遺伝子の機能が欠損している非ヒト哺乳動物（Psf1遺伝子欠損動物）に関する。 That is, the present invention relates to a non-human mammal deficient in the function of the Psf1 gene on the chromosome (Psf1 gene-deficient animal).
前記動物において、Psf1遺伝子の機能は、Psf1遺伝子またはその発現制御領域上における少なくとも一部の配列の欠失、置換、および／または他の配列の挿入によって欠損させることができる。 In the animal, the function of the Psf1 gene can be impaired by deletion, substitution, and / or insertion of other sequences of at least a part of the sequence on the Psf1 gene or its expression control region.
本発明のPsf1遺伝子欠損動物は、例えば、以下の工程で作製される。
１）Psf1遺伝子またはその発現制御領域上における少なくとも一部の配列の欠失、置換、および／または他の配列の挿入を目的としたターゲッティングベクターを作製する；
２）上記ベクターをES細胞に導入し、該ベクターで相同組換えされたES細胞を得る；
３）上記組換えES細胞を初期胚に導入し、発生させてキメラ動物を得る；
４）上記キメラ動物を野生型動物と交配して得られるF1ヘテロ接合体動物同士を交配し、得られるF2動物またはその子孫から染色体上のPsf1遺伝子の機能が欠損している動物を得る。
The Psf1 gene-deficient animal of the present invention is produced, for example, by the following steps.
1) creating a targeting vector for the purpose of deletion, substitution and / or insertion of other sequences of at least a part of the sequence on the Psf1 gene or its expression control region;
2) Introducing the vector into ES cells to obtain ES cells homologously recombined with the vector;
3) The recombinant ES cell is introduced into an early embryo and developed to obtain a chimeric animal;
4) F1 heterozygous animals obtained by mating the above chimeric animals with wild-type animals are mated with each other, and animals lacking the function of the Psf1 gene on the chromosome are obtained from the obtained F2 animals or their progeny.
本発明のPsf1遺伝子欠損動物としては、特にマウスが好ましい。
本発明のPsf1遺伝子欠損動物は、Psf1遺伝子の機能研究はもとより、骨髄抑制疾患のモデル動物としても好適に利用することができる。そのような骨髄抑制疾患としては、例えば、再生不良性貧血、抗がん剤投与、放射線被爆（照射）による遷延性の骨髄機能抑制症、自己免疫疾患に伴う骨髄抑制、種々の細菌、ウイルス感染による骨髄抑制、医薬品による副作用としての骨髄抑制、原因不明の骨髄抑制等を挙げることができる。
As the Psf1 gene-deficient animal of the present invention, a mouse is particularly preferable.
The Psf1 gene-deficient animal of the present invention can be suitably used not only for functional studies of the Psf1 gene but also as a model animal for myelosuppressive disease. Examples of such myelosuppressive diseases include aplastic anemia, administration of anticancer agents, prolonged myelosuppression due to radiation exposure (irradiation), myelosuppression associated with autoimmune diseases, various bacteria, and viral infections Bone marrow suppression due to pharmacology, bone marrow suppression as a side effect due to pharmaceuticals, bone marrow suppression with unknown cause, and the like.
本発明のPsf1遺伝子動物は骨髄機能が抑制されているため、簡単に造血幹細胞を取得することができる。取得された造血幹細胞は、種々の研究、スクリーニング系に有用である。 Since the bone marrow function is suppressed in the Psf1 gene animal of the present invention, hematopoietic stem cells can be easily obtained. The obtained hematopoietic stem cells are useful for various studies and screening systems.
本発明はまた、本発明のPsf1遺伝子欠損動物を利用した骨髄抑制疾患治療薬のスクリーニング方法を提供する。該方法は、被験物質の投与条件下と非投与条件下における動物の表現上の相違を指標として、該被験物質の骨髄抑制疾患治療薬としての効果を評価することができる。 The present invention also provides a screening method for a therapeutic agent for myelosuppressive disease using the Psf1 gene-deficient animal of the present invention. The method can evaluate the effect of the test substance as a therapeutic agent for myelosuppressive disease, using as an index the difference in expression of the animal between the test substance administration condition and the non-administration condition.
本発明により、Psf1遺伝子の機能が欠損した動物が提供される。このPsf1遺伝子欠損動物は骨髄機能抑制に起因する種々の症状を呈し、特に5-FU等の投与によって抗ガン剤投与後の重篤な骨髄抑制症状に良く似た症状を呈する。したがってかかる疾患の病態解明や薬剤開発、薬剤スクリーニングに有用である。また、本発明のPsf1遺伝子欠損動物を利用すれば、容易に造血幹細胞を調製することができる。 The present invention provides an animal deficient in the function of the Psf1 gene. This Psf1 gene-deficient animal exhibits various symptoms due to suppression of bone marrow function, and particularly exhibits symptoms similar to severe myelosuppression after administration of an anticancer drug by administration of 5-FU or the like. Therefore, it is useful for elucidating the pathology of such diseases, drug development, and drug screening. In addition, hematopoietic stem cells can be easily prepared by using the Psf1 gene-deficient animal of the present invention.
以下、本発明について詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
１．Psf1遺伝子欠損動物
本発明は、染色体上のPsf1遺伝子の機能が欠損している非ヒト哺乳動物に関する。
本発明にかかる「Psf1遺伝子」とは、出芽酵母Dpb11に関する研究で、SLD5に結合する因子（Partner of Sld Five）として見出された遺伝子である。Sld5、Psf1、Psf2、Psf3で形成される複合体は出芽酵母においてDNA複製に不可欠であることが報告されているが、その詳細な機能はわかっていない。
1. TECHNICAL FIELD The present invention relates to a non-human mammal deficient in the function of the Psf1 gene on the chromosome.
The “Psf1 gene” according to the present invention is a gene found as a factor that binds to SLD5 (Partner of Sld Five) in research on the budding yeast Dpb11. The complex formed by Sld5, Psf1, Psf2, and Psf3 has been reported to be essential for DNA replication in budding yeast, but its detailed function is unknown.
Psf1遺伝子は、酵母のみならず、マウス、ヒト等の哺乳動物にもそのオーソログの存在が報告されている。例えば、ヒトのPsf1ホモログは、かずさDNAバンクにKIAA0186として登録されている。 The presence of the ortholog of the Psf1 gene has been reported not only in yeast but also in mammals such as mice and humans. For example, the human Psf1 homolog is registered as KIAA0186 in Kazusa DNA Bank.
マウスPsf1遺伝子は、GenBank Accession No.AK013116（hypotehtical protein KIAA0186 homologue）として登録されているものがあるが、この配列は発明者らが単離、同定したマウスPsf1のCDSと完全に一致した。マウスPsf1のゲノム遺伝子は、7つのエクソンと6つのイントロンを含み、全長196aaのアミノ酸からなるPsf1タンパクをコードする（配列番号１に本発明者が同定したPsf1のCDS（配列番号２はそのアミノ酸配列）を示す）。 The mouse Psf1 gene has been registered as GenBank Accession No. AK013116 (hypotehtical protein KIAA0186 homologue), but this sequence completely matched the CDS of mouse Psf1 isolated and identified by the inventors. The genomic gene of mouse Psf1 contains 7 exons and 6 introns, and encodes a Psf1 protein consisting of 196 aa amino acids in total (SEQ ID NO: 1 is the CDS of Psf1 identified by the present inventor (SEQ ID NO: 2 is its amino acid sequence). )
公共データベースにその配列が登録されていない動物であっても、常法により、既知のPsf1遺伝子との相同性からそのPsf1遺伝子をクローニングし、配列を決定することができる。すなわち、当該動物のゲノムDNAライブラリーを作製し、遺伝的に最も近い種に由来する既知のPsf1遺伝子、またはその一部をプローブとして該ライブラリーをスクリーニングすれば、目的とするPsf1遺伝子を同定し、配列を決定すればよい。 Even in an animal whose sequence is not registered in a public database, the Psf1 gene can be cloned and sequenced by homology with a known Psf1 gene by a conventional method. That is, if a genomic DNA library of the animal is prepared and the library is screened using a known Psf1 gene derived from the genetically closest species or a part thereof as a probe, the target Psf1 gene is identified. The sequence may be determined.
本発明にかかる「Psf1遺伝子」には、上記のようなPsf1遺伝子の全てのオーソログを含み、またゲノムDNAのみならず、mRNA、cDNAも含むものとする。 The “Psf1 gene” according to the present invention includes all orthologs of the Psf1 gene as described above, and includes not only genomic DNA but also mRNA and cDNA.
本発明において、「Psf1遺伝子の機能が欠損している」とは、染色体上のPsf1遺伝子が破壊され、その機能が正常に発現されないことを意味する。すなわち、Psf1遺伝子産物が全く発現されない場合だけでなく、当該遺伝子産物が発現されてもPsf1として正常な機能を有しなければ、「Psf1遺伝子の機能が欠損している」ことになる。こうしたPsf1遺伝子の破壊は、Psf1遺伝子上、またはその転写調節領域やプロモーター領域を含む発現制御領域上の部分配列の欠失、置換、および／または他の配列の挿入等の改変によって生じさせることができる。 In the present invention, “the function of the Psf1 gene is deficient” means that the Psf1 gene on the chromosome is destroyed and the function is not normally expressed. That is, not only when the Psf1 gene product is not expressed at all, but also when the gene product is expressed, if it does not have a normal function as Psf1, it means that the function of the Psf1 gene is deficient. Such disruption of the Psf1 gene may be caused by modifications such as deletion, substitution, and / or insertion of other sequences on the Psf1 gene or on its expression control region including its transcriptional regulatory region and promoter region. it can.
なお、前記欠失、置換、または挿入を行う部位や、欠失、置換、または挿入される配列は、Psf1遺伝子の正常な機能が欠損しうる限り、特に限定されない。Psf1ゲノム遺伝子は長大であるため、そのコーディング領域の相当部分を欠失あるいは置換するような変異は、確実にPsf1遺伝子の機能を損なわせることができる。このPsf1遺伝子の機能を欠損させる手法については次項で詳細に説明する。 The site where the deletion, substitution or insertion is performed and the sequence to be deleted, substituted or inserted are not particularly limited as long as the normal function of the Psf1 gene can be deleted. Since the Psf1 genomic gene is long, a mutation that deletes or replaces a substantial part of the coding region can surely impair the function of the Psf1 gene. The method for deleting the function of the Psf1 gene will be described in detail in the next section.
本発明の非ヒト哺乳動物は、前記Psf1遺伝子機能の欠損を染色体上の一方のアレル（ヘテロ）に有する。両アレル（ホモ）でのPsf1遺伝子機能の欠損は動物にとって致死的だからである。 The non-human mammal of the present invention has a defect in the Psf1 gene function in one allele (hetero) on the chromosome. This is because the loss of Psf1 gene function in both alleles (homo) is lethal to animals.
また、本発明にかかる「非ヒト哺乳動物」は、ヒト以外の哺乳動物であれば特に限定されないが、マウス、ラット、ウサギ等の齧歯動物が好ましく、特にES細胞が確立し、遺伝子組換えが容易に実施できるマウスが最も好ましい。 Further, the “non-human mammal” according to the present invention is not particularly limited as long as it is a mammal other than a human, but is preferably a rodent such as a mouse, a rat, or a rabbit. Most preferred is a mouse that can be easily performed.
２．Psf1遺伝子欠損動物の作製方法
本発明のPsf1遺伝子欠損動物は、ジーンターゲッティング、Cre-loxPシステム、体細胞クローン等の技術を利用することにより作製することができる。
2. Method for producing Psf1 gene-deficient animal The Psf1 gene-deficient animal of the present invention can be produced by using techniques such as gene targeting, Cre-loxP system, and somatic cell clone.
２．１ ジーンターゲッティング
ジーンターゲッティングは、相同組換えを利用して染色体上の特定遺伝子に変異を導入する手法である（Capeccchi, M.R. Science, 244, 1288-1292, 1989, Thomas, K.R. & Cpeccchi, M.R. Cell, 44, 419-428, 1986）。
2.1 Gene targeting Gene targeting is a technique for introducing mutations into specific genes on chromosomes using homologous recombination (Capeccchi, MR Science, 244, 1288-1292, 1989, Thomas, KR & Cpeccchi, MR Cell, 44, 419-428, 1986).
１）ターゲティングベクターの構築
まず、Psf1遺伝子を欠損させるためのターゲッティングベクターを構築する。ターゲッティングベクターの構築に先立って、使用する動物のゲノムDNAライブラリーを調製する。このゲノムDNAライブラリーは、多型等による組換え頻度の低下が起こらないよう、使用する動物のES細胞、または当該細胞が由来する系統のゲノムDNAから作製したライブラリーを用いる必要がある。そのようなライブラリーとしては市販のもの（例えば、Stratagene社製 129Sv/Jゲノムライブラリー等）を用いてもよい。ゲノムライブラリーは、標的とするPsf1 cDNAまたはその部分配列をプローブとしてスクリーニングを行い、Psf1ゲノムDNAをクローニングする。
1) Construction of targeting vector First, a targeting vector for deleting the Psf1 gene is constructed. Prior to construction of the targeting vector, a genomic DNA library of the animal to be used is prepared. As this genomic DNA library, it is necessary to use an ES cell of an animal to be used or a library prepared from genomic DNA of a strain from which the cell is derived so that the recombination frequency does not decrease due to polymorphism or the like. As such a library, a commercially available one (eg, 129Sv / J genomic library manufactured by Stratagene) may be used. The genomic library is screened using the target Psf1 cDNA or a partial sequence thereof as a probe, and Psf1 genomic DNA is cloned.
クローニングされたゲノムDNAはシークエンシング、サザンブロッティング、制限酵素消化等を行うことにより、各エクソンの位置を明示した制限酵素地図を作成し、変異導入部位等を決定する。また、ターゲッティングベクターに使用する相同領域の外側には相同組換え体をスクリーニングするためのプローブ（external probe）を設定する。 The cloned genomic DNA is subjected to sequencing, Southern blotting, restriction enzyme digestion, etc. to create a restriction enzyme map that clearly shows the position of each exon, and to determine a mutation introduction site and the like. In addition, a probe (external probe) for screening homologous recombinants is set outside the homologous region used for the targeting vector.
本発明において、染色体上に導入する変異（欠失、置換、または挿入）はPsf1遺伝子の正常な機能が損なわれる限り特に限定されない。例えば、欠失または置換される配列は、Psf1遺伝子のイントロン領域であってもエクソン領域であっても、あるいはPsf1遺伝子の発現制御領域であってもよい。特に、Psf1遺伝子のエクソン領域の相当部分を欠失、置換させるような変異であれば、確実にPsf1遺伝子の機能を欠損させることができる。また、挿入される他の配列も特に限定されないが、以下のような各マーカー遺伝子配列が好適に用いられる。 In the present invention, the mutation (deletion, substitution, or insertion) introduced into the chromosome is not particularly limited as long as the normal function of the Psf1 gene is impaired. For example, the sequence to be deleted or replaced may be an intron region or an exon region of the Psf1 gene, or an expression control region of the Psf1 gene. In particular, if the mutation is such that a corresponding portion of the exon region of the Psf1 gene is deleted or replaced, the function of the Psf1 gene can be reliably lost. In addition, other sequences to be inserted are not particularly limited, but the following marker gene sequences are preferably used.
ターゲッティングベクターは、変異導入部位の3’および5’側の相同領域とともに、組み換え体を選択するための適当な選択マーカーを含む。該マーカーとしては、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子（pGKneo、pMC1neo等）、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ遺伝子等のポジティブセレクションマーカー、LacZやβラクタマーゼ遺伝子等の破壊対象遺伝子の発現レポーター、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（HSV-TK）、ジフテリア毒素Ａフラグメント（DT-A）等のネガティブセレクションマーカー等が挙げられるが、これらに限定されない。また、ベクターは相同領域の外側に、ベクターを直鎖化するための適当な制限酵素切断部位を含む。 The targeting vector contains an appropriate selectable marker for selecting a recombinant, together with the 3 'and 5' homologous regions of the mutagenesis site. Examples of the marker include a neomycin resistance gene (pGKneo, pMC1neo, etc.), a positive selection marker such as a hygromycin B phosphotransferase gene, an expression reporter for a gene to be disrupted such as LacZ or β-lactamase gene, a herpes simplex virus thymidine kinase gene ( HSV-TK) and negative selection markers such as diphtheria toxin A fragment (DT-A), but are not limited thereto. The vector also contains an appropriate restriction enzyme cleavage site for linearizing the vector outside the homologous region.
図５にマウスPsf1遺伝子欠損用のターゲッティングベクターの一例を示す。このコンストラクトは、Psf1遺伝子のイントロン4とイントロン5の遺伝子配列には変異を加えずに、Psf1遺伝子のエクソン5（マウスPsf1遺伝子のコーディング領域の約20％に相当する）のほぼ全ての配列がレポーター遺伝子としてのLacZ遺伝子とポジティブセレクションマーカーとしてのネオマイシン耐性遺伝子に置換されるように構築されている。また、ネガティブセレクションマーカーとしてジフテリア毒素Ａフラグメント（DT）が挿入されている。
FIG. 5 shows an example of a targeting vector for mouse Psf1 gene deletion. In this construct, almost all the sequences of
こうしたターゲッティングベクターの構築は、市販のプラスミドベクター（例えば、pBluescriptII (Stratagene製)等）を利用して好適に行うことができる。 Such a targeting vector can be suitably constructed using a commercially available plasmid vector (for example, pBluescriptII (manufactured by Stratagene)).
２）ES細胞へのターゲッティングベクターの導入
次に、構築されたターゲティングベクターを胚性幹細胞（ES細胞）等の全能性を有する細胞に導入する。ES細胞は、マウス、ハムスター、ブタ等では細胞株が樹立されており、特にマウスでは、129系マウス由来のK14株、E14株、D3株、AB-1株、J1株や、R1株、TT2株等、複数の細胞株が入手可能である。また、マウスではES細胞に代えて胚性ガン腫細胞（EC細胞）を利用することもできる。
2) Introduction of targeting vector into ES cells Next, the constructed targeting vector is introduced into cells having totipotency such as embryonic stem cells (ES cells). ES cells have been established in mice, hamsters, pigs, etc., especially in mice, K14 strain, E14 strain, D3 strain, AB-1 strain, J1 strain, R1 strain, TT2 derived from 129 mice Multiple cell lines, such as strains, are available. In mice, embryonic carcinoma cells (EC cells) can be used instead of ES cells.
ES細胞は、ターゲッティングベクターの導入に先立って、適当な培地で培養しておく。例えば、マウスES細胞であれば、マウス繊維芽細胞等をフィーダー細胞として、これにES細胞用の液体培地（例えば、GIBCO製）を加えて共培養する。 Prior to the introduction of the targeting vector, ES cells are cultured in an appropriate medium. For example, in the case of mouse ES cells, mouse fibroblasts and the like are used as feeder cells, and a liquid medium for ES cells (for example, manufactured by GIBCO) is added thereto and co-cultured.
ES細胞へのターゲッティングベクターの導入は、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム法等、公知の遺伝子導入法により実施することができる。ターゲッティングベクターが導入されたES細胞は、ベクター中に挿入されたマーカーにより容易に選択することができる。例えば、ネオマイシン耐性遺伝子をマーカーとして導入した細胞であれば、G418を加えたES細胞用培地で培養することにより、一次セレクションを行うことができる。 Introduction of a targeting vector into ES cells can be carried out by a known gene introduction method such as electroporation, microinjection, calcium phosphate method and the like. ES cells into which a targeting vector has been introduced can be easily selected using a marker inserted in the vector. For example, for cells into which a neomycin resistance gene has been introduced as a marker, primary selection can be performed by culturing in a medium for ES cells supplemented with G418.
ターゲッティングベクターが導入されたES細胞では、相同組換えによって、染色体上のPsf1遺伝子の一部が該ベクターで置換され、内因性のPsf1遺伝子が破壊される。所望の相同組換えがなされたか否かは、サザンブロティングやPCR法等を利用したジェノタイプ解析によって判定できる。サザンブロッティングによるジェノタイプ解析は、変異導入部位の外側に設定したプローブ（external probe）を用いて行うことができる。PCR法によるジェノタイプ解析は、それぞれ野性型と変異型Psf1遺伝子の特異的増幅産物を検出することにより実施できる。こうしてターゲッティングベクターが適切に導入されたES細胞は、さらに次の段階に備えて培養しておく。 In ES cells into which a targeting vector has been introduced, a part of the Psf1 gene on the chromosome is replaced by the vector by homologous recombination, and the endogenous Psf1 gene is destroyed. Whether or not the desired homologous recombination has been achieved can be determined by genotype analysis using Southern blotting, PCR method or the like. Genotype analysis by Southern blotting can be performed using a probe (external probe) set outside the mutation introduction site. Genotype analysis by PCR can be carried out by detecting specific amplification products of wild type and mutant Psf1 genes, respectively. The ES cells into which the targeting vector has been appropriately introduced in this way are further cultured for the next stage.
３）キメラ動物の作製
ターゲッティングベクターが導入されたES細胞（組換えES細胞）は、ES細胞が由来する系統とはコートカラーが明らかな相違を有する別な系統由来の初期胚に導入し、キメラ動物として発生させる。例えば、マウスであれば、アグーチ色の毛色を有する129系由来のES細胞に対しては、黒色の毛色を有し、マーカーとして利用できる各種遺伝子座が129系マウスとは異なっているC57BL/6マウス等の初期胚を用いることが望ましい。これにより、キメラマウスはその毛色によって、キメラ率を判断することができる。
3) Production of chimeric animals ES cells into which a targeting vector has been introduced (recombinant ES cells) are introduced into early embryos derived from another strain that has a distinct coat color from the strain from which the ES cells are derived. Generate as an animal. For example, in the case of mice, C57BL / 6 is different from 129 mice in various loci that have black hair color and can be used as markers for ES cells derived from 129 strains with agouti color. It is desirable to use an early embryo such as a mouse. Thereby, the chimera mouse can judge the chimera rate from the hair color.
ES細胞の初期胚への導入は、マイクロインジェクション法（Hogan, B. et al. ”Manipulating the Mouse Embryo” Cold Spring Habor Laboratory Press, 1988）や、アグリゲーション法（Andra, N. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 8424-8428, 1993, Stephen, A.W. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 4582-4585, 1993）等により行うことができる。 ES cells can be introduced into early embryos by microinjection (Hogan, B. et al. “Manipulating the Mouse Embryo” Cold Spring Habor Laboratory Press, 1988) or aggregation (Andra, N. et al. Proc. Natl). Acad. Sci. USA, 90, 8424-8428, 1993, Stephen, AW et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 4582-4585, 1993).
マイクロインジェクション法は、ES細胞を8細胞期胚〜胚盤胞（ブラストシスト）に直接注入する方法である。すなわち、動物より採取した胚に、マイクロマニピュレーター等を用いて組換えES細胞を顕微鏡下で直接注入してキメラ胚を作製する。このキメラ胚を、仮親（偽妊娠動物）の子宮に移植し、発生させれば、所望のキメラ動物を得ることができる。 The microinjection method is a method in which ES cells are directly injected into an 8-cell embryo to a blastocyst. That is, a recombinant embryonic stem cell is directly injected into an embryo collected from an animal using a micromanipulator or the like under a microscope to produce a chimeric embryo. If this chimeric embryo is transplanted into the uterus of a foster parent (pseudopregnant animal) and generated, a desired chimeric animal can be obtained.
一方、アグリゲーション法では、透明帯を除去した1〜２個の８細胞期胚とES細胞を共培養し、凝集させてキメラ胚を得る。このキメラ胚を、仮親（偽妊娠動物）の子宮に移植し、発生させれば、キメラ動物を得ることができる。 On the other hand, in the aggregation method, one or two 8-cell stage embryos from which the zona pellucida has been removed and ES cells are co-cultured and aggregated to obtain a chimeric embryo. If this chimeric embryo is transplanted into the uterus of a foster parent (pseudopregnant animal) and generated, a chimeric animal can be obtained.
４）Psf1遺伝子欠損動物の作製
仮親から得られたキメラ動物は、さらに同系の野性型動物と交配する。得られる動物の約半分は、Psf1遺伝子欠失染色体をヘテロで有するはずである。各個体のジェノタイプは、毛色等の外見上の特徴で一時判定できるほか、前述したサザンブロッティングやPCR法を利用したジェノタイプ解析によって決定することができる。こうして、ヘテロ型のPsf1遺伝子欠損動物が同定されたら、このヘテロ型のPsf1遺伝子欠損動物同士を交配して、Psf1遺伝子の欠損をホモで有する動物を得ることができる。
4) Production of Psf1 gene-deficient animals Chimera animals obtained from foster parents are further mated with syngeneic wild-type animals. About half of the resulting animals should have heterozygous Psf1 gene deleted chromosomes. The genotype of each individual can be determined temporarily by appearance characteristics such as hair color, and can be determined by genotype analysis using the Southern blotting or PCR method described above. When heterozygous Psf1 gene-deficient animals are identified in this way, the heterozygous Psf1 gene-deficient animals can be crossed to obtain animals having a homozygous Psf1 gene deficiency.
上記のようにして作製されたPsf1遺伝子欠損動物の子孫も、染色体上のPsf1遺伝子の機能が欠損している限り、本発明のPsf1遺伝子欠損動物に含まれる。 Progeny of the Psf1 gene-deficient animal produced as described above are also included in the Psf1 gene-deficient animal of the present invention as long as the function of the Psf1 gene on the chromosome is deficient.
２．２ Cre-loxPシステムの利用
ジーンターゲッティングにバクテリオファージP1由来のCre-loxPシステムを利用して、部位特異的、時期特異的に標的遺伝子を欠損させる方法（Kuhn R. et al., Science, 269, 1427-1429, 1995）もある。loxP（locus of X-ing-over）配列は34塩基対からなるDNA配列でCre（Causes recombination）組換え酵素の認識配列である。遺伝子上の2つのloxP配列はCre蛋白の存在下で特異的組換えを起こす。すなわち、欠損させたい標的遺伝子をloxPで挟んだものに置換し、さらにCre発現ベクターを組み込めば、部位特異的・時期特異的なCre蛋白の産生により、loxPで挟まれた標的遺伝子を欠失させることができる。
2.2 Utilization of Cre-loxP system Site-specific and time-specific deletion of target genes using Cre-loxP system derived from bacteriophage P1 for gene targeting (Kuhn R. et al., Science, 269, 1427-1429, 1995). The loxP (locus of X-ing-over) sequence is a DNA sequence consisting of 34 base pairs and a recognition sequence for Cre (Causes recombination) recombination enzyme. Two loxP sequences on the gene undergo specific recombination in the presence of Cre protein. In other words, if the target gene to be deleted is replaced with the one sandwiched by loxP, and then the Cre expression vector is incorporated, the target gene sandwiched between loxP is deleted by the production of site-specific and time-specific Cre proteins. be able to.
例えば、前項２．１の１）に準じて欠損させるPsf1遺伝子領域の5’側にloxP遺伝子を3’側にloxP遺伝子で挟んだマーカー遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子等）を組み込んだターゲッティングベクターを作製し、ES細胞に導入する。ES細胞はマーカーによる選択の後、サザンブロッティングあるいはPCR法によるジェノタイプ解析を行って相同組換えを確認する。この相同組換えES細胞に、さらにCre蛋白を特異的プロモーターに連結したCre発現ベクターを導入する。得られたES細胞から、loxP組換えによってマーカー遺伝子のみが欠失し、Psf1遺伝子領域は欠失していないES細胞クローンを同定する。このES細胞を前項２．２の３）および４）に準じて動物に導入し、Cre-loxP組換え動物を得る。 For example, a targeting vector in which a marker gene (such as a neomycin resistance gene) in which a loxP gene is sandwiched between the loxP gene on the 5 ′ side and the 3 ′ side of the Psf1 gene region to be deleted according to 1) of the previous section 2.1 is prepared. Introduce into ES cells. ES cells are selected by marker and then subjected to Southern blotting or genotype analysis by PCR to confirm homologous recombination. A Cre expression vector in which Cre protein is linked to a specific promoter is further introduced into this homologous recombinant ES cell. From the obtained ES cells, an ES cell clone in which only the marker gene is deleted by loxP recombination and the Psf1 gene region is not deleted is identified. This ES cell is introduced into an animal according to 3) and 4) in the previous section 2.2 to obtain a Cre-loxP recombinant animal.
あるいは、Psf1遺伝子両端にloxP遺伝子を組み込んだターゲッティングベクターを導入したloxP導入組換え動物と、Cre発現ベクターを導入したCre発現組換え動物を別個に作製し、両者を交配することによって、Cre-loxP組換え動物を作製してもよい。 Alternatively, a loxP-introduced recombinant animal introduced with a targeting vector incorporating the loxP gene at both ends of the Psf1 gene and a Cre-expressed recombinant animal introduced with a Cre expression vector were prepared separately and crossed to create a Cre-loxP Recombinant animals may be produced.
こうして得られたCre-loxP組換え動物は、Cre蛋白の発現に応じて、部位特異的、時期特異的にPsf1遺伝子を欠損しうる。したがって、特定時期、特定部位におけるPsf1遺伝子の機能解析に極めて有用である。 The Cre-loxP recombinant animal thus obtained can be deficient in the Psf1 gene in a site-specific and time-specific manner depending on the expression of Cre protein. Therefore, it is extremely useful for functional analysis of the Psf1 gene at a specific time and at a specific site.
２．３ 体細胞クローン
ES細胞が利用できない動物の場合、体細胞クローン（I. Wilmut et al, Nature, Vol.385, 810-813, 1997、A. E. Schnieke et al, Science, Vol.278, 2130-2133, 1997）を利用してPsf1遺伝子欠損動物を作製することも可能である。体細胞クローンとは、体細胞から取り出した核を、脱核した未受精卵に移植してクローン胚を作製し、このクローン胚を仮親の子宮に移植して発生させたクローンである。この体細胞クローンに遺伝子導入技術を組み合わせれば、所望の組換え動物クローンを得ることができる。すなわち、予めPsf1遺伝子を欠損させる組換え操作を行った体細胞から核を取り出し、これを脱核した未受精卵に移植して、クローン胚を作製する。このクローン胚を仮親（偽妊娠動物）の子宮に移植して、体細胞クローン動物を得れば、この動物はPsf1遺伝子の欠損を有することになる。
2.3 Somatic cell clones
For animals where ES cells are not available, use somatic cell clones (I. Wilmut et al, Nature, Vol. 385, 810-813, 1997, AE Schnieke et al, Science, Vol. 278, 2130-2133, 1997) It is also possible to produce a Psf1 gene-deficient animal. A somatic cell clone is a clone generated by transplanting a nucleus extracted from a somatic cell into an enucleated unfertilized egg to produce a cloned embryo and then transplanting this cloned embryo into a foster mother's uterus. A desired recombinant animal clone can be obtained by combining gene transfer technology with this somatic cell clone. That is, a nucleus is taken out from a somatic cell that has been subjected to a recombination operation for deleting the Psf1 gene in advance, and this is transplanted into an enucleated unfertilized egg to produce a cloned embryo. If this cloned embryo is transplanted into the uterus of a foster parent (pseudopregnant animal) to obtain a somatic cell cloned animal, this animal has a Psf1 gene deficiency.
３．Psf1遺伝子欠損動物の表現型
本発明のPsf1遺伝子欠損動物において、同腹の野生型動物とは異なる表現型が現れた場合、それはPsf1遺伝子の欠損に起因することが予測される。例えば、Psf1遺伝子欠損マウスでは、以下に代表される変化が認められた。
１）ホモ欠損による着床後の早期致死
２）ヘテロ欠損マウスにみられる骨髄抑制（少量の5-FU投与で骨髄機能抑制で致死となる）
3. Psf1 gene-deficient animal phenotype In the Psf1 gene-deficient animal of the present invention, when a phenotype different from that of a wild-type animal of the same litter appears, it is predicted that it is caused by a defect in the Psf1 gene. For example, changes represented by the following were observed in Psf1 gene-deficient mice.
1) Early lethality after implantation due to homo-deficiency 2) Bone marrow suppression seen in hetero-deficient mice (Small 5-FU administration causes death due to suppression of bone marrow function)
４． Psf1遺伝子欠損動物の利用方法
（１）骨髄抑制モデル動物
従来より造血幹細胞移植には致死量放射線照射し骨髄機能を抑制する手段が一般的に使われてきたが、本発明のPsf1遺伝子欠損マウスでは少量の5-FU投与で骨髄機能抑制により致死となるため、放射線照射をしなくても造血機能を観察する実験系に使用することができる。
4). How to use Psf1 gene-deficient animals (1) Myelosuppressive model animals Conventionally, a means of suppressing bone marrow function by irradiation with a lethal dose of radiation has been generally used for hematopoietic stem cell transplantation, but in the Psf1 gene-deficient mice of the present invention, Since a small amount of 5-FU is lethal due to suppression of bone marrow function, it can be used in an experimental system for observing the hematopoietic function without irradiation.
白血病や抗ガン剤投与後、骨髄抑制が回復せず死亡する症例がある。Psf1遺伝子欠損マウスに5-FU投与した後の状況はこうした症例に類似していることから、本発明のPsf1遺伝子欠損動物をこのような重度骨髄抑制モデルとして使用することができる。当該モデル動物は、骨髄抑制を回復させる薬剤（骨髄機能改善剤）の開発やこうした薬剤のスクリーニングに使用できる。 There are cases where bone marrow suppression does not recover after leukemia or anticancer drug administration and die. Since the situation after 5-FU administration to Psf1 gene-deficient mice is similar to these cases, the Psf1 gene-deficient animal of the present invention can be used as such a severe myelosuppression model. The model animal can be used for the development of a drug (bone marrow function improving agent) that restores myelosuppression and the screening of such a drug.
例えば、被験物質の投与条件下と非投与条件下でPsf1遺伝子欠損動物を飼育し、該被験物質の投与条件下と非投与条件下での骨髄機能の変化を骨髄ＭＮＣ(単核球)等を指標として比較評価する。あるいは、被験物質を5-FU等の抗がん剤と同時投与して、動物の生存率や骨髄機能の変化を、同様に被験物質の投与条件下と非投与条件下で比較評価することにより、被験物質の骨髄機能改善剤としての効果を評価することができる。 For example, a Psf1 gene-deficient animal is bred under test substance administration conditions and non-administration conditions, and changes in bone marrow function between the test substance administration conditions and non-administration conditions are determined using bone marrow MNC (mononuclear cells), etc. Compare and evaluate as an index. Alternatively, the test substance can be co-administered with an anticancer agent such as 5-FU, and the change in animal survival rate or bone marrow function can be similarly evaluated under comparative and non-administration conditions of the test substance. The effect of the test substance as a bone marrow function improving agent can be evaluated.
（２） 造血幹細胞の調整
本発明のPsf1欠損マウスに5-FUを投与すると、相対的に造血幹細胞が骨髄中に増加するため、細胞をソートすることなく簡単に造血幹細胞が高頻度に含まれる細胞集団を得ることができる。得られる造血幹細胞は、種々の実験や薬剤スクリーニングに有用である。
(2) Preparation of hematopoietic stem cells When 5-FU is administered to the Psf1-deficient mouse of the present invention, hematopoietic stem cells are relatively increased in the bone marrow, so that hematopoietic stem cells are easily included frequently without sorting the cells. A cell population can be obtained. The resulting hematopoietic stem cells are useful for various experiments and drug screening.
（３） 幹細胞の試験管内増殖
Psf1遺伝子はいわゆる幹細胞レベルの細胞に広く発現しており、様々な幹細胞のDNA複製を制御していると予測される。したがって、Psf1遺伝子の制御（Psf1遺伝子の強制的高発現など）により、幹細胞の自己複製／増殖を誘導できる可能性がある。すなわち、Psf1遺伝子は、造血幹細胞をはじめ種々の幹細胞の試験管内増幅技術にも応用できる。特に、近年、がんはがん幹細胞による幹細胞システムの異常によると考えられているが、Psf1遺伝子の機能抑制によって、がん幹細胞の細胞死誘導法も開発することができる。
(3) Stem cell proliferation in vitro
The Psf1 gene is widely expressed in cells at the so-called stem cell level, and is predicted to control DNA replication of various stem cells. Therefore, there is a possibility that self-replication / proliferation of stem cells can be induced by controlling the Psf1 gene (for example, forced high expression of the Psf1 gene). That is, the Psf1 gene can be applied to in vitro amplification techniques for various stem cells including hematopoietic stem cells. In particular, in recent years, cancer is thought to be due to abnormalities in the stem cell system caused by cancer stem cells, but a method of inducing cancer stem cell death can also be developed by suppressing the function of the Psf1 gene.
（４） その他
本発明のPsf1遺伝子欠損動物は、個体レベルでのPsf1の機能や作用メカニズムの解明に有用である。こうした個体レベルでの機能解明には、恒常的なPsf1の発現抑制に加えて、前述したCre-loxPシステム等を利用した、部位特異的、時期特異的Psf1の発現抑制が有用である。
(4) Others The Psf1 gene-deficient animal of the present invention is useful for elucidating the function and action mechanism of Psf1 at the individual level. In order to elucidate the function at the individual level, in addition to constant Psf1 expression suppression, site-specific and time-specific Psf1 expression suppression using the Cre-loxP system described above is useful.
Psf1遺伝子欠損胚はCdc45欠損胚と良く似た表現上の変化を示した。Cdc45はDNA複製の開始に不可欠なタンパクであり、Psf1も同様の機能を有することが示唆される。したがって、Psf1タンパクやPsf1遺伝子は、骨髄機能抑制やそれに伴う疾患の治療はもちろん、DNA複製の異常やそれに伴う疾患の病態解明や治療にも利用可能と考えられる。 Psf1 gene-deficient embryos showed similar phenotypic changes to Cdc45-deficient embryos. Cdc45 is an essential protein for the initiation of DNA replication, suggesting that Psf1 has a similar function. Therefore, Psf1 protein and Psf1 gene can be used not only for suppression of bone marrow function and treatment of diseases associated therewith, but also for elucidation and treatment of DNA replication abnormalities and associated diseases.
以下、実施例により本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に制限されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further in detail, this invention is not restrict | limited to these Examples.
〔実施例１〕 Psf1の発現解析
１．試験方法
（１）RT-PCR法によるマウスPsf1の発現解析
マウスの種々の組織（脳、心臓、肺、胸腺、肝臓、脾臓、骨髄、精巣、卵巣）から全RNAを抽出し、SuperscriptII逆転写酵素とoligo d(T) （共にInvitrogen製）を用いてcDNAを合成した。このcDNAを鋳型にしてExTaq DNAポリメラーゼ（TaKaRa製）を用いてPCRを行った。GAPDHの増幅には5’-acc aca gtc cat gcc atc ac-3’（配列番号３）と5’-tcc acc acc ctg ttg ctg ta-3’（配列番号４）を、Psf1の増幅には5’-tta aga aat aga cgc tgc acg a-3’ （配列番号５）と5’-tgc cat cat caa ctt caa att c-3’ （配列番号６）をプライマーに用いた。
[Example 1] Expression analysis of Psf1 Test method (1) Expression analysis of mouse Psf1 by RT-PCR method Extracting total RNA from various mouse tissues (brain, heart, lung, thymus, liver, spleen, bone marrow, testis, ovary), SuperscriptII reverse transcriptase And oligo d (T) (both manufactured by Invitrogen) were used to synthesize cDNA. Using this cDNA as a template, PCR was performed using ExTaq DNA polymerase (TaKaRa). 5'-acc aca gtc cat gcc atc ac-3 '(SEQ ID NO: 3) and 5'-tcc acc acc ctg ttg ctg ta-3' (SEQ ID NO: 4) are used for amplification of GAPDH, and 5'-acc aca gtc cat gcc atc ac-3 '(SEQ ID NO: 4). '-tta aga aat aga cgc tgc acg a-3' (SEQ ID NO. 5) and 5'-tgc cat cat caa ctt caa att c-3 '(SEQ ID NO. 6) were used as primers.
同様に、骨髄細胞を表面マーカによりFACS（ベクトン製）を用いて純化し同様にRT-PCRを行った。分化抗原（Lin）にはMac-1、Gr-1、Ter119、B220、CD4、CD8を選んだ。分化抗原およびSca-1とc-kitに対する特異抗体はすべてPharmingen製のものを用いた。また、白血病細胞株（BaF3）およびメラノーマ細胞株（B16）についても同様にRT-PCR法でPsf１の発現を解析した。。 Similarly, bone marrow cells were purified with a surface marker using FACS (Becton) and RT-PCR was performed in the same manner. Mac-1, Gr-1, Ter119, B220, CD4, and CD8 were selected as differentiation antigens (Lin). The differentiation antigens and specific antibodies against Sca-1 and c-kit were all from Pharmingen. Moreover, the expression of Psf1 was similarly analyzed by RT-PCR for leukemia cell line (BaF3) and melanoma cell line (B16). .
（２）免疫染色法によるPsf1の胎児組織内局在の解析
胎生11日のマウスのパラフィン包埋切片を作成し、抗Psf1抗体を用いて免疫染色法を行った。図3（A）の実験には2次抗体にビオチンで標識された抗ウサギIgG抗体を、3次試薬にABC-HRP複合体(Dako製)を用いた。発色にはDAB (Sigma製)を用いた。図3（B）ではCy3で標識された抗ウサギIgG抗体を2次抗体に用いた。
(2) Analysis of Psf1 localization in fetal tissues by immunostaining method Paraffin-embedded sections of embryonic day 11 mice were prepared, and immunostaining was performed using anti-Psf1 antibody. In the experiment of FIG. 3 (A), an anti-rabbit IgG antibody labeled with biotin was used as the secondary antibody, and an ABC-HRP complex (manufactured by Dako) was used as the tertiary reagent. DAB (manufactured by Sigma) was used for color development. In FIG. 3 (B), an anti-rabbit IgG antibody labeled with Cy3 was used as the secondary antibody.
（３）Psf1の細胞内局在（細胞周期との関係）
NIH3T3細胞について図3（B）と同様に蛍光免疫染色を行った。染色体DNAはDAPI（ナカライ製）を用いて染色した。
(3) Intracellular localization of Psf1 (relationship with cell cycle)
NIH3T3 cells were subjected to fluorescent immunostaining in the same manner as in FIG. 3 (B). Chromosomal DNA was stained using DAPI (Nacalai).
２．試験結果
（１）マウスPsf1の発現解析結果
図２にマウスPsf1の発現解析結果を示す。マウスの成体組織ではPsf1転写産物は骨髄、胸腺、精巣、卵巣で確認された。骨髄細胞では分化・成熟した細胞群（Lin+）ではPsf1の発現は検出されなかったが、未分化な細胞群（Lin+KIT+、Lin-KIT+Sca-1-、Lin-KIT+SCA-1+）のうち特にLin+KIT+おおびLin-KIT+Sca-1-の細胞群でPsf1の高い発現を検出した。一方、腫瘍細胞株では恒常的にPsf1の発現が検出された。
2. Test result (1) Expression analysis result of mouse Psf1 FIG. 2 shows the expression analysis result of mouse Psf1. In adult mouse tissues, Psf1 transcripts were found in bone marrow, thymus, testis, and ovary. The expression of differentiation and mature cell populations (Lin +) In Psf1 in bone marrow cells were detected, undifferentiated cell populations (Lin + KIT +, Lin - KIT + Sca-1 -, Lin - KIT + SCA- In 1 + ), high expression of Psf1 was detected especially in the cell group of Lin + KIT + and Lin − KIT + Sca-1 − . On the other hand, expression of Psf1 was constantly detected in tumor cell lines.
（２）マウスPsf1の組織内局在
図３にPsf1の胎児組織内局在を示す。胎児組織では間葉系細胞、AER領域、心臓、背側大動脈に特異的にPsf1が発現していた。
(2) Localization of mouse Psf1 in tissue FIG. 3 shows the localization of Psf1 in fetal tissue. In fetal tissue, Psf1 was expressed specifically in mesenchymal cells, AER region, heart, and dorsal aorta.
（３）マウスPsf1の細胞内局在（細胞周期との関係）
図４にNIH3T3細胞におけるPsf1の細胞内局在を示す。Psf1の細胞内局在は細胞周期に依存して変化していた。すなわちPsf1は、間期では細胞核に局在し、M期では細胞質に局在していた。
(3) Intracellular localization of mouse Psf1 (relationship with cell cycle)
FIG. 4 shows the intracellular localization of Psf1 in NIH3T3 cells. The subcellular localization of Psf1 varied depending on the cell cycle. That is, Psf1 was localized in the cell nucleus in the interphase and in the cytoplasm in the M phase.
〔実施例２〕Psf1遺伝子欠損マウスの作製
１．試験方法
（1）Psf1遺伝子欠損マウスの作製
ジーンターゲッティングにより、以下のようにしてPsf1遺伝子欠損マウスを作製した。まず、129SV/Jマウスのゲノムライブラリー（Stratagene製）を、前述のmouse Psf1 cDNA配列（配列番号１）をプローブとしてスクリーニングを行い、マウスPsf1ゲノムクローンを複数個同定した。得られたクローンよりDNAを抽出し、pBluescriptII（Stratagene製）にサブクローニングした。配列決定、制限酵素消化、サザンブロット法等を行いPsf1遺伝子の制限酵素マップを作製した。得られたPsf1のゲノム断片を用いて以下のようにターゲッティングベクターを作製した。LacZ遺伝子（レポーター；pCMVb（Stratagene製）に由来）とpGKneo（ポジティブセレクションマーカー；金沢大、浅野雅秀より分与）をつないだLacZ-Neoカセットに、得られたゲノム断片を鋳型にてPCR法で増幅したShort Arm（イントロン5の5’末端領域）およびLA2(イントロン4の3’末端領域)をそれぞれ3’、5’側つないだ。さらにLA2の5’側にイントロン4の一部配列とネガティブセレクションマーカーとしてジフテリア毒素フラグメントA遺伝子（DT）を組換えた。このターゲティングベクターによりエクソン5のほぼ全てがLacZ-Neoカセットに置き換わり全長の約20％のアミノ酸が欠失することになる（図５）。
[Example 2] Production of Psf1 gene-deficient mice Test method (1) Production of Psf1 gene-deficient mice Psf1 gene-deficient mice were produced by gene targeting as follows. First, a 129SV / J mouse genomic library (Stratagene) was screened using the aforementioned mouse Psf1 cDNA sequence (SEQ ID NO: 1) as a probe to identify a plurality of mouse Psf1 genomic clones. DNA was extracted from the resulting clone and subcloned into pBluescriptII (Stratagene). Sequencing, restriction enzyme digestion, Southern blotting, etc. were performed to prepare a restriction enzyme map of the Psf1 gene. Using the obtained genomic fragment of Psf1, a targeting vector was prepared as follows. The LacZ gene (reporter; derived from pCMVb (Stratagene)) and pGKneo (positive selection marker; distributed by Kanazawa Univ., Masahide Asano) were linked to the LacZ-Neo cassette using the resulting genomic fragment as a template by PCR. Amplified Short Arm (5 ′ end region of intron 5) and LA2 (3 ′ end region of intron 4) were connected 3 ′ and 5 ′, respectively. Furthermore, a partial sequence of
このターゲティングベクターにより、GenBank Accession No. AL808125に示されるマウスPsf1ゲノムDNAの塩基配列中、92781-92897番目の塩基配列（エキソン5）が欠失し、該遺伝子がコードする全長196 アミノ酸のうち、39個のアミノ酸が欠失することになる。 By this targeting vector, the base sequence of the 92781-92897 positions (exon 5) was deleted from the base sequence of mouse Psf1 genomic DNA shown in GenBank Accession No. AL808125. Of the total length of 196 amino acids encoded by the gene, 39 One amino acid will be deleted.
調製したターゲッティングコンストラクトはエレクトロポレーションにより129系マウス由来のES細胞（E14.1;金沢大、浅野より分与）に導入し、マウス繊維芽細胞をフィーダー細胞とするG418を含むES細胞用培地（GIBCO製）で選抜した。選抜されたES細胞は、さらに培養した後、相同組換え体を同定するために、常法に従ってDNA抽出を行った。抽出されたDNAは、前述のサザンブロット解析によりGenotypeスクリーニングを行った。サザンブロット解析は、DNAをEcoRIで消化後、標識したexternal probe(3’ probe)を用いて行った。このexternal probeには、ターゲッティングベクターに用いる相同領域の外側に位置するエキソン7を用いた。サザン解析により、野性型アレルからは約7.5kb、変異アレルからは約12.3kbのバンドが検出された（図６Ａ）。 The prepared targeting construct was introduced into ES cells derived from 129 mice by electroporation (E14.1; distributed by Kanazawa Univ., Asano), and medium for ES cells containing G418 using mouse fibroblasts as feeder cells ( Selected by GIBCO. The selected ES cells were further cultured, and then DNA extraction was performed according to a conventional method in order to identify homologous recombinants. The extracted DNA was subjected to Genotype screening by the Southern blot analysis described above. Southern blot analysis was performed using a labeled external probe (3 'probe) after digesting the DNA with EcoRI. For this external probe, exon 7 located outside the homologous region used for the targeting vector was used. Southern analysis revealed a band of about 7.5 kb from the wild type allele and about 12.3 kb from the mutant allele (FIG. 6A).
相同組換えが確認されたES細胞は、常法に従いC57B6/Jマウスから摘出した8細胞期胚と凝集させてキメラ胚を作製した。キメラ胚は、仮親である偽妊娠ICRマウスの子宮角に移植してキメラマウスを樹立した。次いで、得られたキメラマウスの雄をさらに別の野性型C57B6/Jマウスの雌と交配してF1マウスを得た。 ES cells in which homologous recombination was confirmed were aggregated with 8-cell stage embryos extracted from C57B6 / J mice according to a conventional method to prepare chimeric embryos. The chimeric embryo was established by transplanting the chimeric embryo into the uterine horn of a pseudopregnant ICR mouse, which was a foster parent. Subsequently, the obtained chimeric mouse male was further mated with another wild type C57B6 / J female to obtain an F1 mouse.
さらに、F1マウスからPsf1遺伝子欠損を有するマウス（Psf1遺伝子欠損をヘテロで有する：ヘテロマウス）を選別し、このヘテロマウス同士をさらに交配した。 Furthermore, a mouse having a Psf1 gene deficiency (having a Psf1 gene deficiency in heterogeneous: heterozygous mouse) was selected from F1 mice, and the heterozygous mice were further mated.
マウスのGenotypingは、マウス尾部より常法に従って抽出したDNAを用いて、PCR法により行った。PCR条件、および用いたプライマーは以下のとおりである。
野生型アリル：
Forward primer: 5’-ggaattcggccccccaaaagcctatatat-3’ （配列番号７）
ReversPsf1imer: 5’-catcccagatcgttcttgttaacc-3’ （配列番号８）
変異アリル：
Forward primer: 5’-ccgaacgcgtataacttcgtatagc-3’ （配列番号９）
ReversPsf1imer: 5’-catcccagatcgttcttgttaacc-3’ （配列番号１０）
表１にジェノタイピングの結果を示す。
Genotyping of mice was performed by PCR using DNA extracted from mouse tails according to conventional methods. PCR conditions and primers used are as follows.
Wild type allele:
Forward primer: 5'-ggaattcggccccccccaaaagcctatatat-3 '(SEQ ID NO: 7)
ReversPsf1imer: 5'-catcccagatcgttcttgttaacc-3 '(SEQ ID NO: 8)
Mutant allele:
Forward primer: 5'-ccgaacgcgtataacttcgtatagc-3 '(SEQ ID NO: 9)
ReversPsf1imer: 5'-catcccagatcgttcttgttaacc-3 '(SEQ ID NO: 10)
Table 1 shows the results of genotyping.
表1より明らかなように、Psf1遺伝子をホモで欠損した胚は着床後の早期致死である（ND; not determine(形態学的所見により判定)、NA; not available）。 As is clear from Table 1, embryos that are homozygous for the Psf1 gene are prematurely lethal after implantation (ND; not determine (determined by morphological findings), NA; not available).
図６Ｂ（表中Ｅ6.5）にPsf1遺伝子ホモ欠損（-/-）胚と野生型の胚の組織切片を示す。ホモ欠損（-/-）胚は明らかに異常な形態を示した。 FIG. 6B (E6.5 in the table) shows tissue sections of Psf1 gene homo-deficient (− / −) embryos and wild-type embryos. Homo-deficient (-/-) embryos clearly showed abnormal morphology.
〔実施例３〕 Psf1遺伝子ホモ欠損（-/-）胚とヘテロ欠損（+/-）胚の比較
・ 試験方法
（１）ブラストシストの試験管内培養（図７）
妊娠3.5日目に子宮を還流しブラストシストを採取する。これを0.1％ゼラチンでコートしたプラスチック皿上にES培地中で6日間培養した。BrdU（5-bromo-2'deoxy-Uridine）(Sigma製)の取込み実験では培地中に最終濃度が10mMになるようにBrdUを添加し12時間培養した。取り込まれたBrdUの検出は抗BrdU抗体(Zymed製)を用いた。
[Example 3] Comparison and testing method of Psf1 gene homo-deficient (-/-) embryo and hetero-deficient (+/-) embryo (1) In vitro culture of blast cyst (Fig. 7)
On the 3.5th day of pregnancy, return the uterus and collect blast cysts. This was cultured in ES medium for 6 days on a plastic dish coated with 0.1% gelatin. In the uptake experiment of BrdU (5-bromo-2'deoxy-Uridine) (manufactured by Sigma), BrdU was added to the medium so that the final concentration was 10 mM, and cultured for 12 hours. For detection of incorporated BrdU, an anti-BrdU antibody (manufactured by Zymed) was used.
2. 試験結果
野生型のあるいはPsf1遺伝子のヘテロ欠損体のブラストシストを培養するとICM (inner cell mass)が盛んに分裂し、トロフォブラスが培養皿の表面に接着して増殖するが、Psf1遺伝子のホモ欠損体のブラストシストではICMの盛んな細胞分裂が見られなかった（図7）。さらにICMのBrdUの取込みもほとんど検出されなかった（図８）。このことからPsf1は初期胚の細胞分裂に必須である事が解った。
2. Test results When blast cysts of wild-type or heterozygous mutants of Psf1 gene are cultured, ICM (inner cell mass) actively divides and trophoblast adheres to the surface of the culture dish and proliferates. In the blast cysts of the defect, active cell division of ICM was not observed (Fig. 7). Furthermore, the incorporation of ICM BrdU was hardly detected (FIG. 8). This indicates that Psf1 is essential for early embryonic cell division.
〔実施例４〕 Psf1遺伝子欠損（+/-）マウスと野生型マウスの比較
1. 試験方法
実施例２で作製したPsf1遺伝子欠損（+/-）マウスと野性型マウス（6週齢、各Ｎ＝5）に、150mg/kgの5-FU（Sigma製）を静脈投与し、その影響を比較した。結果を図９（Ａ：生存、Ｂ：血中ＭＮＣ、Ｃ：骨髄ＭＮＣ）および図10に示す。
[Example 4] Comparison of Psf1 gene-deficient (+/-) mice and wild-type mice
1. Test method
150 mg / kg of 5-FU (manufactured by Sigma) was intravenously administered to Psf1 gene-deficient (+/-) mice and wild-type mice (6 weeks old, each N = 5) prepared in Example 2, Compared. The results are shown in FIG. 9 (A: survival, B: blood MNC, C: bone marrow MNC) and FIG.
2. 試験結果
（１）生存率
野生型マウスはすべて生存していたが、Psf1遺伝子欠損マウスは1週間以内に全て死んだ。野生型マウスは、350mg/kg（LD50に対応する）の5-FUを投与した場合でも、半数が生存していた。
2. Test results (1) Survival rate All wild-type mice were alive, but all Psf1-deficient mice died within one week. Half of the wild-type mice survived even when 350 mg / kg (corresponding to LD50) of 5-FU was administered.
（２）血中ＭＮＣおよび骨髄ＭＮＣ
両マウスで血中ＭＮＣ変化に大きな違いは認められなかったが、骨髄ＭＮＣについては、野生型マウスでは回復がみられたのに対し、Psf1遺伝子欠損マウスでは全く回復がみられなかった。
(2) Blood MNC and bone marrow MNC
Although there was no significant difference in blood MNC changes between the two mice, bone marrow MNC recovered in wild-type mice, whereas Psf1 gene-deficient mice did not recover at all.
（３）骨髄細胞の解析
Psf1遺伝子欠損（+/-）マウスと野性型マウスの全骨髄細胞の形態をFACSで解析した。Psf1遺伝子へテロ欠損マウスでは5-FU投与後にFSCが高い細胞集団（リンパ球、単球、顆粒球などの白血球）の増加が殆ど見られなかった。野生型の場合はLin(Mac-1を除く)-Sca-1+KIT+の造血幹細胞は5-FU処理後はMac-1を中程度発現するようになるが、Psf1遺伝子へテロ欠損マウスではMac-1を発現する分裂中の幹細胞の出現がほとんど見られなかった。5-FU投与後5日に幹細胞集団（Lin(Mac-1を除く)-Sca-1+KIT+）のDNA含有率を解析するとPsf1遺伝子へテロ欠損マウスでは大部分の細胞でDNA合成が行われておらずG1期に留まっていることが解った。
(3) Analysis of bone marrow cells
The morphology of whole bone marrow cells of Psf1 gene-deficient (+/-) mice and wild type mice was analyzed by FACS. In Psf1 heterozygous mice, there was almost no increase in cell populations with high FSC (white blood cells such as lymphocytes, monocytes, granulocytes) after 5-FU administration. Lin In the case of wild-type (except for the Mac-1) - Sca-1 + KIT + after hematopoietic stem cell 5-FU treatment becomes to express moderate to Mac-1, the hetero-deficient mice to Psf1 gene There was little appearance of dividing stem cells expressing Mac-1. 5-FU to 5 days after the administration (excluding Lin (Mac-1) - Sca -1 + KIT +) stem cell population DNA synthesis lines in most cells the DNA content in hetero-deficient mice to which the Psf1 genetic analysis of I understand that I was not in the G1 period.
以上のとおり、Psf1遺伝子へテロ欠損マウスでは、骨髄機能不全に起因すると思われる種々の表現型の変化が認められた。 As described above, various phenotypic changes considered to be caused by bone marrow dysfunction were observed in Psf1 gene hetero-deficient mice.
本発明のPsf1遺伝子欠損動物は、骨髄機能抑制に起因する種々の症状を呈し、特に5-FU等の投与によって白血病や抗ガン剤投与後の重篤な骨髄抑制症状に良く似た症状を呈する。したがってかかる疾患の病態解明や薬剤開発、薬剤スクリーニングに有用である。また、本発明のPsf1遺伝子欠損動物は造血幹細胞のソースとして有用である。 The Psf1 gene-deficient animal of the present invention exhibits various symptoms due to suppression of bone marrow function, and particularly exhibits symptoms similar to severe myelosuppression after administration of leukemia or anticancer agents by administration of 5-FU or the like. . Therefore, it is useful for elucidating the pathology of such diseases, drug development, and drug screening. The Psf1 gene-deficient animal of the present invention is useful as a source of hematopoietic stem cells.
配列番号３−プライマー
配列番号４−プライマー
配列番号５−プライマー
配列番号６−プライマー
配列番号７−プライマー
配列番号８−プライマー
配列番号９−プライマー
配列番号１０−プライマー
SEQ ID NO: 3-Primer SEQ ID NO: 4-Primer SEQ ID NO: 5-Primer SEQ ID NO: 6-Primer SEQ ID NO: 7-Primer SEQ ID NO: 8-Primer SEQ ID NO: 9-Primer SEQ ID NO: 10-Primer
Claims (6)
１）Psf1遺伝子またはその発現制御領域上における少なくとも一部の配列の欠失、置換、および／または他の配列の挿入を目的としたターゲッティングベクターを作製する；
２）上記ベクターをES細胞に導入し、該ベクターで相同組換えされたES細胞を得る；
３）上記組換えES細胞を初期胚に導入し、発生させてキメラ動物を得る；
４）上記キメラ動物を野生型動物と交配して得られるF1ヘテロ接合体動物同士を交配し、得られるF2動物またはその子孫から染色体上の一方のアレルにおけるPsf1遺伝子の機能が欠損している動物を得る。 The myelosuppressive model non-human mammal according to claim 1 or 2, produced by the following steps:
1) creating a targeting vector for the purpose of deletion, substitution and / or insertion of other sequences of at least a part of the sequence on the Psf1 gene or its expression control region;
2) Introducing the vector into ES cells to obtain ES cells homologously recombined with the vector;
3) The recombinant ES cell is introduced into an early embryo and developed to obtain a chimeric animal;
4) An F1 heterozygous animal obtained by mating the above chimeric animal with a wild-type animal, and an animal that lacks the function of the Psf1 gene in one allele on the chromosome from the F2 animal or its offspring obtained Get.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2004242022A JP4590629B2 (en) | 2004-08-23 | 2004-08-23 | Psf1 gene-deficient animal and method of using the same |
| PCT/JP2005/015496 WO2006022361A1 (en) | 2004-08-23 | 2005-08-19 | Psf1 GENE-DEFICIENT ANIMAL AND METHOD OF USING THE SAME |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2004242022A JP4590629B2 (en) | 2004-08-23 | 2004-08-23 | Psf1 gene-deficient animal and method of using the same |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2006055110A JP2006055110A (en) | 2006-03-02 |
| JP4590629B2 true JP4590629B2 (en) | 2010-12-01 |
Family
ID=35967566
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2004242022A Active JP4590629B2 (en) | 2004-08-23 | 2004-08-23 | Psf1 gene-deficient animal and method of using the same |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4590629B2 (en) |
| WO (1) | WO2006022361A1 (en) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8501431B2 (en) * | 2008-10-24 | 2013-08-06 | Magnachem International Laboratories, Inc. | Method for screening for compounds selectively interacting with RAD9 |
-
2004
- 2004-08-23 JP JP2004242022A patent/JP4590629B2/en active Active
-
2005
- 2005-08-19 WO PCT/JP2005/015496 patent/WO2006022361A1/en active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2006055110A (en) | 2006-03-02 |
| WO2006022361A1 (en) | 2006-03-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11317611B2 (en) | Genetically modified non-human animal with human or chimeric PD-L1 | |
| US11279948B2 (en) | Genetically modified non-human animal with human or chimeric OX40 | |
| US10945418B2 (en) | Genetically modified non-human animal with human or chimeric PD-L1 | |
| US11505806B2 (en) | Genetically modified non-human animal with human or chimeric OX40 | |
| US10820580B2 (en) | Immunodeficient non-human animal | |
| Sakurai et al. | A non-inheritable maternal Cas9-based multiple-gene editing system in mice | |
| JP6282591B2 (en) | Gene knock-in non-human animal | |
| WO2021083366A1 (en) | Genetically modified non-human animals with human or chimeric thpo | |
| WO2017175745A1 (en) | Method for producing genetically modified animal employing reproductive cell-deficient animal | |
| JP4590629B2 (en) | Psf1 gene-deficient animal and method of using the same | |
| US6172278B1 (en) | Ikaros transgenic cells and mice | |
| JP4470077B2 (en) | Mice deficient in the function of the neutrophil chemotactic factor LECT2 gene | |
| WO2021043289A1 (en) | Genetically modified non-human animals with kit mutations | |
| US20220217956A1 (en) | Rodent Model Of Increased Bone Mineral Density | |
| JP5308651B2 (en) | Drp1-deficient non-human mammal | |
| JP2004073198A (en) | Embryonic stem cell strain defective in poly(adp-ribose)glycohydrolase activity | |
| CN116063450A (en) | IL12 gene humanized non-human animal and construction method and application thereof | |
| WO2001043539A1 (en) | Animals with insufficient expression of uridine phosphorylase | |
| JP5403536B2 (en) | Transgenic non-human animal introduced with human MLL / AF4 fusion gene | |
| JP4940477B2 (en) | OASIS gene-deficient mouse | |
| JP2003092956A (en) | Animal with insufficient expression of thymidine phosphorylase | |
| JPWO2004032615A1 (en) | Bradion gene expression-suppressed chimeric mice | |
| JPH08140527A (en) | Animal deficient in treb5 gene and creation of the same | |
| JPH10295216A (en) | Bombesin-like peptide receptor gene function lacking non-homo sapiens animal | |
| JPH1132627A (en) | Mammalian animal of which sez-6 gene expression is suppressed |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070713 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100608 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100806 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20100824 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |