JP2003092956A - Animal with insufficient expression of thymidine phosphorylase - Google Patents
Animal with insufficient expression of thymidine phosphorylaseInfo
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Abstract
Description
【0001】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、ヌクレオシドホス
ホリラーゼ発現不全の非ヒト動物及びその子孫に関す
る。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a non-human animal deficient in nucleoside phosphorylase expression and its progeny.
【0002】[0002]
【従来の技術】ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ
は、ピリミジン代謝の生合成と分解に関与している酵素
であり、サルベージ経路におけるピリミジン塩基の分
解、合成を通じて生体内ヌクレオシドプールの調節とい
う重要な働きを担っている。哺乳類におけるピリミジン
ヌクレオシドホスホリラーゼには、ウリジンホスホリラ
ーゼとチミジンホスホリラーゼが知られており、いずれ
もピリミジン代謝の生合成と分解に関与している。BACKGROUND OF THE INVENTION Pyrimidine nucleoside phosphorylase is an enzyme involved in the biosynthesis and degradation of pyrimidine metabolism, and plays an important role in regulating the in vivo nucleoside pool through the degradation and synthesis of pyrimidine bases in the salvage pathway. . Uridine phosphorylase and thymidine phosphorylase are known as pyrimidine nucleoside phosphorylases in mammals, and both are involved in biosynthesis and degradation of pyrimidine metabolism.
【0003】チミジンホスホリラーゼは、多くの癌でそ
の発現が上昇することが報告されており、近年、本発明
者らはチミジンホスホリラーゼ遺伝子をクローニング
し、これが従来から血管新生因子として報告されてきた
PD−ECGFと同一の蛋白質であることを見出すと共
に、チミジンホスホリラーゼ及び2−デオキシリボース
が血管新生活性をもつことを明らかにした。そして、実
際に臨床の腫瘍でチミジンホスホリラーゼの発現と腫瘍
血管量に相関があることが多数のグループから報告され
ている。It has been reported that the expression of thymidine phosphorylase is increased in many cancers. In recent years, the present inventors have cloned the thymidine phosphorylase gene, which has been reported as an angiogenic factor PD-. It was found to be the same protein as ECGF, and it was revealed that thymidine phosphorylase and 2-deoxyribose have angiogenic activity. And, it has been reported from many groups that the expression of thymidine phosphorylase and the tumor vascular volume are actually correlated in clinical tumors.
【0004】また、胃癌に浸潤するマクロファージでチ
ミジンホスホリラーゼが高く発現していること、浸潤性
の膀胱癌では表在性のものよりチミジンホスホリラーゼ
の発現が高いことも報告されている。更に、1999年
にはNishinoにより、チミジンホスホリラーゼの活性の
欠損がミトコンドリア脳筋症(MNGIE)の病因とな
っている可能性があることが報告されている。It has also been reported that thymidine phosphorylase is highly expressed in macrophages infiltrating gastric cancer, and that thymidine phosphorylase is more highly expressed in invasive bladder cancer than in superficial ones. Furthermore, in 1999, Nishino reported that deficiency in the activity of thymidine phosphorylase may be a causative factor of mitochondrial encephalomyopathy (MNGIE).
【0005】一方、癌化学療法の分野で重要な役割を果
たしているヌクレオシド系代謝拮抗剤は、その化学構造
からチミジン又はウリジンホスホリラーゼによって不活
性化されることが知られ、当該物質の斯かる酵素による
代謝様式を正確に把握することが、優れた薬理効果を有
し、且つ副作用の少ない薬剤を開発するために必要とさ
れている。On the other hand, nucleoside antimetabolites, which play an important role in the field of cancer chemotherapy, are known to be inactivated by thymidine or uridine phosphorylase due to their chemical structure, Accurate understanding of the metabolic pattern is required to develop a drug having excellent pharmacological effects and few side effects.
【0006】このように、チミジンホスホリラーゼは多
彩な機能をもつと考えられていることから、チミジンホ
スホリラーゼ発現不全動物が系統的に得られれば、チミ
ジンホスホリラーゼの各疾患への関与を直接的に確認す
ることができ、関連疾患の解明に役立つと共にチミジン
ホスホリラーゼの生理機能の研究にも有用である。[0006] As described above, since thymidine phosphorylase is considered to have various functions, if thymidine phosphorylase expression-deficient animals are systematically obtained, the involvement of thymidine phosphorylase in each disease is directly confirmed. Therefore, it is useful for elucidating related diseases and also useful for studying physiological functions of thymidine phosphorylase.
【0007】[0007]
【発明が解決しようとする課題】本発明は、実験動物と
して利用可能なチミジンホスホリラーゼ発現不全非ヒト
動物及びその子孫を提供することを目的とする。DISCLOSURE OF THE INVENTION An object of the present invention is to provide a non-human animal deficient in thymidine phosphorylase expression and its progeny that can be used as an experimental animal.
【0008】[0008]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、斯かる実
状に鑑み、チミジンホスホリラーゼ遺伝子の変異及びタ
ーゲティングベクターの設計等について種々研究した結
果、実質的に機能しないチミジンホスホリラーゼ遺伝子
を有する形質転換動物及びその子孫を作製することに成
功した。そして、更にチミジンホスホリラーゼ発現不全
非ヒト動物とウリジンホスホリラーゼ発現不全非ヒト動
物を交配することにより、チミジンホスホリラーゼ遺伝
子及びウリジンホスホリラーゼ遺伝子の機能が共に欠損
した非ヒト動物が系統的に得られることを見出し、本発
明を完成した。In view of such circumstances, the present inventors have conducted various studies on mutations of the thymidine phosphorylase gene, designing of targeting vectors, etc., and as a result, transformants having a substantially non-functional thymidine phosphorylase gene. Successfully produced animals and their offspring. And by further mating thymidine phosphorylase expression deficient non-human animals and uridine phosphorylase expression deficient non-human animals, it was found that non-human animals thymidine phosphorylase gene and uridine phosphorylase gene functions are both deficiently obtained, The present invention has been completed.
【0009】すなわち本発明は、染色体上のチミジンホ
スホリラーゼ遺伝子の機能が欠損した非ヒト動物及びそ
の子孫、更には染色体上のチミジンホスホリラーゼ遺伝
子及びウリジンホスホリラーゼ遺伝子の機能が欠損した
非ヒト動物及びその子孫を提供するものである。That is, the present invention provides a non-human animal deficient in the function of the thymidine phosphorylase gene on the chromosome and its progeny, and a non-human animal deficient in the function of the thymidine phosphorylase gene and uridine phosphorylase gene on the chromosome and its progeny. It is provided.
【0010】近年、遺伝子工学の発展に伴い、種々の遺
伝子を人為的に操作することが可能となり、外来性の遺
伝形質を人為的に付加したり、生物が持っている遺伝形
質の発現を抑制した様々な形質転換動物が作り出されて
いる(Nature,Vol.300,pp.611-615, 16 December 1982
、Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.87,pp.7688-7692,Octo
ber 1990等)。これまでにウリジンホスホリラーゼ遺伝
子の機能が欠損した動物が作出されているが(特開20
01−169684号公報)、染色体上のチミジンホス
ホリラーゼ遺伝子の機能が欠損した動物、更にはチミジ
ンホスホリラーゼ遺伝子とウリジンホスホリラーゼ遺伝
子が共に欠損し、且つ遺伝的に安定な動物はこれまでに
知られていない。In recent years, with the development of genetic engineering, it has become possible to artificially manipulate various genes, artificially add exogenous genetic traits, and suppress the expression of genetic traits possessed by organisms. Various transformed animals have been created (Nature, Vol.300, pp.611-615, 16 December 1982).
, Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.87, pp.7688-7692, Octo
ber 1990). Up to now, an animal deficient in the function of the uridine phosphorylase gene has been produced (Japanese Patent Application Laid-Open No. 20-29200).
No. 01-169684), an animal in which the function of the thymidine phosphorylase gene on the chromosome is deficient, and further, an animal in which both the thymidine phosphorylase gene and the uridine phosphorylase gene are deficient and genetically stable have not been known so far.
【0011】[0011]
【発明の実施の形態】本発明において、「染色体上のチ
ミジンホスホリラーゼ遺伝子の機能が欠損した」とは、
体細胞及び生殖細胞の染色体上のチミジンホスホリラー
ゼ遺伝子が、その塩基配列の一部の欠失又は他の遺伝子
の挿入若しくは置換等により元来の構造とは異なったも
のとなり、チミジンホスホリラーゼとして機能するタン
パク質を産生することができないか或いは遺伝子産物が
得られてもそのタンパク質がチミジンホスホリラーゼと
して機能しないものであることをいい、具体的には、プ
ロモーター領域又はコード領域の塩基配列の欠失、挿入
又は置換等の遺伝子変異によってその機能が破壊された
もの等が挙げられる。即ち、「染色体上のチミジンホス
ホリラーゼ遺伝子の機能が欠損した非ヒト動物」とは、
チミジンホスホリラーゼ遺伝子(変異型チミジンホスホ
リラーゼ遺伝子)を遺伝子工学的な手法を用い、改変
(操作)して作出されたチミジンホスホリラーゼ発現不
全動物を意味する。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION In the present invention, "the function of the thymidine phosphorylase gene on the chromosome is defective" means
A protein that functions as a thymidine phosphorylase, in which the thymidine phosphorylase gene on the chromosomes of somatic cells and germ cells differs from its original structure due to a partial deletion of its nucleotide sequence or insertion or substitution of another gene. Or a gene product is obtained, the protein does not function as thymidine phosphorylase. Specifically, deletion, insertion or substitution of the nucleotide sequence of the promoter region or coding region And the like, whose functions are disrupted by gene mutations such as That is, "a non-human animal deficient in the function of the thymidine phosphorylase gene on the chromosome",
It means a thymidine phosphorylase expression-deficient animal produced by modifying (manipulating) a thymidine phosphorylase gene (mutant thymidine phosphorylase gene) using a genetic engineering technique.
【0012】ここで、「非ヒト動物」としては、チミジ
ンホスホリラーゼ遺伝子を有するヒト以外の動物あれば
何れでもよいが、非ヒト哺乳動物が好ましい。非ヒト哺
乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、
ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウ
ス、ラットなどが挙げられるが、病体動物モデル系の作
製の面から個体発生及び生物サイクルが比較的短く、ま
た、繁殖が容易なげっ歯動物、とりわけマウス又はラッ
トが好ましい。Here, the "non-human animal" may be any animal other than human having a thymidine phosphorylase gene, but a non-human mammal is preferable. Examples of non-human mammals include cow, pig, sheep, goat,
Rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, mice, rats, etc. are mentioned, but rodents with relatively short ontogeny and biological cycle from the viewpoint of preparation of animal model system for pathological diseases, and easy breeding, especially mice Alternatively, rat is preferable.
【0013】染色体上のチミジンホスホリラーゼ遺伝子
の破壊は、通常染色体上の遺伝子を破壊するのに用いら
れている方法を適用することができ、具体的には、チミ
ジンホスホリラーゼ遺伝子をクローニングし、インビト
ロでその遺伝子の機能を欠損した後に、該欠損遺伝子を
動物に戻すことによりその動物及びその子孫の該遺伝子
の機能を欠損させる方法が用いられる。For the disruption of the thymidine phosphorylase gene on the chromosome, the method usually used for disrupting the gene on the chromosome can be applied. Specifically, the thymidine phosphorylase gene can be cloned and the A method is used in which the gene function is lost and then the defective gene is returned to the animal so that the function of the gene in the animal and its progeny is lost.
【0014】また、動物に遺伝子を導入する手法として
は、例えば(1)遺伝子DNAを受精卵の前核期胚に注
入する方法、(2)組換えレトロウイルスを初期胚に感
染させる方法、(3)相同組換えを起こさせた胚性幹細
胞(ES細胞)を胚盤胞又は8細胞期胚に注入する方
法、等が挙げられ、本発明の非ヒト動物を得るためには
これらの何れも方法も用いることができるが、このうち
ES細胞を用いる遺伝子導入の方法は、相同組換えによ
り遺伝子を破壊するのに適しており、ES細胞に遺伝子
を導入する工程とキメラ動物を作出する工程とを分けて
行えるという利点を有している点で好ましい。As a method of introducing a gene into an animal, for example, (1) a method of injecting gene DNA into a pronuclear stage embryo of a fertilized egg, (2) a method of infecting an early embryo with a recombinant retrovirus, ( 3) A method of injecting an embryonic stem cell (ES cell) that has undergone homologous recombination into a blastocyst or an 8-cell stage embryo, and the like. In order to obtain the non-human animal of the present invention, any of these is available. Although a method can also be used, the method of gene transfer using ES cells is suitable for disrupting the gene by homologous recombination, and includes a step of introducing the gene into ES cells and a step of producing a chimeric animal. It is preferable because it has the advantage that it can be performed separately.
【0015】従って、本発明の非ヒト動物は、先ず変異
型チミジンホスホリラーゼ遺伝子を有する細胞(例えば
ES細胞)を作出し、該細胞を動物に移植することによ
りキメラ動物を作出することができ、更に斯かるキメラ
動物を他の個体と交配することによりその構成細胞の全
てにおいて当該変異型チミジンホスホリラーゼ遺伝子が
ヘテロ又はホモで欠損している動物を作出することがで
きる。以下に本発明の非ヒト動物及びその子孫の代表的
な作成方法について詳細に説明する。Therefore, the non-human animal of the present invention can first produce a cell having a mutant thymidine phosphorylase gene (for example, ES cell), and transplant the cell into an animal to produce a chimeric animal. By mating such a chimeric animal with another individual, an animal can be produced in which the mutant thymidine phosphorylase gene is heterozygously or homozygously deleted in all of its constituent cells. Hereinafter, a typical method for producing the non-human animal of the present invention and its progeny will be described in detail.
【0016】チミジンホスホリラーゼ遺伝子の変異体
(変異型チミジンホスホリラーゼ遺伝子)を得るために
は、チミジンホスホリラーゼ遺伝子の塩基配列の一部を
欠失又は他の遺伝子を挿入若しくは置換することにより
行われる。欠失、挿入等の部位は、機能する遺伝子産物
が得られなくなる部位であれば特に限定されず、プロモ
ーター領域、イントロン領域、エクソン領域等いずれで
あってもよいが、該遺伝子の発現能を確実に欠損させる
には、プロモーター領域又はコード領域の少なくとも一
部を変異させることが好ましい。また、欠失、置換又は
挿入した部位にレポーター遺伝子など別の遺伝子を挿入
することもできる。例えば、マウスのチミジンホスホリ
ラーゼ遺伝子は、図1及び図2に示すごとく、10個の
コーディングエクソンを含んでおり、チミジンホスホリ
ラーゼタンパクは、10個のコーディングエクソンに渡
ってコードされている。従って、チミジンホスホリラー
ゼ遺伝子の発現能の欠損には、個々のエクソンのいずれ
か又はこれらの一部を欠失させてもよく、またこれらの
いずれかの部位に他の遺伝子を挿入してもよい。To obtain a mutant of the thymidine phosphorylase gene (mutant thymidine phosphorylase gene), a part of the nucleotide sequence of the thymidine phosphorylase gene is deleted or another gene is inserted or replaced. The site of deletion, insertion, etc. is not particularly limited as long as a functional gene product is not obtained, and may be any of promoter region, intron region, exon region, etc. It is preferable to mutate at least a part of the promoter region or the coding region in order to delete the gene. Further, another gene such as a reporter gene can be inserted at the deleted, substituted or inserted site. For example, the mouse thymidine phosphorylase gene contains 10 coding exons as shown in FIGS. 1 and 2, and the thymidine phosphorylase protein is encoded over 10 coding exons. Therefore, for the lack of expression ability of the thymidine phosphorylase gene, either one of the individual exons or a part thereof may be deleted, and another gene may be inserted at any of these sites.
【0017】チミジンホスホリラーゼ遺伝子としては、
動物から単離、抽出されたゲノム由来のチミジンホスホ
リラーゼ遺伝子を用いる。クローニングは、例えばマウ
スの肝からゲノムDNAを抽出し、常法に従ってDNA
ライブラリーを作製し、次にこれをすでにクローニング
されているチミジンホスホリラーゼmRNAをコードす
るDNA、例えばcDNAの部分配列をプローブとして
用いてスクリーニングすることにより取得することがで
きる。上記のチミジンホスホリラーゼ遺伝子に人為的に
変異を加える方法は、インビトロで常用のDNA組換え
技術により行うことができる。As the thymidine phosphorylase gene,
The thymidine phosphorylase gene derived from the genome isolated and extracted from the animal is used. For cloning, for example, the genomic DNA is extracted from the liver of a mouse and the DNA is extracted according to a conventional method.
It can be obtained by preparing a library and then screening this using a partial sequence of DNA, for example, cDNA, which has already been cloned and which codes for thymidine phosphorylase mRNA. The above-mentioned method for artificially mutating the thymidine phosphorylase gene can be performed in vitro by a conventional DNA recombination technique.
【0018】次に、チミジンホスホリラーゼ遺伝子の機
能を欠損させるための相同組換え用ターゲティングベク
ターを作製する。ターゲティングベクターの設計は、染
色体由来チミジンホスホリラーゼ遺伝子の一部又は全部
を欠失させるか又は別の塩基配列を挿入するか若しくは
別の塩基配列に置き換え、その変異部分を囲む上流及び
下流の領域をチミジンホスホリラーゼ遺伝子と相同な塩
基配列を持つように設計すればよい。Next, a targeting vector for homologous recombination for deleting the function of the thymidine phosphorylase gene is prepared. The targeting vector is designed by deleting a part or all of the chromosome-derived thymidine phosphorylase gene, inserting another base sequence or replacing it with another base sequence, and thymidine-containing upstream and downstream regions surrounding the mutated part. It may be designed to have a nucleotide sequence homologous to the phosphorylase gene.
【0019】また、このターゲティングベクター中に
は、ベクターが取り込まれた細胞や目的とする相同組換
えの起こっている可能性の高い細胞を選択するためのマ
ーカー遺伝子、例えばネオマイシン耐性遺伝子(ne
o)、ヘルペスウイルスチミジンリン酸化酵素遺伝子
(HSV−tk)、ジフテリアトキシンAフラグメント
(DT−A)遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子(tk)
等の薬剤選択に通常用いられる遺伝子が挿入されている
ことが好ましい。例えば、ネオマイシン耐性遺伝子は、
ネオマイシン類似体であるG418を用いることにより
目的遺伝子の選別を可能にする。また、目的細胞を選別
除去するためにネガティブ選別に用いるマーカー遺伝
子、例えばチミジンキナーゼ遺伝子(tk)(選別剤と
してガンシクロビル、FIAU等を用い、それに対する
感受性により非相同組換え体を選別除去する)、ジフテ
リアトキシンAフラグメント(DT−A)遺伝子(DT
−Aにより発現されたジフテリア毒素により、非相同組
換え体を選別除去する)等をネオマイシン耐性遺伝子
(neo)等のポジティブ選別用マーカー遺伝子と共に
用いることもできる。Further, in this targeting vector, a marker gene such as a neomycin resistance gene (ne) is selected for selecting cells into which the vector has been incorporated or cells in which the desired homologous recombination is likely to occur.
o), herpesvirus thymidine phosphatase gene (HSV-tk), diphtheria toxin A fragment (DT-A) gene, thymidine kinase gene (tk)
It is preferable that a gene usually used for drug selection such as is inserted. For example, the neomycin resistance gene
The neomycin analog G418 is used to allow selection of the target gene. In addition, a marker gene used for negative selection to select and remove target cells, for example, thymidine kinase gene (tk) (using ganciclovir, FIAU, etc. as a selection agent, and selecting and removing non-homologous recombinants depending on its sensitivity), Diphtheria toxin A fragment (DT-A) gene (DT
(A non-homologous recombinant is selectively removed by the diphtheria toxin expressed by -A) and the like can be used together with a marker gene for positive selection such as a neomycin resistance gene (neo).
【0020】斯かるターゲティングベクターの調製は、
通常のDNA組換え技術により行うことができ、例え
ば、クローニングしたチミジンホスホリラーゼ遺伝子を
利用して、これを適当な制限酵素で切断して得られる断
片、又はPCR法などにより一部を増幅して調製したD
NA断片などを、DNA合成機などにより合成されたリ
ンカーDNAやレポータ遺伝子、薬剤耐性マーカ遺伝子
を含む断片などと、前記のような設計に従って適当な順
序で結合させればよい。The preparation of such a targeting vector is
It can be carried out by an ordinary DNA recombination technique, for example, using a cloned thymidine phosphorylase gene, a fragment obtained by cutting this with an appropriate restriction enzyme, or a part of which is amplified by a PCR method or the like. D
The NA fragment or the like may be linked to a fragment containing a linker DNA, a reporter gene, a drug resistance marker gene synthesized by a DNA synthesizer or the like in an appropriate order according to the above design.
【0021】次に、調製した相同組換え用ターゲティン
グベクターを、通常キメラ動物の作出に用いられる適当
な細胞へ導入する。ここで用いる細胞は、例えば卵細胞
や胚性幹細胞(ES細胞)が挙げられるが、生体のあら
ゆる種類の細胞に分化することができる多分化能を有し
ている点でES細胞が好ましい。また、ベクターDNA
を細胞中に導入する方法は、通常の方法、例えば、エレ
クトロポレーション法、マイクロインジェクション法、
リン酸カルシウム法等によって行うことができる。Next, the prepared targeting vector for homologous recombination is introduced into an appropriate cell which is usually used for producing a chimeric animal. The cells used here include, for example, egg cells and embryonic stem cells (ES cells), and ES cells are preferable because they have pluripotency capable of differentiating into all kinds of cells in the living body. Also, vector DNA
The method for introducing into cells is a usual method, for example, electroporation, microinjection,
It can be performed by the calcium phosphate method or the like.
【0022】ES細胞は、129系マウスの胚盤胞の内
部細胞塊から樹立され、未分化状態を保ったまま増殖・
培養可能な細胞株であり、ES細胞を用いる遺伝子導入
の方法はマウスについては確立されている(Mansour,
S. L. et al., Nature 336:348 (1988))。ES細胞の
培養は、原理的には哺乳動物一般で可能であると考えら
れ、マウスの他にJラット、ウサギ又はブタ、ウシ等の
家畜についてもES細胞の樹立を確立すべく研究が進展
している。尚、ES細胞が培養されていないか、又は培
養されていても生殖細胞にまで分化する細胞系が確立し
ていない動物種については、前記した(1)又は(2)
等の方法により変異遺伝子を導入すればよい。ES cells are established from the inner cell mass of the 129 blast mouse blastocyst and proliferate and grow in an undifferentiated state.
It is a culturable cell line and the method of gene transfer using ES cells has been established for mice (Mansour,
SL et al., Nature 336: 348 (1988)). In principle, it is considered that ES cells can be cultured in mammals in general, and research is progressing to establish ES cells not only in mice but also in domestic animals such as J rats, rabbits or pigs, and cows. ing. For animal species in which ES cells are not cultured, or in which a cell line that differentiates into germ cells has not been established, the aforementioned (1) or (2)
The mutant gene may be introduced by the method described above.
【0023】ターゲティングベクターの変異型チミジン
ホスホリラーゼ遺伝子配列を遺伝子相同組換えにより、
動物細胞(例えばES細胞)の染色体上のチミジンホス
ホリラーゼ遺伝子と入れ換えることにより行うことがで
きる。この時、ターゲティングベクターDNA中に挿入
されていたマーカー遺伝子がES細胞のゲノムのチミジ
ンホスホリラーゼ遺伝子に挿入される。By mutating the mutant thymidine phosphorylase gene sequence of the targeting vector by gene homologous recombination
It can be carried out by replacing the thymidine phosphorylase gene on the chromosome of animal cells (for example, ES cells). At this time, the marker gene inserted into the targeting vector DNA is inserted into the thymidine phosphorylase gene of the ES cell genome.
【0024】ターゲティングベクターが取り込まれた細
胞は、ベクターDNA中の薬物耐性遺伝子などのマーカ
ー遺伝子が同時に挿入され、当該遺伝子の発現に基づい
て、例えば適当な期間薬剤存在下で培養することにより
選択することができる。選択された細胞のうち、相同組
換えによる変異が生じた細胞の解析は、チミジンホスホ
リラーゼ遺伝子上又はその近傍のDNA配列をプローブ
としたサザンハイブリダイゼーション法による解析又は
ターゲッティングベクター上のDNA配列と、ターゲッ
ティングベクターに使用したマウス由来のチミジンホス
ホリラーゼ遺伝子以外の近傍領域のDNA配列とをプラ
イマーとしたPCR法による解析で判定することができ
る。The cells into which the targeting vector has been incorporated are selected by inserting a marker gene such as a drug resistance gene in the vector DNA at the same time and culturing in the presence of a drug for an appropriate period based on the expression of the gene. be able to. Among the selected cells, analysis of cells in which a mutation has occurred due to homologous recombination is carried out by Southern hybridization analysis using a DNA sequence on or near the thymidine phosphorylase gene as a probe or a DNA sequence on a targeting vector and targeting. It can be determined by an analysis by the PCR method using a DNA sequence in a region other than the mouse-derived thymidine phosphorylase gene used as the vector as a primer.
【0025】次に、この変異型チミジンホスホリラーゼ
遺伝子座を生じた細胞を用いて、注入法や集合法等の通
常キメラ動物の作出に用いられる方法に従い、キメラ動
物を作製する。具体的には、変異型の遺伝子座を生じた
細胞(例えばES細胞)を胚形成の初期の適当な時期、
例えば8細胞期の非ヒト動物胚又は胚盤胞に注入し、得
られた胚を偽妊娠動物の子宮内に移植することにより、
正常なチミジンホスホリラーゼ遺伝子座をもつ細胞と変
異型チミジンホスホリラーゼ遺伝子座をもつ細胞とから
構成されるキメラ動物が得られる。宿主胚をどのような
系統の動物から得るかの選択は、常法に従い毛色等の表
現型によりES細胞由来の細胞と宿主胚由来の細胞とを
区別することができるように行えばよい。Next, using the cells in which the mutant thymidine phosphorylase locus has been generated, a chimeric animal is produced according to a method generally used for producing a chimeric animal such as an injection method or an assembly method. Specifically, cells that have mutated loci (for example, ES cells) are treated at an appropriate time in the early stage of embryogenesis,
For example, by injecting into an 8-cell stage non-human animal embryo or blastocyst, and transplanting the obtained embryo into the uterus of a pseudopregnant animal,
A chimeric animal composed of cells having a normal thymidine phosphorylase locus and cells having a mutant thymidine phosphorylase locus is obtained. The selection of the strain of the animal from which the host embryo is obtained may be performed according to a conventional method so that the ES cell-derived cells and the host embryo-derived cells can be distinguished by the phenotype such as coat color.
【0026】このキメラ動物の生殖細胞の一部が変異型
チミジンホスホリラーゼ遺伝子座をもつ場合には、キメ
ラ個体を正常個体と交配することにより得られた個体群
より、全ての組織が変異型チミジンホスホリラーゼ遺伝
子座をもつ細胞で構成された個体(チミジンホスホリラ
ーゼ発現不全動物)を毛色等の判別法により選別し得る
ことができる。When a part of the germ cells of this chimeric animal has a mutant thymidine phosphorylase locus, all tissues are mutated thymidine phosphorylase from the population obtained by mating the chimeric individual with a normal individual. Individuals composed of cells having a locus (animals that do not express thymidine phosphorylase) can be selected by a method of discriminating hair color or the like.
【0027】例えば、例えばJ1株のマウスES細胞と
C57BL/J系の宿主胚を用いて得られたキメラマウ
スをC57BL/6J系と交配する場合は、娩出される
産仔は、キメラマウスの生殖細胞が、相同組換えES細
胞に由来していれば該ES細胞が由来するマウスと同じ
野生色(アグーチ)を呈し、宿主胚に由来していれば該宿
主胚が由来するマウスと同じ黒色を呈する。チミジンホ
スホリラーゼ遺伝子の発現欠損は、離乳に至った後に尾
からDNAを注出後、サザンブロット又はPCRを行っ
て、確認することができる。For example, when a chimeric mouse obtained by using a mouse ES cell of the J1 strain and a host embryo of the C57BL / J strain is crossed with the C57BL / 6J strain, the offspring delivered are reproduction of the chimeric mouse. If the cell is derived from a homologous recombinant ES cell, it exhibits the same wild color as the mouse from which the ES cell is derived (agouti), and if it is derived from the host embryo, the same black color as the mouse from which the host embryo is derived. Present. The expression deficiency of the thymidine phosphorylase gene can be confirmed by performing Southern blotting or PCR after pouring out DNA from the tail after weaning.
【0028】また、F1ヘテロ型発現不全産仔同士を交
配すれば、F2ヘテロ型発現不全産仔及びF2ホモ型発
現不全産仔を得ることができる。本発明の非ヒト動物
は、キメラ型動物、F1ヘテロ型発現不全動物及びF2
ホモ型発現不全動物を包含するものであるが、チミジン
ホスホリラーゼ遺伝子の発現欠損の効果の点からF2ホ
モ型発現不全動物が好ましい。Further, if the pups deficient in F1 heterotype expression are crossed with each other, pups deficient in F2 heterotype expression and pups deficient in F2 homotype expression can be obtained. The non-human animals of the present invention include chimeric animals, F1 heterozygous expression-deficient animals and F2 animals.
Although the homozygous expression-deficient animal is included, the F2 homozygous-deficient animal is preferable from the viewpoint of the effect of defective expression of the thymidine phosphorylase gene.
【0029】かくして得られた形質転換非ヒト動物は、
体細胞及び生殖細胞の染色体上のチミジンホスホリラー
ゼ遺伝子の発現能が欠損しており、且つ当該欠損は遺伝
的に安定である。The transformed non-human animal thus obtained is
The expression ability of the thymidine phosphorylase gene on the chromosomes of somatic cells and germ cells is defective, and the defect is genetically stable.
【0030】本発明の染色体上のチミジンホスホリラー
ゼ遺伝子及びウリジンホスホリラーゼ遺伝子の機能が欠
損した非ヒト動物は、上記のチミジンホスホリラーゼ発
現不全動物とウリジンホスホリラーゼ発現不全動物とを
交配することにより作出することができ、更に得られた
チミジンホスホリラーゼ遺伝子及びウリジンホスホリラ
ーゼ遺伝子の機能が欠損した非ヒト動物の子孫同士を交
配することによっても作出できる。ここで、ウリジンホ
スホリラーゼ発現不全動物としては、例えばウリジンホ
スホリラーゼ遺伝子の一部のDNA配列を欠失させる
か、又はいずれかの部位に他の遺伝子を挿入若しくは置
換することによりチミジンホスホリラーゼ遺伝子の機能
が欠損したもの、具体的にはマウスウリジンホスホリラ
ーゼ遺伝子の第2コーディングエクソンの代りにネオマ
イシン耐性遺伝子を挿入することにより当該遺伝子の機
能が欠損したもの等が挙げられ、特開2001−169
684号公報に記載の遺伝子工学的な手法を用い、改変
(操作)して作出することができる。The non-human animal deficient in the functions of the thymidine phosphorylase gene and the uridine phosphorylase gene on the chromosome of the present invention can be produced by mating the above-mentioned thymidine phosphorylase expression deficient animal with uridine phosphorylase expression deficient animal. It can also be produced by mating the progeny of non-human animals deficient in the functions of the obtained thymidine phosphorylase gene and uridine phosphorylase gene. Here, as the uridine phosphorylase expression-deficient animal, for example, a partial DNA sequence of the uridine phosphorylase gene is deleted, or the function of the thymidine phosphorylase gene is deficient by inserting or replacing another gene at any site. And specifically, one in which the function of the gene has been deficient by inserting a neomycin resistance gene in place of the second coding exon of the mouse uridine phosphorylase gene, and the like.
It can be created by modification (manipulation) using the genetic engineering method described in Japanese Patent No. 684.
【0031】例えば、マウス小腸においては、ウリジン
ホスホリラーゼの発現が高くこれがチミジンホスホリラ
ーゼ活性をもつことが報告されていることから、このよ
うな臓器においては、チミジンホスホリラーゼのみをノ
ックアウトした動物を作出してもチミジンホスホリラー
ゼ活性を完全に消失させることはできないが、本発明の
チミジンホスホリラーゼ遺伝子及びウリジンホスホリラ
ーゼ遺伝子の機能を欠損した動物では、後記実施例に示
すようにチミジンホスホリラーゼ活性がほぼ完全に欠失
している。従って、これを用いれば、様々な組織におけ
るチミジンホスホリラーゼの生理機能の研究やチミジン
ホスホリラーゼが関与する疾患の病態生理の解明をより
効率的に且つ正確に行うことが可能となる。For example, since expression of uridine phosphorylase is high in the mouse small intestine and it has been reported to have thymidine phosphorylase activity, even if an animal in which only thymidine phosphorylase was knocked out was produced in such an organ, Although the thymidine phosphorylase activity cannot be completely abolished, the animals lacking the functions of the thymidine phosphorylase gene and the uridine phosphorylase gene of the present invention have almost completely deleted thymidine phosphorylase activity as shown in Examples below. . Therefore, by using this, it becomes possible to more efficiently and accurately study the physiological function of thymidine phosphorylase in various tissues and elucidate the pathophysiology of diseases involving thymidine phosphorylase.
【0032】[0032]
【実施例】以下、実施例により本発明をより具体的に説
明する。
実施例1マウスチミジンホスホリラーゼ遺伝子のターゲティング
ベクターの作製
129SVマウスのES細胞のゲノムDNAをBACベ
クターにつないだゲノムライブラリーを高密度にナイロ
ンフィルターにスポットしたhigh density filterをゲ
ノムシステム社より購入した。マウスチミジンホスホリ
ラーゼ遺伝子のcDNA(Genbank accession number A
B06274)をプローブとしてhigh densityfilterのハイブ
リダイゼーションを行い、2個の陽性クローンを得た。
これを用いてチミジンホスホリラーゼ遺伝子のイントロ
ンを含む約11kbのSpeI−SpeI断片を得、p
GEM−5ZfベクターにつなぎS8と名付けた。The present invention will be described in more detail with reference to the following examples. Example 1 Targeting of the mouse thymidine phosphorylase gene
Preparation of vector A high density filter obtained by spotting a genomic library in which the genomic DNA of 129SV mouse ES cells was ligated to a BAC vector on a nylon filter at high density was purchased from Genome Systems. Mouse thymidine phosphorylase gene cDNA (Genbank accession number A
B06274) was used as a probe for high density filter hybridization to obtain two positive clones.
Using this, an SpeI-SpeI fragment of about 11 kb containing the intron of the thymidine phosphorylase gene was obtained.
It was ligated to the GEM-5Zf vector and named S8.
【0033】次いで、チミジンホスホリラーゼ遺伝子の
構造を破壊するためのターゲティングベクターの作製を
行った。チミジンホスホリラーゼ遺伝子の開始コドン及
びエクソン2,3,4を含む約1.6kbのAflII
−ClaI断片をS8より切り出した。一方そのかわり
にネオマイシン耐性遺伝子(pGK-neo-promoter)を挿入し
た。さらにチミジンホスホリラーゼ遺伝子の5’側上流
にはジフテリア毒素A遺伝子(DT−A)を本来の転写
方向とは逆向きに挿入した。ES細胞への導入の際には
AatIIで切断して線状化し、ターゲティングベクタ
ーを得た(図1)。Next, a targeting vector for disrupting the structure of the thymidine phosphorylase gene was prepared. AflII of about 1.6 kb containing the start codon of the thymidine phosphorylase gene and exons 2, 3, and 4
The -ClaI fragment was excised from S8. On the other hand, a neomycin resistance gene (pGK-neo-promoter) was inserted instead. Furthermore, the diphtheria toxin A gene (DT-A) was inserted upstream of the thymidine phosphorylase gene on the 5'side in the direction opposite to the original transcription direction. Upon introduction into ES cells, it was cut with AatII and linearized to obtain a targeting vector (FIG. 1).
【0034】実施例2相同組換え用DNAの導入によるES細胞のチミジンホ
スホリラーゼ遺伝子の欠損
相同組換え用DNA(TP−neo)25μgをそれぞ
れマウスES細胞(J1株)2×107個を含むエレク
トロポレーション用緩衝液に懸濁させ、電界強度(Fiel
d Strength)400V/cm、静電容量(Capacitance
)25μFの条件で、遺伝子導入を行った。TP−n
eoは導入後48時間から175μg/mlのG418
(Genetisin,GIBCO BRL)濃度で選択培養を行った。Example 2 Thymidine ho of ES cells by introducing DNA for homologous recombination
Deficiency of the suphorylase gene 25 μg of DNA for homologous recombination (TP-neo) was suspended in an electroporation buffer containing 2 × 10 7 mouse ES cells (J1 strain), and the electric field strength (Fiel
d Strength) 400 V / cm, Capacitance
) Gene transfer was performed under the condition of 25 μF. TP-n
eo is 175 μg / ml G418 from 48 hours after introduction
Selective culture was performed at a concentration of (Genetisin, GIBCO BRL).
【0035】G418耐性コロニーを、それぞれ遺伝子
導入後184時間後から、マイクロピペットを用いて4
0μlの0.05%トリプシン−HBS−EDTA溶液
を含む96穴のマイクロプレートに移し換え、5分間処
理した後、ピペッティングすることによって単一細胞に
し、これらを半分に分け96穴のマイクロプレートに移
し換え、培養を行った。十分に増殖したところで24穴
のマイクロプレートに移し、さらに培養を続けた。半分
は液体窒素で保存し、残りの半分をサザンハイブリダイ
ゼーションによる組換え体検出のためのDNA抽出に使
用した。DNA抽出は常法に従い行ったが、検体数が多
いため、proteinase K、イソプロパノール
処理で沈殿してきたDNAをNheIで切断してサザン
ハイブリダイゼーションを行った。プローブはターゲテ
イングベクターに使用した3’側ホモロジー領域のさら
に下流に位置する(SpeI切断部位の下流)0.5k
bの断片を用いた。サザンハイブリダイゼーションによ
るバンドは非相同組換えES細胞では約10kbとなる
が相同組換えをおこしたものはネオマイシン耐性遺伝子
挿入にともないNheI切断部位が一個欠失するため約
15kbとなることが期待できた。またDNAをNde
Iで切断して同じプローブを用いてサザンハイブリダイ
ゼーションを行ったものでは非相同組換えES細胞では
約8.5kbとなるが相同組換えをおこしたものはネオ
マイシン耐性遺伝子挿入にともないNdeI切断部位が
一個欠失するため約11kbとなることが期待できた
(図1、図2)。G418-resistant colonies were transferred to each other using a micropipette 184 hours after the gene transfer.
Transfer to a 96-well microplate containing 0 μl of 0.05% trypsin-HBS-EDTA solution, treat for 5 minutes, and pipette to obtain single cells, divide them in half, and divide into 96-well microplates. Transfer and culture were performed. When the cells were sufficiently grown, they were transferred to a 24-well microplate and further cultured. Half was stored in liquid nitrogen and the other half was used for DNA extraction for recombinant detection by Southern hybridization. Although DNA extraction was performed according to a conventional method, since the number of samples was large, DNA precipitated by treatment with proteinase K and isopropanol was cleaved with NheI and subjected to Southern hybridization. The probe is located further downstream of the 3'side homology region used for the targeting vector (downstream of the SpeI cleavage site) 0.5k
The fragment from b was used. The band obtained by Southern hybridization is about 10 kb in non-homologous recombinant ES cells, but it was expected that the homologous recombination band would be about 15 kb due to the deletion of one NheI cleavage site due to the insertion of the neomycin resistance gene. . In addition, DNA is Nde
In the case of the non-homologous recombinant ES cell which was cleaved with I and subjected to Southern hybridization using the same probe, the size of the non-homologous recombinant ES cell was about 8.5 kb. It could be expected to be about 11 kb due to one deletion (Figs. 1 and 2).
【0036】ハイブリダイゼーションの結果は、Bio-Im
age Analyzer BAS2000(Fuji)により解析した。その頻
度はTP−neoが150クローン中6クローンが相同
組換えを起こしていた(図3)。変異型遺伝子座と野生
型遺伝子座のバンドがほぼ同じ強さで出る細胞を選択
し、それを胚盤胞に導入した。The result of the hybridization was Bio-Im.
It analyzed by age Analyzer BAS2000 (Fuji). Regarding the frequency, 6 out of 150 clones of TP-neo underwent homologous recombination (FIG. 3). We selected cells in which the bands of the mutant locus and the wild-type locus appeared at almost the same intensity, and introduced them into blastocysts.
【0037】実施例3キメラマウスの作出とチミジンホスホリラーゼ発現不全
マウスの選別
キメラマウスはBradleyらの方法(Bradley, A.
(1987). Production and analysis of chimeric mice i
n teratocarcinomas and embryonic stem cells;A prac
tical approach. E. J. Robertoson ed. (Oxford:IRL p
ress), pp113-151)、Gossler の方法(Gossler, A., D
oetschman, T., Korn, R., Serfling, E., andKemler,
R. (1986). Transgenesis by means of blastocyst-der
ived embryonic stem cell lines. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 83, 9065-9069)により作製した。C57B
L/6の交尾後3.5日目に卵管より胚盤胞を取得し、
その内腔に約7個の相同組換えES細胞を導入した。そ
れを擬妊娠させたICRマウスの子宮内に戻し、この仮
親から生まれたキメラマウスの中でES細胞の寄与が大
きいと考えられる体毛の黒色が淡くなったマウスをそれ
ぞれ2匹づつを選び、C57BL/6と交配を行った。
生まれたマウスでアグーチ色のマウスについて、尻尾よ
りDNAを抽出し、常法によりサザンハイブリダイゼー
ションを行った。尻尾からのDNA抽出は、Prote
inaseK処理後フェノール抽出、クロロホルム抽
出、エタノール沈殿行いTE溶液に溶解した。組換えを
起こした遺伝子座を持つマウスを選び、そのマウス同士
を交配し、ホモで変異型チミジンホスホリラーゼ遺伝子
座を有するマウスを取得した。Example 3 Generation of chimeric mice and defective expression of thymidine phosphorylase
Selection of Mouse Chimera mouse was prepared by the method of Bradley et al.
(1987). Production and analysis of chimeric mice i
n teratocarcinomas and embryonic stem cells; A prac
tical approach.EJ Robertoson ed. (Oxford: IRL p
ress), pp113-151), Gossler's method (Gossler, A., D
oetschman, T., Korn, R., Serfling, E., andKemler,
R. (1986) .Transgenesis by means of blastocyst-der
ived embryonic stem cell lines. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 83, 9065-9069). C57B
Obtain blastocysts from the oviduct 3.5 days after mating L / 6,
About 7 homologous recombinant ES cells were introduced into the lumen. Return it to the uterus of pseudo-pregnant ICR mouse, and select two mice each with pale black hair, which is considered to have a large contribution of ES cells, among the chimeric mice born from this foster mother. Crossed with / 6.
With regard to the born mouse of agouti color, DNA was extracted from the tail and subjected to Southern hybridization by a conventional method. DNA extraction from the tail is done by Prote
After inaseK treatment, it was extracted with phenol, extracted with chloroform, precipitated with ethanol and dissolved in a TE solution. Mice having a gene locus that had undergone recombination were selected, and the mice were crossed to obtain a homozygous mouse having a mutant thymidine phosphorylase locus.
【0038】マウスの尾のDNAをNheIで切断し、
ターゲテイングベクターに使用した3’側ホモロジー領
域のさらに下流に位置する(SpeI切断部位の下流)0.
5kbの断片をプローブとして用いてサザンハイブリダ
イゼーションを行ったところ10kbと15kbのバン
ドを示し、片方の染色体のチミジンホスホリラーゼが破
壊されていると判断できた。アグーチ色のマウスを5匹
得て、サザンハイブリダイゼーションで解析したところ
そのうち2匹が10kbと15kbのバンドを示した
(図3)。その後これらのマウスを交互に交配した。マ
ウス尾のDNAを常法に従って抽出、精製し、ネオマイ
シン耐性遺伝子が挿入された部位の外側と内側の配列
(TPf:GAGCGCTGTAACCCGACCCT (配列番号1)、NE
O:CCGATTCGCAGCGCATCGCC(配列番号2))あるいはネ
オマイシン耐性遺伝子が挿入されていない場合にのみ存
在する野生型チミジンホスホリラーゼ遺伝子の配列(T
PR:TATCACCGCGTGCACGAAGTTTC(配列番号3))をプ
ライマーとして遺伝子増幅を行った。野生型のチミジン
ホスホリラーゼ遺伝子をテンプレートとした場合640
bpの、相同組換え体では400bpの遺伝子増幅産物
が得られることが期待された。最終的に400bpの遺
伝子増幅産物のバンドだけを示すマウス、すなわちホモ
で変異型チミジンホスホリラーゼ遺伝子座を有するマウ
スを得ることができた(図4)。生まれてきたマウスは
見かけ上異常が見い出されず、全く健康な状態で生まれ
てくることがわかった。リッターメイト間でTP+/
+、+/−、−/−の遺伝子型を持つマウスがほぼ1:
2:1の比率で生まれてくることから、遺伝子背景に関
係なくTP−/−も全く健康な状態で生まれていると判
断できた。The DNA of the mouse tail was cut with NheI,
It is located further downstream of the 3'side homology region used for the targeting vector (downstream of the SpeI cleavage site).
When Southern hybridization was carried out using a 5 kb fragment as a probe, bands of 10 kb and 15 kb were shown, and it could be determined that the thymidine phosphorylase of one chromosome was destroyed. When five agouti-colored mice were obtained and analyzed by Southern hybridization, two of them showed bands of 10 kb and 15 kb (FIG. 3). These mice were then crossed alternately. The mouse tail DNA was extracted and purified by a conventional method, and the sequences outside and inside the site where the neomycin resistance gene was inserted.
(TPf: GAGCGCTGTAACCCGACCCT (SEQ ID NO: 1), NE
O: CCGATTCGCAGCGCATCGCC (SEQ ID NO: 2)) or the sequence of the wild-type thymidine phosphorylase gene (T which is present only when the neomycin resistance gene is not inserted).
PR: TATCACCGCGTGCACGAAGTTTC (SEQ ID NO: 3)) was used as a primer for gene amplification. When using the wild-type thymidine phosphorylase gene as a template, 640
It was expected that a 400 bp gene amplification product could be obtained from the bp homologous recombinant. Finally, a mouse showing only the band of the gene amplification product of 400 bp, that is, a mouse having a homozygous mutant thymidine phosphorylase locus could be obtained (FIG. 4). It was found that the born mouse did not appear to be abnormal, and was born in a completely healthy state. TP + / between littermates
Mice with genotypes of +, +/-,-/-are almost 1:
Since they were born at a ratio of 2: 1, it was judged that TP − / − were born in a completely healthy state regardless of the genetic background.
【0039】実施例4正常及びチミジンホスホリラーゼ発現不全マウスにおけ
るチミジンホスホリラーゼ活性
ホモで変異型チミジンホスホリラーゼ遺伝子を有するマ
ウスについてチミジンホスホリラーゼ活性の有無を調べ
た。すなわちチミジンホスホリラーゼ発現不全マウス及
びコントロール(正常)として同じ遺伝子背景の非組換
え体マウスより小腸及び肝組織を摘出し、4倍量の緩衝
液(50mM Tris-Hcl, 1% TritonX-100, 2mM PMSF, 0.02%
2-Mercaptoethanol)を加えてホモジナイズし、200
0gで30分間遠心分離したのち、その上清を用いて活
性を測定した。チミジンホスホリラーゼ活性はT.En
g Ganらの方法(T.Eng Gan et al., A rapid and s
imple radiometric assay for thymidine phosphorylas
e of human peripheral blood cells, Clinica Chimica
Acta 116, 231-236, 1981)に従って[3H] チミジンか
らの[3H]チミンの生成を測定した。結果を表1に示
す。Example 4 In normal and thymidine phosphorylase expression deficient mice
Were examined for thymidine phosphorylase activity for mice with mutant thymidine phosphorylase gene that thymidine phosphorylase activity homo. That is, the small intestine and liver tissue were removed from a mouse deficient in thymidine phosphorylase expression and a non-recombinant mouse having the same gene background as a control (normal), and a 4-fold amount of buffer solution (50 mM Tris-Hcl, 1% TritonX-100, 2 mM PMSF was used. , 0.02%
2-Mercaptoethanol) and homogenize to 200
After centrifugation at 0 g for 30 minutes, the supernatant was used to measure the activity. Thymidine phosphorylase activity was determined by T. En
g Gan et al. (T. Eng Gan et al., A rapid and s
imple radiometric assay for thymidine phosphorylas
e of human peripheral blood cells, Clinica Chimica
The production of [ 3 H] thymine from [ 3 H] thymidine was measured according to Acta 116, 231-236, 1981). The results are shown in Table 1.
【0040】[0040]
【表1】 [Table 1]
【0041】その結果チミジンホスホリラーゼ発現不全
マウスでは肝臓でのチミジンホスホリラーゼ活性が著明
に減少していた。一方、小腸組織でのチミジンホスホリ
ラーゼ活性は非組換え体(正常)マウスとの差がみられ
なかった。マウスの小腸組織ではウリジンホスホリラー
ゼが発現しておりこれがチミジンホスホリラーゼ活性を
もつことが確認されている。As a result, the thymidine phosphorylase activity in the liver was remarkably reduced in the thymidine phosphorylase expression-deficient mouse. On the other hand, the thymidine phosphorylase activity in the small intestine tissue was not different from that in the non-recombinant (normal) mouse. Uridine phosphorylase is expressed in the mouse small intestinal tissue, and it has been confirmed that this has thymidine phosphorylase activity.
【0042】実施例5正常及びチミジンホスホリラーゼ発現不全マウスの肝臓
におけるチミジンホスホリラーゼmRNAの発現
正常及びチミジンホスホリラーゼ発現不全マウス各2匹
より肝臓組織を摘出し、グアニジンチオシアネートとフ
ェノールを用いてトータルRNAを抽出した。このRN
Aを用いてRT−PCR法にてチミジンホスホリラーゼ
の発現を調べた。図5に示すようにチミジンホスホリラ
ーゼ発現不全マウスではチミジンホスホリラーゼのバン
ドは検出されなかった。Example 5 Liver of normal and thymidine phosphorylase-deficient mice
Expression of Thymidine Phosphorylase mRNA in 2 Normal and thymidine phosphorylase expression-deficient mice each had 2 liver tissues excised, and total RNA was extracted using guanidine thiocyanate and phenol. This RN
Using A, the expression of thymidine phosphorylase was examined by the RT-PCR method. As shown in FIG. 5, the thymidine phosphorylase band was not detected in the mouse deficient in thymidine phosphorylase expression.
【0043】実施例6正常及びチミジンホスホリラーゼ発現不全マウスにおけ
る血中チミジン濃度
正常及びチミジンホスホリラーゼ発現不全マウスより、
血液を採取し、血清に分離したのち氷冷したメタノール
を9倍量加え、氷中に30分間放置して蛋白質を十分に
沈殿させた。次にこれを遠心分離し、得られた上清を6
0℃で窒素ガス気流下で乾固したのち、残渣に純水20
0μlを加えて、0.45μmのフィルターでろ過し、
HPLC法にてウリジン、チミジン及びシチジン濃度を
測定した。結果を表2に示す。Example 6 In normal and thymidine phosphorylase expression deficient mice
Blood thymidine concentration from normal and thymidine phosphorylase expression deficient mice,
Blood was collected, separated into serum, and ice-cooled methanol was added in an amount of 9 times, and the mixture was allowed to stand in ice for 30 minutes to sufficiently precipitate the protein. Then, this is centrifuged, and the resulting supernatant is mixed with 6
After drying in a nitrogen gas stream at 0 ° C, the residue is purified with 20% pure water.
Add 0 μl and filter through a 0.45 μm filter,
Uridine, thymidine and cytidine concentrations were measured by the HPLC method. The results are shown in Table 2.
【0044】[0044]
【表2】 [Table 2]
【0045】表2に示したように正常マウスの血清中の
チミジン濃度は0.094nmol/mlであったのに対しチ
ミジンホスホリラーゼ発現不全マウスでは0.32nmol
/mlを示し約3倍の上昇が見られた。ウリジンやシチジ
ン濃度はチミジンホスホリラーゼをノックアウトするこ
とによる変動は認められなかった。As shown in Table 2, the thymidine concentration in the serum of the normal mouse was 0.094 nmol / ml, whereas that in the mouse deficient in thymidine phosphorylase expression was 0.32 nmol.
/ ml was shown and about 3-fold increase was observed. Uridine and cytidine concentrations were not changed by knocking out thymidine phosphorylase.
【0046】実施例7正常マウス及びチミジンホスホリラーゼ発現不全マウス
におけるヌクレオシド系抗癌剤の代謝動態
チミジンホスホリラーゼ遺伝子をノックアウトしたこと
によるヌクレオシド系抗癌剤の血中濃度の変化を5−ト
リフルオロチミジン(F3dThd)を用いて調べた。Example 7 Normal mouse and mouse deficient in thymidine phosphorylase expression
Metabolic Dynamics of Nucleoside Anticancer Drugs in Rats Changes in blood levels of nucleoside anticancer drugs due to knockout of the thymidine phosphorylase gene were examined using 5-trifluorothymidine (F 3 dThd).
【0047】正常マウス及びチミジンホスホリラーゼ発
現不全マウス(各n=3)に対して10mg/kgのF
3dThdを経口投与し、経時的に血液を採取し血清に
分離したのちF3dThd濃度をHPLC法にて測定し
た。結果を表3に示す。F of 10 mg / kg was used for normal mice and mice deficient in thymidine phosphorylase expression (n = 3 each).
3 dThd was orally administered, blood was sampled with time, separated into serum, and the F 3 dThd concentration was measured by the HPLC method. The results are shown in Table 3.
【0048】[0048]
【表3】 [Table 3]
【0049】表3に示したようにF3dThdを経口投
与した場合チミジンホスホリラーゼ発現不全マウスでの
F3dThd濃度は正常のそれより約6倍高く(60
分)チミジンホスホリラーゼ活性の欠損に伴い、生体内
でのF3dThdの分解が抑制されていることが証明さ
れた。As shown in Table 3, when F 3 dThd was orally administered, the F 3 dThd concentration in thymidine phosphorylase deficient mice was about 6 times higher than that in the normal case (60
Min) It was proved that the degradation of F 3 dThd in vivo was suppressed due to the lack of thymidine phosphorylase activity.
【0050】実施例8チミジンホスホリラーゼ及びウリジンホスホリラーゼ発
現不全マウスの作出と選別
実施例3で得られたチミジンホスホリラーゼ発現不全マ
ウスと特開2001−169684号公報に記載のウリ
ジンホスホリラーゼ発現不全マウスを交配し、ヘテロで
変異型チミジンホスホリラーゼ遺伝子座と変異型ウリジ
ンホスホリラーゼ遺伝子座を有するマウスを得た。これ
らのマウスについては尻尾よりDNAを抽出し、精製し
たのちチミジンホスホリラーゼとウリジンホスホリラー
ゼの遺伝子型をしらべるため、それぞれの固有のプライ
マーを使って遺伝子増幅を行った。チミジンホスホリラ
ーゼ遺伝子については実施例3と同様のプライマー(T
Pf(配列番号1)、Neo(配列番号2)、TPr
(配列番号3))を用いて遺伝子増幅を行った。野生型
のチミジンホスホリラーゼ遺伝子をテンプレートとした
場合640bpの、変異型では400bpの遺伝子増幅
産物が得られることが期待された。ウリジンホスホリラ
ーゼ遺伝子については変異型ウリジンホスホリラーゼ遺
伝子に対応する配列(PGK−3:CCTGAAGAACGAGATCAGC
AGCCTC(配列番号4)、UPG−4:AGCTCTTGCTCCTTCGC
CTGCTTGC(配列番号5))或いは野生型ウリジンホスホ
リラーゼ遺伝子に対応する配列(UPG−2:CAAAGCTGAG
GCCCAACTGCCATGG(配列番号6)、UPG−3:CCTTGGA
CTTCCATTCACAGCTGCG(配列番号7))をプライマーとし
て遺伝子増幅を行った。野生型のウリジンホスホリラー
ゼ遺伝子をテンプレートとした場合、210bpの、変
異型ウリジンホスホリラーゼ遺伝子では313bpの遺
伝子増幅産物が得られることが期待された。これらのマ
ウスをさらに交配し、最終的にチミジンホスホリラーゼ
遺伝子については400bpの遺伝子増幅産物だけ、ウ
リジンホスホリラーゼ遺伝子については313bpの遺
伝子増幅産物だけを生じるマウス、すなわちホモで変異
型チミジンホスホリラーゼ遺伝子座と変異型ウリジンホ
スホリラーゼ遺伝子座を有するマウスを得ることができ
た(図6)。生まれてきたマウスは見かけ上異常が見い
出されず、全く健康な状態で生まれてくることがわかっ
た。Example 8 Generation of thymidine phosphorylase and uridine phosphorylase
Generation and selection of presently deficient mouse Mice obtained by mating the thymidine phosphorylase expression-deficient mouse obtained in Example 3 with the uridine phosphorylase expression-deficient mouse described in JP 2001-169684 A are heterozygous mutant thymidine phosphorylase locus and mutant type. Mice carrying the uridine phosphorylase locus were obtained. For these mice, DNA was extracted from the tail, purified, and then examined for the genotypes of thymidine phosphorylase and uridine phosphorylase. Therefore, gene amplification was carried out using each unique primer. For the thymidine phosphorylase gene, the same primers (T
Pf (SEQ ID NO: 1), Neo (SEQ ID NO: 2), TPr
(SEQ ID NO: 3)) was used for gene amplification. It was expected that a gene amplification product of 640 bp was obtained when the wild-type thymidine phosphorylase gene was used as a template, and that of the mutant type was 400 bp. Regarding the uridine phosphorylase gene, a sequence corresponding to the mutant uridine phosphorylase gene (PGK-3: CCTGAAGAACGAGATCAGC
AGCCTC (SEQ ID NO: 4), UPG-4: AGCTCTTGCTCCTTCGC
CTGCTTGC (SEQ ID NO: 5)) or a sequence (UPG-2: CAAAGCTGAG) corresponding to the wild-type uridine phosphorylase gene.
GCCCAACTGCCATGG (SEQ ID NO: 6), UPG-3: CCTTGGA
Gene amplification was performed using CTTCCATTCACAGCTGCG (SEQ ID NO: 7)) as a primer. When the wild-type uridine phosphorylase gene was used as a template, it was expected that a 210 bp gene amplification product could be obtained with the mutant uridine phosphorylase gene. These mice were further bred to finally give only a 400 bp gene amplification product for the thymidine phosphorylase gene and only a 313 bp gene amplification product for the uridine phosphorylase gene, ie, a homozygous mutant thymidine phosphorylase locus and a mutant type. Mice carrying the uridine phosphorylase locus could be obtained (Fig. 6). It was found that the newborn mice were apparently healthy, and no abnormalities were found.
【0051】実施例9正常及びチミジンホスホリラーゼ及びウリジンホスホリ
ラーゼ発現不全マウスにおけるチミジンホスホリラーゼ
活性とウリジンホスホリラーゼ活性
ホモで変異型チミジンホスホリラーゼ遺伝子及び変異型
ウリジンホスホリラーゼ遺伝子を有するマウスについ
て、実施例4と同様にして、チミジンホスホリラーゼ活
性とウリジンホスホリラーゼ活性の有無を調べた。結果
を表4に示す。Example 9 Normal and Thymidine Phosphorylase and Uridine Phosphoryl
Thymidine phosphorylase in mice lacking lacase expression
Activity and Uridine Phosphorylase Activity For mice having a homozygous mutant thymidine phosphorylase gene and a mutant uridine phosphorylase gene, the presence or absence of thymidine phosphorylase activity and uridine phosphorylase activity was examined in the same manner as in Example 4. The results are shown in Table 4.
【0052】[0052]
【表4】 [Table 4]
【0053】その結果、野生型マウスでは肝臓組織でチ
ミジンホスホリラーゼ活性が高かったがチミジンホスホ
リラーゼ発現不全マウス、あるいはチミジンホスホリラ
ーゼ及びウリジンホスホリラーゼ発現マウスではこの活
性がほぼ欠失していた。小腸のチミジンホスホリラーゼ
活性はチミジンホスホリラーゼ発現不全マウスでは維持
されていたがウリジンホスホリラーゼ発現不全マウスで
著明に減少し、チミジンホスホリラーゼ及びウリジンホ
スホリラーゼ発現マウスではほぼ欠失していた。マウス
小腸はウリジンホスホリラーゼの発現が高くこれがチミ
ジンホスホリラーゼ活性をもつことが報告されている。
ウリジンホスホリラーゼ活性は野生型マウスの小腸で高
くウリジンホスホリラーゼ発現不全マウス、チミジンホ
スホリラーゼ及びウリジンホスホリラーゼ発現マウスで
はほぼ欠失していた。As a result, the thymidine phosphorylase activity was high in the liver tissue of the wild-type mouse, but the thymidine phosphorylase expression deficient mouse, or the thymidine phosphorylase- and uridine phosphorylase-expressing mouse had almost this activity deleted. The thymidine phosphorylase activity in the small intestine was maintained in thymidine phosphorylase-deficient mice, but was markedly decreased in uridine phosphorylase-deficient mice, and was almost abolished in thymidine phosphorylase- and uridine phosphorylase-expressing mice. It has been reported that the mouse small intestine has high expression of uridine phosphorylase, which has thymidine phosphorylase activity.
Uridine phosphorylase activity was high in the small intestine of wild-type mice, and was almost deleted in uridine phosphorylase-deficient mice, thymidine phosphorylase- and uridine phosphorylase-expressing mice.
【0054】実施例10正常及びチミジンホスホリラーゼ及びウリジンホスホリ
ラーゼ発現不全マウスにおける血中ヌクレオシド濃度
実施例6と同様にして正常及びチミジンホスホリラーゼ
及びウリジンホスホリラーゼの血中ヌクレオシド濃度を
測定した。結果を表5に示す。Example 10 Normal and thymidine phosphorylase and uridine phosphoryl
Blood Nucleoside Concentrations in Lase-Deficient Mice In the same manner as in Example 6, normal and thymidine phosphorylase and uridine phosphorylase blood nucleoside concentrations were measured. The results are shown in Table 5.
【0055】[0055]
【表5】 [Table 5]
【0056】表5に示したように正常マウス血清中のチ
ミジン濃度は0.185nmol/mlであったのに対
しチミジンホスホリラーゼ・ウリジンホスホリラーゼ発
現不全マウスは1.042nmol/mlで約5倍の上
昇が見られた。ウリジン濃度は0.588nmol/m
lであったのに対しチミジンホスホリラーゼ及びウリジ
ンホスホリラーゼ発現不全マウスは1.047nmol
/mlで約2倍の上昇が見られた。またデオキシウリジ
ン濃度は0.154nmol/mlであったのに対しチ
ミジンホスホリラーゼ及びウリジンホスホリラーゼ発現
不全マウスは0.995nmol/mlで6倍以上の上
昇が見られた。As shown in Table 5, the thymidine concentration in the serum of normal mice was 0.185 nmol / ml, whereas in thymidine phosphorylase / uridine phosphorylase expression-deficient mice, 1.042 nmol / ml resulted in about a 5-fold increase. I was seen. Uridine concentration is 0.588 nmol / m
However, in the mouse deficient in expression of thymidine phosphorylase and uridine phosphorylase, 1.047 nmol
About 2 times increase was seen at / ml. In addition, the deoxyuridine concentration was 0.154 nmol / ml, whereas in mice deficient in thymidine phosphorylase and uridine phosphorylase expression, a 6-fold or more increase was observed at 0.995 nmol / ml.
【0057】[0057]
【発明の効果】本発明により、遺伝的に安定なチミジン
ホスホリラーゼ発現不全動物が得られる。斯かる動物
は、チミジンホスホリラーゼの生理機能の研究やチミジ
ン代謝異常等のチミジンホスホリラーゼが関与する疾患
の病態生理の解明、更にはヌクレオシド系代謝拮抗剤の
体内動態を調べるためのモデル動物として有用である。INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, a genetically stable thymidine phosphorylase-deficient animal can be obtained. Such animals are useful as a model animal for studying physiological functions of thymidine phosphorylase, elucidation of pathophysiology of diseases related to thymidine phosphorylase such as abnormal thymidine metabolism, and further for studying pharmacokinetics of nucleoside antimetabolites. .
【0058】[0058]
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Taiho Pharmaceutical Co.,LTD. Misako Haraguchi <120> Animals with insufficient expression of thymidine phosphorylase <130> P04251309 <160> 7 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 1 gagcgctgta acccgaccct 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 2 ccgattcgca gcgcatcgcc 20 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 tatcaccgcg tgcacgaagt ttc 23 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 cctgaagaac gagatcagca gcctc 25 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 agctcttgct ccttcgcctg cttgc 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 6 caaagctgag gcccaactgc catgg 25 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 7 ccttggactt ccattcacag ctgcg 25[Sequence list] SEQUENCE LISTING <110> Taiho Pharmaceutical Co., LTD. Misako Haraguchi <120> Animals with insufficient expression of thymidine phosphorylase <130> P04251309 <160> 7 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 1 gagcgctgta acccgaccct 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 2 ccgattcgca gcgcatcgcc 20 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 tatcaccgcg tgcacgaagt ttc 23 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 cctgaagaac gagatcagca gcctc 25 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 agctcttgct ccttcgcctg cttgc 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 6 caaagctgag gcccaactgc catgg 25 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 7 ccttggactt ccattcacag ctgcg 25
【0059】[0059]
【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]
【図1】マウスチミジンホスホリラーゼ遺伝子とそのタ
ーゲティング破壊を示す模式図である。図中、neoは
ネオマイシン耐性遺伝子を示し、DT−Aはジフテリア
トキシンAフラグメント遺伝子を示し、太実線はエクソ
ンを、細実線はイントロンを示す。FIG. 1 is a schematic diagram showing the mouse thymidine phosphorylase gene and its targeting disruption. In the figure, neo indicates the neomycin resistance gene, DT-A indicates the diphtheria toxin A fragment gene, the thick solid line indicates exons, and the thin solid line indicates introns.
【図2】相同組換体ES細胞を確認するためのゲノミッ
クサザンハイブリダイゼーションの結果を示す図であ
る。図中、+/+は正常マウスを、+/−はヘテロ欠損
マウスを示す。FIG. 2 shows the results of genomic Southern hybridization for confirming homologous recombinant ES cells. In the figure, + / + indicates a normal mouse and +/− indicates a heterozygous deficient mouse.
【図3】相同組換体マウスを確認するためのゲノミック
サザンハイブリダイゼーションの結果を示す図である。
図中、+/+は正常マウスを、+/−はヘテロ欠損マウ
スを示す。FIG. 3 shows the results of genomic Southern hybridization to confirm homologous recombinant mice.
In the figure, + / + indicates a normal mouse and +/− indicates a heterozygous deficient mouse.
【図4】相同組換体マウスを確認するためのPCRの結
果を示す図である。図中、+/+は正常マウスを、+/
−はヘテロ欠損マウスを、−/−はホモ欠損マウスを示
す。FIG. 4 shows the results of PCR for confirming homologous recombinant mice. In the figure, + / + indicates a normal mouse, + / +
− Indicates a hetero-deficient mouse, and − / − indicates a homo-deficient mouse.
【図5】正常マウス及びチミジンホスホリラーゼ発現不
全マウスについてチミジンホスホリラーゼの発現量を示
した図である。図中、+/+は正常マウスを、−/−は
ホモ欠損マウスを示す。FIG. 5 is a diagram showing the expression level of thymidine phosphorylase in a normal mouse and a mouse deficient in thymidine phosphorylase expression. In the figure, + / + indicates a normal mouse and − / − indicates a homo-deficient mouse.
【図6】相同組換体マウスを確認するためのPCRの結
果を示す図である。図中、+/+は正常マウスを、+/
−はヘテロ欠損マウスを、−/−はホモ欠損マウスを示
す。FIG. 6 shows the results of PCR for confirming homologous recombinant mice. In the figure, + / + indicates a normal mouse, + / +
− Indicates a hetero-deficient mouse, and − / − indicates a homo-deficient mouse.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 原口 みさ子 鹿児島県鹿児島市東坂元町2丁目49−11 (72)発明者 福島 正和 埼玉県飯能市本町3丁目8−5−202 (72)発明者 秋山 伸一 鹿児島県鹿児島市皇徳寺台3丁目23−12 Fターム(参考) 4B024 AA01 BA10 CA04 CA07 DA02 EA04 GA11 HA12 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continued front page (72) Inventor Misako Haraguchi 2-49-11 Higashisakamotomachi, Kagoshima City, Kagoshima Prefecture (72) Inventor Masakazu Fukushima 8-5-202, Honmachi 3-chome, Hanno City, Saitama Prefecture (72) Inventor Shinichi Akiyama Kagoshima City, Kagoshima City F-term (reference) 4B024 AA01 BA10 CA04 CA07 DA02 EA04 GA11 HA12
Claims (8)
子の機能が欠損した非ヒト動物及びその子孫。1. A non-human animal deficient in the function of the thymidine phosphorylase gene on the chromosome and its progeny.
DNA配列を欠失させるか、又はいずれかの部位に他の
遺伝子を挿入若しくは置換することによりチミジンホス
ホリラーゼ遺伝子の機能が欠損したものである請求項1
記載の非ヒト動物及びその子孫。2. The function of the thymidine phosphorylase gene is deficient by deleting a part of the DNA sequence of the thymidine phosphorylase gene or inserting or substituting another gene at any site.
The described non-human animal and its progeny.
求項2記載の非ヒト動物及びその子孫。3. The non-human animal and its progeny according to claim 2, wherein the other gene is a marker gene.
伝子である請求項3記載の非ヒト動物及びその子孫。4. The non-human animal and its progeny according to claim 3, wherein the marker gene is a neomycin resistance gene.
第1〜4コーディングエクソンの代りにネオマイシン耐
性遺伝子が挿入されたものである請求項1〜4のいずれ
か1項記載の非ヒト動物及びその子孫。5. The non-human animal according to any one of claims 1 to 4, wherein the neomycin resistance gene is inserted in place of the first to fourth coding exons of the mouse thymidine phosphorylase gene, and the progeny thereof.
ゼ遺伝子の機能が欠損した請求項1〜5のいずれか1項
に記載の非ヒト動物及びその子孫。6. The non-human animal and its progeny according to any one of claims 1 to 5, which further lacks the function of the uridine phosphorylase gene on the chromosome.
のいずれか1項に記載の非ヒト動物及びその子孫。7. The animal according to claim 1, which is a rodent.
The non-human animal and the progeny thereof according to any one of 1.
載の非ヒト動物及びその子孫。8. The non-human animal and its progeny according to claim 7, wherein the rodent is a mouse.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2001294585A JP2003092956A (en) | 2001-09-26 | 2001-09-26 | Animal with insufficient expression of thymidine phosphorylase |
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Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2001169684A (en) * | 1999-12-17 | 2001-06-26 | Taiho Yakuhin Kogyo Kk | Uridine phosphorylase-expression-deficient animal |
-
2001
- 2001-09-26 JP JP2001294585A patent/JP2003092956A/en active Pending
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JP2001169684A (en) * | 1999-12-17 | 2001-06-26 | Taiho Yakuhin Kogyo Kk | Uridine phosphorylase-expression-deficient animal |
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