JP4588447B2 - 過剰増殖および関連疾患に関連するオンコキナーゼ融合ポリペプチド、これをコードする核酸、ならびにこれを検出する方法および同定する方法 - Google Patents
過剰増殖および関連疾患に関連するオンコキナーゼ融合ポリペプチド、これをコードする核酸、ならびにこれを検出する方法および同定する方法 Download PDFInfo
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Description
(発明の分野)
本発明は、過剰増殖疾患に関連する新規のオンコキナーゼ融合ポリペプチド、およびこのような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、このような融合ポリペプチドおよびポリヌクレオチドを同定する方法ならびに特徴付ける方法;このような融合ポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関連する疾患状態を診断する方法;ならびにこのような融合ポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関連する疾患状態を処置するために有用な薬剤を同定するためのスクリーニングアッセイに関する。
遺伝子変異の蓄積が、過剰増殖障害(例えば、癌)の発生および進行の根底にあり、その挙動、生化学、遺伝学、および顕微的な外観において正常細胞と異なる細胞を生じる。重要なタンパク質の発現レベルにおける変化を引き起こすか、またはタンパク質の構造および生物学的活性における変化を引き起こす、DNAにおける変異は、癌の中心になると考えられる。例えば、細胞増殖および細胞生存の調節において重要な役割を果たす遺伝子が、その過剰発現および/または活性化を導く変異を受ける場合、癌が誘発され得る。このような「オンコジーン」は、癌において起こる増殖調節不全に関連する。
過剰増殖障害に関連するオンコキナーゼ(特にチロシンキナーゼ)融合ポリペプチド、およびこれをコードする核酸が、提供される。本発明の融合ポリペプチドの特徴は、これらが、通常はC末端チロシンキナーゼドメインに融合しないN末端ドメインに融合するC末端チロシンキナーゼドメインを含むことであり、ここで、本発明の融合ポリペプチドは、構成的に活性化されたチロシンキナーゼ活性を有する;すなわち、これらは、外因性の因子(例えば、その触媒活性を発現する増殖因子)の存在を必要としない。本発明の融合ポリペプチドは、少なくとも1つの以下の特徴を含むことによりさらに特徴付けられる:(a)C末端ドメインは、第4染色体チロシンキナーゼ由来であること;(b)N末端ドメインは、第4染色体がコードするタンパク質由来である(例えば、これはNM_030917ドメインである)こと;および(c)融合タンパク質は、転座事象から生じたものではないこと(すなわち、異なった染色体間のDNAの交換によって生じない);特定の実施形態において、これらの3つ全てを含む2つ以上の特徴が、本発明の融合ポリペプチドに存在する。本発明の融合ポリペプチドを同定する方法および特徴付ける方法もまた、提供される。本発明のポリペプチド/ポリヌクレオチドの存在を検出すること、および/または本発明のポリペプチド/ポリヌクレオチドを生じる染色体欠失事象に起因する1つ以上のゲノム配列の欠失を検出することにより、疾患状態を診断する方法もまた、提供される。さらに、本発明の融合ポリペプチドの存在に関連する疾患状態の処置において用途を見出す薬剤を同定するためのスクリーニングアッセイが、提供される。その上、本発明の融合ポリペプチドの存在に関連する疾患状態を処置する方法が、提供される。
過剰増殖障害に関連するオンコキナーゼ(特にチロシンキナーゼ)融合ポリペプチド、およびこれをコードする核酸、ならびにこれを検出する方法および同定する方法が、提供される。本発明の融合ポリペプチドの特徴は、これらが、通常はC末端チロシンキナーゼドメインに融合しないN末端ドメインに融合するC末端チロシンキナーゼドメインを含むことであり、ここで、本発明の融合ポリペプチドは、構成的に活性化されたチロシンキナーゼ活性を有する。本発明の融合ポリペプチドは、少なくとも1つの以下の特徴を含むことによりさらに特徴付けられる:(a)C末端ドメインは、第4染色体チロシンキナーゼ由来であること;(b)N末端ドメインは、第4染色体がコードするタンパク質由来である(例えば、NM_030917ドメイン)こと;および(c)融合タンパク質は、転座事象から生じたものではないこと(すなわち、異なった染色体間のDNAの交換によって生じない);特定の実施形態において、これらの3つ全てを含む2つ以上の特徴が、本発明の融合ポリペプチドに存在する。本発明の融合タンパク質を同定する方法および特徴付ける方法もまた、提供される。本発明のポリペプチド/ポリヌクレオチドの存在を検出すること、および/または本発明のポリペプチド/ポリヌクレオチドを生じる染色体欠失事象に起因する1つ以上のゲノム配列の欠失を検出することにより、疾患状態を診断する方法もまた、提供される。さらに、本発明の融合ポリペプチドの存在に関連する疾患状態の処置において用途を見出す薬剤を同定するためのスクリーニングアッセイが、提供される。その上、本発明の融合ポリペプチドの存在に関連する疾患状態を処置する方法が、提供される。
上で要約したように、本発明は、構成的チロシンキナーゼ活性を示すオンコキナーゼ(特にチロシンキナーゼ)融合タンパク質(すなわち、構成的活性キナーゼ融合ポリペプチド)を提供する。構成的に活性なキナーゼ活性とは、Scienceら,(1998)279:577−580に記載のアッセイを用いて決定されるように、細胞内条件下で「常にオンである」キナーゼ活性を意味する。
(1)これらが、C末端第4染色体チロシンキナーゼドメイン(すなわち、第4染色体上に見出されるコード配列によってコードされる、第4染色体がコードするチロシンキナーゼ)を有すること;
(2)これらが、第4染色体タンパク質のN末端ドメイン(すなわち、第4染色体上に見出されるコード配列によってコードされる、第4染色体がコードするタンパク質)(例えば、NM_030917)を有すること;および
(3)これらが、異なった染色体間の遺伝情報の交換に関する転座事象から生じないこと。特定の実施形態において、融合ポリペプチドは、上記の特徴の少なくとも2つを含み、そしてこれらの特定の実施形態において、融合ペプチドは、上記の特徴の3つ全てを含む(例えば、C末端ドメインおよびN末端ドメインの両方が、第4染色体がコードするタンパク質に由来する)。
本発明の融合ポリペプチドおよび(上述のように)そのフラグメントなどをコードする核酸組成物もまた、提供される。特に、本発明のポリペプチドおよびそのフラグメントまたはホモログをコードする核酸組成物が、提供される。「核酸組成物」とは、本発明に従い、融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド塩基の配列を含む組成物(すなわち、本発明の融合ポリペプチドをコードするmRNAに転写されることが可能なゲノムDNAの領域、本発明の融合タンパク質をコードしその合成に導くmRNA、mRNAの逆転写に由来するcDNAなど)を意味する。特定の目的の核酸としては、本明細書中で配列番号05;配列番号06;配列番号07および配列番号08として同定された核酸が挙げられる。また、この用語には、本明細書中で具体的に開示された核酸(例えば、配列番号05;配列番号06;配列番号07および配列番号08)に相同であるか、実質的に類似するかまたは同一である核酸を包含し、ここで配列類似性は、BRAST機能性比較(National Center for Biotechnologyからオンラインで提供される)を用いて決定される(初期設定を用いる)。
本発明の融合タンパク質は、任意の簡便なプロトコールを使用して得られ得る。このように、これらは、天然に存在する供給源から得られ得るか、または組換え的に産生され得る。本発明のタンパク質の天然に存在する供給源としては、組織および部分/画分が挙げられ、細胞、細胞株およびその画分(例えば、抽出物、ホモジネートなど)を含み、これは所望のタンパク質が発現する細胞を含む。
(i)細菌
細菌における発現系としては、
酵母における発現系としては、
昆虫における異種遺伝子の発現は、
哺乳動物発現は、
本発明により、サンプル(例えば、細胞、組織または目的の他のサンプル)においてオンコ−チロシンキナーゼ融合タンパク質を同定および特徴付ける方法もまた、提供される。このような方法において、オンコ−チロシンキナーゼ融合タンパク質は、目的のサンプルの第1スクリーニングによって同定され、サンプル中に何らかのオンコ−チロシンキナーゼ融合タンパク質が存在するか否かが決定される。サンプルをスクリーニングするために、チロシン−リン酸化タンパク質が、代表的にこのサンプルの残りの構成成分から最初に分離され、サンプル誘導化チロシンリン酸化タンパク質の集団を生成する。同サンプルにおける残りの構成成分からのチロシン−キナーゼ融合タンパク質の分離または単離は、任意の簡便なプロトコール(例えば、抗ホスホチロシン抗体を用いた免疫沈降)を用いて達成され得る。次に、得られたサンプル誘導化チロシンリン酸化タンパク質の集団の構成メンバーを、2つ以上の異なったタンパク質由来のドメインの存在について評価する。言い換えれば、単離されたチロシンリン酸化タンパク質の集団における1つ以上の異なったタンパク質が評価され、これが2つ以上の異なったタンパク質由来のドメインを含むか否かを決定される。この評価工程は、任意の簡便なプロトコールを用いて達成され得る。1つの代表的な実施形態において、チロシンリン酸化タンパク質の集団は、SDS−PAGE、2次元IE/PAGE、高性能液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動などを用いて、分離されるか、またはその構成タンパク質に分画される。次に、構成タンパク質は、例えばトリプシンのようなエンドプロテイナーゼを用いたタンパク質溶解に供することにより、小さなサイズのペプチドに切断される。次いで、生じたペプチドは、例えばミクロボア(microbore)キャピラリー電気泳動、高性能液体クロマトグラフィー、または質量分析を用いて分離または分画される。次いで、単離したかまたは分画した、生じたペプチドを、例えば、自動化Edman分解または質量分析を用いて配列決定する。次いで、生じた配列を、観察されたペプチドの配列と公知のペプチド配列またはサンプルが得られた生物において発現されるタンパク質から予測されたペプチド配列とで比較する。次に、構成タンパク質が2つの異なったタンパク質由来のタンパク質溶解ペプチド(例えば、遺伝子NM_030917によってコードされるタンパク質のN末端ドメイン由来のペプチドおよびPDGFRαのC末端ドメイン由来のペプチド)を提供するように、決定を行う。この様式において、オンコ−チロシンキナーゼ融合タンパク質について目的のサンプルをスクリーニングする。
本発明の融合タンパク質およびそのホモログに結合する抗体もまた、提供される。適切な抗体は、宿主動物をこの融合タンパク質の全てまたは一部を含むペプチドで免疫化することにより、得られる。適切な宿主動物としては、ラット、ヒツジ、ヤギ、ハムスター、ウサギなどが挙げられる。タンパク質免疫原の起源は、マウス、ラット、サルなどであり得るが、多くの実施形態において、ヒトである。宿主動物は、一般に、免疫原と異なった種である(例えば、ウサギを免疫化するためにヒトタンパク質を用いるなど)。
融合タンパク質活性(またはその非存在にさえ)関連する疾患状態(例えば、下記に列挙される疾患状態)を、例えば、目的の生物学的サンプル中の融合タンパク質レベルまたは遺伝子/コード配列の存在および/もしくは発現レベルを検出/観察することに基づいて、診断する方法、ならびに/あるいは目的のサンプル中の1つ以上の核酸(好ましくはゲノム)配列の欠失を検出する方法もまた、提供され、この欠失は、本ポリペプチド/ポリヌクレオチドを生じる染色体欠失事象から生じる。
本発明によってまた提供されるのは、本融合タンパク質の活性を調節(例えば、阻害または増強)する薬剤を同定するためのスクリーニングプロトコルおよびアッセイである。従って、このスクリーニングアッセイは、本融合タンパク質のキナーゼ活性を調節(例えば、阻害または増強)する薬剤の同定を提供するアッセイである。
融合タンパク質機能のインビトロモデルが、提供される。このインビトロモデルは、無細胞モデルであっても、細胞を使用してもよい。特に興味深いのは、融合タンパク質キナーゼ活性のモデルである。
融合タンパク質機能の種々の異なるインビボモデルがまた、本発明により提供され、これは、本発明のスクリーニングアッセイに用いられ得る。目的のインビボモデルは、目的の融合タンパク質をコードする発現カセットを含む遺伝子操作した細胞を含む。多細胞インビボモデル(例えば、以下に記載するトランスジェニック動物)もまた、本発明のスクリーニングアッセイの目的である。
1)液体腫瘍細胞株の、免疫無防備状態の宿主動物(例えば、NOD/SCIDマウス)への皮下注射。液体腫瘍であるが、腫瘍細胞は、免疫無防備状態の宿主において、皮下に固形腫瘍を形成し得る。一旦固形腫瘍が一定のサイズに達すると、候補薬剤の投与を開始し、候補薬剤の活性が、腫瘍サイズの減少および生存において測定される。
本発明の融合タンパク質の活性を、調節(増強および抑制を含む)する方法がまた、本発明により提供される。従って、融合タンパク質のキナーゼ活性の増加および減少の両方の方法が提供される。多くの実施形態において、このような方法は、融合タンパク質のキナーゼ活性を阻害する方法である。
この方法はまた、標的細胞または細胞のコレクションにおける融合プロテインキナーゼ活性を調節する(例えば、上昇または低下させる、代表的には低下させる)ことが所望される種々の治療適用において用途を見出し、ここで、細胞のコレクションは、動物全体またはその一部(例えば、組織、器官など)であり得る。このように、標的細胞は、宿主動物またはその一部であり得る。このような方法において、融合タンパク質の活性を調節する(例えば、オンコキナーゼ活性を所望に応じて増強するかまたは低下させる)活性薬剤の有効量は、例えば、これらの細胞をこれらの薬剤と接触させること、この薬剤をこの動物に投与すること、などにより、標的細胞に投与される。有効量とは、所望に応じて、標的細胞内の融合タンパク質の活性を調節するために充分な投薬量を意味する。
R1は、4−ピラジニル、1−メチル−1H−ピロリル、アミノ置換フェニルもしくはアミノ−低級アルキル置換フェニル(ここで、このアミノ基は、各場合において、遊離であるか、アルキル化もしくはアシル化されている)、5員環炭素原子に結合した1H−インドリルもしくは1H−イミダゾリル、または環炭素原子に結合し、かつ窒素原子が置換されていないかもしくは酸素によって窒素原子が置換されている、非置換ピリジルもしくは低級アルキル置換ピリジルである。
−N(R9)−C(=X)−(Y)k−R10(II)
ここで、
R9は、水素または低級アルキルであり、
Xは、オキソ(O)、チオ(S)、イミノ(NH)、N−低級アルキル−イミノ、ヒドロキシイミノ(hydroximino)またはO−低級アルキル−ヒドロキシイミノであり、
Yは、酸素または基NHであり、
kは、0または1であり、そして
R10は、少なくとも5個の炭素原子を有する脂肪族ラジカル、または芳香族ラジカル、芳香族−脂肪族ラジカル、脂環式ラジカル、脂環式−脂肪族ラジカル、複素環式ラジカルもしくは複素環式−脂肪族ラジカルであり、
そして残りのラジカルR4、R5、R6、R7およびR8は、他とは各々独立して、水素、置換されていないかもしくは遊離アミノもしくはアルキル化アミノ、ピペラジニル、ピペリジニル、ピロリジニルもしくはモルホリニルによって置換された低級アルキル、または低級アルカノイル、トリフルオロメチル、遊離の、エーテル化もしくはエステル化されたヒドロキシ、遊離の、アルキル化もしくはアシル化されたアミノ、または遊離のもしくはエステル化されたカルボキシ、および少なくとも1つの塩形成基を有するこのような化合物の塩ある。
1−メチル−1H−ピロリルは、好ましくは、1−メチル−1H−ピロール−2−イルまたは1−メチル−1H−ピロール−3−イルである。
(i)R13は、水素原子またはC1−4アルキル基を表し;そしてR14は、式−A1−NR17R18の基を表し、ここで、R17およびR18の各々は、独立して、水素原子またはC1−4アルキル基を表し、そしてA1は、(CH2)m’、(CH2)n’−A2−(CH2)p’または(CH2CH2O)q’CH2CH2を表し、ここで、m’は、2〜10の整数であり、n’およびp’の各々は、1〜6の整数であり、A2は、CH=CH、フェニレン、ビフェニレン、シクロヘキシレンまたはピペラジニレンであり、そしてq’は、1、2または3であるか;
(ii)R13およびR14は、−A3−NR19−A4−を一緒になって表し、ここで、A3およびA4の各々が、独立して、(CH2)r’または(CH2CH2O)s’CH2CH2を表し、ここで、rは、2〜6の整数であり、s’は、1、2または3であり、そしてR19は、水素原子またはC1−4アルキル基を表すか;
(iii)R13およびR14は、結合している窒素原子と一緒になって、ピペリジニル基を表し、このピペリジニル基は、4位に式−A5−R20の置換基を保有し、ここで、A5は、C1−4アルキレンを表し、そしてR20は、ピペリジン−4−イルを表すか;または
(iv)R13およびR14は、結合している窒素原子と一緒になって、ピロリジニル基、ピペリジニル基またはモルホリノ基を表し;そして
R15およびR16は各々、独立して、水素原子、ハロゲン原子、C1−4アルキル基、C1−4アルコキシ基、置換されていないかまたはハロゲン原子、C1−4アルキル基およびC1−4アルコキシ基から独立して選択される1個もしくは2個の置換基によって置換されているフェニル基、式R21S(O)2NR22−の基、式R23N(R24)S(O)2−の基、式R25C(O)N(R26)−の基または式R27N(R28)C(O)−の基を表し、ここで、R21、R23、R25およびR27の各々は、独立して、C1−4アルキル基またはフェニル基(これは、置換されていないかまたはハロゲン原子、C1−4アルキル基およびC1−4アルコキシ基から独立して選択される1個もしくは2個の置換基によって置換されている)を表し、R22、R24、R26およびR28の各々は、独立して、水素原子またはC1−4アルキル基を表す。
R29は、−CN、−X、−CX3、−R33、−CO2R33、−SO2R33、直鎖または分枝鎖である−O−C1−8アルキル、−O−フェニル、−O−ナフチル、−O−インドリル、および−O−イソキノリニルからなる群より選択され、ここで、Xは、ハロゲンであり、そしてR33は、水素または直鎖もしくは分枝鎖であるC1−8アルキルであり、
R30およびR32は、各々、独立して、−O−CH3、−O−CH2−CH3、−O−CH2−CH=CH2、−O−CH2−C≡CH、−O(CH2)−SO2−R33、−O−CH2−CH(R34)CH2−R31および−O(−CH2)n”−R31からなる群より選択され、ここで、R34は、−OH、−X、または直鎖もしくは分枝鎖であるC1−8アルキルであり、n”は、2または3であり、そして
R31は、−OH、−O−CH3、−O−CH2−CH3、−NH2、−N(−CH3)2、−NH−CH2−フェニル、−NH−フェニル、−CN、−C(=NH)−NH2、−NH−C(=NH)−NH2、チアゾリル、オキサゾリル、ピロリジニル、4,4−ジフルオロピペリジニル、3,3−ジフルオロピペリジニル、3,3−ジフルオロピロリジニル、モルホリニル、ピペリジニル、イミダゾリル、1,2,3−トリアゾリル、メチルピペリジニル、チオモルホリニル、1,1−ジオキシド−チオモルホリニル、−O−4−ピリジニル、1H−テトラゾリル、ピペラジニル、および4−メチルピペラジニルからなる群より選択される。
R35は、水素、ハロ、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ脂環式、ヒドロキシ、アルコキシ、−C(O)R48、−NR46R47、−(CH2)r*R49および−C(O)NR42R43からなる群より選択され;
R36は、水素、ハロ、アルキル、トリハロメチル、ヒドロキシ、アルコキシ、シアノ、−NR46R47、−NR46C(O)R47、−C(O)R48、アリール、ヘテロアリール、および−S(O)2NR46R47からなる群より選択され;
R37は、水素、ハロ、アルキル、トリハロメチル、ヒドロキシ、アルコキシ、−C(O)R48、−NR46R47、アリール、ヘテロアリール、−NR46S(O)2R47、−S(O)2NR46R47、−NR46C(O)R47、−NR46C(O)OR47、および−S(O)2R53からなる群より選択され、ここで、R53は、アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたはヘテロアラルキルであり;
R38は、水素、ハロ、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、および−NR46R47からなる群より選択され;
R39は、水素、アルキルおよび−C(O)R40からなる群より選択され;
R41は、水素、アルキル、アリール、ヘテロアリール、−C(O)R50および−C(O)R40からなる群より選択され;
R42およびR43は、水素、アルキルおよびアリールからなる群より独立して選択され;
R40は、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、−N(R44)(CH2)n*R45、および−NR46R47からなる群より選択され;
R44は、水素およびアルキルからなる群より選択され;
R45は、−NR46R47、ヒドロキシ、−C(O)R48、アリール、ヘテロアリール、−N+(O−)R46R47、−N(OH)R46、および−NHC(O)Raからなる群より選択され、ここで、Raは、置換されていないアルキル、ハロアルキルまたはアラルキルであり;
R46およびR47は、水素、アルキル、ならびにヒドロキシアルキルアミノ、シアノアルキル、シクロアルキル、アリール、およびヘテロアリールで置換された低級アルキルからなる群より独立して選択されるか;または
R46およびR47は結合して、ヘテロシクロ基を形成し得;
R48は、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、およびアリールオキシからなる群より選択され;
R49は、ヒドロキシ、−C(O)R48、−NR46R47および−C(O)NR46R47からなる群より選択され;
R50は、アルキル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され;そして
n*およびr*は、独立して、1、2、3、または4である。
本ポリペプチド組成物および核酸は、種々のさらなる適用における用途を見出す。本ポリペプチド組成物および核酸が用途を見出す適用としては、(a)ホモログの同定;(b)発現調節因子の同定;(c)ハイブリダイゼーション適用(例えば、PCR)におけるプローブおよびプライマーとしての用途;(d)生物学的検体における発現パターンの同定、などが挙げられる。
ホモログは、多くの方法のうちのいずれかによって同定される。提供されるcDNAのフラグメントは、目的の標的生物からのcDNAライブラリーに対するハイブリダイゼーションプローブとして使用され得、ここで、低ストリンジェンシー条件が使用される。このプローブは、長いフラグメントであり得るか、または1以上の短い縮重プライマーであり得る。配列類似性を有する核酸は、低ストリージェンシー条件(例えば、50℃で、6×SSC(0.9M塩化ナトリウム/0.09Mクエン酸ナトリウム))下のハイブリダイゼーションによって検出され、そして、1×SSC(0.15M塩化ナトリウム/0.015クエン酸ナトリウム)で55℃にて洗浄に供した場合は結合したままである。配列同一性は、ストリンジェントな条件((例えば、50℃以上、かつ、0.1×SSC(15mM塩化ナトリウム/01.5Mクエン酸ナトリウム))下でのハイブリダイゼーションによって決定され得る。提供された配列に対して実質的な同一性をもつ領域を有する核酸(例えば、対立遺伝子改変体、その遺伝子の遺伝子操作による改変体など)は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、その提供された配列に結合する。DNA配列についてのプローブ(特に標識されたプローブ)を使用することによって、相同性遺伝子または関連する遺伝子を単離し得る。
あるいは、実験的に規定した系における発現を変化させる効果を決定するために、変異は、プロモーター領域に導入され得る。転写因子の結合に関与する特定のDNAモチーフを同定する方法(例えば、公知の結合モチーフに対する配列類似性、ゲル遅延研究など)は、当該分野で公知である。例えば、Blackwellら(1995)、Mol.Med.1:194〜205;Mortlockら(1996)、Genome Res.6:327〜33ならびにJoulinおよびRichard−Foy(1995)、Eur.J.Biochem.232:620〜626を参照のこと。
小さなDNAフラグメントは、PCRのプライマーとして、ハイブリダーゼーションスクリーニングプローブとして、などで有用である。より大きなDNAフラグメント(すなわち、100ntより大きい)は、前の節で記載されるとおりコードされるポリペプチドの産生のために有用である。増幅反応(例えば、PCR)での使用のために、一対のプライマーが使用される。プライマー配列の正確な組成は、本発明に対して重要ではないが、大部分の適用について、プライマーは、当該分野で公知であるように、ストリンジェントな条件下で対象の配列にハイブリダイズする。少なくとも約50ntの増幅産物、好ましくは少なくとも約100ntの増幅産物を産生する一対のプライマーを選択することが好ましい。プライマー配列の選択のためのアルゴリズムは、一般的に公知であり、そして、市販のソフトウェアパッケージにおいて利用可能である。増幅プライマーは、DNAの相補鎖にハイブリダイズし、相互に対して伸長を開始する。
DNAはまた、生物学的標本における遺伝子の発現を同定するために使用され得る。特定のヌクレオチド配列(ゲノムDNAまたはRNAなど)の存在に対して、細胞をプローブする様式が、文献中でよく確立されている。簡単にいうと、DNAまたはmRNAは、細胞サンプルから単離される。mRNAは、相補的なDNA鎖を形成するための逆転写酵素を使用して、RT−PCRによって増幅され得、その後、対象のDNA配列に特異的なプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応増幅が行われ得る。あるいは、mRNAサンプルは、ゲル電気泳動により分離され、適切な支持体(例えば、ニトロセルロース、ナイロンなど)に移され、次いで、プローブとしての対象DNAのフラグメントでプローブされる。他の技術(例えば、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ、インサイチュハイブリダイゼーションおよび固体チップ上に配列されたDNAプローブへのハイブリダイゼーション)もまた、用途を見出し得る。対象の配列へハイブリダイズするmRNAのの検出は、サンプル中の遺伝子発現を示す。
遺伝子配列(隣接プロモーター領域およびコード領域を含む)は、当該分野で公知の種々の方法で変異されて、プロモーターの強度、コードされるタンパク質の配列などにおける目的とする変化を生じ得る。このような変異のDNA配列またはタンパク質産物は、通常、本明細書に提供される配列に実質的に類似している。すなわち、それぞれ、少なくとも1個のヌクレオチドもしくはアミノ酸が異なり、そして、少なくとも2個以上(例えば、5個、10個、20個またはそれより多い)ヌクレオチドもしくはアミノ酸が異なり得る。配列の変化は、置換、挿入、欠失またはこれらの組合せであり得る。欠失はさらに、より大きな変化(例えば、ドメインまたはエキソンの欠失)を含み得る。他の目的とする改変としては、(例えば、FLAGシステム、HAなどを用いた)エピトープタグ化が挙げられる。細胞内局在化の研究については、グリーン蛍光タンパク質(GFP)との融合タンパク質も使用され得る。
(A.化合物)
イマチニブメシレートを、Geevec(登録商標)のカプセルから抽出した。バタラニブを、公開された手順に従って調製した(Boldら、J.Med.Chem.(2000)43:2310〜2323)。THRX−165724は、米国特許出願番号10/327,385号の実施例1aに記載されるように、ピペラジンをSU6668(Sunら、J.Med.Chem.(1999)42:5120〜5130)のカルボキシル基に結合させることによって調製した。
RNeasyキット(Qiagen)を使用して、5×107個のEOL−1細胞から総RNAを単離した。PDGFRαの3’非翻訳領域(5’−tccgcattgcaataaagtgg−3’(配列番号13(塩基3478〜3459;登録番号M22734由来)))において開始する逆オリゴヌクレオチドおよびThermoscript RT−PCR System(Gibco−BRL)を使用して、20μlの容積で、100ngの総RNAを用いてcDNAを作製した。2μlのcDNA溶液は、100μLのPCR反応溶液中で、全長NM_030917−PDGFRα(前方向オリゴ:5’−gttgcgctcggggcggccat−3’(配列番号14)(塩基150〜169由来;登録番号NM_030917)、逆方向オリゴ:5’−ttctgaacgggatccagagg−3’(配列番号15)(塩基3456〜3437由来;登録番号M22734))を増幅するためのテンプレートとしての役目を果たした。PCRフラグメントを、アガロースゲル電気泳動によって単離し、TOPO−PCRベクター(Invitrogen)中にクローニングし、配列決定した。2つの観察された選択的スプライシングをされたエキソンを欠く、スプライス改変体の誤りのない配列を、哺乳動物の発現ベクターpcDNA3.1(+)(Invitrogen)にクローニングした。ランダム六量体または特定のPDGFRαプライマー5’−ggatgtcggaatatttagaa−3’(配列番号16)および5’−gcagaaaggtactgcctttc−3’(配列番号17)を使用して、患者のcDNAを上記のように産生した。患者のcDNAを、NM_030917−PDGFRα融合転写物に関して分析するために、以下のプライマー対を使用した:NM_030917前方向:5’−aattatgggtttaatgaag−3’(配列番号18)(塩基651〜699由来;登録番号NM_030917)、PDGFRα逆方向:5’−aactttcatgacaggttgg−3’(配列番号19)(塩基2000〜1982由来;登録番号M22734)。EOL−1におけるゲノム融合点ならびに2人の患者のPCR分析については、PDGFRαエキソン12の3’を開始するオリゴヌクレオチドを、逆向きで、特定の前方向プライマー:PDGFRαゲノム逆方向:5’−ttcttactaagcacaagctcagatc−3’(配列番号20)(塩基13912〜13888由来;登録番号AC098587);EOL−1および患者3のゲノム前方向:5’−aagcatctaattaggtgaaactg−3’(配列番号20)(塩基48554〜48576由来;登録番号NT_022853)と組み合わせた。患者1のゲノム前方向:5’−cagggaagaactggaaactc−3’(配列番号22)(塩基22466〜22485;登録番号NT_022853)。
EOL−1細胞株およびBaF3細胞株を、DSMZ(Braunschweig、Germany)から入手した。EOL−1細胞株およびBaF3細胞株のための基本培養培地は、10%FBS、100U/mlペニシリンおよび100U/mlストレプトマイシンを補充したRPMI1640(Gibco−BRL)であった。BaF3細胞のための培地はまた、1ng/ml IL−3(Biosource International)が補充された。NM_030917−PDGFRαを発現するBaF3細胞株を、300mV/960μFで、BaF3細胞のエレクトロポレーションによって作製した。エレクトロポレーション後、BaF3細胞を、IL−3を含有する培地に48時間維持し、1mg/ml G418を添加したIL−3含有培地で10日間選択し、その後、限界希釈によってサブクローニングした。
細胞の生存率を、MTTアッセイ(Roche)を使用するテトラゾリウム塩還元によって評価した。96ウェルプレート中で、化合物の連続希釈物の存在下で、5×104細胞/ウェルをプレートした。MTT基質を添加する前に、細胞を72時間インキュベートした。
PDGFRα/βに対する抗体およびホスホチロシンに対する抗体(4G10)をUpstate Biotechnologyから購入した。各免疫沈降については、1×107個の細胞を、0.75mlの改変RIPA緩衝液(50mM Tris−HCl pH7.4、1% NP−40、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM Na3VO4、プロテアーゼインヒビター混液(Roche))に溶解させた。溶解物を、適切な抗体およびプロテインGビーズ(Sigma)とともに、一晩4℃でインキュベートした。免疫複合体を遠心分離により回収し、RIPA緩衝液で洗浄し、サンプル緩衝液中で煮沸し、SDS−PAGEにより分解した。タンパク質をPVDF膜(Invitrogen)に移し、PBS/0.1% Tween/3% BSAでブロックし、その後、室温で3時間、特定の抗体でプローブした。その後、ブロットをPBS/0.1% Tweenで洗浄した。特異的抗体結合を、二次抗体を結合した西洋ワサビペルオキシダーゼで検出し、その後、増強した化学発光ECL(Amersham)を行い、フィルムに曝露した。第二の抗体でブロットを再プローブするために、一次抗体を代表的に、ImmunoPure IgG Elution Buffer(Pierce)でストリップした。
細胞(1×107個)を、示した濃度の薬物を含有する3mlの培地中で、1時間インキュベートした。その後、細胞を溶解し、適切な抗体で免疫沈降した。その後、SDS−PAGEに続いて、抗ホスホチロシン抗体4G10を用いた免疫ブロッティングを行なった。
この研究は、Proteomic Research Services,Inc.(RPS、Ann Arbor、MI)によって行なわれた。1×108個のEOL−1細胞由来のチロシンリンタンパク質を、抗体4G10によって結合したプロテインG免疫親和性樹脂50μlの形態で、サンプルをPRSに提供した。タンパク質をSDS−PAGEにより分画し、SYPROルビーで染色することにより可視化した。4G10を使用するウエスタンブロッティングにより可視化した対のレーンのオーバーレイとともに、SYPRO染色レーンのオーバーレイに基づいて、切り出しのためにプラグを選択した。プラグを、トリプシン(ProGest)を用いたゲル内消化に供し、その上清の一部を、マトリックス支援レーザー脱着イオン化質量分析(MALDI/MS)による分析に使用した。MALDI/MSデータを、Applied Biosystems Voyager DE−STR機器によって取得し、観察されたm/z値を、NCBInrデータベースを照会するソフトウェアパッケージProFound(Proteometrics製)によるペプチド質量フィンガープリントについての検索に提示した。MALDI/MS分析が結論に到達しない場合、サンプルを、ナノ液体クロマトグラフィーにより分析し、その後、Micromass Q−Tof2機器により2次元質量分析(LC/MS/MS)を行なった。MS/MSデータを、Matrix Science製の検索エンジンMascot(www.matrixscience.com)を使用して検索した。
イマチニブメシレート(STI−571/NovartisまたはGleevecTM)(本明細書これ以降「イマチニブ」)を、種々のCML細胞株およびAML細胞株について試験した。驚くべきことに、イマチニブが、EOL−1細胞において強力なアポトーシス誘導因子であったことが発見された。EOL−1細胞株は、好酸球増加症候群に続く急性骨髄性(好酸性)白血病を有する33歳男性の末梢血から1984年に樹立された。上記の発見は、4人のHES患者がイマチニブ治療に十分応答したという報告によってその後確認された。Schallerら、Med.Gen.Med.(2001年9月7日)3:9;およびLancet(2002年5月4日);359(9317):1577−8を参照のこと。
1.ヌクレオリン。ヌクレオリンは、豊富に存在し、リボソームのアセンブリに関与する105kDaのリンタンパク質である。これらの既知の特徴に基づいて、ヌクレオリンは、おそらくイマチニブにとって標的ではないことが決定された。
1.NM_030917およびPDGFRαは、PDGFRαのキナーゼドメインを含む細胞内ドメインがNM_030917のN末端に融合される融合転写物を形成する。
正常な第4染色体上のNM_030917およびPDGFRαの融合エキソンに隣接するプライマー対を設計した。ゲノムDNAを用いて、EOL−1細胞ならびに他の白血病細胞株におけるエキソンを、PCRプロトコルにおいて設計されたプライマー対を用いて増幅した。融合NM_030917エキソンの5’プライマーが、融合PDGFRαエキソンの3’プライマーと結合された場合、試験した他の任意の細胞株ではなく、EOL−1ゲノムDNA由来の1100塩基対のフラグメントはPCRプロトコルにおいて得られた。このフラグメントは、ゲノム組換え点を含み、そして変異第4染色体に由来する。1100塩基対フラグメントを配列決定し、ゲノム組換え点を特徴付けた。以下の観察を行った:
1.組換え点は、第4染色体上の約100万塩基対が欠失している。これは、NM_030917におけるイントロンの、PDGFRαにおけるエキソン12の中央への融合を誘発する。
ウェスタンブロット分析を使用して、細胞性NM_030917−PDGFRα自己リン酸化を阻害する際のTHRX−165724(特許出願番号10/327,385の実施例1に記載される)およびバタラニブ(vatalanib)(PTK787)(米国特許第6,258,812 B1の実施例1〜4に記載される)の効力を、評価した。これらのキナーゼインヒビターの両方が、このアッセイにおいて活性を有することが見出された。並行して、両方のインヒビターを、EOL−1細胞においてアポトーシスを誘導するそれらの能力について試験した。2つのアッセイにおいて得られたIC50を、以下の表に列挙する。
多くの癌において見出されるような変異的活性化チロシンキナーゼは、マウスミエロイド細胞株BaF3からインターロイキン3独立(independence)形質転換し得る。NM_030917−PDGFRαが、細胞を形質転換する能力を有するかどうかを決定するために、BaF3細胞株を確立した。EOL−1由来のNM_030917−PDGFRαを発現するBaF3細胞が、IL−3独立であることが見出された。これらの細胞の融合タンパク質は、恒常的にリン酸化され、そしてリン酸化は、30nMのIC50(EOL−1において観察されるのと同じ値)であるイマチニブによって阻害された。イミタニブ、バタラニブおよびTHRX−165724での阻害は、EOL−1における薬物の潜在性に類似するIC50を有するBaF3 NM_030917−PDGFRα細胞の生存度の減少をもたらした。インヒビターの効果は、IL−3の存在で克服された。融合遺伝子の発現が、EOL−1細胞の生存度を阻害したこれらと類似の濃度で、3つの薬物によって阻害されたBaF3細胞に、IL−3独立増殖をもたらしたので、NM_030917−PDGFRαはまた、EOL−1におけるイマチニブ、バタラニブおよびTHRX−165724についての標的であるようである。PDGFRαインヒビターの存在下でのこれらのBaF3細胞の生存度は、外来性IL−3によって維持され得た。
NM_030917−PDGFRα融合が、HES患者に存在したかどうかを決定するために、HESと診断を下された4人の患者から血液細胞を得た。患者1および2を、イマチニブで処置した。患者1は処置に応答したが、患者2は応答しなかった。完全な血液学的寛解を示した後、患者1は再発し、そして死亡した。この患者は、CELの診断の原因となる複数のクローナル細胞遺伝学的異常を有した。ゲノムDNAならびに総RNAおよび総cDNAを、患者1を除いて、全ての患者細胞から調製した(患者1はゲノムDNAのみをイマチニブ処置の前の細胞から得たが、RNAおよびcDNAは得られなかった)。cDNAサンプルを、EOL−1細胞において決定された融合点をスパニングするプライマー対を用いてPCRに供した。患者1および3からにサンプルにおいて、フラグメントが、NM_030917とPDGFRαとの間にインフレームで融合転写物を構成したcDNAから増幅され得た(図3A)。NM_030917−PDGFRα融合物は、患者2および4において検出されなかった。患者1において、融合転写物は、PDGFRαのエキソン12内でNM_030917のエキソン8を接続する。EOL−1についての類似の適用を使用して、ゲノム破壊点を同定した。患者1において、イントロンの破壊は、スプライスアクセプター部位として作用するAGジヌクレオチドであり、その結果、NM_030917中のエキソン8およびPDGFRα中のエキソン12の一部が、融合転写物においてインフレームで融合される(図3B)。患者1におけるNM_030917−PDGFRα融合物が、イマチニブ治療の開始の前および再発の時点で採取された細胞由来のゲノムDNA調製物において検出された。再発の時点で、NM_030917−PDGFRα cDNAの分析は、PDGFRαキナーゼドメインにおける点変異を明らかにした。この変異は、イソロイシンによるスレオニンの置換を生じるPDGFRαにおけるアミノ酸位674に影響する(T674I)。
Claims (11)
- PDGFRα C末端チロシンキナーゼドメインと、Fip1L1のキナーゼ活性化ドメインを含むN末端ドメインとを含む融合ポリペプチドであって、該融合ポリペプチドは、構成的に活性化されたキナーゼ活性を有し、その天然に存在する環境以外で存在し、かつ転座事象の産物ではなく、該キナーゼ活性化ドメインの配列は、
配列番号1の残基1〜272;
配列番号2の残基1〜257;
配列番号3の残基1〜249;
配列番号4の残基1〜234;
配列番号1の残基1〜339;
配列番号2の残基1〜324;
配列番号3の残基1〜316;および
配列番号4の残基1〜301
からなる群より選択される、融合ポリペプチド。 - 前記融合ポリペプチドが、ヒトポリペプチドである、請求項1に記載の融合ポリペプチド。
- 配列番号01、配列番号02、配列番号03および配列番号04から選択される配列と同じであるかまたは少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項1〜2のいずれか1項に記載の融合ポリペプチド。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載の融合ポリペプチドをコードする、その天然に存在する環境以外で存在するポリヌクレオチド。
- 配列番号05、配列番号06、配列番号07および配列番号08ならびにそれらの相補体から選択される配列、または配列番号05、配列番号06、配列番号07および配列番号08ならびにそれらの相補体から選択されるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列と、同一である残基の配列を有する、請求項4に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項4または請求項5に記載のポリヌクレオチドを含む細胞。
- 宿主が過剰増殖性疾患状態に罹患しているか否かの決定にあたって補助する方法であって、該方法は、以下:
請求項1〜3のいずれか1項に記載の融合ポリペプチドまたはそのコード配列を含むヌクレオチドの存在について該宿主から得たサンプルをアッセイし、それによりアッセイ結果を得る工程であって、ここで該アッセイ結果を、該宿主が該過剰増殖性疾患状態に罹患しているか否かを決定するために、利用し得る工程
を包含する、方法。 - 前記アッセイ工程が、前記ポリヌクレオチドの存在について前記サンプルをスクリーニングする工程を包含する、請求項7に記載の方法。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載の融合ポリペプチドの活性を阻害する薬剤を同定する方法であって、該方法は、以下:
該融合ポリペプチドを、試験薬剤と接触させる工程;および
該融合ポリペプチドの活性に対する該試験薬剤の効果があればこれを決定する工程、
を包含する、方法。 - 請求項1〜3のいずれか1項に記載の融合ポリペプチドの、そのコード配列からの発現を阻害する薬剤を同定する方法であって、該方法は、以下:
該コード配列を試験薬剤と接触させる工程;および
該コード配列からの該融合ポリペプチドの該発現に対する該試験薬剤の効果があればこれを決定する工程、
を包含する、方法。 - サンプルにおける請求項1〜3に記載の融合ポリペプチドの存在について該サンプルをスクリーニングする方法であって、該方法は、以下:
(a)該サンプルの残留する成分からチロシンリン酸化タンパク質を分離し、サンプル由来のチロシンリン酸化タンパク質集団を産生する工程;および
(b)該サンプル由来のチロシンリン酸化タンパク質集団の成分メンバーを、前記PDGFRα チロシンキナーゼドメインと、前記Fip1L1のキナーゼ活性化ドメインとの存在について評価する工程、
を包含する、方法。
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