JP4566993B2 - Screening method for pesticides that induce disease resistance and plants used in the method - Google Patents
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Description
本発明は、病害抵抗性を誘導する農薬のスクリーニング方法およびスクリーニングのためのシステム、ならびにその方法に使用される植物体に関する。 The present invention relates to a screening method and system for screening for pesticides that induce disease resistance, and a plant used in the method.
植物の病原菌に対する薬剤としては、代表的には、病原菌に直接の殺菌効果を有する薬剤と、病原菌に対して直接の殺菌効果を示さず、植物の病害抵抗性を誘導する薬剤とが挙げられる。植物の病害抵抗性を誘導する薬剤は、病原菌の耐性菌株の出現の頻度が少ないことから有用ではあるが、病原菌に直接の殺菌効果を有する薬剤と比較してその開発が遅れている。わずかに、イネいもち病防除剤であるオリゼメートの作用成分であるプロベナゾール、セレブロシドＢ、Ｎ−シアノメチル−２−クロロ−イソニコチン酸、２，６−ジクロロ−イソニコチン酸、ベンゾ［１，２，３］チアゾール−７−カルボチオ酸 Ｓ−メチルエステル、４−メチル−［１，２，３］チアゾール−５−カルボン酸（３−クロロ−４−メチル−フェニル）−アミド）、２，２−ジクロロ−３，３−ジメチル−シクロプロパンカルボン酸、Ｎ−（２−クロロ−ピリジン−４−カルボニル）−ベンゼンスルホンアミドなどが植物の病害抵抗性を誘導する薬剤またはその候補として開発されているのみである。 Typically, a drug against a pathogenic fungus of a plant includes a drug having a direct bactericidal effect on the pathogenic fungus and a drug that does not show a direct bactericidal effect on the pathogenic fungus and induces plant disease resistance. Drugs that induce plant disease resistance are useful because the frequency of resistant strains of pathogenic bacteria is low, but their development is delayed compared to drugs that have a direct bactericidal effect on pathogenic bacteria. Slightly, probenazole, cerebroside B, N-cyanomethyl-2-chloro-isonicotinic acid, 2,6-dichloro-isonicotinic acid, benzo [1,2,3, which are active ingredients of oryzate, a rice blast control agent Thiazole-7-carbothioic acid S-methyl ester, 4-methyl- [1,2,3] thiazole-5-carboxylic acid (3-chloro-4-methyl-phenyl) -amide), 2,2-dichloro- 3,3-Dimethyl-cyclopropanecarboxylic acid, N- (2-chloro-pyridine-4-carbonyl) -benzenesulfonamide, etc. are only developed as agents or their candidates for inducing plant disease resistance. .
植物の病害抵抗性を誘導する薬剤の開発が遅れている原因の１つには、そのスクリーニング方法の開発が遅れている点にある。従って、簡便かつ迅速な植物の病害抵抗性を誘導する薬剤のスクリーニング方法の開発が求められている。 One of the causes of the delay in the development of drugs that induce plant disease resistance is the delay in the development of screening methods. Therefore, there is a demand for the development of a screening method for drugs that induce plant disease resistance in a simple and rapid manner.
病害抵抗性を誘導する薬剤によって発現が誘導される遺伝子のプロモーターを用いて、候補薬剤をスクリーニングする場合には、適切なプロモーターを選択することが重要である。例えば、プロベナゾールおよびＮ−シアノメチル−２−クロロ−イソニコチン酸の両薬剤に応答性の遺伝子プロモーターとしては、ＰＢＺ１遺伝子のプロモーターが公知である（特開平９−２７０）。しかし、これら薬剤に応答性のプロモーターを病害抵抗性を誘導する薬剤のスクリーニング方法に用いた例はない。なぜなら、病害抵抗性を誘導する薬剤のスクリーニングにおいては、培養細胞レベルではなく、植物体においてそのプロモーターの応答性を検証する必要があるものの、従来は、簡便に植物体においてプロモーター活性を決定する方法が確立されていなかったからである。 When a candidate drug is screened using a promoter of a gene whose expression is induced by a drug that induces disease resistance, it is important to select an appropriate promoter. For example, a promoter of the PBZ1 gene is known as a gene promoter responsive to both drugs of probenazole and N-cyanomethyl-2-chloro-isonicotinic acid (Japanese Patent Laid-Open No. 9-270). However, there is no example in which promoters responsive to these drugs are used in screening methods for drugs that induce disease resistance. This is because, in screening for drugs that induce disease resistance, it is necessary to verify the responsiveness of the promoter in the plant body, not at the level of cultured cells. This is because no has been established.
現在まで、植物体での薬剤のスクリーニング方法は確立されておらず、従来公知のプロモーターがどの程度広範な刺激に対して応答性であるかについて、未だ検証されておらず、そのため、従来公知であるプロモーターが、簡便かつ迅速な植物の病害抵抗性を誘導する薬剤のスクリーニングに適用できるか否かは、不明である。従って、病害抵抗性を誘導する薬剤によって発現が誘導される遺伝子のプロモーターを用いて、種々の薬剤に対する応答性を検証することにより、改善された薬剤スクリーニング方法を確立することが必要である。 To date, methods for screening drugs in plant bodies have not been established, and the extent to which a conventionally known promoter is responsive to a wide range of stimuli has not yet been verified. It is unclear whether a promoter can be applied to screening for drugs that induce plant disease resistance in a simple and rapid manner. Therefore, it is necessary to establish an improved drug screening method by verifying responsiveness to various drugs using a promoter of a gene whose expression is induced by a drug that induces disease resistance.
（発明の要旨）
植物において病害抵抗性を誘導する農薬をスクリーニングする方法およびシステム、ならびにその方法に使用される植物体を提供することが、本発明の課題である。
(Summary of the Invention)
It is an object of the present invention to provide a method and system for screening for pesticides that induce disease resistance in plants, and a plant used in the method.
本発明者らは、ａ）植物の病害抵抗性誘導遺伝子の天然のプロモーター；およびｂ）該プロモーターに作動可能に連結された蛍光タンパク質をコードする遺伝子、を含む発現カセットを含むベクターによって形質転換された植物体を得て、その植物体を候補薬剤によって処理し、その蛍光タンパク質の発現量を指標にして、候補薬剤にスクリーニングを行なう方法を開発し、本発明を完成した。 We have transformed with a vector comprising an expression cassette comprising: a) a natural promoter of a plant disease resistance inducing gene; and b) a gene encoding a fluorescent protein operably linked to the promoter. The present invention was completed by developing a method for screening a candidate drug by treating the plant body with a candidate drug and using the expression level of the fluorescent protein as an index.
従って、本発明は、以下を提供する。 Accordingly, the present invention provides the following.
１．病害抵抗性を誘導する農薬をスクリーニングするために使用され得る植物体であって、
ａ）植物の病害抵抗性誘導遺伝子のプロモーター；および
ｂ）該プロモーターに作動可能に連結された、蛍光タンパク質をコードする遺伝子
を含む、発現カセットを含む植物体。
1. A plant that can be used to screen for pesticides that induce disease resistance,
a plant comprising an expression cassette comprising a) a promoter of a plant disease resistance-inducing gene; and b) a gene encoding a fluorescent protein operably linked to the promoter.
２．前記プロモーターが、プロベナゾールにより発現誘導され得るプロモーターである、項目１に記載の植物体。 2. Item 2. The plant according to Item 1, wherein the promoter is a promoter capable of inducing expression with probenazole.
３．前記プロモーターが、配列番号１に記載されるＰＢＺ１遺伝子プロモーター配列を有する、項目２に記載の植物体。 3. Item 3. The plant according to Item 2, wherein the promoter has the PBZ1 gene promoter sequence described in SEQ ID NO: 1.
４．前記プロモーターが、配列番号１に記載されるＰＢＺ１遺伝子プロモーター配列中の、プロベナゾールにより発現誘導され得る配列からなるフラグメントを有する、項目２に記載の植物体。 4). Item 3. The plant according to Item 2, wherein the promoter has a fragment consisting of a sequence capable of inducing expression by probenazole in the PBZ1 gene promoter sequence described in SEQ ID NO: 1.
５．前記プロモーターが、配列番号４に記載されるＤ９遺伝子プロモーター配列を有する、項目２に記載の植物体。 5. Item 3. The plant according to Item 2, wherein the promoter has a D9 gene promoter sequence described in SEQ ID NO: 4.
６．前記プロモーターが、配列番号４に記載されるＤ９遺伝子プロモーター配列中の、プロベナゾールにより発現誘導され得る配列からなるフラグメントを有する、項目２に記載の植物体。 6). Item 3. The plant according to Item 2, wherein the promoter has a fragment consisting of a sequence that can be induced to be expressed by probenazole in the D9 gene promoter sequence described in SEQ ID NO: 4.
７．前記プロモーターが、配列番号６に記載されるＲａｃ１遺伝子プロモーター配列を有する、項目２に記載の植物体。 7). Item 3. The plant according to Item 2, wherein the promoter has the Racl gene promoter sequence described in SEQ ID NO: 6.
８．前記プロモーターが、配列番号６に記載されるＲａｃ１遺伝子プロモーター配列中の、プロベナゾールにより発現誘導され得る配列からなるフラグメントを有する、項目２に記載の植物体。 8). Item 3. The plant according to Item 2, wherein the promoter has a fragment consisting of a sequence that can be expressed and induced by probenazole in the Racl gene promoter sequence described in SEQ ID NO: 6.
９．病害抵抗性を誘導する農薬をスクリーニングするために使用され得る植物体であって、
ａ）配列番号１に記載されるＰＢＺ１遺伝子プロモーター配列またはそのフラグメントを有する第１のプロモーター、
ｂ）該第１のプロモーターに作動可能に連結された、第１の蛍光タンパク質をコードする遺伝子、
ｃ）配列番号４に記載されるＤ９遺伝子プロモーター配列またはそのフラグメントを有する第１のプロモーター、ならびに
ｄ）該第２のプロモーターに作動可能に連結された、第２の蛍光タンパク質をコードする遺伝子、
を含む、発現カセットを含む植物体。
9. A plant that can be used to screen for pesticides that induce disease resistance,
a) a first promoter having the PBZ1 gene promoter sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or a fragment thereof,
b) a gene encoding a first fluorescent protein operably linked to the first promoter;
c) a first promoter having the D9 gene promoter sequence set forth in SEQ ID NO: 4 or a fragment thereof, and d) a gene encoding a second fluorescent protein operably linked to the second promoter,
A plant containing an expression cassette.
１０．前記蛍光タンパク質をコードする遺伝子が、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、キンドリングレッド蛍光タンパク質、カエデタンパク質からなる群から選択される蛍光タンパク質をコードする遺伝子である、項目１に記載の植物体。 10. Item 2. The plant according to Item 1, wherein the gene encoding the fluorescent protein is a gene encoding a fluorescent protein selected from the group consisting of green fluorescent protein, yellow fluorescent protein, red fluorescent protein, kindling red fluorescent protein, and maple protein. body.
１１．前記蛍光タンパク質をコードする遺伝子が、緑色蛍光タンパク質、をコードする遺伝子である、項目１に記載の植物体。 11. Item 2. The plant according to Item 1, wherein the gene encoding the fluorescent protein is a gene encoding green fluorescent protein.
１２．単子葉植物である、項目１に記載の植物体。 12 Item 2. The plant according to Item 1, which is a monocotyledonous plant.
１３．イネである、項目１に記載の植物体。 13. Item 1. The plant according to Item 1, which is rice.
１４．病害抵抗性を誘導する農薬をスクリーニングするために使用され得るシステムであって、
ａ）項目３または４に記載の植物体、および
ｂ）項目５または６に記載の植物体、
を含む、システム。
14 A system that can be used to screen for pesticides that induce disease resistance,
a) the plant according to item 3 or 4, and b) the plant according to item 5 or 6,
Including the system.
１５．病害抵抗性を誘導する農薬をスクリーニングするために使用され得るシステムであって、
ａ）項目３または４に記載の植物体、
ｂ）項目５または６に記載の植物体、および
ｃ）発光ダイオードを光源として使用する蛍光測定法
を含む、システム。
15. A system that can be used to screen for pesticides that induce disease resistance,
a) the plant according to item 3 or 4,
A system comprising b) a plant according to item 5 or 6, and c) a fluorescence measurement method using a light emitting diode as a light source.
１６．病害抵抗性を誘導する農薬をスクリーニングするために使用され得るシステムであって、
ａ）項目３または４に記載の植物体、
ｂ）項目５または６に記載の植物体、および
ｃ）項目７または８に記載の植物体、
を含む、システム。
16. A system that can be used to screen for pesticides that induce disease resistance,
a) the plant according to item 3 or 4,
b) the plant according to item 5 or 6, and c) the plant according to item 7 or 8,
Including the system.
１７．病害抵抗性を誘導する農薬をスクリーニングするために使用され得るシステムであって、
ａ）項目３または４に記載の植物体、
ｂ）項目５または６に記載の植物体、
ｃ）項目７または８に記載の植物体、および
ｄ）発光ダイオードを光源として使用する蛍光測定法
を含む、システム。
17. A system that can be used to screen for pesticides that induce disease resistance,
a) the plant according to item 3 or 4,
b) the plant according to item 5 or 6,
c) A plant comprising the plant according to item 7 or 8, and d) a fluorescence measurement method using a light emitting diode as a light source.
１８．病害抵抗性を誘導する農薬をスクリーニングするために使用され得るシステムであって、
ａ）項目９に記載の植物体、
を含む、システム。
18. A system that can be used to screen for pesticides that induce disease resistance,
a) the plant according to item 9,
Including the system.
１９．病害抵抗性を誘導する農薬をスクリーニングするために使用され得るシステムであって、
ａ）項目９に記載の植物体、および
ｂ）発光ダイオードを光源として使用する蛍光測定法
を含む、システム。
19. A system that can be used to screen for pesticides that induce disease resistance,
A system comprising: a) the plant according to item 9, and b) a fluorescence measurement method using a light emitting diode as a light source.
２０．病害抵抗性を誘導する農薬をスクリーニングするために使用され得るシステムであって、
ａ）項目９に記載の植物体、および
ｂ）項目７または８に記載の植物体、
を含む、システム。
20. A system that can be used to screen for pesticides that induce disease resistance,
a) the plant according to item 9, and b) the plant according to item 7 or 8,
Including the system.
２１．病害抵抗性を誘導する農薬をスクリーニングするために使用され得るシステムであって、
ａ）項目９に記載の植物体、
ｂ）項目７または８に記載の植物体、および
ｃ）発光ダイオードを光源として使用する蛍光測定法
を含む、システム。
21. A system that can be used to screen for pesticides that induce disease resistance,
a) the plant according to item 9,
b) a plant according to item 7 or 8, and c) a fluorescence measurement method using a light emitting diode as a light source.
２２．病害抵抗性を誘導する農薬をスクリーニングする方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）配列番号１に記載されるＰＢＺ１遺伝子プロモーター配列またはそのフラグメントを有する第１のプロモーター、および該第１のプロモーターに作動可能に連結された第１の蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む発現カセットを含む第１の植物体を提供する工程；
（ｉｉ）配列番号４に記載されるＤ９遺伝子プロモーター配列またはそのフラグメントを有する第２のプロモーター、および該第２のプロモーターに作動可能に連結された第２の蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む発現カセットを含む第２の植物体を提供する工程；
（ｉｉｉ）該植物体と候補薬物を接触させる工程；ならびに
（ｉｖ）該第１および第２の植物体において該第１および第２の蛍光タンパク質の発現を測定する工程；
を包含し、
ここで該第１および第２の蛍光タンパク質の発現を測定する工程において第１および第２の蛍光タンパク質の両方の発現が誘導された場合、候補薬物は植物において病害抵抗性を誘導する農薬であり得る、方法。
22. A method of screening for a pesticide that induces disease resistance, the method comprising the following steps:
(I) an expression cassette comprising a first promoter having a PBZ1 gene promoter sequence described in SEQ ID NO: 1 or a fragment thereof, and a gene encoding a first fluorescent protein operably linked to the first promoter Providing a first plant comprising:
(Ii) an expression cassette comprising a second promoter having the D9 gene promoter sequence described in SEQ ID NO: 4 or a fragment thereof, and a gene encoding a second fluorescent protein operably linked to the second promoter Providing a second plant comprising:
(Iii) contacting the plant with a candidate drug; and (iv) measuring the expression of the first and second fluorescent proteins in the first and second plants;
Including
When the expression of both the first and second fluorescent proteins is induced in the step of measuring the expression of the first and second fluorescent proteins, the candidate drug is an agrochemical that induces disease resistance in the plant. How to get.
２３．前記第１および第２の蛍光タンパク質をコードする遺伝子が、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、キンドリングレッド蛍光タンパク質、カエデタンパク質からなる群から選択される蛍光タンパク質をコードする遺伝子である、項目２２に記載の方法。 23. The gene encoding the first and second fluorescent proteins is a gene encoding a fluorescent protein selected from the group consisting of green fluorescent protein, yellow fluorescent protein, red fluorescent protein, kindling red fluorescent protein, and maple protein, Item 23. The method according to Item 22.
２４．前記第１または第２の蛍光タンパク質をコードする遺伝子が、緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子である、項目２３に記載の方法。 24. 24. The method according to Item 23, wherein the gene encoding the first or second fluorescent protein is a gene encoding green fluorescent protein.
２５．前記植物細胞が単子葉植物細胞である、項目２２に記載の方法。 25. 23. A method according to item 22, wherein the plant cell is a monocotyledonous plant cell.
２６．前記植物細胞がイネ細胞である、項目２２に記載の方法。 26. The method according to item 22, wherein the plant cell is a rice cell.
２７．前記蛍光タンパク質の発現を測定する工程が、発光ダイオードを光源として使用する蛍光測定法である、項目２２に記載の方法。 27. Item 23. The method according to Item 22, wherein the step of measuring the expression of the fluorescent protein is a fluorescence measurement method using a light-emitting diode as a light source.
２８．病害抵抗性を誘導する農薬をスクリーニングする方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）第１および第２の発現カセットを含む植物体を提供する工程であって、ここで、
該第１の発現カセットは、配列番号１に記載されるＰＢＺ１遺伝子プロモーター配列またはそのフラグメントを有する第１のプロモーター、および該第１のプロモーターに作動可能に連結された第１の蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含み、そして、
該第２の発現カセットは、配列番号４に記載されるＤ９遺伝子プロモーター配列またはそのフラグメントを有する第２のプロモーター、および該第２のプロモーターに作動可能に連結された第２の蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む、工程；
（ｉｉ）該植物体と候補薬物を接触させる工程；ならびに
（ｉｉｉ）該植物体において該第１および第２の蛍光タンパク質の発現を測定する工程；
を包含し、
ここで該第１および第２の蛍光タンパク質の発現を測定する工程において第１および第２の蛍光タンパク質の両方の発現が誘導された場合、候補薬物は植物において病害抵抗性を誘導する農薬であり得る、方法。
28. A method of screening for a pesticide that induces disease resistance, the method comprising the following steps:
(I) providing a plant comprising the first and second expression cassettes, wherein:
The first expression cassette encodes a first promoter having a PBZ1 gene promoter sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or a fragment thereof, and a first fluorescent protein operably linked to the first promoter Contains genes, and
The second expression cassette encodes a second promoter having the D9 gene promoter sequence set forth in SEQ ID NO: 4 or a fragment thereof, and a second fluorescent protein operably linked to the second promoter Including a gene;
(Ii) contacting the plant with a candidate drug; and (iii) measuring the expression of the first and second fluorescent proteins in the plant;
Including
When the expression of both the first and second fluorescent proteins is induced in the step of measuring the expression of the first and second fluorescent proteins, the candidate drug is an agrochemical that induces disease resistance in the plant. How to get.
２９．前記第１および第２の蛍光タンパク質をコードする遺伝子が、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、キンドリングレッド蛍光タンパク質、カエデタンパク質からなる群から選択される蛍光タンパク質をコードする遺伝子である、項目２８に記載の方法。 29. The gene encoding the first and second fluorescent proteins is a gene encoding a fluorescent protein selected from the group consisting of green fluorescent protein, yellow fluorescent protein, red fluorescent protein, kindling red fluorescent protein, and maple protein, 29. A method according to item 28.
３０．前記第１または第２の蛍光タンパク質をコードする遺伝子が、緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子である、項目２９に記載の方法。 30. 30. The method according to item 29, wherein the gene encoding the first or second fluorescent protein is a gene encoding green fluorescent protein.
３１．前記植物細胞が単子葉植物細胞である、項目２８に記載の方法。 31. 29. A method according to item 28, wherein the plant cell is a monocotyledonous plant cell.
３２．前記植物細胞がイネ細胞である、項目２８に記載の方法。 32. 29. The method according to item 28, wherein the plant cell is a rice cell.
３３．前記蛍光タンパク質の発現を測定する工程が、発光ダイオードを光源として使用する蛍光測定法である、項目２８に記載の方法。 33. Item 29. The method according to Item 28, wherein the step of measuring the expression of the fluorescent protein is a fluorescence measurement method using a light emitting diode as a light source.
３４．病害抵抗性を誘導する農薬をスクリーニングする方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）発現カセットを含む植物体を提供する工程であって、ここで、該発現カセットは、（ａ）配列番号１に記載されるＰＢＺ１遺伝子プロモーター配列またはそのフラグメントを有する第１のプロモーター、および該第１のプロモーターに作動可能に連結された第１の蛍光タンパク質をコードする遺伝子、および（ｂ）配列番号４に記載されるＤ９遺伝子プロモーター配列またはそのフラグメントを有する第２のプロモーター、および該第２のプロモーターに作動可能に連結された第２の蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む、工程；
（ｉｉ）該植物体と候補薬物を接触させる工程；ならびに
（ｉｉｉ）該植物体において該第１および第２の蛍光タンパク質の発現を測定する工程；
を包含し、
ここで該第１および第２の蛍光タンパク質の発現を測定する工程において第１および第２の蛍光タンパク質の両方の発現が誘導された場合、候補薬物は植物において病害抵抗性を誘導する農薬であり得る、方法。
34. A method of screening for a pesticide that induces disease resistance, the method comprising the following steps:
(I) providing a plant comprising an expression cassette, wherein the expression cassette comprises (a) a first promoter having a PBZ1 gene promoter sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or a fragment thereof; and A gene encoding a first fluorescent protein operably linked to the first promoter, and (b) a second promoter having a D9 gene promoter sequence set forth in SEQ ID NO: 4 or a fragment thereof, and Comprising a gene encoding a second fluorescent protein operably linked to two promoters;
(Ii) contacting the plant with a candidate drug; and (iii) measuring the expression of the first and second fluorescent proteins in the plant;
Including
When the expression of both the first and second fluorescent proteins is induced in the step of measuring the expression of the first and second fluorescent proteins, the candidate drug is an agrochemical that induces disease resistance in the plant. How to get.
３５．前記第１および第２の蛍光タンパク質をコードする遺伝子が、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、キンドリングレッド蛍光タンパク質、カエデタンパク質からなる群から選択される蛍光タンパク質をコードする遺伝子である、項目３４に記載の方法。 35. The gene encoding the first and second fluorescent proteins is a gene encoding a fluorescent protein selected from the group consisting of green fluorescent protein, yellow fluorescent protein, red fluorescent protein, kindling red fluorescent protein, and maple protein, 35. A method according to item 34.
３６．前記第１または第２の蛍光タンパク質をコードする遺伝子が、緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子である、項目３５に記載の方法。 36. 36. The method of item 35, wherein the gene encoding the first or second fluorescent protein is a gene encoding green fluorescent protein.
３７．前記植物細胞が単子葉植物細胞である、項目３４に記載の方法。 37. 35. A method according to item 34, wherein the plant cell is a monocotyledonous plant cell.
３８．前記植物細胞がイネ細胞である、項目３４に記載の方法。 38. 35. A method according to item 34, wherein the plant cell is a rice cell.
３９．前記蛍光タンパク質の発現を測定する工程が、発光ダイオードを光源として使用する蛍光測定法である、項目３４に記載の方法。 39. 35. The method according to item 34, wherein the step of measuring the expression of the fluorescent protein is a fluorescence measuring method using a light emitting diode as a light source.
４０．病害抵抗性を誘導する農薬を分類する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）配列番号１に記載されるＰＢＺ１遺伝子プロモーター配列またはそのフラグメントを有する第１のプロモーター、および該第１のプロモーターに作動可能に連結された第１の蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む発現カセットを含む第１の植物体を提供する工程；
（ｉｉ）配列番号６に記載されるＲａｃ１遺伝子プロモーター配列またはそのフラグメントを有する第２のプロモーター、および該第２のプロモーターに作動可能に連結された第２の蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む発現カセットを含む第２の植物体を提供する工程；
（ｉｉｉ）該植物体と候補薬物を接触させる工程；ならびに
（ｉｖ）該第１および第２の植物体において該第１および第２の蛍光タンパク質の発現を測定する工程；
を包含し、
ここで該第１および第２の蛍光タンパク質の発現の測定結果から、候補薬物を分類する、方法。
40. A method for classifying pesticides that induce disease resistance, the method comprising the following steps:
(I) an expression cassette comprising a first promoter having a PBZ1 gene promoter sequence described in SEQ ID NO: 1 or a fragment thereof, and a gene encoding a first fluorescent protein operably linked to the first promoter Providing a first plant comprising:
(Ii) an expression cassette comprising a second promoter having the Rac1 gene promoter sequence described in SEQ ID NO: 6 or a fragment thereof, and a gene encoding a second fluorescent protein operably linked to the second promoter Providing a second plant comprising:
(Iii) contacting the plant with a candidate drug; and (iv) measuring the expression of the first and second fluorescent proteins in the first and second plants;
Including
A method of classifying candidate drugs from the measurement results of expression of the first and second fluorescent proteins.
（発明の詳細な説明）
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など、独語の場合の「ｅｉｎ」、「ｄｅｒ」、「ｄａｓ」、「ｄｉｅ」などおよびその格変化形、仏語の場合の「ｕｎ」、「ｕｎｅ」、「ｌｅ」、「ｌａ」など、スペイン語における「ｕｎ」、「ｕｎａ」、「ｅｌ」、「ｌａ」など、他の言語における対応する冠詞、形容詞など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
(Detailed description of the invention)
The present invention will be described below. Throughout this specification, singular articles such as “ein”, “der”, “das”, “die” in German, such as “a”, “an”, “the” in English, etc. Etc. and their case changes, such as “un”, “une”, “le”, “la” in French, etc., “un”, “una”, “el”, “la”, etc. in Spanish It is to be understood that the corresponding articles, adjectives, etc. in a language also include the plural concept unless otherwise stated. In addition, it is to be understood that the terms used in the present specification are used in the meaning normally used in the art unless otherwise specified.
（用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
(Definition of terms)
Listed below are definitions of terms particularly used in the present specification.
本明細書において使用される用語「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされ得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。 As used herein, the terms “protein”, “polypeptide”, “oligopeptide” and “peptide” are used interchangeably herein and refer to a polymer of amino acids of any length. This polymer may be linear, branched, or cyclic. The amino acid may be natural or non-natural and may be a modified amino acid. The term can also be assembled into a complex of multiple polypeptide chains. The term also encompasses natural or artificially modified amino acid polymers. Such modifications include, for example, disulfide bond formation, glycosylation, lipidation, acetylation, phosphorylation or any other manipulation or modification (eg, conjugation with a labeling component). This definition also includes, for example, polypeptides containing one or more analogs of amino acids (eg, including unnatural amino acids, etc.), peptide-like compounds (eg, peptoids) and other modifications known in the art. Is included.
本明細書において使用する場合、「蛍光タンパク質」とは、蛍光を発するタンパク質をいい、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、配列番号３のアミノ酸配列を有する変異型ＧＦＰ、イソギンチャク近縁種Ｄｉｓｃｏｓｏｎａ ｓｔｒｉａｔａ由来の蛍光タンパクであるＲＦＰ（Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ａｅｑｕｒｅ ｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ由来のＧＦＰ（例えば、Ｅｖｒｏｇｅｎ社（ロシア）のＡｃｅ−Ｇｒｅｅｎ（登録商標））、甲殻生物であるＣｏｐｅｐｏｄ由来のＧＦＰ（例えば、Ｅｖｒｏｇｅｎ社（ロシア）のＣｏｐ−Ｇｒｅｅｎ（登録商標））、黄色蛍光タンパク質（例えば、Ｅｖｒｏｇｅｎ社（ロシア）のＰｈｉ−Ｙｅｌｌｏｗ（登録商標））、Ｋｉｎｄｌｉｎｇ Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（キンドリングレッド蛍光タンパク質：ＫＦＰ−Ｒｅｄ）（例えば、Ｅｖｒｏｇｅｎ社（ロシア）のＫｉｎｄｌｉｎｇ−Ｒｅｄ（登録商標））、赤色蛍光タンパク質（例えば、Ｅｖｒｏｇｅｎ社（ロシア）のＨｕＲＥＤ−ｔａｎｄｅｍ（登録商標））、Ｋａｅｄｅ（カエデ）タンパク質（Ａｎｄｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００２、Ｏｃｔ １；９９（２０）：１２６５１−６）。 As used herein, “fluorescent protein” refers to a fluorescent protein, such as green fluorescent protein (GFP) derived from Aequorea jellyfish, mutant GFP having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and sea anemone related species RFP (Red Fluorescent Protein) which is a fluorescent protein derived from Discosona striata, GFP derived from Aequle coerulescens (for example, Ace-Green (registered trademark) of Evrogen (Russia)), GFP derived from Ceppod which is a crustacean (for example, E (Russia) Cop-Green (registered trademark)), yellow fluorescent protein (for example, Evrogen (Russia) Phi-Yellow (registered trademark)), Kindling Re d Fluorescent Protein (Kindling Red Fluorescent Protein: KFP-Red) (for example, Kindling-Red (registered trademark) of Evrogen (Russia)), Red Fluorescent Protein (for example, HuRED-tandem (registered trademark) of Evrogen (Russia)) ), Kaede protein (Ando et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002, Oct 1; 99 (20): 12651-6).
本明細書において使用する場合、「植物病原体」とは、植物に有害な影響を与える外来の因子をいい、例えば、ウイルス、真菌、細菌が挙げられるがこれらに限定されない。 As used herein, “phytopathogen” refers to an exogenous factor that has a detrimental effect on plants and includes, but is not limited to, viruses, fungi, and bacteria.
本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」を含む。「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８（１９９４））。用語「核酸」はまた、本明細書において、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用される。特定の核酸配列はまた、「スプライス改変体」を包含する。同様に、核酸によりコードされた特定のタンパク質は、その核酸のスプライス改変体によりコードされる任意のタンパク質を暗黙に包含する。その名が示唆するように「スプライス改変体」は、遺伝子のオルタナティブスプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写物は、異なる（別の）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライスされ得る。スプライス改変体の産生機構は変化するが、エキソンのオルタナティブスプライシングを含む。読み過し転写により同じ核酸に由来する別のポリペプチドもまた、この定義に包含される。スプライシング反応の任意の産物（組換え形態のスプライス産物を含む）がこの定義に含まれる。 As used herein, the terms “polynucleotide”, “oligonucleotide”, and “nucleic acid” are used interchangeably herein and refer to a polymer of nucleotides of any length. The term also includes “derivative oligonucleotide” or “derivative polynucleotide”. A “derivative oligonucleotide” or “derivative polynucleotide” refers to an oligonucleotide or polynucleotide that includes a derivative of a nucleotide or that has an unusual linkage between nucleotides and is used interchangeably. Specific examples of such oligonucleotides include, for example, 2′-O-methyl-ribonucleotides, derivative oligonucleotides in which phosphodiester bonds in oligonucleotides are converted to phosphorothioate bonds, and phosphodiester bonds in oligonucleotides. Is an N3′-P5 ′ phosphoramidate bond derivative oligonucleotide, a ribose and phosphodiester bond in the oligonucleotide converted to a peptide nucleic acid bond, and uracil in the oligonucleotide is C− A derivative oligonucleotide substituted with 5-propynyluracil, a derivative oligonucleotide wherein uracil in the oligonucleotide is substituted with C-5 thiazole uracil, and cytosine in the oligonucleotide is C-5 propynylcytosine Substituted derivative oligonucleotides, derivative oligonucleotides in which the cytosine in the oligonucleotide is replaced with phenoxazine-modified cytosine, derivative oligonucleotides in which the ribose in the DNA is replaced with 2'-O-propylribose Examples thereof include derivative oligonucleotides in which ribose in the oligonucleotide is substituted with 2′-methoxyethoxyribose. Unless otherwise indicated, a particular nucleic acid sequence may also be conservatively modified (eg, degenerate codon substitutes) and complementary sequences, as well as those explicitly indicated. Is contemplated. Specifically, a degenerate codon substitute creates a sequence in which the third position of one or more selected (or all) codons is replaced with a mixed base and / or deoxyinosine residue. (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91-). 98 (1994)). The term “nucleic acid” is also used herein interchangeably with gene, cDNA, mRNA, oligonucleotide, and polynucleotide. Particular nucleic acid sequences also include “splice variants”. Similarly, a particular protein encoded by a nucleic acid implicitly encompasses any protein encoded by a splice variant of that nucleic acid. As the name suggests, a “splice variant” is the product of alternative splicing of a gene. After transcription, the initial nucleic acid transcript can be spliced such that different (another) nucleic acid splice products encode different polypeptides. The production mechanism of splice variants varies, but includes exon alternative splicing. Other polypeptides derived from the same nucleic acid by read-through transcription are also encompassed by this definition. Any product of a splicing reaction (including recombinant forms of splice products) is included in this definition.
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体ヌクレオチド」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。 In the present specification, the “nucleotide” may be natural or non-natural. A “derivative nucleotide” or “nucleotide analog” refers to a nucleotide that is different from a naturally occurring nucleotide but has the same function as the original nucleotide. Such derivative nucleotides and nucleotide analogs are well known in the art. Examples of such derivative nucleotides and nucleotide analogs include, but are not limited to, phosphorothioates, phosphoramidates, methyl phosphonates, chiral methyl phosphonates, 2-O-methyl ribonucleotides, peptide-nucleic acids (PNA). .
本明細書において、「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書においてプロモーターの「フラグメント」とは、好ましくは、プロモーター配列中の部分配列であって、プロモーター配列と同様の制御（例えば、薬物などの外来因子による発現誘導、組織特異的発現、時期特異的発現など）を受ける配列をいう。 In the present specification, the “fragment” refers to a polypeptide or polynucleotide having a sequence length of 1 to n−1 with respect to a full-length polypeptide or polynucleotide (length is n). The length of the fragment can be appropriately changed according to the purpose. For example, the lower limit of the length is 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, Examples include 15, 20, 25, 30, 40, 50 and more amino acids, and lengths expressed in integers not specifically listed here (eg, 11 etc.) are also suitable as lower limits. obtain. In the case of polynucleotides, examples include 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100 and more nucleotides. Non-integer lengths (eg, 11 etc.) may also be appropriate as a lower limit. In the present specification, a “fragment” of a promoter is preferably a partial sequence in the promoter sequence, and the same control as the promoter sequence (for example, expression induction by a foreign factor such as a drug, tissue-specific expression, time-specificity) The sequence which receives the expression etc.).
本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。「種相同体またはホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは、オルソロガス遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅ）ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトとマウスのαヘモグロビン遺伝子はオルソログであるが，ヒトのαヘモグロビン遺伝子とβヘモグロビン遺伝子はパラログ（遺伝子重複で生じた遺伝子）である。オルソログは、分子系統樹の推定に有用であることから、オルソログもまた、本発明において有用であり得る。 In the present specification, the “variant” refers to a substance in which a part of the original substance such as a polypeptide or polynucleotide is changed. Such variants include substitutional variants, addition variants, deletion variants, truncated variants, allelic variants, and the like. An allele refers to genetic variants that belong to the same locus and are distinguished from each other. Therefore, an “allelic variant” refers to a variant having an allelic relationship with a certain gene. “Species homologue or homolog” means homology (preferably at least 60% homology, more preferably at least 80%, at a certain amino acid level or nucleotide level within a certain species. 85% or higher, 90% or higher, 95% or higher homology). The method for obtaining such species homologues will be apparent from the description herein. “Ortholog” is also called an orthologous gene, which is a gene derived from speciation from a common ancestor with two genes. For example, taking the hemoglobin gene family with multiple gene structures as an example, the human and mouse alpha hemoglobin genes are orthologs, but the human alpha and beta hemoglobin genes are paralogs (genes generated by gene duplication). . Since orthologs are useful for the estimation of molecular phylogenetic trees, orthologs may also be useful in the present invention.
「保存的（に改変された）改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンの任意のものに変更され得る。このような核酸の変動は、保存的に改変された変異の１つの種である「サイレント改変（変異）」である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、その核酸の可能なすべてのサイレント変異を記載する。当該分野において、核酸中の各コドン（通常メチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンのための唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が、機能的に同一な分子を産生するために改変され得ることが理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された各配列において暗黙に含まれる。好ましくは、そのような改変は、ポリペプチドの高次構造に多大な影響を与えるアミノ酸であるシステインの置換を回避するようになされ得る。 “Conservative (modified) variants” applies to both amino acid and nucleic acid sequences. Conservatively modified variants with respect to a particular nucleic acid sequence refer to nucleic acids that encode the same or essentially the same amino acid sequence, and are essentially identical if the nucleic acid does not encode an amino acid sequence. An array. Because of the degeneracy of the genetic code, a large number of functionally identical nucleic acids encode any given protein. For example, the codons GCA, GCC, GCG, and GCU all encode the amino acid alanine. Thus, at every position where an alanine is specified by a codon, the codon can be altered to any of the corresponding codons described without altering the encoded polypeptide. Such nucleic acid variations are “silent modifications (mutations)” which are one species of conservatively modified mutations. Every nucleic acid sequence herein which encodes a polypeptide also describes every possible silent variation of that nucleic acid. In the art, each codon in a nucleic acid (except AUG, which is usually the only codon for methionine, and TGG, which is usually the only codon for tryptophan), produces a functionally identical molecule. It is understood that it can be modified. Thus, each silent variation of a nucleic acid that encodes a polypeptide is implicit in each described sequence. Preferably, such modifications can be made to avoid substitution of cysteine, an amino acid that greatly affects the conformation of the polypeptide.
本明細書中において、機能的に等価なポリペプチドを作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、グリコシル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。 As used herein, in addition to amino acid substitutions, amino acid additions, deletions, or modifications can also be made to produce functionally equivalent polypeptides. Amino acid substitution means that the original peptide is substituted with one or more, for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3 amino acids. Addition of an amino acid means adding 1 or more, for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3 amino acids to the original peptide chain. Deletion of amino acids refers to deletion of one or more, for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3 amino acids from the original peptide. Amino acid modifications include, but are not limited to, amidation, carboxylation, sulfation, halogenation, alkylation, glycosylation, phosphorylation, hydroxylation, acylation (eg, acetylation), and the like. The amino acid to be substituted or added may be a natural amino acid, a non-natural amino acid, or an amino acid analog. Natural amino acids are preferred.
このような核酸は、周知のＰＣＲ法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。 Such a nucleic acid can be obtained by a well-known PCR method, and can also be chemically synthesized. These methods may be combined with, for example, a site-specific displacement induction method or a hybridization method.
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わることまたは取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、癌マーカー、神経疾患マーカーなど）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１０％以内、または１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。 As used herein, “substitution, addition or deletion” of a polypeptide or polynucleotide is a substitution of an amino acid or a substitute thereof, or a nucleotide or a substitute thereof, respectively, with respect to the original polypeptide or polynucleotide. , Adding or removing. Such substitution, addition, or deletion techniques are well known in the art, and examples of such techniques include site-directed mutagenesis techniques. The number of substitutions, additions or deletions may be any number as long as it is one or more, and such a number is a function (for example, cancer marker, neurological disease) in a variant having the substitution, addition or deletion. As long as the marker etc.) is retained. For example, such a number can be one or several, and preferably can be within 20%, within 10%, or less than 100, less than 50, less than 25, etc. of the total length.
本明細書において使用する場合、「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。 As used herein, “operably linked” means the control of a transcriptional translational regulatory sequence (eg, promoter, enhancer, etc.) or translational regulatory sequence that has the expression (operation) of the desired sequence. It is arranged below. In order for a promoter to be operably linked to a gene, the promoter is usually placed immediately upstream of the gene, but need not necessarily be adjacent.
本明細書において使用する場合、植物における「病害抵抗性」とは、少なくとも２つ以上の植物疾患に対して植物の状態を改善する作用をいう。例えば、病害抵抗性を有する植物は、病害抵抗性を有さない植物と比較して、少なくとも２つ以上の植物疾患に対して、改善された耐性および／または抵抗性を有する。 As used herein, “disease resistance” in a plant refers to the action of improving the state of a plant against at least two or more plant diseases. For example, a plant having disease resistance has improved tolerance and / or resistance to at least two or more plant diseases compared to a plant having no disease resistance.
本明細書において使用する場合、植物における「病害抵抗性を誘導する農薬」とは、少なくとも２つ以上の植物疾患に対して植物の状態を改善する農薬であり、かつ植物病原体に対して直接作用しない農薬をいう。 As used herein, a “pesticide that induces disease resistance” in a plant is a pesticide that improves the state of the plant against at least two plant diseases and that acts directly on the plant pathogen. No pesticides.
本明細書において使用する場合、植物体と、薬剤および／または農薬を「接触させる」とは、薬剤および／または農薬が植物体に対して何らかの作用をすることが可能な程度に物理的に接近することをいう。この接触は、例えば、噴霧、塗布、パンチ接種、および注入、によってなされ得る。 As used herein, “contacting” a plant and a drug and / or pesticide is physically close enough to allow the drug and / or pesticide to have some effect on the plant. To do. This contact can be made, for example, by spraying, applying, punching, and pouring.
本明細書において使用する場合、「病害抵抗性誘導遺伝子」とは、病害抵抗性をもたらす何らかの刺激（例えば、プロベナゾールのような化合物との接触）によって誘導される、遺伝子をいう。この遺伝子の例としては、ＰＢＺ１遺伝子、Ｄ９遺伝子、Ｒａｃ１遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。 As used herein, “disease resistance-inducing gene” refers to a gene that is induced by any stimulus that causes disease resistance (eg, contact with a compound such as probenazole). Examples of this gene include, but are not limited to, the PBZ1 gene, the D9 gene, and the Rac1 gene.
ＰＢＺ１遺伝子のプロモーターを使用する場合、代表的には、イネ由来の配列番号１に記載の配列全長、またはそのフラグメントを用いることができる。 When using the promoter of the PBZ1 gene, typically, the full-length sequence described in SEQ ID NO: 1 derived from rice or a fragment thereof can be used.
Ｄ９遺伝子のプロモーターを使用する場合、代表的には、イネ由来の配列番号４に記載の配列全長、またはそのフラグメントを用いることができる。 When using the promoter of the D9 gene, typically, the full length sequence described in SEQ ID NO: 4 derived from rice, or a fragment thereof can be used.
Ｒａｃ１遺伝子のプロモーターを使用する場合、代表的には、イネ由来の配列番号６に記載の配列全長、またはそのフラグメントを用いることができる。 In the case of using the promoter of Rac1 gene, typically, the full-length sequence described in SEQ ID NO: 6 derived from rice or a fragment thereof can be used.
本発明を植物において利用する場合、植物細胞への植物発現ベクターの導入には、当業者に周知の方法、例えば、アグロバクテリウムを介する方法および直接細胞に導入する方法、が用いられ得る。アグロバクテリウムを介する方法としては、例えば、Ｎａｇｅｌらの方法（Ｎａｇｅｌ ら（１９９０）、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ．，６７，３２５）が用いられ得る。この方法は、まず、例えば植物発現ベクターでエレクトロポレーションによってアグロバクテリウムを形質転換し、次いで、形質転換されたアグロバクテリウムをＧｅｌｖｉｎら（Ｇｅｌｖｉｎら編（１９９４）、 Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ））に記載の方法で植物細胞に導入する方法である。植物発現ベクターを直接細胞に導入する方法としては、エレクトロポレーション法（Ｓｈｉｍａｍｏｔｏら（１９８９）、Ｎａｔｕｒｅ、３３８：２７４−２７６；およびＲｈｏｄｅｓら（１９８９）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０：２０４−２０７を参照のこと）、パーティクルガン法（Ｃｈｒｉｓｔｏｕら（１９９１）、 Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：９５７−９６２を参照のこと）ならびにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法（Ｄａｔｔａら（１９９０）、 Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：７３６−７４０を参照のこと）が挙げられる。これらの方法は、当該分野において周知であり、形質転換する植物に適した方法が、当業者により適宜選択され得る。 When the present invention is used in plants, plant expression vectors can be introduced into plant cells by methods well known to those skilled in the art, for example, methods involving Agrobacterium and methods for direct introduction into cells. As a method using Agrobacterium, for example, the method of Nagel et al. (Nagel et al. (1990), Microbiol. Lett., 67, 325) can be used. This method involves first transforming Agrobacterium, for example by electroporation with a plant expression vector, and then transforming the transformed Agrobacterium into Gelvin et al. (Edited by Gelvin et al. (1994), Plant Molecular Biology Manual (Kluwer Academic). (Press Publishers)). For methods of introducing plant expression vectors directly into cells, see electroporation (see Shimamoto et al. (1989), Nature, 338: 274-276; and Rhodes et al. (1989) Science, 240: 204-207. ), Particle gun method (see Christou et al. (1991), Bio / Technology 9: 957-962) and polyethylene glycol (PEG) method (Datta et al. (1990), see Bio / Technology 8: 736-740). ). These methods are well known in the art, and a method suitable for the plant to be transformed can be appropriately selected by those skilled in the art.
植物発現ベクターを導入された細胞は、まずカナマイシン耐性などの薬剤耐性で選択される。次いで、当該分野で周知の方法により、植物組織、植物器官および／または植物体に再分化され得る。さらに、植物体から種子が取得され得る。導入した遺伝子の発現は、ノーザンブロット法またはＰＣＲ法により、検出し得る。必要に応じて、遺伝子産物たるタンパク質の発現を、例えば、ウェスタンブロット法により確認し得る。 Cells into which a plant expression vector has been introduced are first selected for drug resistance such as kanamycin resistance. It can then be redifferentiated into plant tissues, plant organs and / or plants by methods well known in the art. Furthermore, seeds can be obtained from the plant body. Expression of the introduced gene can be detected by Northern blotting or PCR. If necessary, the expression of a protein as a gene product can be confirmed by, for example, Western blotting.
未処理の葉身（Ａ）・オリゼメート処理１０日目の葉身（Ｂ）、未処理の葉身（Ｃ）、プロベナゾール処理３日目の葉身（Ｄ）、未処理の葉身（Ｅ）、セレブロシドＢ処理後６時間の葉身（Ｆ）、セレブロシドＢ処理後３日目の葉身（Ｇ）。
００７菌を接種した葉身を可視光（Ａ）（Ｃ）・励起光（Ｂ）（Ｄ）で観察した。
０３１菌を接種した葉身を可視光（Ａ）、励起光（Ｂ）で観察した。 The blades inoculated with 031 bacteria were observed with visible light (A) and excitation light (B).
００７菌を接種した葉身を可視光（Ｃ）、励起光（Ｄ）で観察した。
ＰＢＺ１：：ＧＦＰ導入種子を可視光（Ａ）、励起光（Ｂ）で観察した。
ＰＢＺ１：：ＧＦＰ、導入種子をＭＳ培地に播種後２日目（Ａ，Ｂ）、３日目（Ｃ，Ｄ）、４日目（Ｅ，Ｆ）７日目（Ｇ，Ｈ）で可視光（Ａ，Ｃ，Ｅ，Ｇ）、励起光（Ｂ，Ｄ，Ｆ；Ｈ）で観察した。
励起光下で非型質転換体（Ａ）、ＰＢＺｌ：：ＧＦＰ導入イネ成熟植物体（Ｂ，Ｃ）、ＰＢＺ１：：ＧＦＰ導入イネの穎果（Ｄ）、登熟中の胚乳（Ｅ）、胚（Ｆ）、根の先端（Ｇ）を観察した。
未処理の葉身（Ａ）・プロベナゾール処理７日目の葉身（Ｂ）。
００７菌を接種した葉身を可視光（Ａ）、および励起光（Ｂ）で観察した。
（スクリーニングに用いる植物体の作製）
本発明に従って、病害抵抗性を誘導する農薬をスクリーニングするために使用され得る植物体は、（ａ）植物の病害抵抗性誘導遺伝子のプロモーター；および（ｂ）該プロモーターに作動可能に連結された、蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む、発現カセットを作製し、その発現カセットを植物に導入することによって作製される。
(Production of plants used for screening)
In accordance with the present invention, a plant that can be used to screen for pesticides that induce disease resistance comprises: (a) a promoter of a plant disease resistance inducing gene; and (b) operably linked to the promoter, It is prepared by preparing an expression cassette containing a gene encoding a fluorescent protein and introducing the expression cassette into a plant.
この発現カセットにおいて使用されるプロモーターとしては、種々の病害抵抗性誘導遺伝子、例えば、ＰＢＺ１遺伝子のプロモーター（配列番号１）、Ｄ９遺伝子のプロモーター（配列番号４）、およびＲａｃ１遺伝子のプロモーター（配列番号６）が挙げられる。また、本発明の発現カセットにおいて使用する場合、必ずしもこれらのプロモーターの全長を用いる必要はなく、これらプロモーターのフラグメントであって、プロベナゾールおよび／またはセレブロシドＢのような病害抵抗性を誘導する農薬に応答するフラグメントであってもよい。例えば、配列番号４に示されるＤ９遺伝子プロモーター領域１０２０ｂｐの場合、その全長のみならず、配列番号４の８１５ｂｐフラグメント（配列番号５）を用いることもできる。実際に、この配列番号４の８１５ｂｐを蛍光タンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結した場合、いもち病によって発現が誘導された。その８１５ｂｐフラグメントによる誘導の強度は、配列番号４の全長１０２０ｂｐを用いた場合と同様であった。 The promoter used in this expression cassette includes various disease resistance-inducing genes, such as the PBZ1 gene promoter (SEQ ID NO: 1), the D9 gene promoter (SEQ ID NO: 4), and the Rac1 gene promoter (SEQ ID NO: 6). ). In addition, when used in the expression cassette of the present invention, it is not always necessary to use the full length of these promoters, and they are fragments of these promoters and respond to pesticides that induce disease resistance such as probenazole and / or cerebroside B. It may be a fragment. For example, in the case of the D9 gene promoter region 1020 bp shown in SEQ ID NO: 4, not only the full length thereof but also the 815 bp fragment of SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 5) can be used. In fact, when 815 bp of SEQ ID NO: 4 was operably linked to a gene encoding a fluorescent protein, expression was induced by blast. The intensity of induction by the 815 bp fragment was the same as when using the full length 1020 bp of SEQ ID NO: 4.
また、これらプロモーターを蛍光タンパク質をコードする遺伝子に連結する場合は、プロモーターが作動可能な条件であればよい。 In addition, when these promoters are linked to a gene encoding a fluorescent protein, it is sufficient if the promoter is operable.
この蛍光タンパク質としては、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、配列番号３のアミノ酸配列を有する変異型ＧＦＰ、イソギンチャク近縁種Ｄｉｓｃｏｓｏｎａ ｓｔｒｉａｔａ由来の蛍光タンパクであるＲＦＰ（Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ａｅｑｕｒｅ ｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ由来のＧＦＰ（例えば、Ｅｖｒｏｇｅｎ社（ロシア）のＡｃｅ−Ｇｒｅｅｎ（登録商標））、甲殻生物であるＣｏｐｅｐｏｄ由来のＧＦＰ（例えば、Ｅｖｒｏｇｅｎ社（ロシア）のＣｏｐ−Ｇｒｅｅｎ（登録商標））、黄色蛍光タンパク質（例えば、Ｅｖｒｏｇｅｎ社（ロシア）のＰｈｉ−Ｙｅｌｌｏｗ（登録商標））、Ｋｉｎｄｌｉｎｇ Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（キンドリングレッド蛍光タンパク質：ＫＦＰ−Ｒｅｄ）（例えば、Ｅｖｒｏｇｅｎ社（ロシア）のＫｉｎｄｌｉｎｇ−Ｒｅｄ（登録商標））、赤色蛍光タンパク質（例えば、Ｅｖｒｏｇｅｎ社（ロシア）のＨｕＲＥＤ−ｔａｎｄｅｍ（登録商標））、およびＫａｅｄｅ（カエデ）タンパク質（Ａｎｄｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００２、Ｏｃｔ １；９９（２０）：１２６５１−６）が挙げられるが、これらに限定されない。 As this fluorescent protein, green fluorescent protein (GFP) derived from Aequorea jellyfish, mutant GFP having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, RFP (Red Fluorescent Protein) derived from the sea anemone related species Discosona stricta, derived from Aequure coerulescens GFP (for example, Ace-Green (registered trademark) of Evrogen (Russia)), GFP derived from Copepod, a crustacean (for example, Cop-Green (registered trademark) of Evrogen (Russia)), yellow fluorescent protein ( For example, Evrogen (Russia) Phi-Yellow (registered trademark), Kindling Red Fluorescent Protein (Kindling Red Firefly) Protein: KFP-Red) (eg, Kindling-Red® from Evrogen (Russia)), red fluorescent protein (eg, HuRED-tandem® from Evrogen (Russia)), and Kaede (Maple) Proteins (Ando et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002, Oct 1; 99 (20): 12651-6), but are not limited to these.
この発現カセットを導入した植物体の作製は、例えば、植物細胞（例えば、カルス細胞、胚細胞、種子）に発現カセットを含むベクターを導入し、その後、遺伝子導入された植物細胞を植物体に再生することによって行われ得る。植物細胞へのベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、以下を用いた形質転換などが挙げられる：アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７、特開２００１−２９０７５（特許３１４１０８４号）、特開２０００−２４５４８５）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６、特許第２５１７８１３）等が例示される。本発明においては、形質転換後に再生した植物体の後代を用いることも可能である。 For example, a plant containing the expression cassette is produced by introducing a vector containing the expression cassette into a plant cell (eg, callus cell, embryo cell, seed), and then regenerating the plant cell into which the gene has been introduced into the plant body. Can be done by doing. As a method for introducing a vector into a plant cell, any method for introducing DNA into a plant cell can be used. Examples thereof include transfection, transduction, and transformation using the following: Agrobacterium Agrobacterium (JP 59-140885, JP 60-70080, WO 94/00977, JP 2001-29075 (JP 3141084), JP 2000-245485), electroporation method (JP 60-6085) -251887), a method using a particle gun (gene gun) (Patent No. 2606856, Patent No. 2517813), and the like. In the present invention, it is possible to use a progeny of a plant regenerated after transformation.
また、本発明の植物体を作製する場合は、プロモーター：蛍光タンパク質コード遺伝子の融合物を２つ以上、植物に導入する発現カセットに含ませてもよい。 When producing the plant body of the present invention, two or more promoter: fluorescent protein-encoding gene fusions may be included in an expression cassette to be introduced into the plant.
また、本発明の植物体を作製する場合は、プロモーター：蛍光タンパク質コード遺伝子の融合物を有する発現カセットを２種類以上、植物に導入してもよい。 Moreover, when producing the plant body of this invention, you may introduce | transduce two or more types of expression cassettes which have a fusion product of a promoter: fluorescent protein coding gene into a plant.
（複数のプロモーターを用いる薬剤のスクリーニング）
上記の本発明の実施例の結果、ＰＢＺ１遺伝子は、プロベナゾールおよびセレブロシドＢの両薬剤に対して応答性であり、しかも、他の２つのプロモーター、Ｄ９プロモーターおよびＲａｃ１プロモーターと比較して、蛍光タンパク質によるシグナルが強かった。従って、ＰＢＺ１プロモーターは、そのシグナルの強さから、発光ダイオードを光源として使用する蛍光測定法と組み合わせた場合、候補薬剤が病害抵抗性を誘導する農薬であるか否かを簡便に決定することができる。しかし、その一方で、ＰＢＺ１プロモーターは、他の多くのストレスに対しても応答性であるという特徴を有する。例えば、気温、水温、水分、光量等がイネの生育に不適切である場合、いわゆる生理障害が起こり、ＰＢＺ１の発現誘導が観察された。また、温室内で、葉が白く抜けるなどの生理障害が生じた場合にも、ＰＢＺ１遺伝子が誘導される。ＰＢＺ１プロモーターは、多くの無関係なストレスに対しても応答性であることから、病害抵抗性を誘導する農薬のスクリーニングにおいて擬陽性を生じやすいことも判明した。
(Drug screening using multiple promoters)
As a result of the examples of the present invention described above, the PBZ1 gene is responsive to both probenazole and cerebroside B drugs, and moreover due to fluorescent protein compared to the other two promoters, the D9 promoter and the Rac1 promoter. The signal was strong. Therefore, the PBZ1 promoter can easily determine whether a candidate drug is a pesticide that induces disease resistance when combined with a fluorescence measurement method using a light-emitting diode as a light source based on the strength of the signal. it can. However, on the other hand, the PBZ1 promoter is characterized by being responsive to many other stresses. For example, when the temperature, water temperature, moisture, light intensity, etc. are inappropriate for the growth of rice, so-called physiological disorders have occurred and PBZ1 expression induction has been observed. In addition, the PBZ1 gene is also induced when a physiological disorder such as white leaves in a greenhouse occurs. Since the PBZ1 promoter is also responsive to many unrelated stresses, it was also found that false positives are likely to occur in screening for pesticides that induce disease resistance.
その一方で、Ｄ９プロモーターは、ＰＢＺ１プロモーターと同様に、プロベナゾールに対して応答性であったが、そのシグナルは、ＰＢＺ１と比較して弱かった。従って、Ｄ９プロモーターは、そのシグナルがＰＢＺ１と比較して弱いため、ＰＢＺ１と比較して、候補薬剤が病害抵抗性を誘導する農薬であるか否かの判定を迅速に行うことはできない。その一方で、Ｄ９プロモーターは、ＰＢＺ１プロモーターと異なり多くの無関係なストレスに対して応答性ではなかった。そのため、ＰＢＺ１プロモーターによって問題となる擬陽性は、ほとんど問題とならない。 On the other hand, the D9 promoter, like the PBZ1 promoter, was responsive to probenazole, but its signal was weak compared to PBZ1. Therefore, since the signal of the D9 promoter is weaker than that of PBZ1, it is not possible to quickly determine whether the candidate drug is an agrochemical that induces disease resistance compared to PBZ1. On the other hand, the D9 promoter, unlike the PBZ1 promoter, was not responsive to many unrelated stresses. Therefore, false positives that are problematic due to the PBZ1 promoter hardly pose a problem.
そこで、ＰＢＺ１プロモーターによるスクリーニングと、Ｄ９プロモーターによるスクリーニングを組み合わせることによって、迅速かつ擬陽性の少ないスクリーニングを行うことが可能である。 Thus, by combining screening with the PBZ1 promoter and screening with the D9 promoter, it is possible to perform screening rapidly and with few false positives.
上記組み合わせスクリーニングにおいては、１つの植物体中に、（ａ）配列番号１に記載されるＰＢＺ１遺伝子プロモーター配列またはそのフラグメントを有する第１のプロモーター、およびその第１のプロモーターに作動可能に連結された第１の蛍光タンパク質をコードする遺伝子、ならびに（ｂ）配列番号４に記載されるＤ９遺伝子プロモーター配列またはそのフラグメントを有する第２のプロモーター、およびその第２のプロモーターに作動可能に連結された第２の蛍光タンパク質をコードする遺伝子、を含む１つの発現カセットを導入し、その植物体を用いることができる。あるいは、１つの植物体中に、（ａ）配列番号１に記載されるＰＢＺ１遺伝子プロモーター配列またはそのフラグメントを有する第１のプロモーター、およびその第１のプロモーターに作動可能に連結された第１の蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む第１の発現カセット、ならびに（ｂ）配列番号４に記載されるＤ９遺伝子プロモーター配列またはそのフラグメントを有する第２のプロモーター、およびその第２のプロモーターに作動可能に連結された第２の蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む第２の発現カセットを導入し、その植物体を用いることができる。あるいは、（ａ）配列番号１に記載されるＰＢＺ１遺伝子プロモーター配列またはそのフラグメントを有する第１のプロモーター、およびその第１のプロモーターに作動可能に連結された第１の蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む第１の発現カセットを導入した第１の植物体、ならびに（ｂ）配列番号４に記載されるＤ９遺伝子プロモーター配列またはそのフラグメントを有する第２のプロモーター、およびその第２のプロモーターに作動可能に連結された第２の蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む第２の発現カセットを導入した第２の植物体を用いることができる。 In the combination screening, in one plant body, (a) a first promoter having the PBZ1 gene promoter sequence described in SEQ ID NO: 1 or a fragment thereof, and the first promoter are operably linked to the first promoter. A gene encoding a first fluorescent protein, and (b) a second promoter having the D9 gene promoter sequence set forth in SEQ ID NO: 4 or a fragment thereof, and a second operably linked to the second promoter One expression cassette containing a gene encoding the fluorescent protein is introduced, and the plant can be used. Alternatively, in one plant, (a) a first promoter having the PBZ1 gene promoter sequence described in SEQ ID NO: 1 or a fragment thereof, and a first fluorescence operably linked to the first promoter A first expression cassette comprising a gene encoding a protein, and (b) a second promoter having the D9 gene promoter sequence set forth in SEQ ID NO: 4 or a fragment thereof, and the second promoter operably linked thereto The plant body can be used by introducing a second expression cassette containing a gene encoding the second fluorescent protein. Or (a) a first promoter having a PBZ1 gene promoter sequence described in SEQ ID NO: 1 or a fragment thereof, and a gene encoding a first fluorescent protein operably linked to the first promoter A first plant into which the first expression cassette has been introduced; and (b) a second promoter having the D9 gene promoter sequence described in SEQ ID NO: 4 or a fragment thereof, and operably linked to the second promoter. The 2nd plant body which introduce | transduced the 2nd expression cassette containing the gene which codes the produced 2nd fluorescent protein can be used.
上記の植物体（単数または複数）を用いて、複数のプロモーターの応答を蛍光タンパク質の発現によって検出することによって、病害抵抗性を誘導する農薬のスクリーニングを行うことができる。 By detecting the response of a plurality of promoters by the expression of a fluorescent protein using the above plant body (s), it is possible to screen for pesticides that induce disease resistance.
例えば、１次スクリーニングにおいては、ＰＢＺ１プロモーターと作動可能に連結した第１の蛍光タンパク質をコードする遺伝子の発現を測定することによって、薬剤および／または農薬の作用を評価する。ＰＢＺ１プロモーターを誘導する薬剤・農薬は、病害抵抗性を誘導する農薬の候補であり、２次スクリーニングに供される。第１の蛍光タンパク質の発現量の測定は、第１の蛍光タンパク質に適したフィルターを備えた蛍光測定装置を用いて行うことができる。 For example, in the primary screening, the action of the drug and / or pesticide is evaluated by measuring the expression of the gene encoding the first fluorescent protein operably linked to the PBZ1 promoter. Drugs and pesticides that induce the PBZ1 promoter are candidates for pesticides that induce disease resistance, and are used for secondary screening. The expression level of the first fluorescent protein can be measured using a fluorescence measuring device equipped with a filter suitable for the first fluorescent protein.
１次スクリーニングにおいて、陽性を示した薬剤および／または農薬について、次に、Ｄ９プロモーターと作動可能に連結した第２の蛍光タンパク質をコードする遺伝子の発現を測定することによって、薬剤および／または農薬の作用を評価する。Ｄ９プロモーターを誘導する薬剤・農薬を、病害抵抗性を誘導する農薬の候補として単離する。 For drugs and / or pesticides that tested positive in the primary screen, the drug and / or pesticides were then determined by measuring the expression of a gene encoding a second fluorescent protein operably linked to the D9 promoter. Evaluate the effect. A drug or pesticide that induces the D9 promoter is isolated as a candidate for a pesticide that induces disease resistance.
上記複数のプロモーターの組み合わせスクリーニングによって、病害抵抗性を誘導する農薬を効率的にスクリーニングすることが可能である。 Pesticides that induce disease resistance can be efficiently screened by the combination screening of the plurality of promoters.
上記のスクリーニング法はさらに、Ｒａｃ１プロモーターを用いるスクリーニングと組み合わせられ得る。以下の実施例において示されるように、Ｒａｃ１プロモーターは、セレブロシドＢで誘導されたが、プロベナゾールでの誘導は確認されなかった。薬剤に対するプロモーターの応答性の差異は、薬剤によって異なる経路で細胞に作用することに起因すると考えられる。従って、複数種類のプロモーターの応答性を比較することによって、作用機構に基づいて候補薬剤を分類することが可能になる。 The screening methods described above can be further combined with screening using the Rac1 promoter. As shown in the following examples, the Racl promoter was induced with cerebroside B, but no induction with probenazole was confirmed. The difference in promoter responsiveness to drugs may be attributed to acting on cells in different pathways depending on the drug. Therefore, by comparing the responsiveness of multiple types of promoters, it becomes possible to classify candidate drugs based on the mechanism of action.
例えば、ＰＢＺ１プロモーターからの発現を誘導し、かつＲａｃ１プロモーターからの発現を誘導する薬剤は、セレブロシドＢと類似する作用機構を有する薬剤であると推定される。これに対して、ＰＢＺ１プロモーターからの発現を誘導するが、Ｒａｃ１プロモーターからの発現を誘導しない薬剤は、プロベナゾールと類似する作用機構を有する薬剤であると推定される。 For example, an agent that induces expression from the PBZ1 promoter and induces expression from the Rac1 promoter is presumed to be an agent having a mechanism of action similar to cerebroside B. In contrast, a drug that induces expression from the PBZ1 promoter but does not induce expression from the Rac1 promoter is presumed to be a drug having an action mechanism similar to that of probenazole .
この知見に基づいて、例えば、ＰＢＺ１プロモーターと作動可能に連結した第１の蛍光タンパク質をコードする遺伝子の発現を測定し、そしてＲａｃ１プロモーターと作動可能に連結した第２の蛍光タンパク質をコードする遺伝子の発現を測定することによって、薬剤をその作用機構によって分類することが可能である。 Based on this finding, for example, the expression of the gene encoding the first fluorescent protein operably linked to the PBZ1 promoter is measured, and the gene encoding the second fluorescent protein operably linked to the Rac1 promoter is determined. By measuring expression, it is possible to classify drugs by their mechanism of action.
病害抵抗性を誘導する薬剤を分類することによって、その薬剤の施用する量、濃度、時期などの手がかりとすることができる。そのような施用の手がかりがある場合、最適な施用方法の決定に必要な試行錯誤を減らし、その結果、任意の薬剤の施用条件をより容易に決定することが可能である。 By classifying drugs that induce disease resistance, it is possible to provide clues such as the amount, concentration, and timing of application of the drugs. In the case of such application cues, it is possible to reduce the trial and error required to determine the optimal application method, and as a result, it is possible to more easily determine the application conditions of any drug.
（発光ダイオードによる蛍光タンパク質の検出）
本発明において、植物体において発現された蛍光タンパク質を検出するためには、例えば、特開２００１−２６９１７１に開示される蛍光物質観察用励起光照射装置を用いることができる。その蛍光物質観察用励起光照射装置は、発光ダイオードを光源とし、図９に示すように、観察に使用する蛍光物質１の励起光２の波長に近い波長を発光特性のピークとする発光ダイオード素子を光源１０として備える。例えば、（１）オワンクラゲより単離された蛍光タンパクＧＦＰに由来する改変型ＧＦＰを用いる場合、その励起波長である４８８ｎｍに近い発光特性を有する発光ダイオードを使用し、ＧＦＰを発現する形質転換植物細胞を５ｌｌｎｍの蛍光発光によって肉眼で識別できる光量１１とする；（２）イソギンチャク近縁種Discosona striataより単離された蛍光タンパク（ＲＦＰ:Red Fluorescent Protein）の改変型ＤｓＲｅｄを用いる場合は、その励起波長である５５８ｎｍに近い発光特性を有する発光ダイオードを使用し、ＲＦＰを発現する形質転換細胞をＤｓＲｅｄの５８３ｎｍの蛍光発光によって識別する。
(Detection of fluorescent protein by light emitting diode)
In the present invention, in order to detect a fluorescent protein expressed in a plant body, for example, an excitation light irradiation apparatus for observing a fluorescent substance disclosed in JP-A-2001-269171 can be used. The excitation light irradiating apparatus for observing a fluorescent substance uses a light emitting diode as a light source, and as shown in FIG. Is provided as the
また、導入遺伝子の発現を起こさせるための装置であるプロモーターの発現特性を、適当な、再分化された個体を対象として、組織毎、あるいは生育ステージ毎に、ＧＦＰにあっては５１１ｎｍ、ＲＦＰにあっては５８３ｎｍの蛍光発光を各々検出することにより明らかにすることも可能である。あるいは、複数のプロモーターを各々異なる蛍光タンパク質をコードする遺伝子に連結し、各々のプロモーターの応答性を同時に、測定することも可能である。 In addition, the expression characteristics of a promoter, which is a device for causing transgene expression, can be set to appropriate re-differentiated individuals for each tissue or each growth stage, for GFP, 511 nm, for RFP. In this case, it is also possible to clarify by detecting each fluorescence emission of 583 nm. Alternatively, a plurality of promoters can be linked to genes encoding different fluorescent proteins, and the responsiveness of each promoter can be measured simultaneously.
必要に応じて、この発光ダイオードを２個またはそれ以上束ねることにより光量を確保する。更に所要により発光帯域を狭める必要がある場合には所要の励起光２の波長のみを透過させるフィルター４を装備する。発光ダイオード素子からの放射光の帯域は狭いため、励起光２の波長のみを透過するフイルター４で波長帯域を制限した場合でも強い励起光２が得られる。 If necessary, the amount of light is secured by bundling two or more of the light emitting diodes. Further, when it is necessary to narrow the emission band as required, a filter 4 that transmits only the wavelength of the required excitation light 2 is provided. Since the band of the radiated light from the light emitting diode element is narrow, strong excitation light 2 can be obtained even when the wavelength band is limited by the filter 4 that transmits only the wavelength of the excitation light 2.
発光ダイオードは電気から光への変換効率が高く、乾電池程度の電源でも十分な光量が得られ、また、発光ダイオード素子の寿命は長く、素子は熱を持ちにくいことから小型化することができる。従って、乾電池またはＡＣアダプターを電源として使用することができる。また、この装置は破損しやすい管球やフィラメント類を使っていないため、可搬性に優れ、暗室や温室、人工気象室内など場所を選ばず容易に移動して、照射、観察が可能となる。 Light-emitting diodes have high conversion efficiency from electricity to light, a sufficient amount of light can be obtained even with a power source of a dry cell level, and the lifetime of the light-emitting diode elements is long and the elements are difficult to hold heat, so that the size can be reduced. Therefore, a dry cell or an AC adapter can be used as a power source. In addition, since this apparatus does not use easily damaged bulbs and filaments, it is highly portable and can be easily moved, illuminated, and observed in any place such as a dark room, greenhouse, or artificial weather room.
以上、好ましい実施形態を例示して本発明を説明してきた。以下に、図面を参照しながら、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供されることに留意されるべきである。従って、本発明の範囲は、説明に用いた特定の実施形態にも下記実施例にも限定されるものではなく、特許請求の範囲によってのみ限定される。 The present invention has been described above by exemplifying preferred embodiments. Hereinafter, the present invention will be described based on examples with reference to the drawings. However, it should be noted that the following examples are provided only for illustrative purposes. Accordingly, the scope of the present invention is not limited to the specific embodiments used in the description or the following examples, and is limited only by the scope of the claims.
以下に実施例等により本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples and the like, but the present invention is not limited thereto.
（実施例１)
ＰＣＲ法により単離したＰＢＺ１プロモーター領域を変異型ＧＦＰ（配列番号２）に融合し，バイナリベクターを用いて、特許３１４１０８４号のアグロバクテリウム法により、イネ品種「日本晴」に導入した。遺伝子導入を行ったカルスから植物体を再分化させ、再生個体を得た。この植物を温室で生育させ、後代の種子を採取した。ＰＢＺｌプロモーターを領域を変異型ＧＦＰに融合したキメラＤＮＡ導入イネ植物体を胚でのＧＦＰ発現により選抜し、キメラＤＮＡの導入が確認された植物体を得た。この植物を生育させ、既存の農薬であるオリゼメートを施用し（方法は、明治製菓研究年報ＮＯ３６、４２−５４、１９９７を参考にした）、７〜１０日目に葉身におけるＧＦＰの発現を観察した。その結果、葉身における変異型ＧＦＰ発現の誘導が確認された（図１ＡおよびＢ）。
(Example 1)
The PBZ1 promoter region isolated by PCR was fused to mutant GFP (SEQ ID NO: 2) and introduced into rice cultivar “Nipponbare” by the Agrobacterium method of Japanese Patent No. 3141084 using a binary vector. The plant body was re-differentiated from the callus into which the gene had been introduced to obtain regenerated individuals. This plant was grown in a greenhouse, and progeny seeds were collected. A chimeric DNA-introduced rice plant in which the PBZl promoter was fused to the mutant GFP was selected by GFP expression in the embryo to obtain a plant in which introduction of the chimeric DNA was confirmed. Growing this plant, applying oryzate, an existing pesticide (method was referred to Meiji Seika Research Annual Report NO36, 42-54, 1997), and observed GFP expression in leaf blades on days 7-10 did. As a result, induction of mutant GFP expression in the leaf blade was confirmed (FIGS. 1A and B).
（実施例２）
実施例１と同様にキメラＤＮＡ導入形質転換イネに、既存の農薬であるオリゼメートの主成分プロベナゾールを２００ｍｇ／１の濃度で施用し、３日目に葉身における変異型ＧＦＰの発現を観察した。その結果、葉身における変異型ＧＦＰ発現の誘導が確認された（図１ＣおよびＤ）。
(Example 2)
In the same manner as in Example 1, chimera DNA-introduced transformed rice was applied with oryzate, a main component, probenazole, at a concentration of 200 mg / 1, and the expression of mutant GFP in the leaf blades was observed on the third day. As a result, induction of mutant GFP expression in the leaf blade was confirmed (FIGS. 1C and D).
（実施例３）
実施例１と同様にキメラＤＮＡ導入形質転換イネに、いもち菌由来のエリシタ一分子であるセレブロシドＢを２μｇ／ｍＬの濃度で施用し、６時間後に葉身におけるＧＦＰの発現を観察した。その結果、葉身における変異型ＧＦＰ発現の誘導が確認された（図１Ｅ〜Ｇ）。
(Example 3)
In the same manner as in Example 1, cerebroside B, which is a single molecule of E. coli derived from blast fungus, was applied to chimeric rice-transformed rice at a concentration of 2 μg / mL, and expression of GFP in the leaf blades was observed after 6 hours. As a result, induction of mutant GFP expression in the leaf blade was confirmed (FIGS. 1E-G).
（実施例４）
実施例１と同様にキメラＤＮＡ導入形質転換イネに、いもち菌（００７菌）を接種し、７日目に変異型ＧＦＰの発現を観察した．その結果、葉身のいもち感染部位における変異型ＧＦＰ発現の誘導が確認された（図２および３）。
Example 4
In the same manner as in Example 1, the rice transformed with the chimeric DNA was inoculated with blast fungus (007), and the expression of mutant GFP was observed on day 7. As a result, induction of mutated GFP expression at the site of leaf blast infection was confirmed (FIGS. 2 and 3).
（実施例５）
実施例１と同様にキメラＤＮＡ導入形質転換イネにおける非誘導性の変異型ＧＦＰの発現を観察した。その結果、茎、外頴、内頴、根、登熟中の胚、発芽中の胚乳及び、胚で変異型ＧＦＰ発現が観察されたが、完熟種子におけるＧＦＰ発現は検出されなかった（図４〜６）。
(Example 5)
In the same manner as in Example 1, the expression of non-inducible mutant GFP was observed in the transgenic rice-introduced rice. As a result, mutant GFP expression was observed in stems, outer pods, inner wings, roots, ripening embryos, germinating endosperm, and embryos, but no GFP expression was detected in fully-ripened seeds (FIG. 4). ~ 6).
（実施例６）
ＰＢＺ１以外の病害抵抗性誘導遺伝子であるＤ９遺伝子のプロモーターについて、実施例１、２および４と同様に実験を行った。
(Example 6)
Experiments were carried out in the same manner as in Examples 1, 2, and 4 for the promoter of the D9 gene, which is a disease resistance-inducing gene other than PBZ1.
実施例１と同様の方法でＤ９プロモーター（配列番号４）と連結したＧＦＰ（配列番号２）キメラＤＮＡを導入した形質転換イネに、既存の農薬であるオリゼメートの主成分プロベナゾールを２００ｍｇ／１の濃度で施用し、７日目に葉身における変異型ＧＦＰの発現を観察した。その結果、葉身における変異型ＧＦＰ発現の誘導が確認された（図７）。 A transformant rice into which GFP (SEQ ID NO: 2) chimeric DNA linked to the D9 promoter (SEQ ID NO: 4) was introduced in the same manner as in Example 1 had a concentration of 200 mg / l as the main component of oryzate, which is an existing pesticide. And the expression of mutant GFP in the leaf blades was observed on the 7th day. As a result, induction of mutant GFP expression in the leaf blade was confirmed (FIG. 7).
次に、実施例１と同様の方法でＤ９プロモーター（配列番号４）と連結したＧＦＰ（配列番号２）キメラＤＮＡを導入した形質転換イネに、いもち菌（００７菌）を接種し、７日目に変異型ＧＦＰの発現を観察した。その結果、葉身のいもち感染部位における変異型ＧＦＰ発現の誘導が確認された（図８Ｂ）。 Next, the rice plant transformed with GFP (SEQ ID NO: 2) chimeric DNA linked to the D9 promoter (SEQ ID NO: 4) in the same manner as in Example 1 was inoculated with blast fungus (007), and the seventh day The expression of mutant GFP was observed. As a result, induction of mutated GFP expression at the leaf blast infection site was confirmed (FIG. 8B).
（実施例７）
ＰＢＺ１以外の病害抵抗性誘導遺伝子であるＲａｃ１遺伝子のプロモーター（配列番号６）について、実施例１〜５と同様に実験を行った。
(Example 7)
Experiments were performed in the same manner as in Examples 1 to 5 on the promoter (SEQ ID NO: 6) of the Rac1 gene, which is a disease resistance-inducing gene other than PBZ1.
その結果、Ｒａｃ１プロモーターは、セレブロシドＢで誘導されたが、プロベナゾールでの誘導は確認できなかった（データ示さず）。また、いもち菌接種時にＲａｃ１遺伝子から転写されるＲＮＡの発現上昇は見られなかった。しかし、Ｒａｃ１ｐ：：ＧＦＰを導入したイネでは，いもち菌接種によるＧＦＰの発現誘導が確認できた。 As a result, the Racl promoter was induced with cerebroside B, but no induction with probenazole could be confirmed (data not shown). Furthermore, no increase in the expression of RNA transcribed from the Rac1 gene was observed when inoculating blasts. However, in rice introduced with Rac1p :: GFP, it was confirmed that GFP expression was induced by inoculation with blast.
以上の結果から、病害抵抗性誘導遺伝子の中で、ＰＢＺ１遺伝子のプロモーターを用いた場合は、プロベナゾールとセレブロシドＢの双方において、蛍光タンパク質による検出が可能であったが。Ｒａｃ１プロモーターは、プロベナゾールに対する応答を確認することができず、セレブロシドＢに対して応答性であった。このことは、プロベナゾールとセレブロシドＢの作用機構が異なること、およびＰＢＺ１遺伝子とＲａｃ１遺伝子は、異なる経路で発現誘導される遺伝子であることを示す。 From the above results, when the promoter of PBZ1 gene was used among the disease resistance-inducing genes, detection with fluorescent protein was possible in both probenazole and cerebroside B. The Rac1 promoter was unable to confirm a response to probenazole and was responsive to cerebroside B. This indicates that the action mechanisms of probenazole and cerebroside B are different, and that the PBZ1 gene and the Rac1 gene are genes that are induced to be expressed by different pathways.
（実施例８）
上記の本発明の実施例の結果、ＰＢＺ１遺伝子は、プロベナゾールおよびセレブロシドＢの両薬剤に対して応答性であり、しかも、他の２つのプロモーター、Ｄ９プロモーターおよびＲａｃ１プロモーターと比較して、蛍光タンパク質によるシグナルが強かった。従って、ＰＢＺ１プロモーターは、そのシグナルの強さから、発光ダイオードを光源として使用する蛍光測定法と組み合わせた場合、候補薬剤が病害抵抗性を誘導する農薬であるか否かを簡便に決定することができる。しかし、その一方で、ＰＢＺ１プロモーターは、他の多くのストレスに対しても応答性であるという特徴を有する。例えば、気温、水温、水分、光量等がイネの生育に不適切である場合、いわゆる生理障害が起こり、ＰＢＺ１の発現誘導が観察された。また、温室内で、葉が白く抜けるなどの生理障害が生じた場合にも、ＰＢＺ１遺伝子が誘導される。ＰＢＺ１プロモーターは、多くの無関係なストレスに対しても応答性であることから、病害抵抗性を誘導する農薬のスクリーニングにおいて擬陽性を生じやすいことも判明した。
(Example 8)
As a result of the examples of the present invention described above, the PBZ1 gene is responsive to both probenazole and cerebroside B drugs, and moreover due to fluorescent protein compared to the other two promoters, the D9 promoter and the Rac1 promoter. The signal was strong. Therefore, the PBZ1 promoter can easily determine whether a candidate drug is a pesticide that induces disease resistance when combined with a fluorescence measurement method using a light-emitting diode as a light source based on the strength of the signal. it can. However, on the other hand, the PBZ1 promoter is characterized by being responsive to many other stresses. For example, when the temperature, water temperature, moisture, light intensity, etc. are inappropriate for the growth of rice, so-called physiological disorders have occurred and PBZ1 expression induction has been observed. In addition, the PBZ1 gene is also induced when a physiological disorder such as white leaves in a greenhouse occurs. Since the PBZ1 promoter is also responsive to many unrelated stresses, it was also found that false positives are likely to occur in screening for pesticides that induce disease resistance.
Ｄ９プロモーターは、ＰＢＺ１プロモーターと同様に、プロベナゾールに対して応答性であったが、そのシグナルは、ＰＢＺ１と比較して弱かった。従って、Ｄ９プロモーターは、そのシグナルがＰＢＺ１よりも弱いため、ＰＢＺ１と比較して、候補薬剤が病害抵抗性を誘導する農薬であるか否かの判定を簡便に行うことができない。その一方で、Ｄ９プロモーターは、ＰＢＺ１プロモーターと異なり多くの無関係なストレスに対して応答性ではなかった。従って、ＰＢＺ１プロモーターによって問題となる擬陽性は、Ｄ９プロモーターの場合、ほとんど問題とならない。 The D9 promoter, like the PBZ1 promoter, was responsive to probenazole, but its signal was weak compared to PBZ1. Therefore, since the signal of the D9 promoter is weaker than that of PBZ1, it is not possible to easily determine whether the candidate drug is an agrochemical that induces disease resistance compared to PBZ1. On the other hand, the D9 promoter, unlike the PBZ1 promoter, was not responsive to many unrelated stresses. Therefore, the false positive that is a problem with the PBZ1 promoter is hardly a problem with the D9 promoter.
そこで、ＰＢＺ１プロモーターによるスクリーニングと、Ｄ９プロモーターによるスクリーニングを組み合わせたスクリーニング方法を以下のように行う。 Therefore, a screening method combining screening with the PBZ1 promoter and screening with the D9 promoter is performed as follows.
組み合わせスクリーニングにおいて、（ａ）配列番号１に記載されるＰＢＺ１遺伝子プロモーター配列またはそのフラグメントを有する第１のプロモーター、およびその第１のプロモーターに作動可能に連結された第１の蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む第１の発現カセットを導入した第１の植物体、ならびに（ｂ）配列番号４に記載されるＤ９遺伝子プロモーター配列またはそのフラグメントを有する第２のプロモーター、およびその第２のプロモーターに作動可能に連結された第２の蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む第２の発現カセットを導入した第２の植物体を用いる。 In the combination screening, (a) a first promoter having a PBZ1 gene promoter sequence described in SEQ ID NO: 1 or a fragment thereof, and a gene encoding a first fluorescent protein operably linked to the first promoter A first plant introduced with a first expression cassette comprising: and (b) a second promoter having the D9 gene promoter sequence described in SEQ ID NO: 4 or a fragment thereof, and operable to the second promoter A second plant body into which a second expression cassette containing a gene encoding the second fluorescent protein linked to is introduced is used.
第１の植物体に多数の候補薬剤を接触させ、第１の蛍光タンパク質を指標として、１次スクリーニングを行う。多数の候補薬剤の中から、第１の蛍光タンパク質の発現を誘導する薬剤、すなわち、ＰＢＺ１誘導性の薬剤を選択する。次に、その選択された薬剤を、第２の植物体に接触させ、第２の蛍光タンパク質を指標として、２次スクリーニングを行う。候補薬剤の中から、第２の蛍光タンパク質の発現を誘導する薬剤、すなわち、Ｄ９誘導性の薬剤を選択する。 A large number of candidate drugs are brought into contact with the first plant body, and primary screening is performed using the first fluorescent protein as an index. An agent that induces the expression of the first fluorescent protein, that is, a PBZ1-inducible agent is selected from among a large number of candidate agents. Next, the selected drug is brought into contact with the second plant body, and secondary screening is performed using the second fluorescent protein as an index. From the candidate drugs, an agent that induces the expression of the second fluorescent protein, that is, a D9-inducing agent is selected.
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。 As mentioned above, although this invention has been illustrated using preferable embodiment of this invention, this invention should not be limited and limited to this embodiment. It is understood that the scope of the present invention should be construed only by the claims. It is understood that those skilled in the art can implement an equivalent range from the description of specific preferred embodiments of the present invention based on the description of the present invention and common general technical knowledge. Patents, patent applications, and documents cited herein should be incorporated by reference in their entirety, as if the contents themselves were specifically described herein. Understood.
本発明によって、ａ）植物の病害抵抗性誘導遺伝子の天然のプロモーター；およびｂ）該プロモーターに作動可能に連結された蛍光タンパク質をコードする遺伝子、を含む発現カセットを含むベクターによって形質転換された植物体を得て、その植物体を候補薬剤によって処理し、その蛍光タンパク質の発現量を指標にして、候補薬剤にスクリーニングを行なう方法およびその方法のためのシステムが提供される。また、そのスクリーニング方法によって使用される植物体もまた、提供される。 According to the present invention, a plant transformed with a vector comprising an expression cassette comprising: a) a natural promoter of a plant disease resistance-inducing gene; and b) a gene encoding a fluorescent protein operably linked to the promoter. A method is provided for obtaining a body, treating the plant with a candidate drug, screening the candidate drug using the expression level of the fluorescent protein as an index, and a system for the method. A plant used by the screening method is also provided.
図面における参照番号は、以下のとおりである：
１ 蛍光物質
２ 励起光
４、６ フィルター
５ 蛍光発光
１０ 発光ダイオードからなる光源
１１ 肉眼で観察できる光量
Reference numbers in the drawings are as follows:
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Fluorescent substance 2 Excitation light 4, 6 Filter 5
Claims (10)
ａ）植物の病害抵抗性誘導遺伝子のプロモーター；および
ｂ）該プロモーターに作動可能に連結された、蛍光タンパク質をコードする遺伝子
を含む、発現カセットを含む植物体であって、
ここで、該プロモーターが、配列番号６に記載されるＲａｃ１遺伝子プロモーター配列を有する、植物体。A plant that can be used to screen for pesticides that induce disease resistance,
a plant comprising an expression cassette comprising: a) a promoter of a plant disease resistance-inducing gene; and b) a gene encoding a fluorescent protein operably linked to the promoter,
Wherein the promoter, that have a Rac1 gene promoter sequence described in SEQ ID NO: 6, plants.
１）請求項１に記載の植物体、ならびに、
２）以下：
ａ）植物の病害抵抗性誘導遺伝子のプロモーター；および、
ｂ）該プロモーターに作動可能に連結された、蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む、発現カセットを含む植物体であって、
ここで、該プロモーターが、配列番号１に記載されるＰＢＺ１遺伝子プロモーター配列を有する、植物体、
を含む、システム。A system that can be used to screen for pesticides that induce disease resistance, the following:
1) The plant according to claim 1, and
2) The following:
a) a promoter of a plant disease resistance-inducing gene; and
b) a plant comprising an expression cassette comprising a gene encoding a fluorescent protein operably linked to the promoter,
Wherein the promoter, that have a PBZ1 gene promoter sequence described in SEQ ID NO: 1, plants,
Including the system.
１）請求項１に記載の植物体、ならびに、
２）以下：
ａ）植物の病害抵抗性誘導遺伝子のプロモーター；および、
ｂ）該プロモーターに作動可能に連結された、蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む、発現カセットを含む植物体であって、
ここで、該プロモーターが、配列番号１に記載されるＰＢＺ１遺伝子プロモーター配列を有する、植物体、および
３）発光ダイオードを光源として使用する蛍光測定装置、
を含む、システム。A system that can be used to screen for pesticides that induce disease resistance, the following:
1) The plant according to claim 1, and
2) The following:
a) a promoter of a plant disease resistance-inducing gene; and
b) a plant comprising an expression cassette comprising a gene encoding a fluorescent protein operably linked to the promoter,
Wherein the promoter, that have a PBZ1 gene promoter sequence described in SEQ ID NO: 1, plants, and 3) the fluorescence measurement device using a light-emitting diode as a light source,
Including the system.
１）請求項１に記載の植物体、ならびに、
２）以下：
ａ）配列番号１に記載されるＰＢＺ１遺伝子プロモーター配列を有する第１のプロモーター、
ｂ）該第１のプロモーターに作動可能に連結された、第１の蛍光タンパク質をコードする遺伝子、
ｃ）配列番号４に記載されるＤ９遺伝子プロモーター配列を有する第２のプロモーター、および、
ｄ）該第２のプロモーターに作動可能に連結された、第２の蛍光タンパク質をコードする遺伝子、
を含む、発現カセットを含む植物体、
を含む、システム。A system that can be used to screen for pesticides that induce disease resistance,
1) The plant according to claim 1, and
2) The following:
first promoter with PBZ1 gene promoter sequence described in a) SEQ ID NO: 1,
b) a gene encoding a first fluorescent protein operably linked to the first promoter;
c) a second promoter having D9 gene promoter sequence set forth in SEQ ID NO: 4, and,
d) a gene encoding a second fluorescent protein operably linked to the second promoter;
A plant containing an expression cassette,
Including the system.
１）請求項１に記載の植物体、
２）以下：
ａ）配列番号１に記載されるＰＢＺ１遺伝子プロモーター配列を有する第１のプロモーター、
ｂ）該第１のプロモーターに作動可能に連結された、第１の蛍光タンパク質をコードする遺伝子、
ｃ）配列番号４に記載されるＤ９遺伝子プロモーター配列を有する第２のプロモーター、および、
ｄ）該第２のプロモーターに作動可能に連結された、第２の蛍光タンパク質をコードする遺伝子、
を含む、発現カセットを含む植物体、ならびに、
３）発光ダイオードを光源として使用する蛍光測定装置、
を含む、システム。A system that can be used to screen for pesticides that induce disease resistance,
1) The plant according to claim 1,
2) The following:
first promoter with PBZ1 gene promoter sequence described in a) SEQ ID NO: 1,
b) a gene encoding a first fluorescent protein operably linked to the first promoter;
c) a second promoter having D9 gene promoter sequence set forth in SEQ ID NO: 4, and,
d) a gene encoding a second fluorescent protein operably linked to the second promoter;
A plant containing an expression cassette, and
3) a fluorescence measuring device using a light emitting diode as a light source,
Including the system.
（ｉ）配列番号１に記載されるＰＢＺ１遺伝子プロモーター配列を有する第１のプロモーター、および該第１のプロモーターに作動可能に連結された第１の蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む発現カセットを含む第１の植物体を提供する工程；
（ｉｉ）配列番号６に記載されるＲａｃ１遺伝子プロモーター配列を有する第２のプロモーター、および該第２のプロモーターに作動可能に連結された第２の蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む発現カセットを含む第２の植物体を提供する工程；
（ｉｉｉ）該植物体と候補薬物を接触させる工程；ならびに
（ｉｖ）該第１および第２の植物体において該第１および第２の蛍光タンパク質の発現を測定する工程；
を包含し、
ここで該第１および第２の蛍光タンパク質の発現の測定結果から、候補薬物を分類する、方法であって、
ここで、ＰＢＺ１遺伝子プロモーターからの発現を誘導し、かつＲａｃ１遺伝子プロモーターからの発現を誘導する候補薬物は、セレブロシドＢと類似する作用機構を有する薬物であると分類され、そしてここで、ＰＢＺ１遺伝子プロモーターからの発現を誘導するが、Ｒａｃ１遺伝子プロモーターからの発現を誘導しない候補薬物は、プロベナゾールと類似する作用機構を有する薬物であると分類される、方法。A method for classifying pesticides that induce disease resistance, the method comprising the following steps:
(I) a first promoter with PBZ1 gene promoter sequence set forth in SEQ ID NO: 1, and an expression cassette comprising a gene encoding a first fluorescent protein operably linked to a promoter of the first Providing a first plant;
(Ii) a second promoter having a Rac1 gene promoter sequence described in SEQ ID NO: 6, and comprising an expression cassette comprising a gene encoding a second fluorescent protein operably linked to a promoter of the second Providing a second plant body;
(Iii) contacting the plant with a candidate drug; and (iv) measuring the expression of the first and second fluorescent proteins in the first and second plants;
Including
A method for classifying candidate drugs from the measurement results of the expression of the first and second fluorescent proteins ,
Here, candidate drugs that induce expression from the PBZ1 gene promoter and induce expression from the Rac1 gene promoter are classified as drugs having a mechanism of action similar to cerebroside B, and where PBZ1 gene promoter A candidate drug that induces expression from but does not induce expression from a Rac1 gene promoter is classified as a drug having a mechanism of action similar to probenazole .
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