JP4558093B1

JP4558093B1 - 新規フラクトピラノシド型ホモオリゴ糖及びその製造方法

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Publication number: JP4558093B1
Application number: JP2009294297A
Authority: JP
Inventors: 秀紀岡田; 昭山森; 直樹川添; 徳夫塩見; 秀一小野寺; 敬司上野
Original assignee: 大高酵素株式会社
Priority date: 2009-07-16
Filing date: 2009-12-25
Publication date: 2010-10-06
Anticipated expiration: 2029-12-25
Also published as: JP2011037821A

Abstract

【課題】フルクトース２分子を有し、新規な構造を持つオリゴ糖及びその製造方法の提供。
【解決手段】該オリゴ糖は、β−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−フルクトフラノースである。該オリゴ糖は、植物を切断したものに原料重量の１／１０量以上２倍量以下の糖質を含むようにショ糖を添加し、ショ糖の浸透圧を利用して抽出して植物抽出エキスを得、該植物抽出エキスを自然発酵させることにより、発酵抽出エキス中に該オリゴ糖を生成させ、該発酵エキス中から該オリゴ糖を採取することにより得られる。
【選択図】なし

Description

本発明は、新規フラクトピラノシド型ホモオリゴ糖及びその製造方法に関し、詳しくはフルクトースのみからなる二糖類で非還元末端フルクトースがピラノース型の新規オリゴ糖に関する。

２個のフルクトースを構成糖とした二糖類として、フルクトースが２−１結合したものはイヌロビオースとして、あるいは２−６結合したものはレバンビオースとして知られている。前記イヌロビオースはβ−フルクトフラノシダーゼによりショ糖から合成されることが知られており（非特許文献１）、また、イヌリンの部分加水分解でも合成されることが知られている。前記レバンビオースもβ−フルクトフラノシダーゼ（非特許文献２）やレバンスクラーゼ（非特許文献３）により、ショ糖とフルクトースの混合物から生成されることが報告されている。

前記の二糖類は、還元末端フルクトースがピラノース或いはフラノースの構造をとるものであるが、非還元末端がフラノース型でありピラノース型ではない。

一方、２個のフルクトースを構成糖とし、還元末端及び非還元末端がピラノース型の二糖類はβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（１→２）−Ｄ−フルクトピラノースとして特開２０００−２４７９９１号（特許文献１）に知られている。

特開２０００−２４７９９１号公報 Acta Chem. Scand. 21(1967)828-829 J. Chem. (1952)4652-4654 Biochem. J. 64(1956)351-361 J. Biochem. (1964) 55, 208

本発明は、フルクトース２分子を有し、新規な構造を持つオリゴ糖及びその製造方法を提供することを課題とする。

本発明者らは、植物エキス発酵液中の新規オリゴ糖について検索、分離し、ＴＯＦ−ＭＳ分析、メチル化糖のガスクロマトグラフィー分析及びＮＭＲ解析を行った結果、いかなる標品とも一致しない未知のオリゴ糖を検出した。この新規オリゴ糖は植物エキス発酵液の発酵中に生成することが見いだされた。このオリゴ糖は、フルクトース２分子が２−６結合したもので、還元末端フルクトースがフラノース型で非還元末端フルクトースがピラノース型の構造を持つ。即ち、本発明の新規オリゴ糖は、下記式（１）で表されるＯ−β−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−フルクトフラノースである（以下で「式（１）で表されるオリゴ糖」と呼ぶことがある。）。

本発明の式（１）で表されるオリゴ糖の製造方法は、植物を切断したものに原料重量の１／１０量以上２倍量以下、好ましくは、１／５量以上２倍量以下、最も好ましくは、１／４量以上２倍量以下の糖質を含むようにショ糖を添加し、ショ糖の浸透圧を利用して抽出して植物抽出エキスを得、該植物抽出エキスを自然発酵させることにより、発酵抽出エキス中に前記式（１）で表されるオリゴ糖を生成させ、得られた発酵エキス中から該オリゴ糖を採取することを特徴とする。

本明細書において、「植物エキス液」とは発酵する前の植物の抽出液の意味で用いる。また、「植物エキス発酵液」とは植物の抽出液を発酵処理したものの意味で用いる。

本発明の前記式（１）で表されるオリゴ糖は、新規化合物として有用である。

本発明の前記式（１）で表されるオリゴ糖は、難消化性糖質であるので、高血糖症状の改善や、高血糖を起因とする肥満症、糖尿病などの疾患の改善のための食品素材、医薬品素材として有用である。

植物エキス発酵液を活性炭セライトカラムクロマトグラフィーに添加し、水で溶出した区分をさらにＡｍｉｄｅ−８０（商品名、東ソー株式会社製）に添加して８０％アセトニトリルで溶出したものについて、溶出時間とシグナル強度の関係を示すグラフを表す図である。図１における溶出時間２５．５〜２８．５分のフラクションをＯＤＳ−８０Ｔｓカラムを用いたＨＰＬＣを行って分離したものについて、溶出時間とシグナル強度の関係を示すグラフを表す図である。糖１についてのＰｏｓｉｔｉｖｅイオンモードでの質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳのチャートを表す図である。糖１についての¹Ｈ−ＮＭＲ解析のチャートを表す図である。糖１についての¹³Ｃ−ＮＭＲ解析のチャートを表す図である。糖１についてのＣＯＳＹのチャートを表す図である。糖１についてのＥ−ＨＳＱＣのチャートを表す図である。糖１についてのＨＳＱＣ−ＴＯＣＳＹのチャートを表す図である。糖１についてのＨＭＢＣのチャートを表す図である。糖１についてのｊｒｅｓ−ＨＭＢＣのチャートを表す図である。糖１の消化性について、縦軸に糖の残存率（％）、横軸に反応時間（分）を採ったグラフとして表す図である。

（植物エキス発酵液の製造方法）
植物エキス発酵液は、以下の様に製造される。植物原料としては、リンゴ、バナナ、イチゴ、ミカン、ミカンの皮、ナシ、パイナップル、ブドウ、等の果物、ニンジン、大根、ショウガ、ゴボウ、キャベツ、ホウレン草、タマネギ、トマト、キュウリ、セロリ、ピーマン、ブラックマッペモヤシ、エンドウモヤシ、ナス、レンコン、カボチャ、レタス、ニンニク、三つ葉、ウド、アスパラガス、シソ、カブ、アサツキ、白菜、サラダ菜、シュンギク、セリ、ニラ、等の野菜類、シイタケ、エノキタケ等のきのこ類、及び熊笹、クローバー、フキノトウ、タンポポ、オオバコ、スギ葉、パセリ、イタドリの若芽、ヨモギ、トドマツ葉等の山野草、昆布、ワカメ等の海藻類が挙げられ、これらの植物原料のうち２種以上、好ましくは、多種類が用いられる。

上記植物原料の配合割合として、例えばリンゴでは植物原料総重量の０．１から５０％、ニンジンでは０．１から５０％、大根では０．０５から４０％、キャベツでは０．０５から４０％、セロリやキュウリでは０．０１から３０％、バナナ、タマネギ、ゴボウ、ホウレン草では０．０１から３０％とすることが望ましいが、特に制限されるものではない。

これらの植物原料を１〜５ｃｍ幅、好ましくは１〜４ｃｍ幅、最も好ましくは２〜３ｃｍ幅に切断し、全ての原料を杉樽中に入れ、これに、ショ糖を混合し、圧搾せずに浸透圧を利用して、３日間から３週間抽出して植物エキス液を得る。ショ糖の混合割合については、全体として１／１０量以上２倍量以下の糖質を含むようにし、好ましくは、植物原料とほぼ等量のショ糖を添加して混合することが望ましい。同時に、数ｐｐｍ程度の濃度となるように若干量の食塩を添加混合してもよい。

圧搾せずに回収した植物エキス液を３７℃で暗所で保存すると主として酵母（例えば、Saccharomyces 属に属する微生物）および乳酸球菌（例えば、Leuconostoc 属に属する微生物）により自然発酵する。発酵後、さらに３７℃で約半年間以上熟成させると褐色、粘稠性液体の植物エキス発酵液が得られる。

（本発明のオリゴ糖の分画、精製）
得られた植物エキス発酵液を活性炭セライトを充填したカラムクロマトグラフィーに通し、水で溶出することにより本発明の前記式（１）で表されるオリゴ糖を含む溶出液を得ることができる。得られた溶出液をさらにＨＰＬＣを用いて前記式（１）で表されるオリゴ糖を分離し、精製する。その後、凍結乾燥して、粉末状の精製された本発明の前記式（１）で表されるオリゴ糖を得ることができる。

［実施例１］
（植物発酵エキスの調製）
植物抽出エキスの原料として以下の配合の材料を２〜３ｃｍ幅に切断したものを使用した。

リンゴ植物原料総重量の２０％
ニンジン同１６％
大根同１２％
キャベツ同１０％
セロリ同９％
キュウリ同９％
バナナ同６％
玉ねぎ同６％
ゴボウ同６％
ホウレン草同６％

これらの植物原料全重量に対して、等量のショ糖を加えて一週間抽出し、得られた植物エキス液を上記微生物により自然発酵させた後、３７℃で約半年間熟成させることにより、褐色の粘稠性の液状の植物エキス発酵液を得た。

（未知の糖成分の分画、精製）
前記工程で得られた発酵後の植物エキス発酵液を活性炭セライトカラムクロマトグラフィー（４．５ｃｍ×３５ｃｍ）に添加し、水、５％エタノール、１５％エタノールのステップワイズグラジエントで溶出した。

水で溶出した区分をさらにＡｍｉｄｅ−８０（商品名、東ソー株式会社製、カラムサイズ：７．８ｍｍ×３０ｃｍ、溶出：８０％アセトニトリル、カラム温度：８０℃、流速：２ｍＬ／ｍｉｎ、検出：示差屈折計）に添加して溶出した。その結果を図１に溶出時間とシグナル強度の関係を示すグラフとして表す。次いで、図１における溶出時間２５．５〜２８．５分のフラクション（図１において矢印で示すピークの部分）を分取し、該分取したフラクションをＯＤＳ−８０Ｔｓカラム（商品名、東ソー株式会社製；カラムサイズ：４．６ｍｍ×２５ｃｍを４本つないだもの、溶出：蒸留水、カラム温度：室温、流速：０．３ｍＬ／ｍｉｎ、検出：示差屈折計）を用いたＨＰＬＣを行った。その結果を、図２に溶出時間とシグナル強度の関係を示すグラフとして表す。図２における溶出時間４７．０〜４９．０分のフラクション（図２において矢印で示すピークの部分）を分取し、精製し、凍結乾燥粉末を得た。

（化学構造の決定）
前記工程で得られた凍結乾燥粉末について、以下に示す機器分析を行い、その化学構造を以下のように決定した。

前記工程で得られた単一の成分として単離された凍結乾燥粉末をＰｏｓｉｔｉｖｅイオンモードで質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）した。そのチャートを図３に表す。図３によれば、未知の成分は３６５の〔Ｍ＋Ｎａ〕のイオンピークを与えた。よって未知の成分はヘキソース二糖類であることが確かめられた。該未知のヘキソース二糖類を糖１と呼ぶ。

糖１を酸加水分解後、ＨＰＡＥＣ分析し、構成糖を調査したところ、フルクトースのみから構成されるものであった。従って、糖１はフルクトースが２分子の二糖類であると決定した。糖１を箱守の方法（非特許文献４：J. Biochem. (1964) 55, 208参照）でメチル化し、メタノール分解した試料をガスクロマトグラフィーで分析した結果、メチル１，３４，５−テトラ−Ｏ−メチル−Ｄ−フルクトピラノシド、メチル１，３，４−トリ−Ｏ−メチル−Ｄ−フルクトシドが検出された。

次に糖１を重水に溶解して次の１次元ＮＭＲ解析を行った。¹Ｈ−ＮＭＲ解析のチャートを図４に示し、¹³Ｃ−ＮＭＲ解析のチャートを図５に表す。

次に糖１を重水に溶解して以下の２次元ＮＭＲ解析を行った。ＣＯＳＹのチャートを図６に、Ｅ−ＨＳＱＣのチャートを図７に、ＨＳＱＣ−ＴＯＣＳＹのチャートを図８に、ＨＭＢＣのチャートを図９に、ｊｒｅｓ−ＨＭＢＣのチャートを図１０に示す。

また糖１のケミカルシフトを表１に示す。

以上の結果から、糖１は、β−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−フルクトフラノースであると決定した。

［実施例２］
（糖１の消化性）
ラット小腸アセトン粉末による本発明の糖１の分解性について下記のように試験した。

ラット小腸アセトン粉末（ｓｉｇｍａ社製）３００ｍｇに１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２．７ｍＬを加えてガラスホモジナイザーを用いてホモジナイズし、１０，０００ｘｇ、１５分間４℃で遠心分離し、得られた上澄みを酵素液とした。該酵素液に対してマルターゼ活性として１ｍＬあたり２．５ユニットとなるように希釈し、得られた酵素液０．２ｍＬと、１％の本発明の糖１の１ｍＬを混合し、３７℃で一定時間反応させ、１００℃で５分間加熱し、反応を停止した。その結果を、縦軸に糖の残存率（％）、横軸に反応時間（分）を採ったグラフとして図１１に示す。

比較のため、糖としてマルトース、ショ糖について前記と同様な処理を行った結果を図１１に併せて示す。

この試験の結果、本発明の糖１は殆ど分解されなかった。したがって、本発明の糖１は、難消化性糖質であることがわかる。

本発明のオリゴ糖は、難消化性糖質であるので、高血糖症状の改善や、高血糖を起因とする肥満症、糖尿病などの疾患の改善のための食品素材、医薬品素材の用途としての利用が期待できる。

Claims

下記式（１）で表されるβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−フルクトフラノース。
植物を切断したものに１／１０量以上２倍量以下の糖質を含むようにショ糖を添加し、ショ糖の浸透圧を利用して抽出して植物エキス液を得、該植物エキス液を自然発酵させることにより、得られた植物エキス発酵液中に請求項１に記載のβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−フルクトースを生成させ、生成されたβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−フルクトフラノースを採取することを特徴とするオリゴ糖の製造方法。
請求項２に記載のオリゴ糖の製造方法において、β−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−フルクトースを採取する方法は、植物エキス発酵液を活性炭セライトカラムクロマトグラフィーに添加し、水で溶出して得た溶出液に対してＨＰＬＣによりβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−フルクトースを分離することを特徴とするオリゴ糖の製造方法。