JP4554277B2 - Method for producing succinic acid by microorganism - Google Patents
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Description
本発明は、微生物によるコハク酸の製造方法に関する。より詳しくは、微生物による発酵、膜分離、電気透析および結晶化などを行なうことにより高純度に精製された、ポリマー、食品、医薬品、その他化学品の合成原料として有用なコハク酸の製造方法に関する。 The present invention relates to a method for producing succinic acid by a microorganism. More particularly, the present invention relates to a method for producing succinic acid useful as a synthetic raw material for polymers, foods, pharmaceuticals, and other chemicals purified by microorganism fermentation, membrane separation, electrodialysis, crystallization, and the like.
コハク酸は、ポリマー、食品、医薬品、その他化学品の合成原料として広く用いられており、特にポリマー原料としてコハク酸を用いる場合、ポリマーの重合度維持や着色防止などのために、高純度のコハク酸が要求される。コハク酸の高純度化は精製段数を重ねれば可能ではあるが、工業的生産を経済的に行なうためには、全工程にわたってのプロセスの改良、すなわち、コハク酸を生産する発酵工程における不純物の低減、コハク酸回収率の向上、工程の簡略化、副生成物の再利用などの効率化が必要となる。 Succinic acid is widely used as a raw material for the synthesis of polymers, foods, pharmaceuticals, and other chemicals. Especially when succinic acid is used as a polymer raw material, high-purity succinic acid is used to maintain the degree of polymerization of the polymer and prevent coloring. Acid is required. Although it is possible to increase the purity of succinic acid by increasing the number of purification stages, in order to achieve industrial production economically, it is necessary to improve the process throughout the entire process, that is, to reduce impurities in the fermentation process for producing succinic acid. Reduction, improvement of the succinic acid recovery rate, simplification of the process, and efficiency of reuse of by-products are required.
発酵法による高純度のコハク酸の製造方法として、水分解電気透析によりコハク酸塩の不飽和水溶液を遊離コハク酸の過飽和水溶液に変換し、該過飽和コハク酸水溶液から結晶化させる方法が知られている（特許文献１参照）。 As a method for producing high-purity succinic acid by fermentation, a method is known in which an unsaturated aqueous solution of succinate is converted into a supersaturated aqueous solution of free succinic acid by hydrolytic electrodialysis and crystallized from the aqueous solution of supersaturated succinic acid. (See Patent Document 1).
しかしながら、特許文献１では、発酵工程での効率化や不純物の低減について、および培養液の除菌工程について言及されていない。また、上記方法では、コハク酸を分離精製する際に、実際には除菌工程を行なう必要があること、過飽和水溶液を得るために、水分解電気透析処理前に通常の電気透析等の工程を行なう必要があることから、処理段数が多いという問題点を有している。さらには、結晶回収後のコハク酸含有濾液を水分解電気透析に再利用する際に、副生物の酢酸を除去することについては言及されているものの、系内に蓄積することになる、共存する反応液由来の無機アニオンおよび糖類を除去することについては言及されていない。
However,
また、コハク酸の発酵工程における効率化を図る方法として、好気的な条件で菌体増殖のための培養を行って集菌した後、反応用培地により嫌気的な条件で有機酸を生産するための菌体反応を行うにあたり、発酵時の糖濃度の最大濃度を特定の範囲に制御することにより、生産物を高濃度に蓄積させる方法が開示されている（特許文献２）。 In addition, as a method to improve the efficiency in the fermentation process of succinic acid, the cells are cultured for agglutination under aerobic conditions and collected, and then the organic acid is produced under anaerobic conditions using the reaction medium. In performing the bacterial cell reaction, a method for accumulating the product at a high concentration by controlling the maximum concentration of sugar during fermentation to a specific range is disclosed (Patent Document 2).
また、生産性を高める方法として、限外濾過膜を用いて菌体濃縮液を再循環し、ｐＨ制御に消費したアルカリ量に連動させて基質を投入することによって、乳酸を主体とした有機酸を連続発酵させる方法が開示されている（特許文献３）。 In addition, as a method for improving productivity, an organic acid mainly composed of lactic acid is introduced by recycling the cell concentrate using an ultrafiltration membrane and introducing a substrate in conjunction with the amount of alkali consumed for pH control. Has disclosed a method of continuously fermenting sucrose (Patent Document 3).
しかしながら、前記特許文献２および３に記載の方法は、製品の高純度化、および、工業的生産に耐えうる効率的な分離精製などの点で、未だ充分ではなかった。そのため、コハク酸の回収率の向上、工程の簡略化、副生成物の循環再利用化、廃棄物の極小化などを図るため、発酵から分離精製までの全工程を包括的に改良し、効率的な製造方法を確立することが望まれていた。
本発明の課題は、従来の微生物によるコハク酸の製造方法における発酵から分離精製ま
での全工程を包括的に改良し、高純度に精製されたコハク酸を効率的に得ることができるコハク酸の製造方法を提供することにある。
An object of the present invention is to comprehensively improve all steps from fermentation to separation and purification in a conventional method for producing succinic acid by microorganisms, and to provide a succinic acid capable of efficiently obtaining highly purified succinic acid. It is to provide a manufacturing method.
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、発酵工程において、切り替え操作および除菌した反応液の回収操作の効率化を図り、培養工程と反応工程とを分割することにより、高生産性および効率化を両立した方法を見出した。また、分離精製工程において、コハク酸への酸転化およびコハク酸の結晶化を行うことにより、高純度のコハク酸を非常に簡便で効率的に製造できる主工程を見出した。さらに、コハク酸結晶回収時に発生した濾液にアルコールを添加して二層分離させ、コハク酸を上層に局在化させて回収することにより、系内に不純物を蓄積させることなく、コハク酸を含む濾液を結晶化工程に再利用できる副工程を見出した。そして、上記主工程および副工程を見出すことにより、本発明を完成するに至った。 As a result of diligent research to solve the above-mentioned problems, the present inventors have attempted to improve the efficiency of the switching operation and the recovery operation of the sterilized reaction liquid in the fermentation process, and by dividing the culture process and the reaction process. And found a method that achieves both high productivity and efficiency. Moreover, the main process which can manufacture highly purified succinic acid very simply and efficiently was discovered by performing the acid conversion to a succinic acid, and the crystallization of a succinic acid in the isolation | separation refinement | purification process. In addition, alcohol is added to the filtrate generated during the recovery of succinic acid crystals and separated into two layers, and succinic acid is contained without accumulating impurities in the system by localizing and collecting succinic acid in the upper layer. We have found a sub-process where the filtrate can be reused in the crystallization process. And it came to complete this invention by discovering the said main process and subprocess.
すなわち、本発明（Ｉ）は、好気的に微生物を培養する工程（１）、嫌気的にコハク酸塩を生産する工程（２）、コハク酸塩をコハク酸に転化する工程（３）、コハク酸を結晶化して固液分離することにより、コハク酸の結晶および濾液を回収する工程（４）を含むことを特徴とするコハク酸の製造方法である。 That is, the present invention (I) comprises a step of aerobically culturing microorganisms (1), a step of anaerobically producing succinate (2), a step of converting succinate to succinic acid (3), A method for producing succinic acid, comprising a step (4) of recovering crystals and filtrate of succinic acid by crystallizing succinic acid and solid-liquid separation.
また、本発明（ＩＩ）は、工程（４）で回収した濾液にアルコールを添加することにより、コハク酸を主に含む上層と、反応液由来の糖および無機アニオンを主に含む下層とに二層分離する工程（５）、および上層液を減圧濃縮することにより、コハク酸濃縮液とアルコールとを分離して回収する工程（６）を含むことを特徴とするコハク酸の製造方法である。 Further, in the present invention (II), alcohol is added to the filtrate collected in the step (4), so that an upper layer mainly containing succinic acid and a lower layer mainly containing sugar and inorganic anions derived from the reaction solution can be used. A method for producing succinic acid, comprising a step (5) of separating layers and a step (6) of separating and recovering the succinic acid concentrate and alcohol by concentrating the upper layer liquid under reduced pressure.
さらに、本発明は、例えば、以下の事項からなる。
[１]
微生物を好気的に培養する工程（１）、
微生物を嫌気的に反応させてコハク酸塩を生産する工程（２）、
コハク酸塩をコハク酸に転化する工程（３）、および
コハク酸を結晶化して固液分離することにより、コハク酸の結晶および濾液をそれぞれ回収する工程（４）
を含むことを特徴とするコハク酸の製造方法。
［２］
前記工程（１）で得られた培養液を膜濾過して菌体を濃縮し、該濃縮菌体に反応培地液を供給する操作を１回または繰り返し行なうことにより、
前記工程（１）で用いられた培養培地から、前記工程（２）で用いられる反応培地に切り替えることを特徴とする前記［１］に記載のコハク酸の製造方法。
［３］
前記工程（２）における反応液を膜濾過して菌体を濃縮し、除菌した反応液を回収するとともに、該除菌反応液の回収と平行してまたは交互に、該濃縮菌体に反応培地液を供給することにより、
微生物による反応と除菌反応液の回収とを連続的または断続的に行うことを特徴とする前記［１］または［２］に記載のコハク酸の製造方法。
［４］
前記工程（３）が、水分解電気透析処理により行なわれることを特徴とする前記［１］〜［３］のいずれかに記載のコハク酸の製造方法。
［５］
前記工程（４）におけるコハク酸の結晶化が、コハク酸液を濃縮処理した後、冷却することにより行なわれることを特徴とする前記［１］〜［４］のいずれかに記載のコハク酸
の製造方法。
［６］
コハク酸液を濃縮した時のコハク酸濃度を、冷却温度における飽和溶解度以上にすることを特徴とする前記［５］に記載のコハク酸の製造方法。
［７］
前記工程（４）で回収した濾液にアルコールを添加することにより、コハク酸を主に含む上層と、反応液由来の糖および無機アニオンを主に含む下層とに二層分離する工程（５）、および
該上層液を減圧濃縮することにより、コハク酸濃縮液とアルコールとを分離して回収する工程（６）
を含むことを特徴とする前記［１］〜［６］のいずれかに記載のコハク酸の製造方法。
［８］
前記工程（５）で添加されるアルコールが、エタノールまたはメタノールであることを特徴とする前記［７］に記載のコハク酸の製造方法。
［９］
前記工程（６）で回収したコハク酸濃縮液を、前記工程（４）に供給して結晶化処理原液の一部として再利用することを特徴とする前記［７］または［８］に記載のコハク酸の製造方法。
Furthermore, this invention consists of the following matters, for example.
[1]
A step of aerobically culturing microorganisms (1),
A step (2) of producing succinate by reacting microorganisms anaerobically;
Step (3) for converting succinate to succinic acid, and step (4) for recovering crystals of succinic acid and filtrate by crystallization of succinic acid and solid-liquid separation, respectively.
A process for producing succinic acid, comprising:
[2]
By performing membrane filtration of the culture solution obtained in the step (1) to concentrate the cells and supplying the reaction medium solution to the concentrated cells once or repeatedly,
The method for producing succinic acid according to the above [1], wherein the culture medium used in the step (1) is switched to the reaction medium used in the step (2).
[3]
The reaction solution in the step (2) is subjected to membrane filtration to concentrate the microbial cells, collect the sterilized reaction solution, and react with the concentrated microbial cells in parallel or alternately with the collection of the sterilization reaction solution. By supplying the medium solution,
The method for producing succinic acid according to the above [1] or [2], wherein the reaction by the microorganism and the collection of the sterilization reaction solution are performed continuously or intermittently.
[4]
The method for producing succinic acid according to any one of the above [1] to [3], wherein the step (3) is carried out by hydrolytic electrodialysis.
[5]
The succinic acid crystallization according to any one of [1] to [4], wherein the crystallization of succinic acid in the step (4) is performed by concentrating the succinic acid solution and then cooling. Production method.
[6]
The method for producing succinic acid according to the above [5], wherein the succinic acid concentration when the succinic acid solution is concentrated is not less than the saturation solubility at the cooling temperature.
[7]
Step (5), in which two layers are separated into an upper layer mainly containing succinic acid and a lower layer mainly containing sugar and inorganic anions derived from the reaction solution by adding alcohol to the filtrate collected in the step (4). And step (6) of separating and recovering the succinic acid concentrate and the alcohol by concentrating the upper layer liquid under reduced pressure.
The method for producing succinic acid according to any one of the above [1] to [6], comprising:
[8]
The method for producing succinic acid according to [7] above, wherein the alcohol added in the step (5) is ethanol or methanol.
[9]
The succinic acid concentrate recovered in the step (6) is supplied to the step (4) and reused as a part of the crystallization treatment stock solution, as described in the above [7] or [8] A method for producing succinic acid.
本発明の製造方法を用いれば、高純度のコハク酸を効率的に製造し、回収することができる。 By using the production method of the present invention, highly pure succinic acid can be efficiently produced and recovered.
以下、本発明に係るコハク酸の製造方法ついて詳細に説明する。
本発明（Ｉ）はコハク酸製造のための主工程からなる方法であり、本発明（ＩＩ）は主工程で発生したコハク酸含有液の不純物を除去する副工程からなる方法である。本発明に係るコハク酸の製造方法の全工程を、図１のプロセスフローに示す。
Hereinafter, the manufacturing method of the succinic acid which concerns on this invention is demonstrated in detail.
The present invention (I) is a method comprising a main process for producing succinic acid, and the present invention (II) is a process comprising a sub-process for removing impurities of the succinic acid-containing liquid generated in the main process. The whole process of the manufacturing method of the succinic acid based on this invention is shown in the process flow of FIG.
主工程としては、好気的に微生物を培養する工程（１）（＝培養工程）、微生物を嫌気的に反応させてコハク酸塩を生産する工程（２）（＝反応工程）、コハク酸塩をコハク酸に転化する工程（３）（＝酸転化工程）、およびコハク酸を結晶化して固液分離することにより、コハク酸の結晶および濾液を回収する工程（４）（＝結晶回収工程）を含む。 The main steps are aerobic microorganism culturing step (1) (= cultivation step), a microorganism anaerobically reacting to produce succinate (2) (= reaction step), succinate (3) (= acid conversion step) for converting succinic acid to succinic acid, and step (4) for recovering crystals of succinic acid and filtrate by solid-liquid separation by crystallization of succinic acid (= crystal recovery step) including.
また、副工程としては、工程（４）で回収した濾液にアルコールを添加して二層分離する工程（５）（＝アルコール添加工程）および工程（５）の上層液を濃縮液とアルコールとに分離して回収する工程（６）（＝アルコール分離工程）を含む。 In addition, as a sub-process, an alcohol is added to the filtrate collected in the step (4) and the two-layer separation step (5) (= alcohol addition step) and the upper layer solution in the step (5) are converted into a concentrate and alcohol. A step (6) (= alcohol separation step) of separating and collecting is included.
まず、主工程からなる本発明（Ｉ）について説明する。
本発明（Ｉ）は、微生物反応液からコハク酸を製造する方法において、膜分離、水分解電気透析、結晶化、固液分離を実施することにより、高純度のコハク酸を効率的に分離精製する方法を提供するものである。
First, the present invention (I) comprising the main steps will be described.
The present invention (I) efficiently separates and purifies high-purity succinic acid by carrying out membrane separation, hydrolyzed electrodialysis, crystallization, and solid-liquid separation in a method for producing succinic acid from a microorganism reaction solution. It provides a way to
＜培養工程および反応工程における膜分離の導入＞
高純度に精製されたコハク酸が効率的に得られる製造方法を確立するためには、発酵工程において目的生成物であるコハク酸の生産性を向上して含有不純物を抑制できるプロセスを構築すること、および、分離精製工程において簡便かつ効率的に高純度のコハク酸を取得できるプロセスを構築することが必要である。
<Introduction of membrane separation in culture process and reaction process>
In order to establish a production method that can efficiently obtain highly purified succinic acid, a process that can improve the productivity of succinic acid, which is the target product, in the fermentation process and control the contained impurities is established. In addition, it is necessary to construct a process capable of obtaining highly pure succinic acid simply and efficiently in the separation and purification step.
本発明の製造方法は、循環型の膜濾過を導入した発酵工程、水分解電気透析による酸転
化工程および濃縮冷却による結晶化を含む結晶回収工程を実施することにより、高純度に精製されたコハク酸を効率的に得ることを特徴としている。
The production method of the present invention comprises a fermentation process in which circulation membrane filtration is introduced, an acid conversion process by water-splitting electrodialysis, and a crystal recovery process including crystallization by concentration and cooling, thereby purifying the succinic acid purified to a high purity. It is characterized by efficiently obtaining an acid.
＜培養工程＞
本発明の製造方法における培養工程は特に限定されず、公知の方法で行なうことができる。
<Culture process>
The culture step in the production method of the present invention is not particularly limited, and can be performed by a known method.
本発明で用いられる微生物としては、通常の好気的な条件下で増殖し、嫌気的な条件下でコハク酸を生成する能力を有する種々の微生物、例えば、コリネバクテリウム(Ｃｏｒ
ｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ)、ブレビバクテリウム(Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ) 、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、ミクロコッカス(Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕ
ｓ）、リゾビウム(Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ)、バチルス(Ｂａｃｉｌｌｕｓ)などの各属に属する微生物が挙げられる。
Examples of the microorganism used in the present invention include various microorganisms capable of growing under normal aerobic conditions and producing succinic acid under anaerobic conditions, such as Corynebacterium (Cor
ynebacterium), Brevibacterium, Arthrobacter, Micrococcus
s), microorganisms belonging to each genus such as Rhizobium, Bacillus and the like.
また、これらの微生物は、野生株または変異株のいずれでもよく、細胞融合もしくは遺伝子操作などの遺伝子的手法により誘導される組み替え株などを用いてもよい。
このような微生物の中でも、触媒活性および反応選択性が高く、高濃度のコハク酸を生成する微生物が好ましく用いられる。生成するコハク酸の濃度としては、７０ｇ／Ｌ以上、好ましくは１００〜５００ｇ／Ｌが望ましい。
These microorganisms may be either wild strains or mutant strains, and may be recombinant strains induced by genetic techniques such as cell fusion or genetic manipulation.
Among such microorganisms, microorganisms that have high catalytic activity and reaction selectivity and that produce a high concentration of succinic acid are preferably used. The concentration of succinic acid produced is 70 g / L or more, preferably 100 to 500 g / L.
微生物を培養するための培地（＝培養培地）の炭素源としては、例えば、グルコース、シュークロース、フルクトース、廃糖蜜等の糖類などが挙げられる。これらは、単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよく、通常、０．１ｗ／ｖ％〜３０ｗ／ｖ％、好ましくは１ｗ／ｖ％〜１０ｗ／ｖ％程度の濃度で用いられる。 Examples of the carbon source of the medium for culturing the microorganism (= culture medium) include saccharides such as glucose, sucrose, fructose, and molasses. These may be used alone or in combination of two or more, and are usually used at a concentration of about 0.1 w / v% to 30 w / v%, preferably about 1 w / v% to 10 w / v%. It is done.
培養培地の窒素源としては、例えば、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムまたは尿素などが挙げられる。これらは、単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよく、通常、０．１ｗ／ｖ％〜３０ｗ／ｖ％、好ましくは１ｗ／ｖ％〜１０ｗ／ｖ％程度の濃度で用いられる。 Examples of the nitrogen source for the culture medium include ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium nitrate, sodium nitrate, potassium nitrate, and urea. These may be used alone or in combination of two or more, and are usually used at a concentration of about 0.1 w / v% to 30 w / v%, preferably about 1 w / v% to 10 w / v%. It is done.
さらに必要に応じて、リン酸１水素カリウム、リン酸２水素カリウム等のリン酸塩；硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、酢酸カルシウム、塩化マンガン等の金属塩；ビタミン類、アミノ酸、核酸などの供給源として、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸、ビオチン、チアミンなどを、菌の生育改善のために添加してもよい。 Furthermore, if necessary, phosphates such as potassium monohydrogen phosphate and potassium dihydrogen phosphate; metal salts such as magnesium sulfate, ferrous sulfate, calcium acetate and manganese chloride; supply of vitamins, amino acids, nucleic acids, etc. As a source, for example, peptone, meat extract, yeast extract, casamino acid, biotin, thiamine and the like may be added to improve the growth of bacteria.
培養は、通常、通気撹拌または好気的条件下で、２０℃〜４０℃、好ましくは２５℃〜３５℃の温度で行うことができる。また、ｐＨは５〜１０、好ましくは７〜８の範囲であり、酸またはアルカリを添加することにより調整することができる。 Culturing can be performed usually at a temperature of 20 ° C. to 40 ° C., preferably 25 ° C. to 35 ° C., under aerated stirring or aerobic conditions. The pH is in the range of 5 to 10, preferably 7 to 8, and can be adjusted by adding an acid or an alkali.
培養工程に用いる槽としては、培養中の菌体と培養培地成分とを通気しながら分散混合できる機能を有する発酵槽であれば、特に限定されない。
培養工程から反応工程への切り替え操作は、菌体が増殖した後、菌体を固液分離により濃縮して回収し、この濃縮された菌体（＝濃縮菌体）に、反応開始時に用いる培地（＝反応培地液）を添加することにより行うことができる。
The tank used for the culturing step is not particularly limited as long as it is a fermenter having a function capable of dispersing and mixing the cells and the culture medium components being cultured.
The switching operation from the culture process to the reaction process is performed by concentrating and recovering the microbial cells by solid-liquid separation after the microbial cells have grown, and using this concentrated microbial cells (= concentrated microbial cells) at the start of the reaction. (= Reaction medium solution) can be added.
発酵工程の培養工程と反応工程とを分割するメリットは、分割することにより目的に合わせて各工程を最適な条件で実施でき、生産性を向上させることができる点である。分割の効果をより一層反映させる手法として、培養工程における副生成物が反応工程に持ち込まれることを抑制することが、反応性の阻害防止、反応液の含有不純物の低減という観点
から有効である。したがって、必要に応じて切り替え操作の前に、回収した菌体に反応培地液または水を添加して固液分離を繰り返すことにより菌体を洗浄する操作を導入することもできる。
The merit of dividing the culture process and the reaction process of the fermentation process is that each process can be carried out under optimum conditions according to the purpose, and productivity can be improved. As a technique for further reflecting the effect of the division, it is effective from the viewpoint of preventing the inhibition of the reactivity and reducing the impurities contained in the reaction solution to suppress the introduction of the by-product in the culture process into the reaction process. Therefore, an operation of washing the cells by adding a reaction medium solution or water to the collected cells and repeating solid-liquid separation before the switching operation as necessary can be introduced.
この場合の固液分離方法は、特に限定されず、例えば、遠心分離、遠心濾過、フィルタープレス濾過、膜濾過などの方法で実施可能である。ただし、遠心分離、遠心濾過、フィルタープレス濾過、非循環型の膜濾過などの方法を採用する場合、菌体を固形分として回収し反応培地液に再懸濁する操作が必要となるため、処理段数が増える。また、遠心濾過およびフィルタープレス濾過のような濾布による濾過機においては、濾過性改善のために珪藻土等の濾過助剤を添加する必要があり、菌体とともに濾過助剤も反応工程に持ち込まれるため、反応や反応液回収の効率を妨げることにもなる。 The solid-liquid separation method in this case is not particularly limited, and can be carried out by methods such as centrifugation, centrifugal filtration, filter press filtration, and membrane filtration. However, when adopting methods such as centrifugation, centrifugal filtration, filter press filtration, and non-circulating membrane filtration, it is necessary to recover the cells as solids and resuspend them in the reaction medium. The number of steps increases. In addition, in a filter using a filter cloth such as centrifugal filtration and filter press filtration, it is necessary to add a filter aid such as diatomaceous earth to improve filterability, and the filter aid is brought into the reaction process together with the cells. Therefore, the efficiency of reaction and reaction liquid recovery is also hindered.
したがって、菌体を回収して取り扱うことおよび濾過助剤を使用することを必要としない、循環型の膜濾過法を採用することが最も好ましい。
膜濾過装置における膜の種類としては、精密濾過膜および／または限外濾過膜などを使用することができるが、処理能力を考慮すれば、透過流束が格段に大きい精密濾過膜が、限外濾過膜よりも好ましい。
Therefore, it is most preferable to employ a circulation type membrane filtration method that does not require the collection and handling of bacterial cells and the use of a filter aid.
As the type of membrane in the membrane filtration device, a microfiltration membrane and / or an ultrafiltration membrane can be used. However, in consideration of processing capability, a microfiltration membrane with a remarkably large permeation flux is an ultrafiltration membrane. More preferred than a filtration membrane.
膜の材質は、特に限定されず、例えば、ポリオレフィン、ポリスルフォン、ポリアクリロニトリル、ポリビニリデンジフルオライドおよびテフロン（登録商標）などの有機膜や、セラミックなどの無機材質の膜を使用することができる。 The material of the film is not particularly limited, and for example, an organic film such as polyolefin, polysulfone, polyacrylonitrile, polyvinylidene difluoride, and Teflon (registered trademark), or a film made of an inorganic material such as ceramic can be used. .
膜型式についても、循環型であればクロスフロー型またはスパイラル型のいずれを使用してもよいが、濾過面の耐閉塞性を考慮すれば、閉塞しにくく処理液の濃縮限界が高いクロスフロー型が有利である
膜の分画サイズは、０．５μｍを超えると菌体成分がリークする可能性があるため、０．５μｍ以下が好ましい。さらに、処理能力および耐菌体リーク性を考慮すれば、分画サイズは０．１０〜０．２５μmの精密濾過膜がより好ましい。
As for the membrane type, either a cross flow type or a spiral type may be used as long as it is a circulation type. However, considering the clogging resistance of the filtration surface, the cross flow type is difficult to clog and has a high concentration limit of the treatment liquid. The membrane fraction size is preferably 0.5 μm or less because cell components may leak when the membrane size exceeds 0.5 μm. Furthermore, in consideration of the treatment ability and the bacterial cell leakage resistance, a microfiltration membrane having a fraction size of 0.10 to 0.25 μm is more preferable.
精密濾過膜は限外濾過膜より分画サイズが大きいため、空孔への固形分の付着閉塞が起こりやすく、透過流束が低減しやすい傾向にある。この傾向を解消するため、精密濾過膜では限外濾過膜より、濾過膜面に水平方向の線速度を上げ、濾過膜面に垂直方向の運転圧力を下げた条件を設定する。 Since the microfiltration membrane has a larger fraction size than the ultrafiltration membrane, the solid content tends to clog the pores, and the permeation flux tends to decrease. In order to eliminate this tendency, in the microfiltration membrane, conditions are set in which the linear velocity in the horizontal direction is increased on the filtration membrane surface and the operating pressure in the vertical direction is lowered on the filtration membrane surface than in the ultrafiltration membrane.
膜濾過の場合、濃縮液を膜濾過装置の循環槽内で直接希釈した後、ポンプの液循環により直ちに再反応を開始することができる。また、膜濾過は、培養に用いた発酵槽に膜濾過装置を直接接続して、培養に引き続いて行うこともできるし、別途用意した膜濾過装置の循環槽に移して行うこともできる。 In the case of membrane filtration, after the concentrated liquid is directly diluted in the circulation tank of the membrane filtration apparatus, the re-reaction can be started immediately by the liquid circulation of the pump. Membrane filtration can be carried out directly after culturing by directly connecting the membrane filtration apparatus to the fermenter used for culturing, or can be carried out by transferring it to a separately prepared circulatory tank of the membrane filtration apparatus.
＜反応工程＞
反応工程では、前記微生物を用いて、反応培地液中、嫌気的な条件下で変換反応させることにより、コハク酸が生産される。
<Reaction process>
In the reaction step, succinic acid is produced by performing a conversion reaction under anaerobic conditions in the reaction medium solution using the microorganism.
反応培地の炭素源としては、通常、グルコース、ガラクトース、フルクトース、セロビオース、シュークロース、マルトース、デキストリン、可溶性澱粉等の糖類が用いられ、中でもグルコースが好ましい。 As the carbon source of the reaction medium, saccharides such as glucose, galactose, fructose, cellobiose, sucrose, maltose, dextrin and soluble starch are usually used, and glucose is particularly preferable.
また、微生物による反応を維持するために必要な成分として、例えば、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムまたは尿素等の窒素源、リン酸１水素カリウム、リン酸２水素カリ
ウム等のリン酸塩、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、酢酸カルシウム、塩化マンガンなどの金属塩、ビタミン類、アミノ酸、核酸などを用いてもよい。
In addition, as components necessary for maintaining a reaction by microorganisms, for example, ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium nitrate, sodium nitrate, potassium nitrate, urea or other nitrogen source, potassium monohydrogen phosphate,
微生物による反応は、通常、嫌気的な条件下で、攪拌や循環などにより菌体と反応培地成分とを分散混合した状態で、温度を２０℃〜４０℃、好ましくは２５℃〜３５℃に、ｐＨを５〜９、好ましくは６．５〜８．５に維持することにより行なわれる。 The reaction by microorganisms is usually carried out under anaerobic conditions in a state where the cells and reaction medium components are dispersed and mixed by stirring, circulation, etc., and the temperature is 20 ° C. to 40 ° C., preferably 25 ° C. to 35 ° C. It is carried out by maintaining the pH at 5-9, preferably 6.5-8.5.
嫌気的な条件の維持方法としては、例えば、窒素ガス等の不活性ガスや炭酸ガスなどを供給して封入する方法や、反応培地に二酸化炭素、炭酸塩、炭酸水素塩などの無機塩を添加する方法などが挙げられる。 Methods for maintaining anaerobic conditions include, for example, supplying inert gas such as nitrogen gas or carbon dioxide and sealing it, or adding inorganic salts such as carbon dioxide, carbonate, or bicarbonate to the reaction medium. The method of doing is mentioned.
反応の進行に伴い生産したコハク酸が蓄積されるため、ｐＨが菌体のコハク酸生産反応の適正領域から逸脱し、反応速度が低下する。そのため、アルカリを添加してｐＨの制御を行い、反応速度を維持する。添加するアルカリとしては、アンモニア、ＮａＯＨなどの水溶液を用いることができる。これにより反応速度の低減を防止することができ、また生産したコハク酸は中和され、コハク酸塩として反応液中に存在することになる。 Since the succinic acid produced with the progress of the reaction is accumulated, the pH deviates from the appropriate range for the succinic acid production reaction of the bacterial cells, and the reaction rate decreases. Therefore, the pH is controlled by adding an alkali to maintain the reaction rate. As the alkali to be added, an aqueous solution of ammonia, NaOH, or the like can be used. This can prevent a reduction in reaction rate, and the produced succinic acid is neutralized and exists in the reaction solution as a succinate.
反応工程の生産性を向上させるためには、反応液のコハク酸塩濃度の向上およびコハク酸塩生産量の増大が必要になる。
反応液のコハク酸濃度を向上させる方法としては、反応培地液を添加する方法、コハク酸の原料となる糖類および炭酸塩もしくは炭酸水素塩等を含む水溶液（＝追添反応培地液）を添加する方法、ならびに両者を組み合わせた方法などが有効である。反応培地液および／または追添反応培地液の添加方法は、連続的あるいは間欠的のいずれで行ってもよく、追添反応培地液の濃度は用いる菌の特性に合わせて適宜設定できる。また、追添反応培地液を添加する場合、糖類と、炭酸塩もしくは炭酸水素塩等とを別々に添加しても、両者を混合して添加してもよい。
In order to improve the productivity of the reaction process, it is necessary to improve the succinate concentration in the reaction solution and increase the succinate production amount.
As a method of improving the succinic acid concentration of the reaction solution, a method of adding a reaction medium solution, an aqueous solution (= addition reaction medium solution) containing a saccharide and a carbonate or hydrogen carbonate as a raw material of succinic acid are added. A method and a combination of both methods are effective. The addition method of the reaction medium solution and / or the additional reaction medium solution may be performed either continuously or intermittently, and the concentration of the additional reaction medium solution can be appropriately set according to the characteristics of the bacteria used. Moreover, when adding a supplementary reaction medium solution, saccharides and carbonate or bicarbonate may be added separately, or both may be mixed and added.
追添反応培地液には、必要に応じて窒素源、リン酸塩、金属塩、ビタミン類、アミノ酸、核酸などを、菌体反応を維持促進するために添加してもよい。これらの成分を追添反応培地に添加する方法としては、糖液に溶解して添加してもよく、あるいは別途溶解液を作成して添加してもよい。 If necessary, a nitrogen source, phosphate, metal salt, vitamins, amino acids, nucleic acids, and the like may be added to the additional reaction medium solution in order to maintain and promote the cell reaction. As a method for adding these components to the supplemental reaction medium, they may be added by dissolving in a sugar solution, or a solution may be separately prepared and added.
除菌した反応液の回収（＝除菌回収）は、生産性の向上および分離精製工程における負荷の軽減、すなわち水分解電気透析の効率向上および不純物除去の負荷軽減の観点から、コハク酸による生成物阻害により生産速度が頭打ちになる付近、すなわちその反応系において、できる限り高い濃度に達した点で開始することが好ましい。 Recovery of the sterilized reaction solution (= sterilization recovery) is generated by succinic acid from the viewpoint of improving productivity and reducing the load in the separation and purification process, that is, improving the efficiency of hydrolytic electrodialysis and reducing the load of removing impurities. It is preferable to start near the point where the production rate reaches a peak due to product inhibition, that is, at the point where the highest possible concentration is reached in the reaction system.
除菌回収は、除菌した反応液（＝除菌反応液）と濃縮された菌体（＝濃縮菌体）とを固液分離することにより、行なうことができる。固液分離は、培養工程から反応工程への切り替え操作における固液分離と同様の方法で行なうことができる。さらに、分離した濃縮菌体に、反応培地液や追添反応培地液を添加して、ｐＨ制御、嫌気性の維持、温度制御および撹拌などの操作を実施することにより、再反応させることができる。 The sterilization recovery can be carried out by solid-liquid separation of the sterilized reaction liquid (= sterilization reaction liquid) and the concentrated microbial cells (= concentrated microbial cells). The solid-liquid separation can be performed by the same method as the solid-liquid separation in the switching operation from the culture process to the reaction process. Furthermore, it is possible to react again by adding a reaction medium solution or a supplemental reaction medium solution to the separated concentrated bacterial cells and performing operations such as pH control, anaerobic maintenance, temperature control and stirring. .
このような除菌回収と再反応は、反応におけるコハク酸塩の生産量を増大させる上で有効であり、菌体当たりの生産性を向上させるとともに、反応液中の不純物を低減した後の生成物の分取を簡便にすることができる。除菌回収と再反応は、菌体のコハク酸生産活性が維持される範囲において、何回でも繰り返すことができる。 Such sterilization recovery and re-reaction are effective in increasing the amount of succinate produced in the reaction, improving productivity per cell and producing after reducing impurities in the reaction solution. Sorting of things can be simplified. The sterilization collection and re-reaction can be repeated any number of times within the range in which the succinic acid production activity of the cells is maintained.
除菌回収と再反応は、通常、並行して行うことも、交互に行うこともできる。例えば、除菌回収に循環型の膜濾過装置を用いた場合、除菌回収と濃縮菌体液の循環とを同時に行
なうことができるため、除菌回収時に平行して反応培地液や糖液の添加を連続的または断続的に実施することも、除菌回収と再反応を交互に実施することも可能である。すなわち、反応の進捗状況に応じて、除菌回収および再反応の双方を、任意のタイミングおよび任意の間隔で自由に実施することができる。
The sterilization recovery and the re-reaction can usually be performed in parallel or alternately. For example, when a circulating membrane filtration device is used for sterilization and recovery, sterilization and circulation of concentrated cell fluids can be performed at the same time. Can be performed continuously or intermittently, or sterilization recovery and re-reaction can be performed alternately. That is, according to the progress of the reaction, both sterilization and recovery and re-reaction can be freely performed at an arbitrary timing and at an arbitrary interval.
したがって、除菌回収と再反応を効率的に行う観点から、反応工程の固液分離は、循環型の膜濾過を用いることが最も好ましい形態である。
反応工程で用いられる装置として、反応槽は、反応液中の菌体と反応培地成分とが分散混合できる機能があれば特に限定されない。したがって、反応は、培養に用いた発酵槽を引き続き用いて行うこともできるし、別途用意した反応槽に移して行うこともできる。また、循環型の膜濾過装置は、反応槽とは別の循環槽を準備して接続してもよいが、反応槽に直接接続することが、好ましい形態である。
Therefore, from the viewpoint of efficiently performing sterilization collection and re-reaction, it is most preferable that the solid-liquid separation in the reaction step uses a circulation type membrane filtration.
As a device used in the reaction step, the reaction vessel is not particularly limited as long as it has a function capable of dispersing and mixing the cells in the reaction solution and the reaction medium components. Therefore, the reaction can be carried out continuously using the fermenter used for the culture, or can be carried out by transferring to a separately prepared reaction vessel. Further, the circulation type membrane filtration device may be prepared and connected to a circulation tank different from the reaction tank, but it is preferable to directly connect to the reaction tank.
反応終点は、コハク酸の生産活性（反応速度）が維持されず、コハク酸濃度の増大が停止した点を目安とする。
＜酸転化工程＞
本発明では、バイポーラ膜およびカチオン交換膜の２種類を使用した水分解電気透析装置を用いて、コハク酸塩を含有する除菌反応液を水分解電気透析処理することにより、カチオンを除去し、コハク酸塩をコハク酸に転化することができる。本発明におけるバイポーラ膜とは、アニオン交換膜とカチオン交換膜とが接合された構造を有する膜である。
The end point of the reaction is based on the point where the succinic acid production activity (reaction rate) is not maintained and the increase in the succinic acid concentration is stopped.
<Acid conversion process>
In the present invention, using a water-splitting electrodialyzer using two types of bipolar membrane and cation exchange membrane, the sterilization reaction solution containing succinate is hydrolyzed and electrodialyzed to remove cations, Succinate can be converted to succinic acid. The bipolar membrane in the present invention is a membrane having a structure in which an anion exchange membrane and a cation exchange membrane are joined.
本発明で用いられる水分解電気透析装置の構造は、カチオンを除去しコハク酸塩をコハク酸に転化することができる機能を有すれば、特に限定されない。例えば、図２の概略図に示すように、陽極（１）および陰極（４）の間にバイポーラ膜（２）とカチオン交換膜（３）とを交互に並べ、特にアニオン交換層とカチオン交換層とからなるバイポーラ膜は、陽極側にアニオン交換層、陰極側にカチオン交換層が向くように配置される。電極と膜の間および膜と膜の間にスペーサーを挿入して両末端から締め付けることにより、陽極とバイポーラ膜との間に電極室（７）、バイポーラ膜カチオン交換層側とカチオン交換膜との間に酸室（５）、カチオン交換とバイポーラ膜アニオン交換層側との間に塩基室（６）、バイポーラ膜と陰極との間に電極室（７）が組み立てられる。 The structure of the water-splitting electrodialysis apparatus used in the present invention is not particularly limited as long as it has a function capable of removing cations and converting succinate to succinic acid. For example, as shown in the schematic diagram of FIG. 2, bipolar membranes (2) and cation exchange membranes (3) are alternately arranged between the anode (1) and the cathode (4), and in particular, an anion exchange layer and a cation exchange layer. Is arranged so that the anion exchange layer faces the anode side and the cation exchange layer faces the cathode side. By inserting spacers between the electrode and the membrane and between the membrane and the membrane and tightening them from both ends, the electrode chamber (7) between the anode and the bipolar membrane, the bipolar membrane cation exchange layer side and the cation exchange membrane In the middle, an acid chamber (5), a base chamber (6) between the cation exchange and the bipolar membrane anion exchange layer side, and an electrode chamber (7) between the bipolar membrane and the cathode are assembled.
水分解電気透析処理は、酸室に処理原液である、コハク酸塩を含有する除菌反応液を、塩基室にコハク酸塩のカチオン成分と水酸基とからなるアルカリ液を、電極室にコハク酸塩のカチオン成分と水酸基とからなるアルカリ液またはコハク酸塩のカチオン成分とアニオン成分とからなる塩液を供給して行うことができる。そのための構造としては、各液を入れる槽を設置し、各室と液が循環できるラインで接続することが望ましい。 The hydrolysis electrodialysis treatment is performed by removing a sterilization reaction solution containing succinate as a treatment stock solution in an acid chamber, an alkaline solution composed of a cation component of succinate and a hydroxyl group in a base chamber, and succinic acid in an electrode chamber. It can be carried out by supplying an alkaline solution comprising a cation component of a salt and a hydroxyl group or a salt solution comprising a cation component of a succinate and an anion component. As a structure for that purpose, it is desirable to install a tank for storing each liquid and to connect each chamber with a line through which the liquid can circulate.
水分解電気透析装置に用いられるバイポーラ膜およびカチオン交換膜は、特に限定されず、公知のバイポーラ膜およびカチオン交換膜を用いることができる。
水分解電気透析を開始すると、酸室では、反応液中のカチオンがカチオン交換膜を透過して塩基室へ移動し、バイポーラ膜から水素イオンが供給されてコハク酸塩がコハク酸に転化する。また、塩基室では、移動したカチオンが、バイポーラ膜から供給された水酸イオンと結合して塩基となる。すなわち、この水分解電気透析処理により、コハク酸塩をコハク酸とアルカリとに分離し、コハク酸およびアルカリをそれぞれ回収することができる。
The bipolar membrane and cation exchange membrane used in the water-splitting electrodialysis apparatus are not particularly limited, and known bipolar membranes and cation exchange membranes can be used.
When water-splitting electrodialysis is started, in the acid chamber, cations in the reaction solution permeate the cation exchange membrane and move to the base chamber, and hydrogen ions are supplied from the bipolar membrane to convert succinate into succinic acid. In the base chamber, the moved cations are combined with the hydroxide ions supplied from the bipolar membrane to become bases. That is, by this water-splitting electrodialysis treatment, the succinate can be separated into succinic acid and alkali, and succinic acid and alkali can be recovered respectively.
水分解電気透析処理時における各液の温度は、通常、５〜７０℃、好ましくは２０〜５０℃の範囲であることが望ましい。また、電流密度は、特に限定されないが、一般には１〜３０Ａ／ｄｍ2、好ましくは２〜２０Ａ／ｄｍ2であることが望ましい。 The temperature of each solution at the time of hydrolytic electrodialysis is usually 5 to 70 ° C, preferably 20 to 50 ° C. The current density is not particularly limited, but generally 1-30 A / dm 2 , preferably 2-20 A / dm 2 is desirable.
分離したアルカリは、培養工程および反応工程で用いるｐＨ制御用のアルカリとして再利用することができる。
＜結晶回収工程＞
本発明の製造方法における結晶回収工程は、コハク酸の結晶化と結晶回収とからなる。
The separated alkali can be reused as an alkali for pH control used in the culture process and the reaction process.
<Crystal recovery process>
The crystal recovery step in the production method of the present invention comprises crystallization of succinic acid and crystal recovery.
結晶化は、水分解電気透析処理により酸転化して得たコハク酸液を濃縮処理した後、冷却することにより実施できる。この時の濃縮方法は特に限定されず、例えば、減圧濃縮缶、薄膜濃縮機、膜濃縮機などを用いた公知の方法により実施することができる。また、濃縮液を冷却して結晶を析出させる操作に用いる装置としては、冷却機能を有する槽であれば、特に限定されない。このような結晶化は、種結晶を接種することなく、上記濃縮および冷却操作のみで実施できる。 Crystallization can be carried out by concentrating a succinic acid solution obtained by acid conversion by hydrolytic electrodialysis and then cooling. The concentration method at this time is not particularly limited, and for example, it can be carried out by a known method using a vacuum concentration can, a thin film concentrator, a membrane concentrator, or the like. Moreover, as an apparatus used for operation which cools a concentrate and precipitates a crystal | crystallization, if it is a tank which has a cooling function, it will not specifically limit. Such crystallization can be carried out only by the above concentration and cooling operations without inoculating seed crystals.
濃縮後のコハク酸濃度および冷却温度は、冷却時の結晶化に支障をきたさなければ、特に限定されない。結晶化は、溶液中のコハク酸の実濃度を濃縮により増大させた状態下で冷却して溶解度を下げることにより、実濃度の溶解度を超えた分を析出させる。したがって、濃縮後のコハク酸濃度は、少なくとも冷却温度におけるコハク酸の溶解度以上の濃度であることが必要である。より多くの結晶を得るためには、濃縮の濃度が高く、冷却の温度が低いことが好ましい。例えば、６０重量％に濃縮した後、冷却を１０℃まで行うと、溶液中の９０％以上のコハク酸が結晶化する。 The concentration of succinic acid and the cooling temperature after concentration are not particularly limited as long as crystallization during cooling is not hindered. In crystallization, by cooling under a state where the actual concentration of succinic acid in the solution is increased by concentration to lower the solubility, a portion exceeding the solubility of the actual concentration is precipitated. Therefore, the succinic acid concentration after the concentration needs to be at least a concentration higher than the solubility of succinic acid at the cooling temperature. In order to obtain more crystals, it is preferable that the concentration of concentration is high and the temperature of cooling is low. For example, after concentration to 60% by weight and cooling to 10 ° C., 90% or more of succinic acid in the solution crystallizes.
結晶回収は、コハク酸を結晶化した液（＝結晶液）を固液分離し、結晶に付着している不純物をリンスにより除去して行なわれる。
固液分離の方法としては、遠心分離、遠心濾過、フィルタープレス濾過、膜濾過などの方法を採用することができる。コハク酸の回収効率、付着不純物の除去効率などを考慮すると、濾布型固液分離が有利であり、特にフィルタープレスおよび／または遠心濾過を採用することが好ましい。また、結晶回収率維持の観点から、結晶液は冷却時の温度で維持されることが好ましく、固液分離機は装置内で結晶液を冷却できる機能を有することが望ましい。
Crystal recovery is carried out by solid-liquid separation of a liquid obtained by crystallizing succinic acid (= crystal liquid) and removing impurities adhering to the crystal by rinsing.
As a method for solid-liquid separation, methods such as centrifugation, centrifugal filtration, filter press filtration, membrane filtration and the like can be employed. Considering the recovery efficiency of succinic acid, the removal efficiency of adhering impurities, filter cloth type solid-liquid separation is advantageous, and it is particularly preferable to employ a filter press and / or centrifugal filtration. Further, from the viewpoint of maintaining the crystal recovery rate, the crystal solution is preferably maintained at the temperature at the time of cooling, and the solid-liquid separator desirably has a function of cooling the crystal solution in the apparatus.
コハク酸結晶は、結晶液をフィルタープレスおよび／または遠心濾過に供給して固液分離することにより、濾過面に回収される。また、結晶回収後の濾過面に水またはコハク酸水溶液を供給することにより、結晶に付着した不純物を洗い流すこともできる。このような洗浄液は、結晶回収率維持の観点から、結晶水の温度以下に冷却されていることが好ましい。また、コハク酸濃度は飽和濃度に近い濃度であることが好ましい。供給する液量は、濾液中の不純物の種類や量、所望の精製度、回収率などに応じて適宜調整することができる。 The succinic acid crystals are recovered on the filtration surface by supplying the crystal liquid to a filter press and / or centrifugal filtration and solid-liquid separation. Further, by supplying water or a succinic acid aqueous solution to the filtration surface after crystal recovery, impurities attached to the crystal can be washed away. Such a cleaning liquid is preferably cooled below the temperature of crystal water from the viewpoint of maintaining the crystal recovery rate. The succinic acid concentration is preferably a concentration close to the saturation concentration. The amount of liquid to be supplied can be appropriately adjusted according to the type and amount of impurities in the filtrate, the desired degree of purification, the recovery rate, and the like.
結晶回収の固液分離において、結晶に付着している不純物の除去が目標の濃度以下に低減しない場合は、回収したコハク酸結晶を、水または温水で溶解した後、冷却して再結晶化し、再度固液分離を行うことにより、付着している不純物を除去してもよい。 In solid-liquid separation of crystal recovery, if removal of impurities adhering to the crystal does not decrease below the target concentration, the recovered succinic acid crystal is dissolved in water or warm water, then cooled and recrystallized, The adhered impurities may be removed by performing solid-liquid separation again.
この場合、溶解後のコハク酸濃度および冷却温度は、冷却時の結晶化に支障をきたさなければ特に限定されない。また、固液分離時の処理は、必要に応じて結晶の回収のみで行っても、水またはコハク酸液の供給による洗浄を加えて行ってもよい。また、再結晶化と再固液分離の操作の回数は一回に限定されるものでもない。 In this case, the succinic acid concentration after dissolution and the cooling temperature are not particularly limited as long as they do not hinder crystallization during cooling. Further, the treatment at the time of solid-liquid separation may be performed only by recovering crystals as necessary, or may be performed by adding water or a succinic acid solution for washing. Further, the number of operations for recrystallization and re-solid-liquid separation is not limited to one.
回収されたコハク酸結晶は、乾燥を行い乾燥品にすることもできる。この場合の（水分）乾燥方法は、コハク酸が変質せず、不純物が混入しない範囲において実施されるものであれば、特に限定されない。 The recovered succinic acid crystals can be dried to obtain a dried product. The (moisture) drying method in this case is not particularly limited as long as it is carried out within a range in which succinic acid is not altered and impurities are not mixed.
次に副工程からなる本発明（ＩＩ）について説明する。
＜アルコール添加工程＞
結晶回収の固液分離における濾液には、冷却温度の飽和溶解度以下の範囲のコハク酸が、反応液由来の無機アニオン、カチオン、糖類などの不純物と一緒に残存する。濾液は、通常、コハク酸の回収率向上の観点から、単独で精製するか、あるいは製造工程に循環して再利用される。生産を繰り返し行うことを考えた場合、濾液を単独で精製してコハク酸を回収するよりは、濾液を主工程に戻して再利用する循環型の精製方法を採用するほうが、系外へのコハク酸のロスを極小化でき有利である。
Next, the present invention (II) comprising the sub-process will be described.
<Alcohol addition process>
In the filtrate in the solid-liquid separation for crystal recovery, succinic acid in the range below the saturation solubility at the cooling temperature remains together with impurities such as inorganic anions, cations, and sugars derived from the reaction solution. From the viewpoint of improving the recovery rate of succinic acid, the filtrate is usually purified alone or recycled to the production process. When considering repetitive production, it is better to use a recirculation-type purification method that returns the filtrate to the main process and reuses it, rather than purifying the filtrate alone and recovering succinic acid. This is advantageous because the acid loss can be minimized.
しかしながら、大部分のコハク酸が結晶として回収されているため、濾液中のコハク酸に対する不純物の濃度比は増大しており、濾液をそのまま未処理の状態で主工程に戻すと、主工程に不純物を蓄積させる結果となる。したがって、主工程に戻すにしても濾液の不純物除去処理（＝副工程）が必要である。 However, since most of the succinic acid is recovered as crystals, the concentration ratio of impurities to succinic acid in the filtrate has increased, and if the filtrate is returned to the main process in an untreated state as it is, impurities are introduced into the main process. As a result of accumulating. Therefore, even if it returns to a main process, the impurity removal process (= sub process) of a filtrate is required.
本発明の製造方法は、結晶回収工程における固液分離によって回収された濾液（＝結晶濾液）中に残存するコハク酸を、副工程において精製処理を行った後に、主工程に戻して再利用することにより、コハク酸の工程ロスを極小化することを特徴としている。 In the production method of the present invention, the succinic acid remaining in the filtrate (= crystal filtrate) recovered by solid-liquid separation in the crystal recovery step is recycled to the main step after being purified in the sub-step. Thus, the process loss of succinic acid is minimized.
本発明の製造方法におけるアルコール添加工程では、結晶濾液にアルコールを添加し、充分混合して静置することにより、液層が二層化し、上層に大部分のコハク酸およびアルコールが局在し、下層には大部分の反応液由来の無機アニオンおよび糖類などの不純物が局在化、すなわち、水和して局在化した状態となる。この場合、下層は不純物成分にもよるが、不純物が溶解して水飴状になる場合と、不純物が析出して懸濁液状になる場合とがある。また、上下層の液比率は大部分が上層液となり、下層は半分以下である。 In the alcohol addition step in the production method of the present invention, the alcohol is added to the crystal filtrate, mixed well and allowed to stand, so that the liquid layer becomes two layers, and most of the succinic acid and alcohol are localized in the upper layer, In the lower layer, impurities such as inorganic anions and saccharides derived from most reaction solutions are localized, that is, hydrated and localized. In this case, although the lower layer depends on the impurity component, there are a case where the impurity dissolves and forms a water tank, and a case where the impurity precipitates and becomes a suspension. The liquid ratio of the upper and lower layers is mostly the upper layer liquid, and the lower layer is less than half.
アルコールは、製品への臭気付着の影響が低い点、ならびに、成分の分離効率が高い点からエタノールまたはメタノールが適している。アルコール添加量は、終濃度として２０〜８０容量％、好ましくは３０〜４０容量％である。 As the alcohol, ethanol or methanol is suitable from the viewpoint of low influence of odor adhesion to the product and high separation efficiency of components. The amount of alcohol added is 20 to 80% by volume, preferably 30 to 40% by volume as the final concentration.
二層化は、アルコール添加後に液を分散混合して均一化した後、静置させることにより行なわれる。この場合の温度は、結晶化時の冷却温度以上で行うことが好ましい。
二層化した液層の回収方法は 上下層を分離できれば特に限定されず、例えば、デカンテーションや遠心分離などの公知の方法で行なうことができる。
The two-layering is performed by allowing the liquid to be dispersed and mixed and homogenized after addition of alcohol, and then allowed to stand. The temperature in this case is preferably higher than the cooling temperature during crystallization.
The method for recovering the two-layered liquid layer is not particularly limited as long as the upper and lower layers can be separated, and can be performed by a known method such as decantation or centrifugation.
＜アルコール分離工程＞
分離された上層は、減圧濃縮などの公知の溶媒回収法により、濃縮液とアルコールとに分離回収され、濃縮液は結晶回収工程の結晶化処理原液として、アルコールはアルコール添加工程で用いられるアルコールとして、それぞれ再利用することができる。
<Alcohol separation process>
The separated upper layer is separated and recovered into a concentrated solution and alcohol by a known solvent recovery method such as vacuum concentration, the concentrated solution is used as a crystallization treatment stock solution in the crystal recovery step, and the alcohol is used as an alcohol used in the alcohol addition step. , Each can be reused.
また、分離された下層は、その不純物成分にもよるが、例えば、糖類の比率が高い場合は、培養工程および／または反応工程の培地原料として再利用することができ、本発明（Ｉ）の主工程に対する副工程として、コハク酸回収率の向上、ならびに工程副生物を循環再利用させ廃棄物極小に寄与することができる。 Moreover, although the separated lower layer depends on the impurity component, for example, when the ratio of saccharides is high, it can be reused as a medium raw material for the culturing step and / or reaction step. As a sub-process with respect to the main process, the succinic acid recovery rate can be improved, and the process by-products can be recycled and contribute to minimizing waste.
以上のように、本発明（Ｉ）による培養工程、反応工程、酸転化工程、結晶回収工程からなる主工程と、本発明（ＩＩ）によるアルコール添加工程、アルコール回収工程からなる副工程を実施することにより、発酵から分離精製までの全工程が包括的に改良される。特に、本発明の製造方法は、コハク酸の生産性、コハク酸の回収率、工程の簡略化、工程発生物の循環・再利用化、廃棄物の極小化について改善し、これにより、高純度のコハク酸結晶を効率的に得ること可能としたものである。 As described above, the main process comprising the culture process, reaction process, acid conversion process and crystal recovery process according to the present invention (I), and the sub-process comprising the alcohol addition process and alcohol recovery process according to the present invention (II) are carried out. Thus, the entire process from fermentation to separation and purification is comprehensively improved. In particular, the production method of the present invention improves succinic acid productivity, succinic acid recovery rate, simplification of processes, recycling and reuse of process products, and minimization of waste, thereby achieving high purity. The succinic acid crystal can be efficiently obtained.
〔実施例〕
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
〔Example〕
EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated more concretely based on an Example, this invention is not limited at all by these Examples.
［実施例１］
（１）培養工程
微生物としてコリネバクテリウムＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｉｕｍ Ｒ（ＦＥＲＭ Ｐ−１８９７６）を、表１に示す条件で２Ｌフラスコ中に調整した液体培地（以下「培養培地」という）７５０ｍＬに接種した後、温度３３℃の振とう培養器にて１２時間好気的に培養した。
[Example 1]
(1) Culture process Corynebacterium glutamicium R (FERM P-18976) as a microorganism is inoculated into 750 mL of a liquid medium (hereinafter referred to as “culture medium”) prepared in a 2 L flask under the conditions shown in Table 1, and then the temperature Cultivated aerobically for 12 hours in a shaking incubator at 33 ° C.
得られた培養液７５０ｍＬ全量を、表１の条件で３０Ｌ発酵槽中に調整した培養培地１５Ｌに接種した後、温度３３℃、撹拌３００ｒｐｍ、通気量１５ＮＬ／ｍｉｎ（＝１．０ＶＶＭ）、槽圧０．０６ＭＰａの好気的条件で２４時間培養した。 After inoculating 750 mL total amount of the obtained culture solution into 15 L of culture medium prepared in a 30 L fermentor under the conditions of Table 1, temperature 33 ° C., stirring 300 rpm, aeration rate 15 NL / min (= 1.0 VVM), tank pressure The cells were cultured for 24 hours under aerobic conditions of 0.06 MPa.
（２）反応工程
培養終了後直ちに培養液１５Ｌ全量を、精密濾過膜が接続された３０Ｌの攪拌機付き循環槽に供給し、ポンプ循環して圧力をかけ濾液を回収しながら培養液を５分の１容量まで精密濾過膜（商品名：マイクローザＰＳＰ１１３、旭化成工業株式会社製）を用いて濃縮した。得られた濃縮液を、表２の条件で調整した液体培地（以下「反応培地」と言う）で５倍に希釈した。この濃縮および希釈操作を再度実施し、菌体の懸濁溶液を培養培地から反応培地に切り替えた。
(2) Reaction process Immediately after completion of the culture, the entire 15 L of the culture broth is supplied to a 30 L circulating tank with a stirrer to which a microfiltration membrane is connected. The solution was concentrated to 1 volume using a microfiltration membrane (trade name: Microza PSP113, manufactured by Asahi Kasei Kogyo Co., Ltd.). The obtained concentrated liquid was diluted 5-fold with a liquid medium (hereinafter referred to as “reaction medium”) adjusted under the conditions shown in Table 2. This concentration and dilution operation was performed again, and the cell suspension was switched from the culture medium to the reaction medium.
濃縮操作の運転条件は、圧力を入口／出口＝０．２０ＭＰａ／０．０４ＭＰａ、線速度を２ｍ／ｓとした。逆洗条件は、圧力を０．３Ｐａとし、サイクルをＯＦＦ／ＯＮ＝１０分／５秒とした。 The operating conditions of the concentration operation were such that the pressure was inlet / outlet = 0.20 MPa / 0.04 MPa, and the linear velocity was 2 m / s. The backwash conditions were such that the pressure was 0.3 Pa and the cycle was OFF / ON = 10 minutes / 5 seconds.
次に、嫌気的な条件にするため、循環槽の懸濁液中に炭酸ガスを１００ｍＬ／ｍｉｎで供給しながら、撹拌１００ｒｐｍ、温度３３℃、ｐＨ７．５（下限制御）の条件で反応を開始した。なお、温度調節は電熱ヒータにより、ｐＨ制御は２５％アンモニア水により行った。 Next, in order to achieve anaerobic conditions, the reaction is started under the conditions of stirring 100 rpm, temperature 33 ° C., pH 7.5 (lower limit control) while supplying carbon dioxide gas to the suspension in the circulation tank at 100 mL / min. did. The temperature was adjusted with an electric heater, and the pH was controlled with 25% ammonia water.
反応開始３時間後から、表３および表４の条件で調整した追添反応培地１および追添反応培地２、各３．０Ｌを１２時間かけて流加した。反応液の上清をＨＰＬＣ（カラム：昭和電工（株）製「Ｓｈｏｄｅｘ（登録商標）ＲＳｐａｋ ＫＣ−８１１」、溶離液：０．１％リン酸水溶液、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、検出：ＲＩ、カラムオーブン：４０℃）により分析したところ、反応液中の主成分として、コハク酸の標準品と保持時間が一致するピークを認めた。反応開始２４時間後において、コハク酸濃度１１０ｇ／Ｌ、液量２４Ｌ、コハク酸２．６４ｋｇ、生産速度４．５８ｇ／Ｌ・Ｈｒであった。
Three hours after the start of the reaction, 3.0 L each of
反応開始２４時間後、精密濾過膜を用いて反応液を４Ｌまで濃縮し、濾液側に除菌反応液を回収した。濃縮操作の運転条件は、培養培地から反応培地に切り替えの場合と同様に実施した。運転の結果、平均透過流束８５Ｌ／Ｈｒ・ｍ2、コハク酸透過率１００％で、
濾液側にコハク酸を２．２０ｋｇ回収し、濃縮液側には菌体全量およびコハク酸０．４４ｋｇが残存した。濾液中には固形成分はなく、反応液から菌体が１００％除去されたことを確認した。
24 hours after the start of the reaction, the reaction solution was concentrated to 4 L using a microfiltration membrane, and the sterilization reaction solution was collected on the filtrate side. The operating conditions for the concentration operation were the same as in the case of switching from the culture medium to the reaction medium. As a result of operation, the average permeation flux is 85 L / Hr · m 2 , and the succinic acid permeability is 100%.
2.20 kg of succinic acid was recovered on the filtrate side, and the total amount of bacterial cells and 0.44 kg of succinic acid remained on the concentrated liquid side. There was no solid component in the filtrate, and it was confirmed that 100% of the cells were removed from the reaction solution.
循環槽に残存した濃縮液に、反応培地を添加して液量１５Ｌとし、これを再反応させた後、精密濾過により４Ｌまで濃縮して除菌反応液を回収する工程を２サイクル繰り返した。条件は、流加する追添培地液１および２の量を、ともに２．０Ｌに変更したこと以外は、前記条件と同一とした。
The reaction medium was added to the concentrated liquid remaining in the circulation tank to make a liquid volume of 15 L, this was reacted again, and the process of concentrating to 4 L by microfiltration and collecting the sterilized reaction liquid was repeated 2 cycles. The conditions were the same as those described above except that the amounts of supplemental
１サイクル目は、反応２０時間、液量２１Ｌ、コハク酸１０５ｇ／Ｌ、生産速度３．７８ｇ／Ｌ・Ｈｒ、除菌回収液中のコハク酸１．７９ｋｇであり、２サイクル目は、反応２
４時間、液量２１Ｌ、コハク酸１０４ｇ／Ｌ、生産速度３．１７ｇ／Ｌ・Ｈｒ、除菌回収液中のコハク酸１．７７ｋｇであった。
The first cycle is a reaction time of 20 hours, a liquid volume of 21 L, a succinic acid of 105 g / L, a production rate of 3.78 g / L · Hr, and 1.79 kg of succinic acid in the sterilized collection liquid.
The amount of liquid was 21 L, succinic acid 104 g / L, production rate 3.17 g / L · Hr, and succinic acid 1.77 kg in the sterilized collection liquid.
合計３回で、反応によるコハク酸生産量６．１７ｋｇ、除菌回収液量５４Ｌ、コハク酸１０７ｇ／Ｌ、５．７５ｋｇ、コハク酸回収率９３．２％であった。 In total three times, the production amount of succinic acid by reaction was 6.17 kg, the sterilization recovery amount was 54 L, succinic acid 107 g / L, 5.75 kg, and the succinic acid recovery rate was 93.2%.
（３）酸転化工程
得られた除菌回収液は、水分解電気透析による処理を行った。電気透析装置として(株)アストム製の電気透析装置ＴＳ２Ｂ−２−１０型を用い、以下の装置条件および運転条件で、除菌回収液５４Ｌを酸室に供給して行った。２４時間の通電により、コハク酸濃度１１０ｇ／Ｌ、酸転化率９５％のコハク酸転化液５１．４Ｌが得られた。電流値は、開始時が３０Ａ、終了時が５Ａであり、電流効率は９０％であった。
(3) Acid conversion step The obtained sterilization recovery liquid was subjected to treatment by hydrolytic electrodialysis. The electrodialysis apparatus TS2B-2-10 manufactured by Astom Co., Ltd. was used as the electrodialysis apparatus, and the sterilization recovery liquid 54L was supplied to the acid chamber under the following apparatus conditions and operating conditions. By energization for 24 hours, 51.4 L of a succinic acid conversion liquid having a succinic acid concentration of 110 g / L and an acid conversion of 95% was obtained. The current value was 30 A at the start and 5 A at the end, and the current efficiency was 90%.
（装置条件）
有効膜面積：０．０２ｍ2／枚
対数：１０対
膜種：バイポーラ膜ＢＰ−１Ｅ（１０枚）およびカチオン交換膜ＣＭＢ（１０枚）
電極材質：Ｎｉ陽極およびＮｉ陰極、
（運転条件）
方式：バッチ式
流量：３．０Ｌ／ｍｉｎ、
温度：２０〜３５℃、
塩基室アルカリ液：０．５Ｎ−Ｎａ2ＳＯ4、
電極室電極液：１．０Ｎ−ＮａＯＨ、
電流制御２Ｖ／対（２０Ｖ／１０対）
定電圧
（４）結晶回収工程
得られたコハク酸転化液は、３０Ｌ減圧濃縮缶により、温度５０℃、圧力０．００１ＭＰａ、撹拌１２０ｒｐｍの条件で、断続的にコハク酸液を追添加しながら５１Ｌから１５Ｌまで濃縮した。濃縮液のコハク酸濃度は３７６ｇ／Ｌであった。濃縮液は引き続き濃縮
缶内で冷却し、１０℃、撹拌８０ｒｐｍの条件で１５時間保持してコハク酸の結晶を析出させた。
(Equipment conditions)
Effective membrane area: 0.02 m 2 / sheet Logarithm: 10 Pair membrane type: bipolar membrane BP-1E (10 sheets) and cation exchange membrane CMB (10 sheets)
Electrode material: Ni anode and Ni cathode,
(Operating conditions)
Method: Batch type flow rate: 3.0 L / min,
Temperature: 20-35 ° C,
Base compartment lye: 0.5N-Na 2 SO 4,
Electrode chamber electrode solution: 1.0 N NaOH
Current control 2V / pair (20V / 10 pair)
Constant voltage (4) Crystal recovery process The obtained succinic acid conversion liquid was added to a liter of succinic acid by adding a succinic acid solution intermittently under the conditions of a temperature of 50 ° C., a pressure of 0.001 MPa and a stirring of 120 rpm using a 30 L vacuum concentrator. To 15 L. The succinic acid concentration of the concentrate was 376 g / L. The concentrated solution was subsequently cooled in a concentrating can and kept for 15 hours under conditions of 10 ° C. and stirring at 80 rpm to precipitate succinic acid crystals.
得られた結晶液１０Ｌは、１０℃を保持し、遠心濾過機（上部排出型遠心分離機Ｈ−１２２、株式会社コクサン製、回転数３０００ｒｐｍ、濾過面積０．１５ｍ2）に結晶がオ
ーバーフローしないように給液し、濾液を回収しながら固液分離した。次いで、１０℃に冷却した水を５Ｌ供給し、濾布上の結晶を洗浄した。遠心濾過機は、給液終了後濾液が出なくなるまで運転を継続した後、停止して結晶の回収を行った結果、５．４６ｋｇの結晶を得た。
The obtained crystal solution 10L is maintained at 10 ° C., so that the crystal does not overflow into the centrifugal filter (upper discharge centrifugal separator H-122, manufactured by Kokusan Co., Ltd., rotation speed 3000 rpm, filtration area 0.15 m 2 ). Then, the liquid was separated and the filtrate was collected. Next, 5 L of water cooled to 10 ° C. was supplied to wash the crystals on the filter cloth. The centrifugal filter was continuously operated until the filtrate was not discharged after the completion of the liquid supply, and then stopped to collect crystals. As a result, 5.46 kg of crystals were obtained.
得られた結晶は、含水率が６％であり、水分以外の固形分が純度９９．９％以上のコハク酸であり、重量が５．１３ｋｇあった。回収された濾液は、液量が１４．８Ｌ、コハク酸濃度が３５ｇ／Ｌ、重量が０．５２ｋｇであった。 The obtained crystal was succinic acid having a water content of 6%, a solid content other than water having a purity of 99.9% or more, and a weight of 5.13 kg. The collected filtrate had a liquid volume of 14.8 L, a succinic acid concentration of 35 g / L, and a weight of 0.52 kg.
結晶回収工程におけるコハク酸回収率は９０．９％、コハク酸の反応液から結晶回収までのワンパスの回収率は８４．８％であった。
（５）アルコール添加工程
５０Ｌ撹拌付きＳＵＳ槽に、回収した遠心濾液１４．８Ｌとエタノール２９．５Ｌとを投入し、２５℃、１２０ｒｐｍの条件で３時間撹拌して充分混合した後、撹拌を停止して２０時間静置した。静置後、ボトムバルブより下層液３Ｌを抜き出し、分液ロートに回収静置して２層分離させた後、各層を回収した結果、上層０．８Ｌ、下層２．２Ｌが得られた。５０Ｌ槽に残された液は、回収された０．８Ｌの上層と同成分であった。
The succinic acid recovery rate in the crystal recovery step was 90.9%, and the one-pass recovery rate from the succinic acid reaction solution to crystal recovery was 84.8%.
(5) Alcohol addition process 14.8L of the collected centrifugal filtrate and 29.5L of ethanol were put into a 50L stirring SUS tank, and the mixture was stirred for 3 hours at 25 ° C and 120rpm. And left to stand for 20 hours. After standing, 3 L of the lower layer liquid was extracted from the bottom valve, recovered and left in a separatory funnel and separated into two layers, and then each layer was recovered. As a result, an upper layer of 0.8 L and a lower layer of 2.2 L were obtained. The liquid left in the 50 L tank was the same component as the recovered upper layer of 0.8 L.
この分離の結果、エタノール添加した４４．３Ｌの原液中に含まれるコハク酸０．５２ｋｇ、グルコース０．２０ｋｇおよび硫酸イオン０．１８ｋｇが、４２．１Ｌの上層にコハク酸０．５２ｋｇ、グルコース０．０５ｋｇおよび硫酸イオン０．０４ｋｇの量で分配され、２．２Ｌの下層にコハク酸０ｋｇ、グルコース０．１５ｋｇおよび硫酸イオン０．１４ｋｇの量で分配された。 As a result of this separation, 0.52 kg of succinic acid, 0.20 kg of glucose and 0.18 kg of sulfate ions contained in 44.3 L of the stock solution added with ethanol were 0.52 kg of succinic acid and 0.12 kg of glucose in the upper layer of 42.1 L. It was distributed in an amount of 05 kg and 0.04 kg of sulfate ions, and was distributed in an amount of 0 kg of succinic acid, 0.15 kg of glucose and 0.14 kg of sulfate ions in the 2.2 L lower layer.
（６）アルコール分離工程
回収された上層液４２．１Ｌを減圧濃縮してエタノールを除去した結果、コハク酸１０３．０ｇ／Ｌ、グルコース９．８ｇ／Ｌ、硫酸８．４ｇ／Ｌ、エタノール濃度５容量％の濃縮液５Ｌが回収された。
(6) Alcohol separation step The recovered upper layer liquid 42.1L was concentrated under reduced pressure to remove ethanol. As a result, succinic acid 103.0 g / L, glucose 9.8 g / L, sulfuric acid 8.4 g / L, ethanol concentration 5 A 5% volumetric concentrate was recovered.
［実施例２]
（１）培養工程および（２）反応工程
実施例１と同様に培養、反応、精密濾過処理を行った結果、液量５０Ｌ、コハク酸９８ｇ／Ｌ、４．９ｋｇの除菌反応液を得た。反応生産量に対する回収率は９２．１％となった。
[Example 2]
(1) Culture process and (2) Reaction process As a result of carrying out culture, reaction and microfiltration treatment in the same manner as in Example 1, a sterilization reaction liquid having a liquid volume of 50 L, succinic acid of 98 g / L, and 4.9 kg was obtained. . The recovery rate relative to the reaction production amount was 92.1%.
（３）酸転化工程
回収した除菌反応液５０．０Ｌを、実施例１と同条件でバイポーラ電気透析処理した。２４時間の通電により、コハク酸濃度１０３ｇ／Ｌ、酸転化率９５％のコハク酸転化液５２．５Ｌが得られた。電流値は、開始時が２８Ａ、終了時が５Ａであり、電流効率は９０％であった。
(3) Acid conversion step 50.0 L of the collected sterilization reaction solution was subjected to bipolar electrodialysis under the same conditions as in Example 1. By energizing for 24 hours, 52.5 L of a succinic acid conversion liquid having a succinic acid concentration of 103 g / L and an acid conversion rate of 95% was obtained. The current value was 28 A at the start and 5 A at the end, and the current efficiency was 90%.
（４）結晶回収工程
酸転化液５２．５Ｌに、実施例１のアルコール回収工程で回収した濃縮液５Ｌを投入して、減圧濃縮により１３Ｌまで濃縮を行った後、実施例１と同条件で結晶回収を行い、５．１８ｋｇの結晶を得た。
(4) Crystal recovery step 52.5 L of acid conversion solution was charged with 5 L of the concentrated solution recovered in the alcohol recovery step of Example 1, concentrated to 13 L by vacuum concentration, and then under the same conditions as in Example 1. Crystal recovery was performed to obtain 5.18 kg of crystals.
得られた結晶は、含水率が６％であり、水分以外の固形分が純度９９．９％以上のコハク酸であり、重量が４．８７ｋｇあった。回収された濾液は、液量が１２．８Ｌ、コハク酸濃度が４３ｇ／Ｌ、重量が０．５５ｋｇであり、結晶回収工程のコハク酸回収率は９０．０％であった。反応液と追加濃縮液とを合計したコハク酸量を１００％とした場合、結晶コハク酸は７６．２％の回収率であった。 The obtained crystals were succinic acid having a moisture content of 6%, a solid content other than water having a purity of 99.9% or more, and a weight of 4.87 kg. The recovered filtrate had a liquid volume of 12.8 L, a succinic acid concentration of 43 g / L, and a weight of 0.55 kg. The succinic acid recovery rate in the crystal recovery step was 90.0%. When the total amount of succinic acid of the reaction liquid and the additional concentrated liquid was taken as 100%, the recovery of crystalline succinic acid was 76.2%.
（５）アルコール添加工程
実施例１と同じ装置に、回収した遠心濾液１２．８Ｌとエタノール２５．６Ｌとを投入し、実施例１と同条件で処理した後、ボトムバルブより下層液３Ｌを抜き出し、分液ロートに回収静置して２層分離させた後、各層を回収した結果、上層１．１Ｌおよび下層１．９Ｌが得られた。５０Ｌ槽に残された液は、回収された１．１Ｌの上層と同成分であった。
(5) Alcohol addition process 12.8L of the collected centrifugal filtrate and 25.6L of ethanol are charged into the same apparatus as in Example 1, and after processing under the same conditions as in Example 1, 3L of the lower layer liquid is extracted from the bottom valve. After collecting and allowing to separate into two layers in a separatory funnel, each layer was collected, and as a result, an upper layer 1.1 L and a lower layer 1.9 L were obtained. The liquid left in the 50 L tank was the same component as the recovered 1.1 L upper layer.
この分離の結果、エタノール添加した３８．４Ｌの原液中に含まれるコハク酸０．５５ｋｇ、グルコース０．２２ｋｇおよび硫酸イオン０．１９ｋｇが、３６．５Ｌの上層にコハク酸０．５５ｋｇ、グルコース０．０５ｋｇおよび硫酸イオン０．０４ｋｇの量で分配され、１．９Ｌの下層にコハク酸０ｋｇ、グルコース０．１７ｋｇおよび硫酸イオン０．１５ｋｇの量で分配された。 As a result of this separation, 0.55 kg of succinic acid, 0.22 kg of glucose and 0.19 kg of sulfate ions contained in 38.4 L of the stock solution added with ethanol were added to 0.55 kg of succinic acid and 0.15 kg of glucose in the upper layer of 36.5 L. It was distributed in an amount of 05 kg and 0.04 kg of sulfate ions, and was distributed in an amount of 0 kg of succinic acid, 0.17 kg of glucose and 0.15 kg of sulfate ions in the lower layer of 1.9 L.
（６）アルコール分離工程
回収された上層液３６．５Ｌを減圧濃縮してエタノールを除去した結果、コハク酸１１０．０ｇ／Ｌ、グルコース１０．１ｇ／Ｌ、硫酸８．０ｇ／Ｌ、エタノール濃度５容量％の濃縮液５Ｌが回収された。
(6) Alcohol Separation Step 36.5 L of the recovered upper layer liquid was concentrated under reduced pressure to remove ethanol. As a result, succinic acid 110.0 g / L, glucose 10.1 g / L, sulfuric acid 8.0 g / L, ethanol concentration 5 A 5% volumetric concentrate was recovered.
［実施例３］
（１）培養工程および（２）反応工程
実施例１の培養工程および反応工程において、反応工程のｐＨ制御用アルカリを１０％ＮａＯＨ水溶液に変更したこと以外は実施例１と同様に行なった結果、液量５０Ｌ、コハク酸８０ｇ／Ｌ、４．０ｋｇの除菌反応液を得た。反応生産量に対する回収率は９２．１％であった。
[Example 3]
(1) Culture step and (2) Reaction step As a result of performing in the same manner as in Example 1 except that the pH control alkali in the reaction step was changed to 10% NaOH aqueous solution in the culture step and reaction step of Example 1, A sterilization reaction solution having a liquid volume of 50 L, succinic acid 80 g / L, and 4.0 kg was obtained. The recovery rate relative to the reaction production amount was 92.1%.
（３）酸転化工程
回収した除菌反応液５０．０Ｌを、実施例１と同条件でバイポーラ電気透析処理した。２２時間の通電により、コハク酸濃度８４ｇ／Ｌ、酸転化率９５％のコハク酸転化液５２．５Ｌが得られた。電流値は、開始時が２９Ａ、終了時が４Ａであり、電流効率は９２％であった。
(3) Acid conversion step 50.0 L of the collected sterilization reaction solution was subjected to bipolar electrodialysis under the same conditions as in Example 1. By energizing for 22 hours, 52.5 L of a succinic acid conversion liquid having a succinic acid concentration of 84 g / L and an acid conversion rate of 95% was obtained. The current value was 29 A at the start and 4 A at the end, and the current efficiency was 92%.
（４）結晶回収工程
酸転化液５２．５Ｌを減圧濃縮により１０Ｌまで濃縮した後、実施例１と同条件で結晶を回収した結果、３．８７ｋｇの結晶が得られた。この結晶は、含水率が６％であり、水分以外の固形分が純度９９．９％以上のコハク酸であり、重量は３．６４ｋｇであった。回収された濾液は、液量が９．８Ｌ、コハク酸濃度が１３．２ｇ／Ｌ、重量が０．１３ｋｇであり、結晶回収工程のコハク酸回収率は９１．０％であった。反応工程のコハク酸生産量を１００％とした場合、結晶コハク酸は８３．８％の回収率であった。
(4) Crystal recovery step After 52.5 L of the acid conversion liquid was concentrated to 10 L by vacuum concentration, crystals were recovered under the same conditions as in Example 1. As a result, 3.87 kg of crystals were obtained. The crystals were succinic acid having a moisture content of 6%, a solid content other than water having a purity of 99.9% or more, and a weight of 3.64 kg. The recovered filtrate had a liquid volume of 9.8 L, a succinic acid concentration of 13.2 g / L, and a weight of 0.13 kg. The succinic acid recovery rate in the crystal recovery step was 91.0%. When the amount of succinic acid produced in the reaction step was 100%, the crystal succinic acid was recovered at 83.8%.
（５）アルコール添加工程
実施例１と同じ装置に、回収した遠心濾液９．８Ｌとエタノール１９．６Ｌとを投入し、実施例１と同条件で処理した後、ボトムバルブより下層液２Ｌを抜き出し、分液ロートに回収静置して２層分離させた後、各層を回収した結果、上層１．０Ｌおよび下層１．０
Ｌが得られた。５０Ｌ槽に残された液は、回収された１．０Ｌの上層と同成分であった。
(5) Alcohol addition step 9.8 L of recovered centrifugal filtrate and 19.6 L of ethanol are charged into the same apparatus as in Example 1, and after processing under the same conditions as in Example 1, 2 L of the lower layer liquid is extracted from the bottom valve. Then, after collecting and standing in a separatory funnel and separating the two layers, each layer was collected, and as a result, an upper layer of 1.0 L and a lower layer of 1.0
L was obtained. The liquid left in the 50 L tank was the same component as the recovered 1.0 L upper layer.
この分離の結果、エタノール添加した２９．４Ｌの原液中に含まれるコハク酸０．１３ｋｇ、グルコース０．３０ｋｇおよび硫酸イオン０．１９ｋｇが、２８．４Ｌの上層にコハク酸０．１３ｋｇ、グルコース０．０７ｋｇおよび硫酸イオン０．０４ｋｇの量で分配され、１．０Ｌ下層にコハク酸０ｋｇ、グルコース０．２３ｋｇおよび硫酸イオン０．１５ｋｇの量で分配された。 As a result of this separation, 0.13 kg of succinic acid, 0.30 kg of glucose and 0.19 kg of sulfate ion contained in 29.4 L of the stock solution to which ethanol was added, and 0.13 kg of succinic acid and 0.16 kg of glucose in the upper layer of 28.4 L. It was distributed in an amount of 07 kg and 0.04 kg of sulfate ions, and was distributed in an amount of 0 kg of succinic acid, 0.23 kg of glucose and 0.15 kg of sulfate ions in the 1.0 L lower layer.
（６）アルコール分離工程
回収された上層液２８．４Ｌを減圧濃縮してエタノールを除去した結果、コハク酸１２６．０ｇ／Ｌ、グルコース１４．１ｇ／Ｌ、硫酸８．０ｇ／Ｌ、エタノール濃度５容量％の濃縮液５Ｌが回収された。
(6) Alcohol separation step The recovered upper layer liquid 28.4 L was concentrated under reduced pressure to remove ethanol. As a result, 126.0 g / L succinic acid, 14.1 g / L glucose, 8.0 g / L sulfuric acid, ethanol concentration 5 A 5% volumetric concentrate was recovered.
（１）・・・陽極
（２）・・・バイポーラ膜
（３）・・・カチオン交換膜
（４）・・・陰極
（５）・・・酸室
（６）・・・塩基室
（７）・・・電極室
(1) ... Anode (2) ... Bipolar membrane (3) ... Cation exchange membrane (4) ... Cathode (5) ... Acid chamber (6) ... Base chamber (7) ... Electrode chamber
Claims (8)
微生物を嫌気的に反応させてコハク酸塩を生産する工程（２）、
コハク酸塩をコハク酸に転化する工程（３）、
コハク酸を結晶化して固液分離することにより、コハク酸の結晶および濾液をそれぞれ回収する工程（４）、
前記工程（４）で回収した濾液にアルコールを添加することにより、コハク酸を主に含む上層と、反応液由来の糖および無機アニオンを主に含む下層とに二層分離する工程（５）、および
該上層液を減圧濃縮することにより、コハク酸濃縮液とアルコールとを分離して回収する工程（６）
を含むことを特徴とするコハク酸の製造方法。 A step of aerobically culturing microorganisms (1),
A step (2) of producing succinate by reacting microorganisms anaerobically;
Converting succinate to succinic acid (3) ,
A step (4) of recovering crystals and filtrate of succinic acid by crystallization of succinic acid and solid-liquid separation ,
Step (5), in which two layers are separated into an upper layer mainly containing succinic acid and a lower layer mainly containing sugar and inorganic anions derived from the reaction solution by adding alcohol to the filtrate collected in the step (4). and
A step of separating and recovering the succinic acid concentrate and the alcohol by concentrating the upper layer liquid under reduced pressure (6)
A process for producing succinic acid, comprising:
前記工程（１）で用いられた培養培地から、前記工程（２）で用いられる反応培地に切り替えることを特徴とする請求項１に記載のコハク酸の製造方法。 By performing membrane filtration of the culture solution obtained in the step (1) to concentrate the cells and supplying the reaction medium solution to the concentrated cells once or repeatedly,
The method for producing succinic acid according to claim 1, wherein the culture medium used in the step (1) is switched to the reaction medium used in the step (2).
微生物による反応と除菌反応液の回収とを連続的または断続的に行うことを特徴とする請求項１または２に記載のコハク酸の製造方法。 The reaction solution in the step (2) is subjected to membrane filtration to concentrate the microbial cells, collect the sterilized reaction solution, and react with the concentrated microbial cells in parallel or alternately with the collection of the sterilization reaction solution. By supplying the medium solution,
The method for producing succinic acid according to claim 1 or 2, wherein the reaction by the microorganism and the collection of the sterilization reaction solution are performed continuously or intermittently.
とを特徴とする請求項５に記載のコハク酸の製造方法。 6. The method for producing succinic acid according to claim 5, wherein the succinic acid concentration when the succinic acid solution is concentrated is not less than the saturation solubility at the cooling temperature.
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