JP4547492B2 - アトピー素因を規定する遺伝子の検出方法 - Google Patents
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Description
本発明は、ヒトの遺伝子の検出方法に関し、より具体的には、ヒトのアレルギー素因を検出するための指標となり得る遺伝子多型の検出方法に関する発明である。
アレルギーは、アレルゲンの侵入により応答して生ずる、生体にとっては不利益な免疫反応の総称であり、その機序の違いにより、Ｉ型からＶ型までの、大きく５つに分類される。また、アトピー（異型の疾患の意味）とは、抗原と抗体による免疫反応のうち、ＩｇＥ抗体が関与するＩ型の反応を示す遺伝的な素質を意味する用語である。そして、このアトピーがかかわって発症する疾患が、アトピー性疾患である。アレルギー疾患の多くは、このアトピー性疾患であることが知られている。かかるアレルギー（アトピー）性疾患は、遺伝的な素因と、環境要因（アレルゲンの存在）によって発症するといわれている。
このように、アレルギー（アトピー）性疾患の発症要素として、アレルゲンは最も本質的なものであり、例えば、アトピー性喘息のアレルゲンは、ハウスダスト、ダニ、カンジダ等である場合が多く、アレルギー性鼻炎では、スギやブタクサの花粉である場合が多い。また、食物性アレルゲンとしては、鶏卵、ミルク、大豆等が挙げられる。
アレルギー（アトピー）性疾患の発症には、まず、生体に、アレルギー（アトピー）の素因が存在することが前提となり、その生体が、アレルゲンと接触することにより、様々な要因によって、アレルギー（アトピー）性疾患が発症する。例えば、上記のＩ型アレルギーは、即時型アレルギーとして知られており、アレルゲンが、アレルギー（アトピー）の素因を有する生体内に侵入することにより、ＩｇＥ抗体が産生される。このＩｇＥ抗体はＦｃｅレセプターを介してマスト細胞や好塩基球上に結合する。ここにアレルゲンが結合することにより、２分子のＩｇＥ抗体が架橋し、その結果、細胞内顆粒に貯蔵されているヒスタミン、セロトニン、ヘパリン、アリルサルファターゼ、ＮＣＦ（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｃｈｍｏｔａｃｔｉｃ ｆａｃｔｏｒ）、ＥＣＰ（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）などが脱顆粒により放出される。さらに、アラキドン酸から新たに産生されるロイコトリエンＢ４、Ｃ４、Ｄ４、プロスタグランジンＥ２、Ｆ２α、Ｉ２、トロンボキサンＡ２や、血小板活性化因子（ＰＡＦ）などの化学伝達物質が放出される。これら放出されたヒスタミンやロイコトリエンなどの化学伝達物質は、好酸球、好中球、リンパ球、単球、マクロファージなどの炎症細胞を刺激し、平滑筋の収縮、血管透過性の亢進、粘液分泌亢進などを引き起こし、アレルギーが発症する。
このように、アレルギー（アトピー）性疾患の発症に際しては、まず、アレルギー（アトピー）の素因が必要であり、この素因を有する生体が、アレルゲンに感作されて免疫アレルギー反応が惹起され、さらに種々の要因が加わり、はじめてアレルギー（アトピー）性疾患が発症し、さらに増悪因子によっても影響されるものと考えられている。
上述したように、ＩｇＥは、アレルギーを規定する、最も基本的で、かつ、重要な蛋白質である。
本発明の目的は、このＩｇＥの産生に関連する遺伝子とアレルギー（アトピー）の素因とを関連づける要素を見い出して、これを利用した、アレルギー（アトピー）の素因の解析手段を提供することで、アレルギー（アトピー）性疾患の発症の予防や、アレルギー（アトピー）性疾患の治療に寄与する途を提供することにある。
このように、アレルギー（アトピー）性疾患の発症要素として、アレルゲンは最も本質的なものであり、例えば、アトピー性喘息のアレルゲンは、ハウスダスト、ダニ、カンジダ等である場合が多く、アレルギー性鼻炎では、スギやブタクサの花粉である場合が多い。また、食物性アレルゲンとしては、鶏卵、ミルク、大豆等が挙げられる。
アレルギー（アトピー）性疾患の発症には、まず、生体に、アレルギー（アトピー）の素因が存在することが前提となり、その生体が、アレルゲンと接触することにより、様々な要因によって、アレルギー（アトピー）性疾患が発症する。例えば、上記のＩ型アレルギーは、即時型アレルギーとして知られており、アレルゲンが、アレルギー（アトピー）の素因を有する生体内に侵入することにより、ＩｇＥ抗体が産生される。このＩｇＥ抗体はＦｃｅレセプターを介してマスト細胞や好塩基球上に結合する。ここにアレルゲンが結合することにより、２分子のＩｇＥ抗体が架橋し、その結果、細胞内顆粒に貯蔵されているヒスタミン、セロトニン、ヘパリン、アリルサルファターゼ、ＮＣＦ（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｃｈｍｏｔａｃｔｉｃ ｆａｃｔｏｒ）、ＥＣＰ（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）などが脱顆粒により放出される。さらに、アラキドン酸から新たに産生されるロイコトリエンＢ４、Ｃ４、Ｄ４、プロスタグランジンＥ２、Ｆ２α、Ｉ２、トロンボキサンＡ２や、血小板活性化因子（ＰＡＦ）などの化学伝達物質が放出される。これら放出されたヒスタミンやロイコトリエンなどの化学伝達物質は、好酸球、好中球、リンパ球、単球、マクロファージなどの炎症細胞を刺激し、平滑筋の収縮、血管透過性の亢進、粘液分泌亢進などを引き起こし、アレルギーが発症する。
このように、アレルギー（アトピー）性疾患の発症に際しては、まず、アレルギー（アトピー）の素因が必要であり、この素因を有する生体が、アレルゲンに感作されて免疫アレルギー反応が惹起され、さらに種々の要因が加わり、はじめてアレルギー（アトピー）性疾患が発症し、さらに増悪因子によっても影響されるものと考えられている。
上述したように、ＩｇＥは、アレルギーを規定する、最も基本的で、かつ、重要な蛋白質である。
本発明の目的は、このＩｇＥの産生に関連する遺伝子とアレルギー（アトピー）の素因とを関連づける要素を見い出して、これを利用した、アレルギー（アトピー）の素因の解析手段を提供することで、アレルギー（アトピー）性疾患の発症の予防や、アレルギー（アトピー）性疾患の治療に寄与する途を提供することにある。
ＩｇＥ産生はＴ細胞（ＴＨ２）より分泌されるインターロイキン４（ＩＬ−４）等が、Ｂ細胞を刺激することにより起こる。このように、ＩｇＥの産生は、ＩＬ−４を中心とする情報伝達により誘導され、活性化される。
一方、このＩＬ−４によるＢ細胞からのＩｇＥ産生は、Ｔ細胞（ＴＨ１）より分泌されるインターフェロンγ（ＩＮＦ−γ）を中心とする情報伝達により制御され、ＩＮＦ−γ産生は、その情報伝達の上流で、さらにインターロイキン１２（ＩＬ−１２）やインターロイキン１８（ＩＬ−１８）等の、サイトカインによるＴ細胞への刺激により、その産生が誘導される。
このように、アレルギー反応の主役であるＩｇＥの産生は、ＩＬ−４による産生誘導と、ＩＮＦ−γによる産生抑制とのバランスによってコントロールされており、このバランスが崩れることによって、ＩｇＥの産生のバランスも崩れることとなる。ＩｇＥ産生促進系のシステムは、ＩＬ−４が、そのレセプターであるＩＬ−４レセプター（ＩＬ−４Ｒ）に結合することによりＩｇＥ産生が促されるシステムであり、ＩｇＥ産生抑制系のシステムは、ＩＬ−１２あるいはＩＬ−１８が、それぞれのレセプターであるＩＬ−１２レセプター（ＩＬ−１２Ｒ）あるいはＩＬ−１８レセプター（ＩＬ−１８Ｒ）に結合することによりＩＮＦ−γが分泌され、ＩｇＥ産生が抑制されるシステムである。
本発明者らは、このＩｇＥの産生システムに関連する遺伝子について着目することで、目的とするアレルギー（アトピー）の素因を遺伝子レベルで特定できるのではないか、と考えた。
本発明者の一人は、アレルギー疾患においては、家族的、あるいは、遺伝的集積があると考えられていることから、患者のＩｇＥ産生量を測定し、その結果、両親のいずれかに血清ＩｇＥ値が高値であるほど、発端者のＩｇＥが高値である結果を得た（近藤直実、他．アトピー性皮膚炎とＩＬ−１２レセプター遺伝子変異．臨床免疫３６：５３５−５４０，２００１）。また、患者末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）を分離し、マイトゲンあるいは抗原刺激により産生される、培養上清中のＩＮＦ−γとＩＬ−４量を測定したところ、ＩｇＥ高値の患者においてＩｇＥ値と産生ＩＬ−４量は正相関を示すよりは、むしろ、ＩＮＦ−γと負の相関を示すことが明らかになった（Ｔｅｒａｍｏｔｏ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ，２８：７４−８２，１９９８）。さらに、卵に過敏性のある患者では、オブアルブミン刺激後の、培養上清中のＩＬ−４量と血清ＩｇＥ値に、有意な（ｐ〈０．０１）正相関が認められ、ＩＮＦ−γ量と血清ＩｇＥ値においては、有意な（ｐ〈０．０５）逆相関が認められた（Ｋｕｗａｂａｒａ Ｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ａｌｌｅｒｇｏｌ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ５：１９８−２０４，１９９５）。また、ＩＬ−４とポークウィードマイトゲンで刺激した、ＰＢＭＣｓのＩｇＥ産生が、リコンビナントＩＮＦ−γにより抑制される（Ｋｕｗａｂａｒａ Ｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ａｌｌｅｒｇｏｌ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ５：１９８−２０４，１９９５）ことから、ＩＮＦ−γが、ＩＬ−４により誘導されるＩｇＥ産生を抑制していることと、ＩＮＦ−γの産生が低下していると、ＩｇＥ産生が亢進することが示唆された。さらに、ＩＮＦ−γのｍＲＮＡを定量したところ、ＩＮＦ−γの産生量は、ＩＮＦ−γのｍＲＮＡ量と強い正相関（ｒ＝０．９４７，ｎ＝８）を示すことから、上記ＩＮＦ−γの産生低下は、ＩＮＦ−γのｍＲＮＡ発現低下によることが明らかになった（Ｔｅｒａｍｏｔｏ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ，２８：７４−８２，１９９８）。
このような研究成果を基に、アレルギーのＩｇＥ産生過剰におけるＩＮＦ−γ産生不全と考えられる病態に関して、さらに情報伝達の上位でＩＮＦ−γの産生誘導するＩＬ−１２とＩＬ−１８について検討した。ＩＬ−１２は、分子サイズ７５ｋＤで、３５ｋＤ（ｐ３５）と４０ｋＤ（ｐ４０）のサブユニットとからなるヘテロダイマーの蛋白質である。ＩＬ−１２レセプター（ＩＬ−１２Ｒ）は、β１鎖とβ２鎖からなり、β２鎖は細胞内ドメインに３ケ所のチロシン残基を有する。
ＩＬ−１２Ｒは、ＩＬ−１２のシグナルカスケードの初発ステップである。患者由来ＰＢＭＣｓを、ＩＬ−１２、あるいは、ＩＬ−１８で刺激した際の培養上清中のＩＮＦ−γ産生量を測定した結果、両者それぞれの刺激で産生されるＩＮＦ−γ産生量は、正相関を示した。しかしながら、両者の刺激によるＩＮＦ−γ産生に乖離する症例が認められた。
このような結果は、ＰＢＭＣｓを、ＩＬ−１２刺激、フィトヘマアグラチニン（ＰＨＡ）刺激した際のＩＮＦ−γ産生量にも同様に認められた。これらのＩＮＦ−γ産生量に乖離が認められた症例について、それぞれのレセプターを含む情報伝達系の異常を検索した。
このような結果に基づき、遺伝子解析を行った結果、アレルギー（アトピー）の素因に関連する、複数の遺伝子多型が認められた（後述する）。
これらの遺伝子多型は、ＩｇＥの産生バランスに深く関わっており、これらの遺伝子多型についての解析を行うことにより、被験者のアレルギー（アトピー）の素因を検出することが可能であることを、本発明者は見い出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、後述する１〜１３で示される遺伝子多型からなる群から選ばれる１種以上の遺伝子多型を検出することにより、被験者のアレルギー素因を検出する、遺伝子の検出方法（以下、本遺伝子検出方法ともいう）を提供する発明である。
なお、「遺伝子多型」とは、遺伝子が、その塩基配列において、個体毎に異なる特異的な部位を保有していることを意味する。遺伝子多型は、第１に、特定の遺伝子のコーディング領域の多型で、当該コーディング領域によりコードされるアミノ酸残基の多型として規定される多型を含む。このタイプの多型には、ゲノムＤＮＡにおいては認められず、ゲノムＤＮＡから、ｍＲＮＡ前駆体を経て、ｍＲＮＡになる過程（主に、ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングの過程）で生ずる多型（この多型は、主にｃＤＮＡにおける多型として特定され得る）も、含まれる。また、第２に、遺伝子多型には、特定の遺伝子の非コーディング領域（典型的には、プロモーター領域、イントロン領域等）の塩基における多型も含まれる。この場合の多型は、主に、ゲノムＤＮＡにおいて規定される多型である。遺伝子多型は、その遺伝子の多型頻度、そのｍＲＮＡの発現量、蛋白発現量、あるいは蛋白の機能等の多角的な解析により、同定される。
また、本明細書において、「野生型」とは、遺伝子多型が認められる塩基またはアミノ酸残基において、具体的には、データベース等において公開されている遺伝子の塩基配列に基づく塩基またはアミノ酸残基である。また、多型塩基または多型アミノ酸残基とは、多型が認められる塩基またはアミノ酸残基における、野生型の塩基またはアミノ酸残基以外の塩基またはアミノ酸残基である。
また、「遺伝子多型の検出」とは、被験者の検体において、遺伝子多型が認められる塩基またはアミノ酸残基が、野生型塩基またはアミノ酸残基であるか、あるいは、多型塩基またはアミノ酸残基塩基であるかを検出することを意味することとする。
ところで、本明細書におけるアミノ酸の表記方法は、三文字法及び一文字法による。念のために、かかる表記内容をここに記載する。
『アラニン〔Ａｌａ（三文字法、以下同様）、Ａ（一文字法、以下同様）〕バリン〔Ｖａｌ、Ｖ〕、ロイシン〔Ｌｅｕ、Ｌ〕、イソロイシン〔Ｉｌｅ、Ｉ〕、プロリン〔Ｐｒｏ、Ｐ〕、フェニルアラニン〔Ｐｈｅ、Ｆ〕、トリプトファン〔Ｔｒｐ、Ｗ〕、メチオニン〔Ｍｅｔ、Ｍ〕、グリシン〔Ｇｌｙ、Ｇ〕、セリン〔Ｓｅｒ Ｓ〕、スレオニン〔Ｔｈｒ、Ｔ〕、システイン〔Ｃｙｓ、Ｃ〕、グルタミン〔Ｇｌｎ、Ｑ〕、アスパラギン〔Ａｓｎ、Ｎ〕、チロシン〔Ｔｙｒ、Ｙ〕、リジン〔Ｌｙｓ、Ｋ〕、アルギニン〔Ａｒｇ、Ｒ〕、ヒスチジン〔Ｈｉｓ、Ｈ〕、アスパラギン酸〔Ａｓｐ、Ｄ〕、グルタミン酸〔Ｇｌｕ、Ｅ〕』
また、本明細書中のアミノ酸残基についての表記で、例えば、「Ａ１００Ｖ」とは、「対象となるペプチドのアミノ酸配列における１００番目の、野生型のアミノ酸残基であるアラニンと、多型アミノ酸残基であるバリンにより規定される、遺伝子多型」を示すこととする。
また、同じく本明細書中の遺伝子の塩基配列についての表記で、例えば、「１０００Ｃ／Ｔ」とは、「対象となる遺伝子の塩基配列における１０００番目の、野生型の塩基であるシトシンと、多型塩基であるチミンにより規定される、遺伝子多型」を示すこととする。
また、後述する１〜９において表される遺伝子多型を特定する基となる、野生型の遺伝子配列における配列表記は、特に断らない限り、全て、ｃＤＮＡの塩基配列番号である。よって、１〜９の遺伝子多型は、全て、少なくともｃＤＮＡにおいて認められる多型であるが、かかるｃＤＮＡの多型に対応するゲノムＤＮＡにおける多型や、ｍＲＮＡにおける多型、に基づくアレルギー素因の検出にかかわる遺伝子の検出方法も、本遺伝子検出方法の技術的範囲に包含されるものである。
さらに、後述する１０〜１３において表される遺伝子多型を特定する基となる、野生型の遺伝子配列における配列表記は、インターロイキン１２・ｐ４０サブユニット遺伝子の配列として、公開データベースにおいて登録されている配列（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ：ＡＹ００８８４７）に基づいて行うこととする。
一方、このＩＬ−４によるＢ細胞からのＩｇＥ産生は、Ｔ細胞（ＴＨ１）より分泌されるインターフェロンγ（ＩＮＦ−γ）を中心とする情報伝達により制御され、ＩＮＦ−γ産生は、その情報伝達の上流で、さらにインターロイキン１２（ＩＬ−１２）やインターロイキン１８（ＩＬ−１８）等の、サイトカインによるＴ細胞への刺激により、その産生が誘導される。
このように、アレルギー反応の主役であるＩｇＥの産生は、ＩＬ−４による産生誘導と、ＩＮＦ−γによる産生抑制とのバランスによってコントロールされており、このバランスが崩れることによって、ＩｇＥの産生のバランスも崩れることとなる。ＩｇＥ産生促進系のシステムは、ＩＬ−４が、そのレセプターであるＩＬ−４レセプター（ＩＬ−４Ｒ）に結合することによりＩｇＥ産生が促されるシステムであり、ＩｇＥ産生抑制系のシステムは、ＩＬ−１２あるいはＩＬ−１８が、それぞれのレセプターであるＩＬ−１２レセプター（ＩＬ−１２Ｒ）あるいはＩＬ−１８レセプター（ＩＬ−１８Ｒ）に結合することによりＩＮＦ−γが分泌され、ＩｇＥ産生が抑制されるシステムである。
本発明者らは、このＩｇＥの産生システムに関連する遺伝子について着目することで、目的とするアレルギー（アトピー）の素因を遺伝子レベルで特定できるのではないか、と考えた。
本発明者の一人は、アレルギー疾患においては、家族的、あるいは、遺伝的集積があると考えられていることから、患者のＩｇＥ産生量を測定し、その結果、両親のいずれかに血清ＩｇＥ値が高値であるほど、発端者のＩｇＥが高値である結果を得た（近藤直実、他．アトピー性皮膚炎とＩＬ−１２レセプター遺伝子変異．臨床免疫３６：５３５−５４０，２００１）。また、患者末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）を分離し、マイトゲンあるいは抗原刺激により産生される、培養上清中のＩＮＦ−γとＩＬ−４量を測定したところ、ＩｇＥ高値の患者においてＩｇＥ値と産生ＩＬ−４量は正相関を示すよりは、むしろ、ＩＮＦ−γと負の相関を示すことが明らかになった（Ｔｅｒａｍｏｔｏ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ，２８：７４−８２，１９９８）。さらに、卵に過敏性のある患者では、オブアルブミン刺激後の、培養上清中のＩＬ−４量と血清ＩｇＥ値に、有意な（ｐ〈０．０１）正相関が認められ、ＩＮＦ−γ量と血清ＩｇＥ値においては、有意な（ｐ〈０．０５）逆相関が認められた（Ｋｕｗａｂａｒａ Ｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ａｌｌｅｒｇｏｌ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ５：１９８−２０４，１９９５）。また、ＩＬ−４とポークウィードマイトゲンで刺激した、ＰＢＭＣｓのＩｇＥ産生が、リコンビナントＩＮＦ−γにより抑制される（Ｋｕｗａｂａｒａ Ｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ａｌｌｅｒｇｏｌ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ５：１９８−２０４，１９９５）ことから、ＩＮＦ−γが、ＩＬ−４により誘導されるＩｇＥ産生を抑制していることと、ＩＮＦ−γの産生が低下していると、ＩｇＥ産生が亢進することが示唆された。さらに、ＩＮＦ−γのｍＲＮＡを定量したところ、ＩＮＦ−γの産生量は、ＩＮＦ−γのｍＲＮＡ量と強い正相関（ｒ＝０．９４７，ｎ＝８）を示すことから、上記ＩＮＦ−γの産生低下は、ＩＮＦ−γのｍＲＮＡ発現低下によることが明らかになった（Ｔｅｒａｍｏｔｏ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ，２８：７４−８２，１９９８）。
このような研究成果を基に、アレルギーのＩｇＥ産生過剰におけるＩＮＦ−γ産生不全と考えられる病態に関して、さらに情報伝達の上位でＩＮＦ−γの産生誘導するＩＬ−１２とＩＬ−１８について検討した。ＩＬ−１２は、分子サイズ７５ｋＤで、３５ｋＤ（ｐ３５）と４０ｋＤ（ｐ４０）のサブユニットとからなるヘテロダイマーの蛋白質である。ＩＬ−１２レセプター（ＩＬ−１２Ｒ）は、β１鎖とβ２鎖からなり、β２鎖は細胞内ドメインに３ケ所のチロシン残基を有する。
ＩＬ−１２Ｒは、ＩＬ−１２のシグナルカスケードの初発ステップである。患者由来ＰＢＭＣｓを、ＩＬ−１２、あるいは、ＩＬ−１８で刺激した際の培養上清中のＩＮＦ−γ産生量を測定した結果、両者それぞれの刺激で産生されるＩＮＦ−γ産生量は、正相関を示した。しかしながら、両者の刺激によるＩＮＦ−γ産生に乖離する症例が認められた。
このような結果は、ＰＢＭＣｓを、ＩＬ−１２刺激、フィトヘマアグラチニン（ＰＨＡ）刺激した際のＩＮＦ−γ産生量にも同様に認められた。これらのＩＮＦ−γ産生量に乖離が認められた症例について、それぞれのレセプターを含む情報伝達系の異常を検索した。
このような結果に基づき、遺伝子解析を行った結果、アレルギー（アトピー）の素因に関連する、複数の遺伝子多型が認められた（後述する）。
これらの遺伝子多型は、ＩｇＥの産生バランスに深く関わっており、これらの遺伝子多型についての解析を行うことにより、被験者のアレルギー（アトピー）の素因を検出することが可能であることを、本発明者は見い出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、後述する１〜１３で示される遺伝子多型からなる群から選ばれる１種以上の遺伝子多型を検出することにより、被験者のアレルギー素因を検出する、遺伝子の検出方法（以下、本遺伝子検出方法ともいう）を提供する発明である。
なお、「遺伝子多型」とは、遺伝子が、その塩基配列において、個体毎に異なる特異的な部位を保有していることを意味する。遺伝子多型は、第１に、特定の遺伝子のコーディング領域の多型で、当該コーディング領域によりコードされるアミノ酸残基の多型として規定される多型を含む。このタイプの多型には、ゲノムＤＮＡにおいては認められず、ゲノムＤＮＡから、ｍＲＮＡ前駆体を経て、ｍＲＮＡになる過程（主に、ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングの過程）で生ずる多型（この多型は、主にｃＤＮＡにおける多型として特定され得る）も、含まれる。また、第２に、遺伝子多型には、特定の遺伝子の非コーディング領域（典型的には、プロモーター領域、イントロン領域等）の塩基における多型も含まれる。この場合の多型は、主に、ゲノムＤＮＡにおいて規定される多型である。遺伝子多型は、その遺伝子の多型頻度、そのｍＲＮＡの発現量、蛋白発現量、あるいは蛋白の機能等の多角的な解析により、同定される。
また、本明細書において、「野生型」とは、遺伝子多型が認められる塩基またはアミノ酸残基において、具体的には、データベース等において公開されている遺伝子の塩基配列に基づく塩基またはアミノ酸残基である。また、多型塩基または多型アミノ酸残基とは、多型が認められる塩基またはアミノ酸残基における、野生型の塩基またはアミノ酸残基以外の塩基またはアミノ酸残基である。
また、「遺伝子多型の検出」とは、被験者の検体において、遺伝子多型が認められる塩基またはアミノ酸残基が、野生型塩基またはアミノ酸残基であるか、あるいは、多型塩基またはアミノ酸残基塩基であるかを検出することを意味することとする。
ところで、本明細書におけるアミノ酸の表記方法は、三文字法及び一文字法による。念のために、かかる表記内容をここに記載する。
『アラニン〔Ａｌａ（三文字法、以下同様）、Ａ（一文字法、以下同様）〕バリン〔Ｖａｌ、Ｖ〕、ロイシン〔Ｌｅｕ、Ｌ〕、イソロイシン〔Ｉｌｅ、Ｉ〕、プロリン〔Ｐｒｏ、Ｐ〕、フェニルアラニン〔Ｐｈｅ、Ｆ〕、トリプトファン〔Ｔｒｐ、Ｗ〕、メチオニン〔Ｍｅｔ、Ｍ〕、グリシン〔Ｇｌｙ、Ｇ〕、セリン〔Ｓｅｒ Ｓ〕、スレオニン〔Ｔｈｒ、Ｔ〕、システイン〔Ｃｙｓ、Ｃ〕、グルタミン〔Ｇｌｎ、Ｑ〕、アスパラギン〔Ａｓｎ、Ｎ〕、チロシン〔Ｔｙｒ、Ｙ〕、リジン〔Ｌｙｓ、Ｋ〕、アルギニン〔Ａｒｇ、Ｒ〕、ヒスチジン〔Ｈｉｓ、Ｈ〕、アスパラギン酸〔Ａｓｐ、Ｄ〕、グルタミン酸〔Ｇｌｕ、Ｅ〕』
また、本明細書中のアミノ酸残基についての表記で、例えば、「Ａ１００Ｖ」とは、「対象となるペプチドのアミノ酸配列における１００番目の、野生型のアミノ酸残基であるアラニンと、多型アミノ酸残基であるバリンにより規定される、遺伝子多型」を示すこととする。
また、同じく本明細書中の遺伝子の塩基配列についての表記で、例えば、「１０００Ｃ／Ｔ」とは、「対象となる遺伝子の塩基配列における１０００番目の、野生型の塩基であるシトシンと、多型塩基であるチミンにより規定される、遺伝子多型」を示すこととする。
また、後述する１〜９において表される遺伝子多型を特定する基となる、野生型の遺伝子配列における配列表記は、特に断らない限り、全て、ｃＤＮＡの塩基配列番号である。よって、１〜９の遺伝子多型は、全て、少なくともｃＤＮＡにおいて認められる多型であるが、かかるｃＤＮＡの多型に対応するゲノムＤＮＡにおける多型や、ｍＲＮＡにおける多型、に基づくアレルギー素因の検出にかかわる遺伝子の検出方法も、本遺伝子検出方法の技術的範囲に包含されるものである。
さらに、後述する１０〜１３において表される遺伝子多型を特定する基となる、野生型の遺伝子配列における配列表記は、インターロイキン１２・ｐ４０サブユニット遺伝子の配列として、公開データベースにおいて登録されている配列（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ：ＡＹ００８８４７）に基づいて行うこととする。
第１図は、インベーダー・アッセイ法のあらましを略図化した図面である。
第２図は、遺伝子多型１にかかわる、塩基配列と電気泳動図、および、その解析内容を示した図面である。
第３図は、遺伝子多型２にかかわる、塩基配列と電気泳動図、および、その解析内容を示した図面である。
第４図は、遺伝子多型３にかかわる、塩基配列と電気泳動図、および、その解析内容を示した図面である。
第５図は、遺伝子多型４にかかわる、塩基配列と電気泳動図、および、その解析内容を示した図面である。
第６図は、遺伝子多型１〜４にかかわる被験者の、培養末梢血単核球が分泌したＩｇＥ量を示す図面である。
第７図は、遺伝子多型５にかかわる、塩基配列と電気泳動図、および、その解析内容を示した図面である。
第８図は、遺伝子多型６にかかわる、塩基配列と電気泳動図、および、その解析内容を示した図面である。
第９図は、遺伝子多型７にかかわる、塩基配列と電気泳動図、および、その解析内容を示した図面である。
第１０図は、遺伝子多型８にかかわる、塩基配列と電気泳動図、および、その解析内容を示した図面である。
第１１図は、遺伝子多型８にかかわる、培養末梢血単核球が分泌したＩｇＥ量を示す図面である。
第１２図は、遺伝子多型９にかかわる、塩基配列と電気泳動図、および、その解析内容を示した図面である。
第１３図は、遺伝子多型９が認められる被験者の家系解析の結果を示す図面である。
第１４図は、遺伝子多型１０と１１が存在する部分を、その近傍の塩基配列と共に示した図面である。
第１５図は、遺伝子多型１２が存在する部分を、その近傍の塩基配列と共に示した図面である。
第１６図は、遺伝子多型１３が存在する部分を、その近傍の塩基配列と共に示した図面である。
第２図は、遺伝子多型１にかかわる、塩基配列と電気泳動図、および、その解析内容を示した図面である。
第３図は、遺伝子多型２にかかわる、塩基配列と電気泳動図、および、その解析内容を示した図面である。
第４図は、遺伝子多型３にかかわる、塩基配列と電気泳動図、および、その解析内容を示した図面である。
第５図は、遺伝子多型４にかかわる、塩基配列と電気泳動図、および、その解析内容を示した図面である。
第６図は、遺伝子多型１〜４にかかわる被験者の、培養末梢血単核球が分泌したＩｇＥ量を示す図面である。
第７図は、遺伝子多型５にかかわる、塩基配列と電気泳動図、および、その解析内容を示した図面である。
第８図は、遺伝子多型６にかかわる、塩基配列と電気泳動図、および、その解析内容を示した図面である。
第９図は、遺伝子多型７にかかわる、塩基配列と電気泳動図、および、その解析内容を示した図面である。
第１０図は、遺伝子多型８にかかわる、塩基配列と電気泳動図、および、その解析内容を示した図面である。
第１１図は、遺伝子多型８にかかわる、培養末梢血単核球が分泌したＩｇＥ量を示す図面である。
第１２図は、遺伝子多型９にかかわる、塩基配列と電気泳動図、および、その解析内容を示した図面である。
第１３図は、遺伝子多型９が認められる被験者の家系解析の結果を示す図面である。
第１４図は、遺伝子多型１０と１１が存在する部分を、その近傍の塩基配列と共に示した図面である。
第１５図は、遺伝子多型１２が存在する部分を、その近傍の塩基配列と共に示した図面である。
第１６図は、遺伝子多型１３が存在する部分を、その近傍の塩基配列と共に示した図面である。
以下、本発明の実施の形態について説明する。
上述したように、本発明は、アレルギー（アトピー）の素因に関連する遺伝子である、インターロイキン１２レセプター（ＩＬ−１２Ｒ）β２鎖およびβ１鎖遺伝子と、インターロイキン１８レセプター（ＩＬ−１８Ｒ）α鎖遺伝子と、インターフェロンγレセプター（ＩＮＦｙＲ）１鎖遺伝子と、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）・ｐ４０サブユニット遺伝子における遺伝子多型を検出することで、アレルギー（アトピー）の素因を検出する、遺伝子多型の検出方法である。
ＩＬ−１２Ｒβ２鎖遺伝子と、これがコードするＩＬ−１２Ｒβ２鎖蛋白質については、すでに解析がなされている（Ｐｒｅｓｋｙ Ｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，９３：１４００２−１４００７，１９９６）。このＩＬ−１２Ｒβ２鎖遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列と、それに対応するアミノ酸配列は、配列番号１に示した（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ：Ｕ６４１９８）。ＩＬ−１２Ｒβ１鎖遺伝子と、これがコードするＩＬ−１２Ｒβ１鎖蛋白質についても解析がなされている（Ｃｈｕａ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎ，１５３：１２８−１３６，１９９４）。このＩＬ−１２Ｒβ１鎖遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列と、それに対応するアミノ酸配列は、配列番号２に示した（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ：Ｕ０３１８７）。また、ＩＮＦγＲ１鎖遺伝子と、これがコードするＩＮＦγＲ１鎖蛋白質については、すでに解析がなされている（Ａｇｕｅｔ Ｍ，Ｃｅｌｌ，５５：２７３−２８０，１９８８）。このＩＮＦγＲ１鎖遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列と、それに対応するアミノ酸配列は、配列番号３に示した（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ：Ｊ０３１４３）。また、ＩＬ−１８Ｒα鎖遺伝子と、これがコードするＩＬ−１８Ｒα鎖蛋白質については、すでに解析がなされている（Ｐａｒｎｅｔ Ｐ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７１：３９６７−３９７０，１９９６）。このＩＬ−１８Ｒα鎖遺伝子ｃＤＮＡの塩基配列と、それに対応するアミノ酸配列は、配列番号４に示した（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ：Ｕ４３６７２）。また、上述のように、ＩＬ−１２・ｐ４０サブユニット遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列は、すでに解析がなされている（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ：ＡＹ００８８４７）。
特定の遺伝子の多型と、これらの多型遺伝子がコードして産生される多型蛋白質により惹起されると考えられる現象、すなわち、種々のアレルギー性疾患（例えば、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー等）との関係を具体的に解析することにより、本遺伝子検出方法において利用し得る、ＩＬ−１２Ｒβ２鎖遺伝子と、ＩＬ−１２Ｒβ１鎖遺伝子と、ＩＬ−１８Ｒα鎖遺伝子と、ＩＮＦγＲ１鎖遺伝子と、ＩＬ−１２・ｐ４０サブユニット遺伝子における遺伝子多型を見い出すことができる。すなわち、アレルギー（アトピー）性疾患と健常人等の組み合わせにおいて、ＩＬ−１２Ｒβ２鎖遺伝子と、ＩＬ−１２Ｒβ１鎖遺伝子と、ＩＬ−１８Ｒα鎖遺伝子と、ＩＮＦγＲ１鎖遺伝子と、ＩＬ−１２・ｐ４０サブユニット遺伝子の多型部位と多型頻度、あるいは、その多型により生ずる蛋白の機能を解析することにより、所望する遺伝子多型を見出すことができる。かかる作業の実際については、後述する実施例において、具体的に記載する。
本発明者は、前述したように、現在までに、ＩＬ−１２Ｒβ２鎖遺伝子と、ＩＬ−１２Ｒβ１鎖遺伝子と、ＩＬ−１８Ｒα鎖遺伝子と、ＩＮＦγＲ１鎖遺伝子と、ＩＬ−１２・ｐ４０サブユニット遺伝子において見い出され、アレルギー素因と関連が認められる遺伝子多型として、
１．ＩＬ−１２Ｒβ２鎖遺伝子によってコードされるＩＬ−１２Ｒβ２鎖蛋白質の３１３番目のアルギニンをコードする部位の遺伝子多型［例えば、ＩＬ−１２Ｒβ２鎖遺伝子の９３７番目の塩基がアデニンまたはグアニン（多型塩基）であることにより、上記の３１３番目の多型アミノ酸残基がグリシンとして規定される遺伝子多型等］。
２．ＩＬ−１２Ｒβ２鎖遺伝子によってコードされるＩＬ−１２Ｒβ２鎖蛋白質の６０４番目のアラニンをコードする部位の遺伝子多型［例えば、ＩＬ−１２Ｒβ２鎖遺伝子の１８１１番目の塩基がシトシンまたはチミン（多型塩基）であることにより、上記の６０４番目の多型アミノ酸残基がバリンとして規定される遺伝子多型等］。
３．ＩＬ−１２Ｒβ２鎖遺伝子によってコードされるＩＬ−１２Ｒβ２鎖蛋白質の６１９番目のグリシン以降のアミノ酸をコードする部位が欠失するか否かで規定される遺伝子多型（例えば、ＩＬ−１２Ｒβ２鎖遺伝子の１８５６〜１９４６番目の塩基が欠失するか否かにより規定される遺伝子多型等）
４．ＩＬ−１２Ｒβ２鎖遺伝子によってコードされるＩＬ−１２Ｒβ２鎖蛋白質の７２０番目のヒスチジンをコードする部位の遺伝子多型［例えば、ＩＬ−１２Ｒβ２鎖遺伝子の２１５９番目の塩基がアデニンまたはグアニン（多型塩基）であることにより、上記の７２０番目の多型アミノ酸残基がアルギニンとして規定される遺伝子多型等］。
５．ＩＬ−１２Ｒβ１鎖遺伝子によってコードされるＩＬ−１２Ｒβ１鎖蛋白質の３６１番目のアルギニンをコードする部位の遺伝子多型［例えば、ＩＬ−１２Ｒβ１鎖遺伝子の１０８１番目の塩基がシトシンまたはチミン（多型塩基）であることにより、上記の３６１番目の多型アミノ酸残基がトリプトファンとして規定される遺伝子多型等］。
６．ＩＬ−１２Ｒβ１鎖遺伝子によってコードされるＩＬ−１２Ｒβ１鎖蛋白質の３６５番目のメチオニンをコードする部位の遺伝子多型［例えば、ＩＬ−１２Ｒβ１鎖遺伝子の１０９４番目の塩基がチミンまたはシトシン（多型塩基）であることにより、上記の３６５番目の多型アミノ酸残基がスレオニンとして規定される遺伝子多型等］。
７．ＩＬ−１２Ｒβ１鎖遺伝子によってコードされるＩＬ−１２Ｒβ１鎖蛋白質の３７８番目のグリシンをコードする部位の遺伝子多型［例えば、ＩＬ−１２Ｒβ１鎖遺伝子の１１３２番目の塩基がグアニンまたはシトシン（多型塩基）であることにより、上記の３７８番目の多型アミノ酸残基がアルギニンとして規定される遺伝子多型等］。
８．ＩＬ−１８Ｒα鎖遺伝子によってコードされるＩＬ−１８Ｒα鎖蛋白質の３１７番目のアラニンが欠失しているか否かで規定される遺伝子多型（例えば、ＩＬ−１８Ｒα鎖遺伝子の９５０〜９５２番目の塩基が欠失するか否かにより規定される遺伝子多型等）。
９．ＩＮＦ−γＲ１鎖遺伝子によってコードされるＩＮＦ−γＲ１鎖蛋白質の４６７番目のロイシンをコードする部位の遺伝子多型［例えば、ＩＮＦ−γＲ１鎖遺伝子の１４００番目の塩基がチミンまたはシトシン（多型塩基）であることにより、上記の４６７番目の多型アミノ酸残基がプロリンとして規定される遺伝子多型等］。
１０．ＩＬ−１２・ｐ４０サブユニット遺伝子のイントロン１の３６９６番目のグアニンと他塩基との置換として規定される遺伝子多型（例えば、当該３６９６番目の多型塩基がアデニンである遺伝子多型等）。
１１．ＩＬ−１２・ｐ４０サブユニット遺伝子のイントロン１の３７５７番目のシトシンと他塩基との置換として規定される遺伝子多型（例えば、当該３７５７番目の多型塩基がチミンである遺伝子多型等）。
１２．ＩＬ−１２・ｐ４０サブユニット遺伝子のイントロン４の１２３５９番目のチミンと他塩基との置換として規定される遺伝子多型（例えば、当該１２３５９番目の多型塩基がグアニンである遺伝子多型等）。
１３．ＩＬ−１２・ｐ４０サブユニット遺伝子のイントロン６の１６０７８番目のシトシンと他塩基との置換として規定される遺伝子多型（例えば、当該１６０７８番目の多型塩基がチミンである遺伝子多型等）。
が挙げられる。
なお、後述するように、ＩＬ−１２・ｐ４０サブユニット遺伝子のイントロン１における上記１０と１１の遺伝子多型は、互いに連鎖平行の関係にあり、本遺伝子検出方法を、当該イントロン１に対して行うに際して、上記１０と１１の遺伝子多型のいずれかを検出することが効率的である。また、同様に、ＩＬ−１２・ｐ４０サブユニット遺伝子のイントロン４における上記１２と、イントロン６における上記１３の遺伝子多型は、互いに平行連鎖の関係にあり、本遺伝子検出方法を、当該イントロン４または６に対して行うに際して、上記１２と１３の遺伝子多型のいずれかを検出することが効率的である。
遺伝子多型部位における遺伝子多型の検出方法としては、通常公知の方法、例えば、サザンブロット法を用いたＲＦＬＰ法や、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、ＨＥＴ（ｈｅｔｅｒｏ ｄｕｐｌｅｘ ａｎａｌｙｓｉｓ）法、ＤＧＧＥ法（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）法、ＤＳ（ｄｉｒｅｃｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）法、ＣＣＭ（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｌｅａｖａｇｅ ｍｉｓｍａｔｃｈ）法、ＣＤＩ（ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、さらにはＰＣＲ法を用いた一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析法〔ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法、以下、本明細書においてはＳＳＣＰ法という〕、ＰＣＲ／ＧＣ−ｃｌａｍｐ法、インベーダー・アッセイ法〔Ｔｈｉｒｄ Ｗａｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（米国）〕等を用いることができる〔例えば、バイオマニュアルシリーズ１，遺伝子工学の基礎技術，山本 雅編，羊土社（１９９３）等を参照のこと、特に、ＰＣＲ／ＧＣ−ｃｌａｍｐ法については、Ｍｙｅｒｓ，Ｒ．Ｍ．，Ｓｈｅｆｉｅｌｄ，Ｖ．，ａｎｄ Ｃｏｘ，Ｄ．Ｒ．（１９８８）ｉｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｋ．Ｄａｖｉｅｓ，ｅｄ．ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，ｐｐ．９５−１３９等を参照のこと〕が、簡便かつ正確に遺伝子多型を特定し得るという点において、インベーダー・アッセイ法を選択することが好ましい。
第１図は、このインベーダー・アッセイ法のあらましを略図化した図面である。
第１図において、鋳型ヌクレオチド鎖１１［野生型遺伝子（ゲノムＤＮＡの塩基配列であっても、ｃＤＮＡの塩基配列であってもよい）］に対して、まず、第１のヌクレオチド鎖１２をハイブリダイズさせる。
第１のヌクレオチド鎖１２は、鋳型ヌクレオチド鎖１１における、多型検出対象塩基〔本図では、野生型がＴ（チミン）〕に相補的な塩基〔本図では、Ａ（アデニン）〕が３’末端に位置する、鋳型ヌクレオチド鎖１１に対して相補的なヌクレオチド鎖である（なお、この例では、第１のヌクレオチド鎖１２の３’末端の塩基は、多型検出対象塩基に対して相補的であるが、たとえ相補的塩基ではなくても、その塩基が、多型検出対象塩基と第２のヌクレオチド鎖の会合反応に干渉することにより、部分的三重鎖構造が形成され得る）。
次いで、この鋳型ヌクレオチド鎖１１と第１のヌクレオチド鎖１２との部分的２本鎖に対して、さらに、第２のヌクレオチド鎖１３をハイブリダイズさせる。
第２のヌクレオチド鎖１３は、鋳型ヌクレオチド鎖１１に対して相補的な「相補的部分」１３１が、３’側にあり、これと連続して、検出要素が設けられた、鋳型ヌクレオチド鎖に対して非相補的な「検出用部分」１３２が、５’側にある、複合的ヌクレオチド鎖であり、「相補的部分」１３１の最も５’側の塩基は、多型検出対象塩基（Ｔ）に対して相補的な塩基（Ａ）となっている。
この第２のハイブリダイズ反応によって、鋳型ヌクレオチド鎖１１の多型検出対象塩基部分（Ｔ）は、第１のヌクレオチド鎖１２の３’末端塩基と、第２のヌクレオチド鎖の「相補的部分」１３１の最も５’側の塩基（Ａ）との、部分的三重鎖構造が形成されることとなる。
次いで、この部分的三重鎖構造を、その３’側で特異的に切断する活性を有するヌクレアーゼ１４を作用させて、このヌクレアーゼにより切断された、第２のヌクレオチド鎖１３の検出用部分１３２’〔３’末端が、多型検出対象塩基（Ｔ）に対して相補的塩基（Ａ）となっている〕を検出することにより、鋳型ヌクレオチド鎖１１が、野生型であることを検出することができる。
本図においては、５’末端近傍に蛍光色素１５１とその３’側の近傍に蛍光消光物質（クエンチャー）１５２を標識した、ヘアピン型プローブ（ヌクレオチド鎖）１５を、上記のハイブリダイズ系と共存させることにより、上記の野生型の検出が可能である。
ヘアピン型プローブ１５の３’側の一本鎖部分は、第２のヌクレオチド鎖１３の検出用部分１３２に対して相補的に設計されており、かつ、かかる一本鎖部分の最も５’側の塩基に隣合うさらに５’側の一塩基は、多型検出対象塩基（Ｔ）となっている。そして、検出用部分１３２’が、ヘアピン型プローブ１５の一本鎖部分とハイブリダイズすると、検出用部分１３２’の３’末端の塩基（Ａ）が、ヘアピン型プローブ１５の二本鎖部分の先端において、再び、部分的三重鎖構造を形成する。これに対し、再度、ヌクレアーゼ１４が作用して、ヘアピン型プローブ１５における、蛍光色素１５１と蛍光消光物質１５２の間が切断され、蛍光色素１５１が遊離し、蛍光消光物質１５２による蛍光消光作用から開放されて、本来の蛍光が検出可能な状態となる。この蛍光を検出することにより、鋳型ヌクレオチド鎖１１が、多型検出対象塩基において多型塩基が認められない野生型遺伝子であることを検出することができる。
これに対して、鋳型ヌクレオチド１１の多型検出対象塩基が、野生型の塩基（Ｔ）ではなく、例えば、Ｇ（グアニン）であるＳＮＰ塩基であり、これをポジティブに検出する場合には、第１のヌクレオチド鎖１２と第２のヌクレオチド鎖１３における、相補的塩基を、上記のＡから、Ｇに相補的なＣ（シトシン）として、さらに、ヘアピン型プローブ１５における蛍光色素１５１と蛍光消光物質１５２を、上記の系とは異なる蛍光を発色する蛍光色素と、これに対する蛍光消光物質とすることにより、鋳型ヌクレオチド鎖１１におけるＳＮＰｓを、異なる蛍光色素の蛍光によって検出することが可能である。
また、鋳型ヌクレオチド１１が、野生型塩基と多型塩基を有するものが、混在する場合（ヘテロ型）は、上記の２種類の蛍光の混合型蛍光として、ポジティブに検出することも可能である。
なお、ここには、ヘアピン型プローブを用いた検出システムを例示したが、これ以外にも、例えば、検出用部分１３２に、直接、蛍光標識やアイソトープ標識を行って、直接、検出用部分を検出することにより、遺伝子多型を検出することも可能である。さらに、ここでは、多型塩基を有する場合も、そうでない場合も、ポジティブに検出する例を示したが、いずれかの場合においては、蛍光等の標識が検出されない、ネガティブな検出を行うことも可能である。
上述したインベーダー・アッセイ法は、技術的には、反応の進行に伴い、部分的三重鎖構造を特異的に切断するヌクレアーゼが、第２のヌクレオチド鎖の「検出用部分」を切り出す段階において（ヘアピン型プローブを用いる場合には、標識された蛍光物質を蛍光消光物質と切り離す段階においても）、連続的に働くため、蛍光等の、インベーダー・アッセイ法において用いる標識が増感される、極めて鋭敏な液相反応である。
ＰＣＲ／ＧＣ−ｃｌａｍｐ法は、ＤＧＧＥ法（ＤＮＡ変性剤の直線的な濃度勾配をつけたポリアクリルアミドゲルにおける、塩基置換を含む二本鎖ＤＮＡ断片と含まない二本鎖ＤＮＡ断片の、ＤＮＡを変性させるべきＤＮＡ変性剤濃度の相違に基づく移動度の差異を利用して、ＤＮＡの塩基置換を検出する方法）の変法であり、ＤＧＧＥ法における、「複数の塩基置換がある場合に、ポリアクリルアミドゲルにおいて、最後に融解するドメインの塩基置換を検出することができない」という欠点を、ＧＣ含量の高い領域（ＧＣ−ｃｌａｍｐ）を、塩基置換の検出対象であるＤＮＡ断片につなげることにより克服した方法である〔Ｓｈｅｆｉｅｌｄ，Ｖ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２３２−２３６等を参照のこと〕。
よって、ＰＣＲ／ＧＣ−ｃｌａｍｐ法の基本的操作等は、ＤＧＧＥ法に準ずるが、塩基置換検出の対象となるＤＮＡ断片に、ＧＣ−ｃｌａｍｐを付加する工程が必要となる。
本遺伝子検出方法における、ＩＬ−１２Ｒβ２鎖遺伝子と、ＩＬ−１２Ｒβ１鎖遺伝子と、ＩＬ−１８Ｒα鎖遺伝子と、ＩＮＦγＲ１鎖遺伝子と、ＩＬ−１２・ｐ４０サブユニット遺伝子の多型の検出の対象となるＤＮＡの出所は、特に限定されるべきものではなく、被験者の体細胞であれば、特に限定されない。例えば、末梢血や白血球等の血液検体を、本発明において好適に選択することができる。
すなわち、被験者の検体細胞（分離後、培養したものを用いることもできる）から、公知の方法を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、このゲノムＤＮＡにおいて、特定の遺伝子部位における遺伝子多型（具体的には、特定の遺伝子部位における塩基の置換、欠失、挿入等）を検出することができる。また、被験者の検体細胞（分離後、培養したものを用いることもできる）から、公知の方法を用いて、ｍＲＮＡを抽出し、このｍＲＮＡを鋳型として得られるｃＤＮＡにおける多型を検出することも可能である。
そして、この検出作業の結果、上述した特定の遺伝子部位に多型塩基が認められた場合、この遺伝子部位の変化と、アレルギー（アトピー）の素因と関連付けて、被験者が発症する蓋然性の高いアレルギー（アトピー）疾患の種類や、現に発症しているアレルギー（アトピー）疾患の原因を特定することができる。
本遺伝子検出方法を行う態様は、特に限定されず、選択する遺伝子、多型の検出方法に応じて適宜選択することができる。典型的には、本遺伝子検出方法を行うための要素が備わっている、遺伝子多型検出用キットを用いて行うことが可能である。具体的には、例えば、ウエルが設けられているマイクロプレートの個々のウエルに、本遺伝子検出方法を行うために必要な材料や試薬を組み合わせて、遺伝子多型の検出反応を行い、かかる検出反応により、所望する遺伝子多型を検出することができる。また、マイクロプレートに代えて、いわゆるマイクロアレイを用いて、遺伝子多型の検出を、さらに集約的に行うことも可能である。このように、この遺伝子多型検出用キットは、マイクロプレートやマイクロアレイ等の遺伝子検出を行う器具、試薬、希釈液等を、必要に応じて組み合わせて、その構成要素とすることができる。
本遺伝子検出方法を行うことによって、例えば、特定の遺伝子部位に多型塩基またはアミノ酸残基が認められる場合には、被験者において、アレルギー（アトピー）の素因が認められ、現時点で、被験者に異常がなくても、アレルギー（アトピー）疾患を発症するリスクが高いことを明らかにすることができる。このような場合、環境因子対策（例えば、ハウスダスト対策や、非アレルゲン食物の摂取等）を行うことによって、アレルギー（アトピー）疾患の発症を予防することが可能である。
また、例えば、既に、アレルギー（アトピー）疾患を発症している被験者に対して、本遺伝子検出方法を行うことにより、その疾患に対する原因を遺伝子レベルで、高い確度で推定することが可能である。このような場合、特定された遺伝子異常に対応した治療方法を選択することにより、より効果的なアレルギー（アトピー）疾患の治療を行うことができる。
さらに、原因遺伝子異常がアレルギー（アトピー）疾患を惹起するメカニズムを明らかにすることにより、かかるメカニズムに対応した、アレルギー（アトピー）の治療薬の開発の途を提供することも可能である。
上述したように、本発明は、アレルギー（アトピー）の素因に関連する遺伝子である、インターロイキン１２レセプター（ＩＬ−１２Ｒ）β２鎖およびβ１鎖遺伝子と、インターロイキン１８レセプター（ＩＬ−１８Ｒ）α鎖遺伝子と、インターフェロンγレセプター（ＩＮＦｙＲ）１鎖遺伝子と、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）・ｐ４０サブユニット遺伝子における遺伝子多型を検出することで、アレルギー（アトピー）の素因を検出する、遺伝子多型の検出方法である。
ＩＬ−１２Ｒβ２鎖遺伝子と、これがコードするＩＬ−１２Ｒβ２鎖蛋白質については、すでに解析がなされている（Ｐｒｅｓｋｙ Ｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，９３：１４００２−１４００７，１９９６）。このＩＬ−１２Ｒβ２鎖遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列と、それに対応するアミノ酸配列は、配列番号１に示した（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ：Ｕ６４１９８）。ＩＬ−１２Ｒβ１鎖遺伝子と、これがコードするＩＬ−１２Ｒβ１鎖蛋白質についても解析がなされている（Ｃｈｕａ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎ，１５３：１２８−１３６，１９９４）。このＩＬ−１２Ｒβ１鎖遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列と、それに対応するアミノ酸配列は、配列番号２に示した（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ：Ｕ０３１８７）。また、ＩＮＦγＲ１鎖遺伝子と、これがコードするＩＮＦγＲ１鎖蛋白質については、すでに解析がなされている（Ａｇｕｅｔ Ｍ，Ｃｅｌｌ，５５：２７３−２８０，１９８８）。このＩＮＦγＲ１鎖遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列と、それに対応するアミノ酸配列は、配列番号３に示した（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ：Ｊ０３１４３）。また、ＩＬ−１８Ｒα鎖遺伝子と、これがコードするＩＬ−１８Ｒα鎖蛋白質については、すでに解析がなされている（Ｐａｒｎｅｔ Ｐ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７１：３９６７−３９７０，１９９６）。このＩＬ−１８Ｒα鎖遺伝子ｃＤＮＡの塩基配列と、それに対応するアミノ酸配列は、配列番号４に示した（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ：Ｕ４３６７２）。また、上述のように、ＩＬ−１２・ｐ４０サブユニット遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列は、すでに解析がなされている（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ：ＡＹ００８８４７）。
特定の遺伝子の多型と、これらの多型遺伝子がコードして産生される多型蛋白質により惹起されると考えられる現象、すなわち、種々のアレルギー性疾患（例えば、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー等）との関係を具体的に解析することにより、本遺伝子検出方法において利用し得る、ＩＬ−１２Ｒβ２鎖遺伝子と、ＩＬ−１２Ｒβ１鎖遺伝子と、ＩＬ−１８Ｒα鎖遺伝子と、ＩＮＦγＲ１鎖遺伝子と、ＩＬ−１２・ｐ４０サブユニット遺伝子における遺伝子多型を見い出すことができる。すなわち、アレルギー（アトピー）性疾患と健常人等の組み合わせにおいて、ＩＬ−１２Ｒβ２鎖遺伝子と、ＩＬ−１２Ｒβ１鎖遺伝子と、ＩＬ−１８Ｒα鎖遺伝子と、ＩＮＦγＲ１鎖遺伝子と、ＩＬ−１２・ｐ４０サブユニット遺伝子の多型部位と多型頻度、あるいは、その多型により生ずる蛋白の機能を解析することにより、所望する遺伝子多型を見出すことができる。かかる作業の実際については、後述する実施例において、具体的に記載する。
本発明者は、前述したように、現在までに、ＩＬ−１２Ｒβ２鎖遺伝子と、ＩＬ−１２Ｒβ１鎖遺伝子と、ＩＬ−１８Ｒα鎖遺伝子と、ＩＮＦγＲ１鎖遺伝子と、ＩＬ−１２・ｐ４０サブユニット遺伝子において見い出され、アレルギー素因と関連が認められる遺伝子多型として、
１．ＩＬ−１２Ｒβ２鎖遺伝子によってコードされるＩＬ−１２Ｒβ２鎖蛋白質の３１３番目のアルギニンをコードする部位の遺伝子多型［例えば、ＩＬ−１２Ｒβ２鎖遺伝子の９３７番目の塩基がアデニンまたはグアニン（多型塩基）であることにより、上記の３１３番目の多型アミノ酸残基がグリシンとして規定される遺伝子多型等］。
２．ＩＬ−１２Ｒβ２鎖遺伝子によってコードされるＩＬ−１２Ｒβ２鎖蛋白質の６０４番目のアラニンをコードする部位の遺伝子多型［例えば、ＩＬ−１２Ｒβ２鎖遺伝子の１８１１番目の塩基がシトシンまたはチミン（多型塩基）であることにより、上記の６０４番目の多型アミノ酸残基がバリンとして規定される遺伝子多型等］。
３．ＩＬ−１２Ｒβ２鎖遺伝子によってコードされるＩＬ−１２Ｒβ２鎖蛋白質の６１９番目のグリシン以降のアミノ酸をコードする部位が欠失するか否かで規定される遺伝子多型（例えば、ＩＬ−１２Ｒβ２鎖遺伝子の１８５６〜１９４６番目の塩基が欠失するか否かにより規定される遺伝子多型等）
４．ＩＬ−１２Ｒβ２鎖遺伝子によってコードされるＩＬ−１２Ｒβ２鎖蛋白質の７２０番目のヒスチジンをコードする部位の遺伝子多型［例えば、ＩＬ−１２Ｒβ２鎖遺伝子の２１５９番目の塩基がアデニンまたはグアニン（多型塩基）であることにより、上記の７２０番目の多型アミノ酸残基がアルギニンとして規定される遺伝子多型等］。
５．ＩＬ−１２Ｒβ１鎖遺伝子によってコードされるＩＬ−１２Ｒβ１鎖蛋白質の３６１番目のアルギニンをコードする部位の遺伝子多型［例えば、ＩＬ−１２Ｒβ１鎖遺伝子の１０８１番目の塩基がシトシンまたはチミン（多型塩基）であることにより、上記の３６１番目の多型アミノ酸残基がトリプトファンとして規定される遺伝子多型等］。
６．ＩＬ−１２Ｒβ１鎖遺伝子によってコードされるＩＬ−１２Ｒβ１鎖蛋白質の３６５番目のメチオニンをコードする部位の遺伝子多型［例えば、ＩＬ−１２Ｒβ１鎖遺伝子の１０９４番目の塩基がチミンまたはシトシン（多型塩基）であることにより、上記の３６５番目の多型アミノ酸残基がスレオニンとして規定される遺伝子多型等］。
７．ＩＬ−１２Ｒβ１鎖遺伝子によってコードされるＩＬ−１２Ｒβ１鎖蛋白質の３７８番目のグリシンをコードする部位の遺伝子多型［例えば、ＩＬ−１２Ｒβ１鎖遺伝子の１１３２番目の塩基がグアニンまたはシトシン（多型塩基）であることにより、上記の３７８番目の多型アミノ酸残基がアルギニンとして規定される遺伝子多型等］。
８．ＩＬ−１８Ｒα鎖遺伝子によってコードされるＩＬ−１８Ｒα鎖蛋白質の３１７番目のアラニンが欠失しているか否かで規定される遺伝子多型（例えば、ＩＬ−１８Ｒα鎖遺伝子の９５０〜９５２番目の塩基が欠失するか否かにより規定される遺伝子多型等）。
９．ＩＮＦ−γＲ１鎖遺伝子によってコードされるＩＮＦ−γＲ１鎖蛋白質の４６７番目のロイシンをコードする部位の遺伝子多型［例えば、ＩＮＦ−γＲ１鎖遺伝子の１４００番目の塩基がチミンまたはシトシン（多型塩基）であることにより、上記の４６７番目の多型アミノ酸残基がプロリンとして規定される遺伝子多型等］。
１０．ＩＬ−１２・ｐ４０サブユニット遺伝子のイントロン１の３６９６番目のグアニンと他塩基との置換として規定される遺伝子多型（例えば、当該３６９６番目の多型塩基がアデニンである遺伝子多型等）。
１１．ＩＬ−１２・ｐ４０サブユニット遺伝子のイントロン１の３７５７番目のシトシンと他塩基との置換として規定される遺伝子多型（例えば、当該３７５７番目の多型塩基がチミンである遺伝子多型等）。
１２．ＩＬ−１２・ｐ４０サブユニット遺伝子のイントロン４の１２３５９番目のチミンと他塩基との置換として規定される遺伝子多型（例えば、当該１２３５９番目の多型塩基がグアニンである遺伝子多型等）。
１３．ＩＬ−１２・ｐ４０サブユニット遺伝子のイントロン６の１６０７８番目のシトシンと他塩基との置換として規定される遺伝子多型（例えば、当該１６０７８番目の多型塩基がチミンである遺伝子多型等）。
が挙げられる。
なお、後述するように、ＩＬ−１２・ｐ４０サブユニット遺伝子のイントロン１における上記１０と１１の遺伝子多型は、互いに連鎖平行の関係にあり、本遺伝子検出方法を、当該イントロン１に対して行うに際して、上記１０と１１の遺伝子多型のいずれかを検出することが効率的である。また、同様に、ＩＬ−１２・ｐ４０サブユニット遺伝子のイントロン４における上記１２と、イントロン６における上記１３の遺伝子多型は、互いに平行連鎖の関係にあり、本遺伝子検出方法を、当該イントロン４または６に対して行うに際して、上記１２と１３の遺伝子多型のいずれかを検出することが効率的である。
遺伝子多型部位における遺伝子多型の検出方法としては、通常公知の方法、例えば、サザンブロット法を用いたＲＦＬＰ法や、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、ＨＥＴ（ｈｅｔｅｒｏ ｄｕｐｌｅｘ ａｎａｌｙｓｉｓ）法、ＤＧＧＥ法（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）法、ＤＳ（ｄｉｒｅｃｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）法、ＣＣＭ（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｌｅａｖａｇｅ ｍｉｓｍａｔｃｈ）法、ＣＤＩ（ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、さらにはＰＣＲ法を用いた一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析法〔ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法、以下、本明細書においてはＳＳＣＰ法という〕、ＰＣＲ／ＧＣ−ｃｌａｍｐ法、インベーダー・アッセイ法〔Ｔｈｉｒｄ Ｗａｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（米国）〕等を用いることができる〔例えば、バイオマニュアルシリーズ１，遺伝子工学の基礎技術，山本 雅編，羊土社（１９９３）等を参照のこと、特に、ＰＣＲ／ＧＣ−ｃｌａｍｐ法については、Ｍｙｅｒｓ，Ｒ．Ｍ．，Ｓｈｅｆｉｅｌｄ，Ｖ．，ａｎｄ Ｃｏｘ，Ｄ．Ｒ．（１９８８）ｉｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｋ．Ｄａｖｉｅｓ，ｅｄ．ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，ｐｐ．９５−１３９等を参照のこと〕が、簡便かつ正確に遺伝子多型を特定し得るという点において、インベーダー・アッセイ法を選択することが好ましい。
第１図は、このインベーダー・アッセイ法のあらましを略図化した図面である。
第１図において、鋳型ヌクレオチド鎖１１［野生型遺伝子（ゲノムＤＮＡの塩基配列であっても、ｃＤＮＡの塩基配列であってもよい）］に対して、まず、第１のヌクレオチド鎖１２をハイブリダイズさせる。
第１のヌクレオチド鎖１２は、鋳型ヌクレオチド鎖１１における、多型検出対象塩基〔本図では、野生型がＴ（チミン）〕に相補的な塩基〔本図では、Ａ（アデニン）〕が３’末端に位置する、鋳型ヌクレオチド鎖１１に対して相補的なヌクレオチド鎖である（なお、この例では、第１のヌクレオチド鎖１２の３’末端の塩基は、多型検出対象塩基に対して相補的であるが、たとえ相補的塩基ではなくても、その塩基が、多型検出対象塩基と第２のヌクレオチド鎖の会合反応に干渉することにより、部分的三重鎖構造が形成され得る）。
次いで、この鋳型ヌクレオチド鎖１１と第１のヌクレオチド鎖１２との部分的２本鎖に対して、さらに、第２のヌクレオチド鎖１３をハイブリダイズさせる。
第２のヌクレオチド鎖１３は、鋳型ヌクレオチド鎖１１に対して相補的な「相補的部分」１３１が、３’側にあり、これと連続して、検出要素が設けられた、鋳型ヌクレオチド鎖に対して非相補的な「検出用部分」１３２が、５’側にある、複合的ヌクレオチド鎖であり、「相補的部分」１３１の最も５’側の塩基は、多型検出対象塩基（Ｔ）に対して相補的な塩基（Ａ）となっている。
この第２のハイブリダイズ反応によって、鋳型ヌクレオチド鎖１１の多型検出対象塩基部分（Ｔ）は、第１のヌクレオチド鎖１２の３’末端塩基と、第２のヌクレオチド鎖の「相補的部分」１３１の最も５’側の塩基（Ａ）との、部分的三重鎖構造が形成されることとなる。
次いで、この部分的三重鎖構造を、その３’側で特異的に切断する活性を有するヌクレアーゼ１４を作用させて、このヌクレアーゼにより切断された、第２のヌクレオチド鎖１３の検出用部分１３２’〔３’末端が、多型検出対象塩基（Ｔ）に対して相補的塩基（Ａ）となっている〕を検出することにより、鋳型ヌクレオチド鎖１１が、野生型であることを検出することができる。
本図においては、５’末端近傍に蛍光色素１５１とその３’側の近傍に蛍光消光物質（クエンチャー）１５２を標識した、ヘアピン型プローブ（ヌクレオチド鎖）１５を、上記のハイブリダイズ系と共存させることにより、上記の野生型の検出が可能である。
ヘアピン型プローブ１５の３’側の一本鎖部分は、第２のヌクレオチド鎖１３の検出用部分１３２に対して相補的に設計されており、かつ、かかる一本鎖部分の最も５’側の塩基に隣合うさらに５’側の一塩基は、多型検出対象塩基（Ｔ）となっている。そして、検出用部分１３２’が、ヘアピン型プローブ１５の一本鎖部分とハイブリダイズすると、検出用部分１３２’の３’末端の塩基（Ａ）が、ヘアピン型プローブ１５の二本鎖部分の先端において、再び、部分的三重鎖構造を形成する。これに対し、再度、ヌクレアーゼ１４が作用して、ヘアピン型プローブ１５における、蛍光色素１５１と蛍光消光物質１５２の間が切断され、蛍光色素１５１が遊離し、蛍光消光物質１５２による蛍光消光作用から開放されて、本来の蛍光が検出可能な状態となる。この蛍光を検出することにより、鋳型ヌクレオチド鎖１１が、多型検出対象塩基において多型塩基が認められない野生型遺伝子であることを検出することができる。
これに対して、鋳型ヌクレオチド１１の多型検出対象塩基が、野生型の塩基（Ｔ）ではなく、例えば、Ｇ（グアニン）であるＳＮＰ塩基であり、これをポジティブに検出する場合には、第１のヌクレオチド鎖１２と第２のヌクレオチド鎖１３における、相補的塩基を、上記のＡから、Ｇに相補的なＣ（シトシン）として、さらに、ヘアピン型プローブ１５における蛍光色素１５１と蛍光消光物質１５２を、上記の系とは異なる蛍光を発色する蛍光色素と、これに対する蛍光消光物質とすることにより、鋳型ヌクレオチド鎖１１におけるＳＮＰｓを、異なる蛍光色素の蛍光によって検出することが可能である。
また、鋳型ヌクレオチド１１が、野生型塩基と多型塩基を有するものが、混在する場合（ヘテロ型）は、上記の２種類の蛍光の混合型蛍光として、ポジティブに検出することも可能である。
なお、ここには、ヘアピン型プローブを用いた検出システムを例示したが、これ以外にも、例えば、検出用部分１３２に、直接、蛍光標識やアイソトープ標識を行って、直接、検出用部分を検出することにより、遺伝子多型を検出することも可能である。さらに、ここでは、多型塩基を有する場合も、そうでない場合も、ポジティブに検出する例を示したが、いずれかの場合においては、蛍光等の標識が検出されない、ネガティブな検出を行うことも可能である。
上述したインベーダー・アッセイ法は、技術的には、反応の進行に伴い、部分的三重鎖構造を特異的に切断するヌクレアーゼが、第２のヌクレオチド鎖の「検出用部分」を切り出す段階において（ヘアピン型プローブを用いる場合には、標識された蛍光物質を蛍光消光物質と切り離す段階においても）、連続的に働くため、蛍光等の、インベーダー・アッセイ法において用いる標識が増感される、極めて鋭敏な液相反応である。
ＰＣＲ／ＧＣ−ｃｌａｍｐ法は、ＤＧＧＥ法（ＤＮＡ変性剤の直線的な濃度勾配をつけたポリアクリルアミドゲルにおける、塩基置換を含む二本鎖ＤＮＡ断片と含まない二本鎖ＤＮＡ断片の、ＤＮＡを変性させるべきＤＮＡ変性剤濃度の相違に基づく移動度の差異を利用して、ＤＮＡの塩基置換を検出する方法）の変法であり、ＤＧＧＥ法における、「複数の塩基置換がある場合に、ポリアクリルアミドゲルにおいて、最後に融解するドメインの塩基置換を検出することができない」という欠点を、ＧＣ含量の高い領域（ＧＣ−ｃｌａｍｐ）を、塩基置換の検出対象であるＤＮＡ断片につなげることにより克服した方法である〔Ｓｈｅｆｉｅｌｄ，Ｖ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２３２−２３６等を参照のこと〕。
よって、ＰＣＲ／ＧＣ−ｃｌａｍｐ法の基本的操作等は、ＤＧＧＥ法に準ずるが、塩基置換検出の対象となるＤＮＡ断片に、ＧＣ−ｃｌａｍｐを付加する工程が必要となる。
本遺伝子検出方法における、ＩＬ−１２Ｒβ２鎖遺伝子と、ＩＬ−１２Ｒβ１鎖遺伝子と、ＩＬ−１８Ｒα鎖遺伝子と、ＩＮＦγＲ１鎖遺伝子と、ＩＬ−１２・ｐ４０サブユニット遺伝子の多型の検出の対象となるＤＮＡの出所は、特に限定されるべきものではなく、被験者の体細胞であれば、特に限定されない。例えば、末梢血や白血球等の血液検体を、本発明において好適に選択することができる。
すなわち、被験者の検体細胞（分離後、培養したものを用いることもできる）から、公知の方法を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、このゲノムＤＮＡにおいて、特定の遺伝子部位における遺伝子多型（具体的には、特定の遺伝子部位における塩基の置換、欠失、挿入等）を検出することができる。また、被験者の検体細胞（分離後、培養したものを用いることもできる）から、公知の方法を用いて、ｍＲＮＡを抽出し、このｍＲＮＡを鋳型として得られるｃＤＮＡにおける多型を検出することも可能である。
そして、この検出作業の結果、上述した特定の遺伝子部位に多型塩基が認められた場合、この遺伝子部位の変化と、アレルギー（アトピー）の素因と関連付けて、被験者が発症する蓋然性の高いアレルギー（アトピー）疾患の種類や、現に発症しているアレルギー（アトピー）疾患の原因を特定することができる。
本遺伝子検出方法を行う態様は、特に限定されず、選択する遺伝子、多型の検出方法に応じて適宜選択することができる。典型的には、本遺伝子検出方法を行うための要素が備わっている、遺伝子多型検出用キットを用いて行うことが可能である。具体的には、例えば、ウエルが設けられているマイクロプレートの個々のウエルに、本遺伝子検出方法を行うために必要な材料や試薬を組み合わせて、遺伝子多型の検出反応を行い、かかる検出反応により、所望する遺伝子多型を検出することができる。また、マイクロプレートに代えて、いわゆるマイクロアレイを用いて、遺伝子多型の検出を、さらに集約的に行うことも可能である。このように、この遺伝子多型検出用キットは、マイクロプレートやマイクロアレイ等の遺伝子検出を行う器具、試薬、希釈液等を、必要に応じて組み合わせて、その構成要素とすることができる。
本遺伝子検出方法を行うことによって、例えば、特定の遺伝子部位に多型塩基またはアミノ酸残基が認められる場合には、被験者において、アレルギー（アトピー）の素因が認められ、現時点で、被験者に異常がなくても、アレルギー（アトピー）疾患を発症するリスクが高いことを明らかにすることができる。このような場合、環境因子対策（例えば、ハウスダスト対策や、非アレルゲン食物の摂取等）を行うことによって、アレルギー（アトピー）疾患の発症を予防することが可能である。
また、例えば、既に、アレルギー（アトピー）疾患を発症している被験者に対して、本遺伝子検出方法を行うことにより、その疾患に対する原因を遺伝子レベルで、高い確度で推定することが可能である。このような場合、特定された遺伝子異常に対応した治療方法を選択することにより、より効果的なアレルギー（アトピー）疾患の治療を行うことができる。
さらに、原因遺伝子異常がアレルギー（アトピー）疾患を惹起するメカニズムを明らかにすることにより、かかるメカニズムに対応した、アレルギー（アトピー）の治療薬の開発の途を提供することも可能である。
以下、実施例により、本発明を、さらに具体的に説明するが、これにより、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
［遺伝子の解析法］
末梢血単核球の分離および培養
末梢血単核球は静脈より血液を５ｍｌヘパリン採血し、ヘパリン血をＦｉｃｏｌｌ（シグマ社製）に重層し、比重遠心により分離した。分離した単核球は１０％ウシ胎児血清、２ｍｍｏｌ／ｌ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、および１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシン含有ＲＰＭＩ１６４０培地にて細胞数１ｘ１０６個／ｍｌの濃度にして、５％ＣＯ２存在下で培養した。単核球の刺激は、１０μｇ／ｍｌフィトヘマアグラチニン（ＰＨＡ、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）、あるいは５ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−１２（Ｒ＆Ｄ社製）、あるいは４００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−１８（ＭＬＢ社製）を培地に添加し、行なった。
サイトカインの定量
刺激した単核球は、２４時間培養後、回収し、遠心により細胞画分を取り除き、培養上清を得た。得られた培養上清中のＩＮＦ−γ量は、ＥＬＩＳＡキット（大塚アッセイ社製）を用いて測定した。
ＢＮＡ抽出およびＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮＡは、２４時間ＰＨＡ刺激した培養単核球を回収し、Ｉｓｏｇｅｎキット（日本ジーン社製）を用いて抽出し、さらに、これを用いて、常法により、ｃＤＮＡの合成を行った。ＩＬ−１２Ｒβ１鎖、ＩＬ−１２Ｒβ２鎖、ＩＬ−１８Ｒα鎖、およびＩＮＦ−γＲ１鎖の、それぞれのｃＤＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅は、それぞれ、特異的なプライマーセット（下記第１表）を、用いて行なった。ＰＣＲ反応は９４℃で１分間、５４℃で１分間、７２℃で１分間のサイクルで、４０サイクル行なった。
塩基配列の決定
それぞれのＰＣＲ産物はＴ−ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に組み込み、組み込まれたベクターを大腸菌（ＪＭ１０９株）に導入し、琳入大腸菌株をクローニングした。クローニングした大腸菌よりプラスミドを抽出し、ダイレクトシーケンス等により、フラグメントの塩基配列を決定した。
ゲノムＤＮＡの抽出とＰＣＲ
ゲノムＤＮＡは、末梢血リンパ球より、常法に従って抽出した。このゲノムＤＮＡを鋳型として、第２表に示した配列のＰＣＲプライマーを用いて、ＩＬ−１２・ｐ４０サブユニット遺伝子のイントロン１と、イントロン４と、イントロン６の領域を、上述したＲＴ−ＰＣＲと同様の条件で増幅し、ダイレクトシーケンスにより、フラグメントの塩基配列を確認した。
［臨床における解析］
アレルギー（アトピー）疾患の患者７５名（以下、アレルギー（アトピー）疾患の患者の抽出集団を「アレルギー群」ともいう）について、非アレルギー（アトピー）疾患の健常者６２名（以下、非アレルギー（アトピー）疾患の健常者の抽出集団を「非アレルギー群」ともいう）を対照として、末梢血単核球を分離し、ＩＬ−１２、あるいはＰＨＡ刺激したときのＩＮＦ−γ産生量を測定した。
ＰＨＡ刺激によるＩＮＦ−γ産生量は、非アレルギー群において１１６〜１０３３８ｐｇ／ｍｌ（平均２８８６ｐｇ／ｍｌ）であるのに対し、アレルギー群においては、４６〜１００００ｐｇ／ｍｌ（平均１３２４ｐｇ／ｍｌ）と低下していた。また、ＩＬ−１２刺激におけるＩＮＦ−γ産生量は、非アレルギー群が、５５〜１００００ｐｇ／ｍｌ（平均９７１ｐｇ／ｍｌ）、アレルギー群が、検出限界以下から１１３０ｐｇ／ｍｌ（平均１４５ｐｇ／ｍｌ）と有意に低下が認められた。アレルギー（アトピー）疾患の患者７５名のうち、２４名は、ＩＬ−１２刺激によるＩＮＦ−γ産生量が、検出限界以下であった。このＩＮＦ−γ産生量が、検出限界以下を呈したアレルギー（アトピー）疾患例について、ＩＬ−１２Ｒβ２鎖の遺伝子を検索した。その結果、下記の遺伝子多型が特定された。
遺伝子多型１（第２図参照）
第２図に示す、塩基配列と電気泳動図、および、その解析内容からわかるように、この遺伝子多型は、ＩＬ−１２Ｒβ２鎖遺伝子の９３７番目の野生型塩基Ａが、Ｇに置換しており、この塩基置換により、ＩＬ−１２Ｒβ２鎖蛋白質の３１３番目の野生型アミノ酸残基Ａｒｇ（ＡＧＡ）が、Ｇｌｙ（ＧＧＡ）に置換する多型であった（Ｒ３１３Ｇ多型）。
後述するように、この例のような、ＩＬ−１２Ｒβ２鎖遺伝子によってコードされるＩＬ−１２Ｒβ２鎖蛋白質の３１３番目のＡｒｇをコードする部位の多型は、被験者のアレルギー素因と関連する遺伝子多型であることが明らかになった。
遺伝子多型２（第３図参照）
第３図に示す、塩基配列と電気泳動図、および、その解析内容からわかるように、この遺伝子多型は、ＩＬ−１２Ｒβ２鎖遺伝子の１８１１番目の野生型塩基Ｃが、Ｔに置換しており、この塩基置換により、ＩＬ−１２Ｒβ２鎖蛋白質の６０４番目の野生型アミノ酸残基Ａｌａ（ＧＣＴ）が、Ｖａｌ（ＧＴＴ）に置換する多型であった（Ａ６０４Ｖ多型）。
後述するように、この例のような、ＩＬ−１２Ｒβ２鎖遺伝子によってコードされるＩＬ−１２Ｒβ２鎖蛋白質の６０４番目のＡｌａをコードする部位の多型は、被験者のアレルギー素因と関連する遺伝子多型であることが明らかになった。
遺伝子多型３（第４図参照）
第４図に示す、塩基配列と電気泳動図、および、その解析内容からわかるように、この遺伝子多型は、野生型ＩＬ−１２Ｒβ２鎖遺伝子の１８５６番目から１９４６番目の９１塩基が欠失することによるフレームシフトにより、欠失部位下流４５番目のアミノ酸残基が、ストップコドン（ＴＡＧ）に置換することにより規定されるものであった。この９１塩基の欠失により、アミノ酸残基６２３個の異常なＩＬ−１２Ｒβ２鎖蛋白質が産生されることが予想される（１８５６ｄｅｌ９１多型）。
後述するように、この例のような、ＩＬ−１２Ｒβ２鎖遺伝子によってコードされるＩＬ−１２Ｒβ２鎖蛋白質の６１９番目のグリシン以降のアミノ酸残基の欠失により規定される多型は、被験者のアレルギー素因と関連する遺伝子多型であることが明らかになった。
遺伝子多型４（第５図参照）
第５図に示す、塩基配列と電気泳動図、および、その解析内容からわかるように、この遺伝子多型は、ＩＬ−１２Ｒβ２鎖遺伝子の２１５９番目の野生型塩基Ａが、Ｇに置換しており、この塩基置換によりＩＬ−１２Ｒβ２鎖蛋白質の７２０番目の野生型アミノ酸残基Ｈｉｓ（ＣＡＴ）がＡｒｇ（ＣＧＴ）に置換する多型であった（Ｈ７２０Ｒ多型）。
後述するように、この例のような、ＩＬ−１２Ｒβ２鎖遺伝子によってコードされるＩＬ−１２Ｒβ２鎖蛋白質の７２０番目のＨｉｓをコードする部位の多型は、被験者のアレルギー素因と関連する遺伝子多型であることが明らかになった。
これらの遺伝子多型１〜４が認められた被験者より、上述のごとく末梢血単核球を分離し、ＩＬ−４、ＩＮＦ−γ、およびＩＬ−１２存在下にて細胞を培養し、培養上清中に分泌されたＩｇＥ量を測定した。その結果、このような多型塩基またはアミノ酸残基が認められないアレルギー（アトピー）疾患の患者に由来する単核球においては、ＩＬ−４により惹起されるＩｇＥ産生が、ＩＮＦ−γ、あるいはＩＬ−１２共存下においてに抑制されたのに対し、これらの多型塩基またはアミノ酸残基を有するアレルギー（アトピー）疾患の患者に由来する単核球においては、ＩＮＦ−γ共存下において、ＩｇＥ産生が抑制されたが、ＩＬ−１２共存下においてはその抑制が認められなかった（第６図）。このことは、ＩＬ−１２を介したＩＮＦ−γ産生系の情報伝達における過程において異常が生じ、ＩＮＦ−γが産生されていないことを意味し、ＩＬ−１２Ｒに機能的異常が存在することを示している。
以上の結果より、遺伝子多型１〜４により、ＩＬ−１２Ｒに異常が生じ、その結果、ＩＮＦ−γの産生が出来ず、ＩＮＦ−γによるＩｇＥ産生が、十分に抑制されないことが示された。また、遺伝子多型１〜４は、アレルギー（アトピー）疾患の症例において、有意（Ｐ＝０．０１７９）に高い頻度で出現していることが示された。
さらに、ＩＬ−１２Ｒβ２鎖遺伝子における多型１、３、４は、ＩＬ−１２刺激によるＩＮＦ−γ産生量が、検出限界以下であったアレルギー（アトピー）疾患の症例２４名のうち、１０名（１８５６ｄｅｌ９１多型８名、Ｒ３１３Ｇ多型１名、Ｈ７２０Ｒ多型１名）に検出されたが、健常者７２名にはいずれの多型塩基またはアミノ酸残基も検出されなかった（第３表）。同様に、Ａ６０４Ｖ多型出現頻度は、アレルギー（アトピー）疾患の症例において有意（Ｐ＜０．００１）に高いことが示された（第４表）。
さらに下記のＩＬ−１２Ｒβ１鎖遺伝子の多型５〜７の存在が明らかになった（第５表参照）。
遺伝子多型５（第７図参照）
第７図に示す、塩基配列と電気泳動図、および、その解析内容からわかるように、この遺伝子多型は、ＩＬ−１２Ｒβ１鎖遺伝子の１０８１番目の野生型塩基ＣがＴに置換しており、この塩基置換により、ＩＬ−１２Ｒβ１鎖蛋白質の３６１番目の野生型アミノ酸残基Ａｒｇ（ＣＧＧ）が、Ｔｒｐ（ＴＧＧ）に置換する多型であった（Ｒ３６１Ｗ多型）。
後述するように、この例のような、ＩＬ−１２Ｒβ１鎖遺伝子によってコードされるＩＬ−１２Ｒβ１蛋白質の３６１番目のＡｒｇをコードする部位の多型は、被験者のアレルギー素因と関連する遺伝子多型であることが明らかになった。
遺伝子多型６（第８図参照）
第８図に示す、塩基配列と電気泳動図、および、その解析内容からわかるように、この遺伝子多型は、ＩＬ−１２Ｒβ１鎖遺伝子の１０９４番目の野生型塩基ＴがＣに置換しており、この塩基置換によりＩＬ−１２Ｒβ１鎖蛋白質の３６５番目の野生型アミノ酸残基Ｍｅｔ（ＡＴＧ）がＴｈｒ（ＡＣＧ）に置換する多型であった（Ｍ３６５Ｔ多型）。
後述するように、この例のような、ＩＬ−１２Ｒβ１鎖遺伝子によってコードされるＩＬ−１２Ｒβ１鎖蛋白質の３６５番目のメチオニンをコードする部位の多型は、被験者のアレルギー素因と関連する遺伝子多型であることが明らかになった。
遺伝子多型７（第９図参照）
第９図に示す、塩基配列と電気泳動図、および、その解析内容からわかるように、この遺伝子多型は、ＩＬ−１２Ｒβ１鎖遺伝子の１１３２番目の野生型塩基ＧがＣに置換しており、この塩基置換によりＩＬ−１２Ｒβ１鎖蛋白質の３７８番目の野生型アミノ酸残基Ｇｌｙ（ＧＧＧ）がＡｒｇ（ＣＧＧ）に置換する多型であった（Ｇ３７８Ｒ多型）。
後述するように、この例のような、ＩＬ−１２Ｒβ１鎖遺伝子によってコードされるＩＬ−１２Ｒβ１鎖蛋白質の３７８番目のグリシンをコードする部位の多型は、被験者のアレルギー素因と関連する遺伝子多型であることが明らかになった。
第５表に、上記の３種類の、ＩＬ−１２Ｒβ１鎖遺伝子の多型の頻度を示した。アレルギー（アトピー）疾患の患者では、健常者に比べて、いずれも高頻度に多型塩基またはアミノ酸残基が認められた。
さらに、ＩＬ−１８Ｒα鎖遺伝子の多型について解析を行ったところ、アレルギー素因と関連する、下記の新たな遺伝子多型が認められた。
遺伝子多型８（第１０図参照）
第１０図に示す、塩基配列と電気泳動図、および、その解析内容からわかるように、この遺伝子多型は、野生型ＩＬ−１８Ｒα鎖遺伝子の９５０番目から９５２番目の３塩基ＣＡＧが欠失しており（９５０ｄｅｌ３）、野生型ＩＬ−１８Ｒα鎖蛋白質の３１７番目のアミノ酸残基Ａｌａ１個を欠いた、５４０個のアミノ酸残基からなる異常な蛋白質の合成が認められる多型であると考えられる。また、この多型は、ゲノムＤＮＡの塩基配列には検出されないことから、オルターネイティブスプライシングによって生じるものと考えられた。
本多型８の多型塩基またはアミノ酸残基を有するアレルギー（アトピー）疾患患者、および、本多型８の多型塩基またはアミノ酸残基が認められないアレルギー（アトピー）疾患患者より、上述のごとく末梢血単核球を分離し、ＩＬ−４、およびＩＬ−１８存在下にて細胞を培養し、培養上清中に分泌されたＩｇＥ量を測定した。その結果、本多型８の多型塩基またはアミノ酸残基が認められないアレルギー（アトピー）疾患患者に由来する単核球においては、ＩＬ−４により惹起されるＩｇＥ産生がＩＬ−１８濃度依存的に抑制されるのに対して、本多型８の多型塩基またはアミノ酸残基を有する患者由来単核球においてはＩＬ−１８共存による抑制が認められなかった（第１１図）。
このことは、本多型８の多型塩基またはアミノ酸残基が認められる者は、ＩＬ−１８を介する情報伝達により産生されるＩＮＦ−γによる抑制がなされていないことを表し、ＩＬ−１８Ｒに機能的異常が存在することを示している。この結果より、本遺伝子多型８の多型塩基またはアミノ酸残基により、ＩＬ−１８Ｒに異常を生じ、ＩＮＦ−γの産生が出来ず、ＩＮＦ−γによるＩｇＥ産生の抑制が機能しないことが示された。また、本多型は、アレルギー（アトピー）疾患症例において有意（Ｐ＝０．０１７９）に高い頻度で出現していることが示された（第６表）。
さらに、ＩＮＦ−γＲ１鎖遺伝子の多型について解析を行ったところ、アレルギー素因と関連する、下記の新たな多型が認められた。
遺伝子多型９（第１２図参照）
第１２図に示す、塩基配列と電気泳動図、および、その解析内容からわかるように、この遺伝子多型は、ＩＮＦ−γＲ１鎖遺伝子の１４００番目の野生型塩基Ｔが、Ｃに置換しており、この塩基置換により、ＩＮＦ−γＲ１鎖蛋白質の４６７番目の野生型アミノ酸残基Ｌｅｕ（ＣＴＴ）がＰｒｏ（ＣＣＴ）に置換していた（Ｌ４６７Ｐ多型）。このＬ４６７Ｐ多型はＳＴＡＴ１結合部の近傍に生じていることから、本多型９の多型塩基またはアミノ酸残基の存在により、重要な情報伝達分子である、ＳＴＡＴ１が結合できなくなり、シグナルの伝達が抑制されるものと考えられる。
また、本多型９についての家系解析より、本多型９の多型塩基またはアミノ酸残基は、気管支喘息、あるいはアトピー性皮膚炎の疾患を有する家族にのみ認められることから、このＬ４６７Ｐ多型に代表される、ＩＮＦ−γＲ１鎖蛋白質の４６７番目のロイシンをコードする部位の多型は、気管支喘息、あるいはアトピー性皮膚炎に特徴的な遺伝子多型であると考えられる（第１３図：図中、ＢＡは、気管支喘息を表し、ＡＲは、アレルギー性鼻炎を表す）。さらに、アレルギー（アトピー）疾患症例１１４名と非アレルギー（アトピー）群１０２名を対象に、Ｌ４６７Ｐ多型について検討したところ、本多型９は、アレルギー（アトピー）疾患症例６名（２．８％）にのみ多型塩基またはアミノ酸残基が検出された。
この結果より、Ｌ４６７Ｐ多型は、アレルギー（アトピー）性疾患の原因の一つであることが示された（第７表）。
遺伝子多型１０・１１（第１３図参照）
遺伝子多型１０は、ＩＬ−１２ｐ４０をコードするゲノム遺伝子配列のイントロン１の３６９６番目の野生型塩基であるグアニンと、多型塩基であるアデニンで規定される遺伝子多型（３６９６Ｇ／Ａ）である。また、遺伝子多型１１は、同イントロン１の３７５７番目の野生型塩基であるシトシンと、多型塩基であるチミンで規定される遺伝子多型（３７５７Ｃ／Ｔ）である。
これらの遺伝子多型について、それぞれ、アレルギー群（３３名）と、非アレルギー群（３３名）における頻度を検討したところ、第８表に示したように、遺伝子多型１０におけるアレルギー群は、Ａアレルの出現頻度が有意に（Ｐ＝０．０１４６）高いことが判明した。
また、第９表に示したように、遺伝子多型１１におけるアレルギー群は、Ａアレルの出現頻度が有意に（Ｐ＝０．０１４６）高いことが判明した。
また、遺伝子多型１０と１１の解析結果が同一であったことから、これらの遺伝子多型は、互いに連鎖平行の関係にあることが示された。
遺伝子多型１２・１３［第１４図（多型１２）、第１５図（多型１３）参照］
遺伝子多型１２は、ＩＬ−１２ｐ４０をコードするゲノム遺伝子配列のイントロン４の１２３５９番目の野生型塩基であるチミンと、多型塩基であるグアニンで規定される遺伝子多型（１２３５９Ｔ／Ｇ）である。また、遺伝子多型１３は、同イントロン６の１６０７８番目の野生型塩基であるシトシンと、多型塩基であるチミンで規定される遺伝子多型（１６０７８Ｃ／Ｔ）である。
これらの遺伝子多型について、それぞれ、アレルギー群（４１名）と、非アレルギー群（５７名）における頻度を検討したところ、第１０表に示したように、遺伝子多型１２におけるアレルギー群は、Ｇアレルの出現頻度が非常に高い傾向である（Ｐ＝０．０６４９５）ことが判明した。
また、第１１表に示したように、遺伝子多型１３におけるアレルギー群は、Ｔアレルの出現頻度が非常に高い傾向である（Ｐ＝０．０６４９５）ことが判明した。
また、遺伝子多型１２と１３の解析結果が同一であったことから、これらの遺伝子多型は、互いに連鎖平行の関係にあることが示された。
［遺伝子の解析法］
末梢血単核球の分離および培養
末梢血単核球は静脈より血液を５ｍｌヘパリン採血し、ヘパリン血をＦｉｃｏｌｌ（シグマ社製）に重層し、比重遠心により分離した。分離した単核球は１０％ウシ胎児血清、２ｍｍｏｌ／ｌ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、および１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシン含有ＲＰＭＩ１６４０培地にて細胞数１ｘ１０６個／ｍｌの濃度にして、５％ＣＯ２存在下で培養した。単核球の刺激は、１０μｇ／ｍｌフィトヘマアグラチニン（ＰＨＡ、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）、あるいは５ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−１２（Ｒ＆Ｄ社製）、あるいは４００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−１８（ＭＬＢ社製）を培地に添加し、行なった。
サイトカインの定量
刺激した単核球は、２４時間培養後、回収し、遠心により細胞画分を取り除き、培養上清を得た。得られた培養上清中のＩＮＦ−γ量は、ＥＬＩＳＡキット（大塚アッセイ社製）を用いて測定した。
ＢＮＡ抽出およびＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮＡは、２４時間ＰＨＡ刺激した培養単核球を回収し、Ｉｓｏｇｅｎキット（日本ジーン社製）を用いて抽出し、さらに、これを用いて、常法により、ｃＤＮＡの合成を行った。ＩＬ−１２Ｒβ１鎖、ＩＬ−１２Ｒβ２鎖、ＩＬ−１８Ｒα鎖、およびＩＮＦ−γＲ１鎖の、それぞれのｃＤＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅は、それぞれ、特異的なプライマーセット（下記第１表）を、用いて行なった。ＰＣＲ反応は９４℃で１分間、５４℃で１分間、７２℃で１分間のサイクルで、４０サイクル行なった。
それぞれのＰＣＲ産物はＴ−ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に組み込み、組み込まれたベクターを大腸菌（ＪＭ１０９株）に導入し、琳入大腸菌株をクローニングした。クローニングした大腸菌よりプラスミドを抽出し、ダイレクトシーケンス等により、フラグメントの塩基配列を決定した。
ゲノムＤＮＡの抽出とＰＣＲ
ゲノムＤＮＡは、末梢血リンパ球より、常法に従って抽出した。このゲノムＤＮＡを鋳型として、第２表に示した配列のＰＣＲプライマーを用いて、ＩＬ−１２・ｐ４０サブユニット遺伝子のイントロン１と、イントロン４と、イントロン６の領域を、上述したＲＴ−ＰＣＲと同様の条件で増幅し、ダイレクトシーケンスにより、フラグメントの塩基配列を確認した。
アレルギー（アトピー）疾患の患者７５名（以下、アレルギー（アトピー）疾患の患者の抽出集団を「アレルギー群」ともいう）について、非アレルギー（アトピー）疾患の健常者６２名（以下、非アレルギー（アトピー）疾患の健常者の抽出集団を「非アレルギー群」ともいう）を対照として、末梢血単核球を分離し、ＩＬ−１２、あるいはＰＨＡ刺激したときのＩＮＦ−γ産生量を測定した。
ＰＨＡ刺激によるＩＮＦ−γ産生量は、非アレルギー群において１１６〜１０３３８ｐｇ／ｍｌ（平均２８８６ｐｇ／ｍｌ）であるのに対し、アレルギー群においては、４６〜１００００ｐｇ／ｍｌ（平均１３２４ｐｇ／ｍｌ）と低下していた。また、ＩＬ−１２刺激におけるＩＮＦ−γ産生量は、非アレルギー群が、５５〜１００００ｐｇ／ｍｌ（平均９７１ｐｇ／ｍｌ）、アレルギー群が、検出限界以下から１１３０ｐｇ／ｍｌ（平均１４５ｐｇ／ｍｌ）と有意に低下が認められた。アレルギー（アトピー）疾患の患者７５名のうち、２４名は、ＩＬ−１２刺激によるＩＮＦ−γ産生量が、検出限界以下であった。このＩＮＦ−γ産生量が、検出限界以下を呈したアレルギー（アトピー）疾患例について、ＩＬ−１２Ｒβ２鎖の遺伝子を検索した。その結果、下記の遺伝子多型が特定された。
遺伝子多型１（第２図参照）
第２図に示す、塩基配列と電気泳動図、および、その解析内容からわかるように、この遺伝子多型は、ＩＬ−１２Ｒβ２鎖遺伝子の９３７番目の野生型塩基Ａが、Ｇに置換しており、この塩基置換により、ＩＬ−１２Ｒβ２鎖蛋白質の３１３番目の野生型アミノ酸残基Ａｒｇ（ＡＧＡ）が、Ｇｌｙ（ＧＧＡ）に置換する多型であった（Ｒ３１３Ｇ多型）。
後述するように、この例のような、ＩＬ−１２Ｒβ２鎖遺伝子によってコードされるＩＬ−１２Ｒβ２鎖蛋白質の３１３番目のＡｒｇをコードする部位の多型は、被験者のアレルギー素因と関連する遺伝子多型であることが明らかになった。
遺伝子多型２（第３図参照）
第３図に示す、塩基配列と電気泳動図、および、その解析内容からわかるように、この遺伝子多型は、ＩＬ−１２Ｒβ２鎖遺伝子の１８１１番目の野生型塩基Ｃが、Ｔに置換しており、この塩基置換により、ＩＬ−１２Ｒβ２鎖蛋白質の６０４番目の野生型アミノ酸残基Ａｌａ（ＧＣＴ）が、Ｖａｌ（ＧＴＴ）に置換する多型であった（Ａ６０４Ｖ多型）。
後述するように、この例のような、ＩＬ−１２Ｒβ２鎖遺伝子によってコードされるＩＬ−１２Ｒβ２鎖蛋白質の６０４番目のＡｌａをコードする部位の多型は、被験者のアレルギー素因と関連する遺伝子多型であることが明らかになった。
遺伝子多型３（第４図参照）
第４図に示す、塩基配列と電気泳動図、および、その解析内容からわかるように、この遺伝子多型は、野生型ＩＬ−１２Ｒβ２鎖遺伝子の１８５６番目から１９４６番目の９１塩基が欠失することによるフレームシフトにより、欠失部位下流４５番目のアミノ酸残基が、ストップコドン（ＴＡＧ）に置換することにより規定されるものであった。この９１塩基の欠失により、アミノ酸残基６２３個の異常なＩＬ−１２Ｒβ２鎖蛋白質が産生されることが予想される（１８５６ｄｅｌ９１多型）。
後述するように、この例のような、ＩＬ−１２Ｒβ２鎖遺伝子によってコードされるＩＬ−１２Ｒβ２鎖蛋白質の６１９番目のグリシン以降のアミノ酸残基の欠失により規定される多型は、被験者のアレルギー素因と関連する遺伝子多型であることが明らかになった。
遺伝子多型４（第５図参照）
第５図に示す、塩基配列と電気泳動図、および、その解析内容からわかるように、この遺伝子多型は、ＩＬ−１２Ｒβ２鎖遺伝子の２１５９番目の野生型塩基Ａが、Ｇに置換しており、この塩基置換によりＩＬ−１２Ｒβ２鎖蛋白質の７２０番目の野生型アミノ酸残基Ｈｉｓ（ＣＡＴ）がＡｒｇ（ＣＧＴ）に置換する多型であった（Ｈ７２０Ｒ多型）。
後述するように、この例のような、ＩＬ−１２Ｒβ２鎖遺伝子によってコードされるＩＬ−１２Ｒβ２鎖蛋白質の７２０番目のＨｉｓをコードする部位の多型は、被験者のアレルギー素因と関連する遺伝子多型であることが明らかになった。
これらの遺伝子多型１〜４が認められた被験者より、上述のごとく末梢血単核球を分離し、ＩＬ−４、ＩＮＦ−γ、およびＩＬ−１２存在下にて細胞を培養し、培養上清中に分泌されたＩｇＥ量を測定した。その結果、このような多型塩基またはアミノ酸残基が認められないアレルギー（アトピー）疾患の患者に由来する単核球においては、ＩＬ−４により惹起されるＩｇＥ産生が、ＩＮＦ−γ、あるいはＩＬ−１２共存下においてに抑制されたのに対し、これらの多型塩基またはアミノ酸残基を有するアレルギー（アトピー）疾患の患者に由来する単核球においては、ＩＮＦ−γ共存下において、ＩｇＥ産生が抑制されたが、ＩＬ−１２共存下においてはその抑制が認められなかった（第６図）。このことは、ＩＬ−１２を介したＩＮＦ−γ産生系の情報伝達における過程において異常が生じ、ＩＮＦ−γが産生されていないことを意味し、ＩＬ−１２Ｒに機能的異常が存在することを示している。
以上の結果より、遺伝子多型１〜４により、ＩＬ−１２Ｒに異常が生じ、その結果、ＩＮＦ−γの産生が出来ず、ＩＮＦ−γによるＩｇＥ産生が、十分に抑制されないことが示された。また、遺伝子多型１〜４は、アレルギー（アトピー）疾患の症例において、有意（Ｐ＝０．０１７９）に高い頻度で出現していることが示された。
さらに、ＩＬ−１２Ｒβ２鎖遺伝子における多型１、３、４は、ＩＬ−１２刺激によるＩＮＦ−γ産生量が、検出限界以下であったアレルギー（アトピー）疾患の症例２４名のうち、１０名（１８５６ｄｅｌ９１多型８名、Ｒ３１３Ｇ多型１名、Ｈ７２０Ｒ多型１名）に検出されたが、健常者７２名にはいずれの多型塩基またはアミノ酸残基も検出されなかった（第３表）。同様に、Ａ６０４Ｖ多型出現頻度は、アレルギー（アトピー）疾患の症例において有意（Ｐ＜０．００１）に高いことが示された（第４表）。
遺伝子多型５（第７図参照）
第７図に示す、塩基配列と電気泳動図、および、その解析内容からわかるように、この遺伝子多型は、ＩＬ−１２Ｒβ１鎖遺伝子の１０８１番目の野生型塩基ＣがＴに置換しており、この塩基置換により、ＩＬ−１２Ｒβ１鎖蛋白質の３６１番目の野生型アミノ酸残基Ａｒｇ（ＣＧＧ）が、Ｔｒｐ（ＴＧＧ）に置換する多型であった（Ｒ３６１Ｗ多型）。
後述するように、この例のような、ＩＬ−１２Ｒβ１鎖遺伝子によってコードされるＩＬ−１２Ｒβ１蛋白質の３６１番目のＡｒｇをコードする部位の多型は、被験者のアレルギー素因と関連する遺伝子多型であることが明らかになった。
遺伝子多型６（第８図参照）
第８図に示す、塩基配列と電気泳動図、および、その解析内容からわかるように、この遺伝子多型は、ＩＬ−１２Ｒβ１鎖遺伝子の１０９４番目の野生型塩基ＴがＣに置換しており、この塩基置換によりＩＬ−１２Ｒβ１鎖蛋白質の３６５番目の野生型アミノ酸残基Ｍｅｔ（ＡＴＧ）がＴｈｒ（ＡＣＧ）に置換する多型であった（Ｍ３６５Ｔ多型）。
後述するように、この例のような、ＩＬ−１２Ｒβ１鎖遺伝子によってコードされるＩＬ−１２Ｒβ１鎖蛋白質の３６５番目のメチオニンをコードする部位の多型は、被験者のアレルギー素因と関連する遺伝子多型であることが明らかになった。
遺伝子多型７（第９図参照）
第９図に示す、塩基配列と電気泳動図、および、その解析内容からわかるように、この遺伝子多型は、ＩＬ−１２Ｒβ１鎖遺伝子の１１３２番目の野生型塩基ＧがＣに置換しており、この塩基置換によりＩＬ−１２Ｒβ１鎖蛋白質の３７８番目の野生型アミノ酸残基Ｇｌｙ（ＧＧＧ）がＡｒｇ（ＣＧＧ）に置換する多型であった（Ｇ３７８Ｒ多型）。
後述するように、この例のような、ＩＬ−１２Ｒβ１鎖遺伝子によってコードされるＩＬ−１２Ｒβ１鎖蛋白質の３７８番目のグリシンをコードする部位の多型は、被験者のアレルギー素因と関連する遺伝子多型であることが明らかになった。
第５表に、上記の３種類の、ＩＬ−１２Ｒβ１鎖遺伝子の多型の頻度を示した。アレルギー（アトピー）疾患の患者では、健常者に比べて、いずれも高頻度に多型塩基またはアミノ酸残基が認められた。
遺伝子多型８（第１０図参照）
第１０図に示す、塩基配列と電気泳動図、および、その解析内容からわかるように、この遺伝子多型は、野生型ＩＬ−１８Ｒα鎖遺伝子の９５０番目から９５２番目の３塩基ＣＡＧが欠失しており（９５０ｄｅｌ３）、野生型ＩＬ−１８Ｒα鎖蛋白質の３１７番目のアミノ酸残基Ａｌａ１個を欠いた、５４０個のアミノ酸残基からなる異常な蛋白質の合成が認められる多型であると考えられる。また、この多型は、ゲノムＤＮＡの塩基配列には検出されないことから、オルターネイティブスプライシングによって生じるものと考えられた。
本多型８の多型塩基またはアミノ酸残基を有するアレルギー（アトピー）疾患患者、および、本多型８の多型塩基またはアミノ酸残基が認められないアレルギー（アトピー）疾患患者より、上述のごとく末梢血単核球を分離し、ＩＬ−４、およびＩＬ−１８存在下にて細胞を培養し、培養上清中に分泌されたＩｇＥ量を測定した。その結果、本多型８の多型塩基またはアミノ酸残基が認められないアレルギー（アトピー）疾患患者に由来する単核球においては、ＩＬ−４により惹起されるＩｇＥ産生がＩＬ−１８濃度依存的に抑制されるのに対して、本多型８の多型塩基またはアミノ酸残基を有する患者由来単核球においてはＩＬ−１８共存による抑制が認められなかった（第１１図）。
このことは、本多型８の多型塩基またはアミノ酸残基が認められる者は、ＩＬ−１８を介する情報伝達により産生されるＩＮＦ−γによる抑制がなされていないことを表し、ＩＬ−１８Ｒに機能的異常が存在することを示している。この結果より、本遺伝子多型８の多型塩基またはアミノ酸残基により、ＩＬ−１８Ｒに異常を生じ、ＩＮＦ−γの産生が出来ず、ＩＮＦ−γによるＩｇＥ産生の抑制が機能しないことが示された。また、本多型は、アレルギー（アトピー）疾患症例において有意（Ｐ＝０．０１７９）に高い頻度で出現していることが示された（第６表）。
遺伝子多型９（第１２図参照）
第１２図に示す、塩基配列と電気泳動図、および、その解析内容からわかるように、この遺伝子多型は、ＩＮＦ−γＲ１鎖遺伝子の１４００番目の野生型塩基Ｔが、Ｃに置換しており、この塩基置換により、ＩＮＦ−γＲ１鎖蛋白質の４６７番目の野生型アミノ酸残基Ｌｅｕ（ＣＴＴ）がＰｒｏ（ＣＣＴ）に置換していた（Ｌ４６７Ｐ多型）。このＬ４６７Ｐ多型はＳＴＡＴ１結合部の近傍に生じていることから、本多型９の多型塩基またはアミノ酸残基の存在により、重要な情報伝達分子である、ＳＴＡＴ１が結合できなくなり、シグナルの伝達が抑制されるものと考えられる。
また、本多型９についての家系解析より、本多型９の多型塩基またはアミノ酸残基は、気管支喘息、あるいはアトピー性皮膚炎の疾患を有する家族にのみ認められることから、このＬ４６７Ｐ多型に代表される、ＩＮＦ−γＲ１鎖蛋白質の４６７番目のロイシンをコードする部位の多型は、気管支喘息、あるいはアトピー性皮膚炎に特徴的な遺伝子多型であると考えられる（第１３図：図中、ＢＡは、気管支喘息を表し、ＡＲは、アレルギー性鼻炎を表す）。さらに、アレルギー（アトピー）疾患症例１１４名と非アレルギー（アトピー）群１０２名を対象に、Ｌ４６７Ｐ多型について検討したところ、本多型９は、アレルギー（アトピー）疾患症例６名（２．８％）にのみ多型塩基またはアミノ酸残基が検出された。
この結果より、Ｌ４６７Ｐ多型は、アレルギー（アトピー）性疾患の原因の一つであることが示された（第７表）。
遺伝子多型１０は、ＩＬ−１２ｐ４０をコードするゲノム遺伝子配列のイントロン１の３６９６番目の野生型塩基であるグアニンと、多型塩基であるアデニンで規定される遺伝子多型（３６９６Ｇ／Ａ）である。また、遺伝子多型１１は、同イントロン１の３７５７番目の野生型塩基であるシトシンと、多型塩基であるチミンで規定される遺伝子多型（３７５７Ｃ／Ｔ）である。
これらの遺伝子多型について、それぞれ、アレルギー群（３３名）と、非アレルギー群（３３名）における頻度を検討したところ、第８表に示したように、遺伝子多型１０におけるアレルギー群は、Ａアレルの出現頻度が有意に（Ｐ＝０．０１４６）高いことが判明した。
また、第９表に示したように、遺伝子多型１１におけるアレルギー群は、Ａアレルの出現頻度が有意に（Ｐ＝０．０１４６）高いことが判明した。
また、遺伝子多型１０と１１の解析結果が同一であったことから、これらの遺伝子多型は、互いに連鎖平行の関係にあることが示された。
遺伝子多型１２は、ＩＬ−１２ｐ４０をコードするゲノム遺伝子配列のイントロン４の１２３５９番目の野生型塩基であるチミンと、多型塩基であるグアニンで規定される遺伝子多型（１２３５９Ｔ／Ｇ）である。また、遺伝子多型１３は、同イントロン６の１６０７８番目の野生型塩基であるシトシンと、多型塩基であるチミンで規定される遺伝子多型（１６０７８Ｃ／Ｔ）である。
これらの遺伝子多型について、それぞれ、アレルギー群（４１名）と、非アレルギー群（５７名）における頻度を検討したところ、第１０表に示したように、遺伝子多型１２におけるアレルギー群は、Ｇアレルの出現頻度が非常に高い傾向である（Ｐ＝０．０６４９５）ことが判明した。
また、第１１表に示したように、遺伝子多型１３におけるアレルギー群は、Ｔアレルの出現頻度が非常に高い傾向である（Ｐ＝０．０６４９５）ことが判明した。
また、遺伝子多型１２と１３の解析結果が同一であったことから、これらの遺伝子多型は、互いに連鎖平行の関係にあることが示された。
本発明により、アレルギーに関連する遺伝子多型を指標として、アレルギー素因を検出可能な、遺伝子の検出方法が提供される。
Claims (4)
- 下記１及び２で示される遺伝子多型からなる群から選ばれる１種又は２種の遺伝子多型を検出することにより、被験者のアトピー素因を検出する、遺伝子の検出方法。
１．インターロイキン１２・ｐ４０サブユニット遺伝子のイントロン１の３６９６番目のグアニンとアデニンとの置換として規定される多型。
２．インターロイキン１２・ｐ４０サブユニット遺伝子のイントロン１の３７５７番目のシトシンとチミンとの置換として規定される多型。 - 前記の検出方法が、インベーダー・アッセイ法を行って遺伝子多型を検出する方法である、請求項１に記載の遺伝子の検出方法。
- 下記１及び２で示される遺伝子多型からなる群から選ばれる１種又は２種の遺伝子多型を検出するための要素が備わっている、請求項１又は２に記載の検出方法を行うための遺伝子検出用キット。
１．インターロイキン１２・ｐ４０サブユニット遺伝子のイントロン１の３６９６番目のグアニンとアデニンとの置換として規定される多型。
２．インターロイキン１２・ｐ４０サブユニット遺伝子のイントロン１の３７５７番目のシトシンとチミンとの置換として規定される多型。 - 前記のキットが、インベーダー・アッセイ法を行って、遺伝子多型を検出するキットである、請求項３に記載の遺伝子検出用キット。
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