JP4531167B2 - New antibacterial compounds - Google Patents

Description

で示されるＡ−５００３５９Ｅ化合物又はその塩、
（２） 下記式（ＩＩ）
【０００７】
【化８】

で示されるＡ−５００３５９Ｆ化合物又はその塩、
（３） 下記式（ＩＩＩ）
【０００８】
【化９】

で示されるＡ−５００３５９Ｆアミド化合物またはその塩、
（４） 下記式（ＩＶ）
【０００９】
【化１０】

で示されるＡ−５００３５９Ｈ化合物またはその塩、
（５） 下記式（Ｖ）
【００１０】
【化１１】

で示されるＡ−５００３５９Ｊ化合物またはその塩、
（６） 下記式（ＶＩ）
【００１１】
【化１２】

で示されるＡ−５００３５９Ｍ−３化合物またはその塩、
（７） ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）ＳＡＮＫ６０１９６（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４２０）を培養し、その培養物より（１）、（２）、（４）又は（５）記載の化合物を採取することを特徴とする、該化合物の製造法、
（８） （１）、（２）、（４）又は（５）記載の化合物を生産することを特徴とするストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）ＳＡＮＫ６０１９６（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４２０）、及び
（９）（１）、（２）、（３）、（４）、（５）又は（６）に記載の化合物もしくはその薬理学的に許容される塩を含むことからなる医薬である。
【００１２】
本発明の式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）及び（ＶＩ）で表わされる化合物は、茨城県筑波山にて採取された土壌より分離した、ストレプトマイセス属に属するストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）ＳＡＮＫ６０１９６株の培養液中に生産されるか、又は培養過程における微生物変換若しくは単離精製過程における化学変換によって生成する。
【００１３】
本発明の前記式（Ｉ）で示されるＡ−５００３５９Ｅ化合物、前記式（ＩＩ）で示されるＡ−５００３５９Ｆ化合物、前記式（ＩＩＩ）で示されるＡ−５００３５９Ｆアミド化合物、前記式（ＩＶ）で示されるＡ−５００３５９Ｈ化合物、前記式（Ｖ）で示されるＡ−５００３５９Ｊ化合物及び前記式（ＶＩ）で示されるＡ−５００３５９Ｍ−３化合物は、それぞれいくつかの不斉炭素原子を有する。それゆえ、種々の光学異性体が存在する。本発明においては、これらのＡ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｆアミド化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物及びＡ−５００３５９Ｍ−３化合物の各異性体がすべて単一の式で示されているが、本発明は、ラセミ化合物を含むこれらの異性体及びこれらの異性体の混合物をもすべて含むものである。立体特異的合成法が使用される場合、または光学活性化合物が原料化合物として使用される場合、個々のＡ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｆアミド化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物及びＡ−５００３５９Ｍ−３化合物の各異性体は直接的に製造してもよいし、一方、異性体の混合物が製造されれば、個々の異性体は常法により得てもよい。
【００１４】
本発明の化合物Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物及びＡ−５００３５９Ｍ−３化合物は、当業者に周知の方法を用いて塩にすることができる。本発明はそのようなＡ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物及びＡ−５００３５９Ｍ−３化合物の塩も包含する。Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物及びＡ−５００３５９Ｍ−３化合物の塩としては、医学的に使用され、薬理学的に許容されるものであれば特に限定はない。なお、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物及びＡ−５００３５９Ｍ−３化合物の塩が、医薬以外の用途に用いられる場合、例えば中間体として用いられる場合にはなんら限定はない。そのような塩としては、好適にはナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、のようなアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩等の金属塩；アンモニウム塩のような無機塩、ｔ−オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ−ベンジル-フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニア塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機アミン塩；及び、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、アスパラギン塩のようなアミノ酸塩を挙げることができる。より好適には、薬理学的に許容される塩として好ましく使用されるもの、すなわち、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等を挙げることができる。
【００１５】
また、本発明の化合物Ａ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｆアミド化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物及びＡ−５００３５９Ｍ−３化合物、またはそれぞれの塩は、溶剤和物となることがある。例えば、大気中に放置したり、または、再結晶をすることにより、水分を吸収し、吸着水が付いたり、水和物となる場合があるが、そのような溶剤和物も本発明に包含される。
【００１６】
さらに本発明は、生体内において代謝されてＡ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｆアミド化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物及びＡ−５００３５９Ｍ−３化合物に変換される化合物、いわゆるプロドラッグもすべて含むものである。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明の式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）又は（ＶＩ）で表わされる化合物Ａ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物及びＡ−５００３５９Ｍ−３化合物は、ストレプトマイセス属に属する該化合物の生産菌を適当な培地で培養し、該培養物から採取することによって得られる。好適なＡ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物及びＡ−５００３５９Ｍ−３化合物の生産菌であるストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）ＳＡＮＫ６０１９６株（以下、「ＳＡＮＫ６０１９６株」と記す。）は、前述のように、茨城県筑波山の土壌から常法に従って採集、分離されたものである。
【００１８】
ＳＡＮＫ６０１９６株の菌学的性状は次の通りである。
【００１９】
１）形態学的特徴
ＳＡＮＫ６０１９６株はインターナショナル・ストレプトマイセス・プロジェクト（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｐｒｏｊｅｃｔ：以下、「ISP」と記す。）規定（Ｓｈｉｒｌｉｎｇ，Ｅ．Ｂ． ａｎｄ Ｇｏｔｔｌｉｅｂ，Ｄ．， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， １６，３１３−３４０、１９９６）の培地上で２８℃、１４日間の培養により次のような形態学的特徴を示した。光学顕微鏡による観察ではＳＡＮＫ６０１９６の基生菌糸は良好に伸長、分岐し黄味灰、黄味茶ないし薄オリーブ色を示すがノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属菌株様の断裂やジグザグ伸長は観察されない。気菌糸は単純分岐する。胞子連鎖の形態は直ないし曲状を示し、およそ１０〜５０個またはそれ以上の胞子の連鎖を形成する。走査型電子顕微鏡による観察では胞子は楕円形で、その表面構造は平滑状（Ｓｍｏｏｔｈ）を示す。胞子の大きさは０．６〜０．８×０．７〜１．２μｍである。胞子は気菌糸上にのみ形成される。また、胞子のう、気菌糸の車軸分岐、気菌糸の断裂、菌核などの特殊器官は認められない。
【００２０】
２）各種培養基上での培養性質
ＳＡＮＫ６０１９６株の２８℃、１４日間培養後の寒天培地上での培養性状は表１に示すとおりである。

表１中、ISP番号の記されている培地の組成はそれぞれISPの規定の通りである。また項目Ｇは生育、ＡＭは気菌糸、Ｒは裏面、ＳＰは可溶性色素をそれぞれ表す。色調の記述は「色の標準（日本色彩研究所版）」によるものであり、カッコ内の色調の表示は、マンセル方式に準拠したカラーナンバーである。水寒天培地中に産生される薄黄色の可溶性色素は０．０５規定（ｎｏｒｍａｌｉｔｙ：以下、「Ｎ」と記す。）塩酸により無色に変化し、０．０５Ｎ水酸化ナトリウムによりなんらの変化も示さなかった。
【００２１】
３）生理学的性質
２８℃で培養後、２〜２１日間に観察した本菌株の生理学的性質は、表２に示した通りである。

表２中、培地１はイーストエキス・麦芽エキス寒天（ISP 2）を指す。また、プリドハム・ゴトリーブ寒天培地（ISP 9）を使用して、２８℃、１４日間培養後に観察したＳＡＮＫ６０１９６株の炭素源の資化性は表３に示した通りである。
［表３］
――――――――――――――――――――――――――――
Ｄ−グルコース ＋
Ｌ−アラビノース −
Ｄ−キシロース ＋
イノシトール −
Ｄ−マンニトール ＋
Ｄ−フルクトース ＋
Ｌ−ラムノース −
シュクロース −
ラフィノース −
対照 −
――――――――――――――――――――――――――――
表３中、「＋」は資化する、「−」は資化しないことを示す。
【００２２】
４）化学的分類学的性質
本菌株の細胞壁を長谷川らの方法（Ｈａｓｅｇａｗａ，Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２９，３１９−３２２、１９８３）に従い検討した結果、ＬＬ−ジアミノピメリン酸が検出された。また、本菌株の全細胞中の主要糖成分をエム・ピー・レシェバリエの方法（Ｌｅｃｈｅｖａｌｉｅｒ，Ｍ．Ｐ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ７１，９３４−９４４，１９６８）に従い検討した結果、特徴的な成分は検出されなかった。
【００２３】
以上の菌学的性質から、本菌株は放線菌の中でもストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属することが明らかにされた。シャーリングとゴトリーブによるISP菌株記載（Ｓｈｉｒｌｉｎｇ，Ｅ．Ｂ． ａｎｄ Ｇｏｔｔｌｉｅｂ，Ｄ．， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １８，６８−１８９ ａｎｄ ２７９−３９２，１９６８：１９，３９１−５１２，１９６９：２２，２６５−３９４，１９７２）、ワックスマン（Ｗａｋｓｍａｎ，Ｓ．Ａ．）著「ジ・アクチノミセーテス（Ｔｈｅ Ａｃｔｙｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）第２巻、１９６１年」、ブキャナンとギボンズ（Ｂｕｃｈａｎａｎ，Ｒ．Ｅ． ａｎｄ Ｇｉｂｂｏｎｓ，Ｎ．Ｅ．）編「バージーズ・マニュアル・オブ・ディタミネイティブ・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第８版、１９７４年」、ウィリアムズ等（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｓ．Ｔ．， ｅｔ ａｌ．）編「バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第４版、１９８９年」及びストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属放線菌に関する最近の文献に記載されている菌種と比較したところ、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）に極めて近縁であることが判明した。しかしながら、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｕｓ）とは、グリセリン・アスパラギン寒天において黄味灰色の、ペプトン・イーストエキス・鉄寒天において薄黄味茶色の可溶性色素を産生するが、ポテトエキス・人参エキス寒天および水寒天においては可溶性色素を産生しないこと、生育上限温度が４０℃であること、および食塩７％存在下で生育することにおいて差異が認められた。
【００２４】
このような菌学的特徴を有する本菌株は、明らかにストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）とは異なる新菌株であると考えられるが、これらの差異のみをもって種を区別することはできない。そこで、本発明者等は本菌株をストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）ＳＡＮＫ６０１９６と同定した。該菌株は平成８年２月２２日付で通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に国際寄託され、ＦＥＲＭ ＢＰ−５４２０が付された。
【００２５】
以上、ＳＡＮＫ６０１９６株について説明したが、放線菌の諸性質は一定したものではなく、自然に又は人工的に容易に変化することは周知の通りである。本発明で使用しうる菌株は、そのようなすべての変異株を包含する。すなわち、本発明は、ストレプトマイセス属に属し、Ａ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物又はＡ−５００３５９Ｍ−３化合物を生産する全ての菌株を包含するものである。
【００２６】
本発明のＡ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物又はＡ−５００３５９Ｍ−３化合物の生産菌を培養するに際し使用される培地としては炭素源、窒素源、無機イオンおよび有機栄養源等より選択されたものを適宜含有する培地であれば合成または天然培地の何れでも使用可能である。
【００２７】
該栄養源としては、従来真菌類や放線菌類の菌株の培養に利用されている公知の、微生物が資化できる炭素源、窒素源および無機塩が使用できる。
【００２８】
具体的には、炭素源としてはグルコース、フルクトース、マルトース、シュクロース、マンニトール、グリセロール、デキストリン、オート麦、ライ麦、トウモロコシ澱粉、ジャガイモ、トウモロコシ粉、大豆粉、綿実油、水飴、糖蜜、大豆油、クエン酸、酒石酸などを単一に、あるいは併用して使用できる。一般には、培地量の 1〜10重量％で変量するが、この範囲に限定されない。
【００２９】
また、窒素源としては、一般に蛋白質またはその水解物を含有する物質を用いることができる。好適な窒素源としては、例えば大豆粉、フスマ、落花生粉、綿実粉、スキムミルク、カゼイン加水分解物、ファーマミン（ＳｈｅｆｉｅｌｄＣｈｅｍｉｃａｌ社製）、魚粉、コーンスティープリカー、ペプトン、肉エキス、生イースト、乾燥イースト、イーストエキス、マルトエキス、ジャガイモ、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム等を使用し得る。該窒素源は、単一または併用して培地量の０．２〜６重量％の範囲で用いられることが好ましい。
【００３０】
さらに栄養無機塩としては、ナトリウム、アンモニウム、カルシウム、フォスフェート、サルフェート、クロライド、カーボネート等のイオンを得ることのできる通常の塩類を使用し得る。また、カリウム、カルシウム、コバルト、マンガン、鉄、マグネシウム等の微量の金属も使用され得る。
【００３１】
特にＡ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物及びＡ−５００３５９Ｊ化合物の生産にはコバルト、スキムミルクおよびイーストエキスの添加が効果的である。
【００３２】
さらに、該生産菌を培養するに際し、抗生物質生合成阻害剤を添加し、Ａ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物及びＡ−５００３５９Ｈ化合物を生産させることもできる。Ａ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物及びＡ−５００３５９Ｈ化合物の生産は、例えば、アスパラギン酸キナーゼ阻害剤であるＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システインまたはその塩を培地添加剤として単独またはコバルト、スキムミルクおよびイーストエキスと併用して用いることにより達成される。該添加剤を、特にスキムミルクと併用することにより、Ａ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物及びＡ−５００３５９Ｈ化合物の生産性が向上する。該添加剤は、終濃度として１〜１００ｍＭの範囲で用いることができる。好ましくは終濃度として１０ｍＭで良好なＡ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物及びＡ−５００３５９Ｈ化合物の生産が可能である。
【００３３】
また、前記添加剤を種々のアミノ酸又はその塩と併用することにより、Ａ−５００３５９Ｆ化合物及びＡ−５００３５９Ｈ化合物の有用関連化合物を生産させることもできる。特にＬ−アリルグリシン又はその塩を併用することにより、Ａ−５００３５９Ｍ−３化合物（ＶＩ）が得られる。Ｌ−アリルグリシンは、終濃度として１〜１００ｍＭの範囲で用いることができる。好ましくは終濃度として１０ｍＭで良好なＡ−５００３５９Ｍ−３物質の生産が可能である。
【００３４】
なお、液体培養に際しては、消泡剤としてシリコン油、植物油、界面活性剤等を使用することができる。
【００３５】
ＳＡＮＫ６０１９６株を培養してＡ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物及びＡ−５００３５９Ｊ化合物を生産するための培地のｐＨは、好適には５．０〜８．０である。
【００３６】
ＳＡＮＫ６０１９６株の生育温度は１２〜３６℃であるが、Ａ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物及びＡ−５００３５９Ｊ化合物を生産させるためには該菌株を１８〜２８℃で培養することが好ましく、より好適には、１９〜２３℃で培養するのが好ましい。
【００３７】
Ａ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物及びＡ−５００３５９Ｍ−３化合物は、ＳＡＮＫ６０１９６株を好気的に培養することにより得られるが、そのような培養法としては、通常用いられる好気的培養法、例えば固体培養法、振とう培養法、通気攪拌培養法等を用いることができる。
【００３８】
小規模の培養においては、１９〜２３℃で数日間振とう培養を行うのが好適である。培養は、バッフル（水流調節壁）のついた、あるいは通常の三角フラスコ中で、１〜２段階の種の発育工程により開始する。種発育段階の培地には、炭素源および窒素源を併用できる。種フラスコは定温インキュベーター中で１９〜２３℃、５日間振とうするか、または充分に成長するまで振とうする。成長した種は、第二の種培地、または、生産培地に接種するのに用いる。中間の発育工程を用いる場合には、本質的に同様の方法で成長させ、その一部を生産培地に接種する。接種したフラスコを一定の温度で数日間振とう培養し、培養終了後フラスコ内の培養物を遠心分離またはろ過する。
【００３９】
大量培養の場合には、攪拌機、通気装置が付いたジャーファーメンターあるいはタンクで培養するのが好ましい。そのためにはまず栄養培地を１２１〜１３０℃まで加熱して滅菌し冷却しておき、ついで、該滅菌済培地に前述したような方法によって予め成長させておいた種を接種する。その後の培養は１９〜２３℃で通気攪拌して行う。この方法は、多量の化合物を得るのに適している。
【００４０】
Ａ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物及びＡ−５００３５９Ｈ化合物の生産は、該滅菌済培地に予めろ過滅菌しておいたアスパラギン酸キナーゼ阻害剤であるＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システインまたはその塩の水溶液を培養開始時点あるいは培養中に培地に添加することによっても達成される。
【００４１】
Ａ−５００３５９Ｍ−３化合物の生産は、該滅菌培地に予めろ過滅菌しておいたＳ−（2−アミノエチル）−Ｌ−システイン又はその塩及びＬ−アリルグリシン又はその塩の水溶液を、培養開始時点あるいは培養中に同時に又は別個に培地に添加することによって達成される。
【００４２】
培養の経過に伴って生産されるＡ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物及びＡ−５００３５９Ｍ−３化合物の量は、培養液の一部を採取してＨＰＬＣ分析を実施することにより測定することができる。Ａ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物及びＡ−５００３５９Ｍ−３化合物の生産量は、通常３〜１５日で最高値に達する。
【００４３】
培養終了後、珪藻土をろ過操作助剤として用いるろ過操作又は遠心分離によって、培養液中の菌体成分を分別し、そのろ液または上清中に存在するＡ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物及びＡ−５００３５９Ｍ−３化合物を、ＨＰＬＣ分析を指標にして、それらの物理化学的特性を利用し精製する。珪藻土としては、例えば、セライト５４５（Ｃｅｌｉｔｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）が好適に用いられる。ろ液中に存在するＡ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物及びＡ−５００３５９Ｍ−３化合物の精製は、吸着剤として、例えば活性炭または吸着用樹脂であるアンバーライトＸＡＤ−２、ＸＡＤ−４（ローム・アンド・ハース社製）等や、ダイヤイオンＨＰ−１０、ＨＰ−２０、ＣＨＰ−２０Ｐ、ＨＰ−５０、セパビーズＳＰ２０５、ＳＰ２０６、ＳＰ２０７（三菱化学社製）等の単独使用、またはそれらの組み合わせにより達成できる。Ａ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物及びＡ−５００３５９Ｍ−３化合物を含む溶液を上記のごとき吸着剤の層を通過させて不純物を吸着させて取り除くか、またはＡ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物及びＡ−５００３５９Ｍ−３化合物を吸着させた後、メタノール水、アセトン水、ｎ−ブタノール水、アンモニア水、アンモニアを含有したメタノール水、アンモニアを含有したアセトン水などを用いて溶出させる事により、Ａ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物及びＡ−５００３５９Ｍ−３化合物を分離することができる。なお、溶出液として、アンモニアを含有する溶液を用いた場合には、カラムからの溶出時または濃縮の際にＡ−５００３５９Ｆアミド化合物が生成する場合がある。
【００４４】
さらに、このようにして得られたＡ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｆアミド化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物及びＡ−５００３５９Ｍ−３化合物は、更にシリカゲル、フロリジル、コスモシル（ナカライテスク社製）、ダイヤイオンＣＨＰ−２０Ｐ、ＳＰ２０７（三菱化学社製）のような担体を用いた吸着カラムクロマトグラフィー；セファデックスＧ−１０（ファルマシア・バイオテク社製）、トヨパールＨＷ４０Ｆ（東ソー社製）などを用いたゲルろ過クロマトグラフィー；ダウエックス１、ＳＢＲ−Ｐ（ダウケミカル社製）、ダイヤイオンＰＡ３１６（三菱化学社製）などを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー；および順層、逆層カラムを用いたＨＰＬＣ等により精製することが出来る。
【００４５】
以上の分離、精製の手段を単独または適宜組み合わせ、場合によっては反復して用いることにより、本発明の化合物Ａ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｆアミド化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物及びＡ−５００３５９Ｍ−３化合物を分離精製することができる。
【００４６】
Ａ−５００３５９Ｆ化合物は、Ａ−５００３５９Ｅ化合物を加水分解しても得ることができる。たとえば塩基性条件下、好ましくは塩基性水溶液において、良好に加水分解される。
【００４７】
使用可能な塩基性化合物としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウムのようなアルカリ金属水酸化物またはその弱酸塩；水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、酢酸マグネシウムのようなアルカリ土類金属水酸化物またはその弱酸塩；アンモニアのような無機塩基性化合物または塩基性を示すその塩；ｔ−オクチルアミン、ジベンジルアミン、モルホリン、グルコサミン、フェニルグリシンアルキルエステル、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、グアニジン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、プロカイン、ジエタノールアミン、Ｎ−ベンジル-フェネチルアミン、ピペラジン、テトラメチルアンモニア、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンのような有機アミンまたは塩基性を示すそれらの塩があげられる。また、それらのアルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、アンモニアのような無機イオン、有機アミンイオンを含有する塩基性緩衝液も使用可能である。これらの塩基性化合物のうち、アルカリ金属水酸化物、特に水酸化ナトリウムが好適である。特に水酸化ナトリウムを用いてＡ−５００３５９Ｅ化合物を加水分解する方法では、Ａ−５００３５９Ｆ化合物を容易に得ることができる。
【００４８】
上記反応に用いられる塩基性化合物の濃度は好ましくは０．００１〜１Ｎ、より好ましくは０．３〜０．１Ｎである。反応温度は、好ましくは−２０〜４０℃、より好ましくは０〜３０℃である。反応時間は３０秒〜１５時間、より好ましくは３０分〜２時間である。
【００４９】
特に水酸化ナトリウムを用いた場合、その濃度は好ましくは０．００１〜１Ｎ、より好ましくは０．０１〜０．１Ｎである。反応温度は、好ましくは−２０〜４０℃、より好ましくは０〜３０℃である。反応時間は、好ましくは３０秒〜２時間、より好ましくは３０分〜１時間である。
【００５０】
尚、塩基としてアンモニア水を使用する場合、Ａ−５００３５９Ｆ化合物の他にＡ−５００３５９Ｆアミド化合物も生成するが、これらは前述の方法で分離精製することができる。
【００５１】
Ａ−５００３５９Ｆアミド化合物はＡ−５００３５９Ｅ化合物に溶媒中アンモニアを作用させることによって得ることができる。
【００５２】
使用される溶媒としては、水またはエタノール、メタノールのようなアルコール類であり、好適には水またはメタノールである。
【００５３】
使用されるアンモニアは、ガスとして化合物の溶液中に導入しても良いが、通常、水またはメタノール、エタノールのようなアルコール類に溶かして使用される。好適には水またはメタノール溶液が使用される。
【００５４】
アンモニア水を用いた場合、その濃度は好ましくは０．１〜１Ｎ、より好ましくは０．３〜０．７Ｎである。反応温度は、好ましくは−２０〜４０℃、より好ましくは０〜３０℃である。反応時間は、好ましくは３０分〜１５時間、より好ましくは１〜４時間である。
【００５５】
尚、アンモニア水を用いた場合、目的のＡ−５００３５９Ｆアミド化合物の他に、エステルが加水分解されてＡ−５００３５９Ｆ化合物が生成するが、これらは前述の方法で分離精製することができる。
【００５６】
Ａ−５００３５９Ｆアミド化合物はＡ−５００３５９Ｆ化合物に溶媒中でメチル化試薬を反応させ、該化合物のメチルエステル体すなわちＡ−５００３５９Ｅ化合物に変換したのち、前述のようにアンモニアと反応させることによっても製造することができる。
【００５７】
メチル化試薬としては、例えばジアゾメタン、ジメチル硫酸等を使用することができ、好適にはジアゾメタンである。Ａ−５００３５９Ｆ化合物をＡ−５００３５９Ｅ化合物に変換するための反応溶液中のメチル化試薬は、好ましくは１〜５当量、より好ましくは１．５〜２当量である。
【００５８】
使用される溶媒としては、例えば水又はメタノール、エタノールのようなアルコール類を挙げることができ、好適には水又はメタノールである。
【００５９】
反応温度は、好ましくは−２０〜４０℃、より好ましくは０〜３０℃である。
反応時間は、好ましくは３０分〜１５時間、より好ましくは１〜２時間である。
【００６０】
反応終了液からＡ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｅ化合物及びＡ−５００３５９Ｆアミド化合物を単離する手段は、前述のＡ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｆアミド化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物及びＡ−５００３５９Ｍ−３化合物の分離・精製手段の項に記載の方法により適宜選択できる。
【００６１】
以上、Ａ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｆアミド化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物及びＡ−５００３５９Ｍ−３化合物の製造法の代表的な方法を説明したが、製造方法はこれらに限定されず、既に当業者に知られているこれら以外の製造方法を用いることもできる。
【００６２】
以上のごとくして得られる本発明の化合物Ａ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｆアミド化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物及びＡ−５００３５９Ｍ−３化合物は、文献未掲載の新規化合物であるが、その一般グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌に対する生育阻止活性は普通寒天培地（栄研化学社製）やハートインフュージョンアガー培地（Ｄｉｆｃｏ社製）を用いたディスクアッセイ法で測定される。さらに、グラム陽性細菌放線菌目マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）に対する生育阻害活性は上記培地にグリセリンを添加した培地で同様に測定される。
【００６３】
以上、化合物Ａ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｆアミド化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物及びＡ−５００３５９Ｍ−３化合物の生物活性の代表的な評価方法を説明したが、評価方法はこれらに限定されず、既に当業者に知られているこれら以外の抗菌活性の評価方法を用いることもできる。
【００６４】
本発明のＡ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｆアミド化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物及びＡ−５００３５９Ｍ−３化合物またはそれらの薬理学的に許容される塩は、種々の形態で投与される。その投与形態としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与、または注射剤（静脈内、筋肉内、皮下）、点滴剤、坐剤等による非経口投与を挙げることができる。これらの各種製剤は、常法に従って主薬に賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤等の医薬の製剤技術分野において通常使用し得る既知の補助剤を用いて製剤化することができる。
【００６５】
錠剤の形態に成形するに際しては、担体としてこの分野で従来公知のものを広く使用でき、例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、グルコース、尿素、澱粉、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸等の賦形剤；水、エタノール、プロパノール、単シロップ、グルコース液、澱粉液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドン等の結合剤；乾燥澱粉、アルギン酸ナトリウム、寒天末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、澱粉、乳糖等の崩壊剤；白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤；第４級アンモニウム塩類、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤；グリセリン、澱粉等の保湿剤；澱粉、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩、硼酸末、ポリエチレングリコール等の潤沢剤等が例示できる。さらに錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠あるいは二重錠、多層錠とすることができる。
【００６６】
丸剤の形態に成形するに際しては、担体としてこの分野で従来公知のものを広く使用でき、例えばグルコース、乳糖、カカオバター、澱粉、硬化植物油、カオリン、タルク等の賦形剤；アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノール等の結合剤；ラミナラン寒天等の崩壊剤等が例示できる。
【００６７】
坐剤の形態に成形するに際しては、担体としてこの分野で従来公知のものを広く使用でき、例えばポリエチレングリコール、カカオバター、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ゼラチン、半合成グリセリド等を挙げることができる。
【００６８】
注射剤として調製される場合には、液剤および懸濁剤は殺菌され、かつ血液と等張であるのが好ましく、これら液剤、乳剤および懸濁剤の形態に成形するに際しては、希釈剤としてこの分野で慣用されているものをすべて使用でき、例えば、水、エタノール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等を挙げることができる。なお、この場合、等張性の溶液を調製するのに充分な量の食塩、グルコース、あるいはグリセリンを医薬製剤中に含有せしめてもよく、また通常の溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤等を添加してもよい。
【００６９】
さらに必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品を含有せしめてもよい。
【００７０】
上記医薬製剤に含まれる有効成分化合物の量は、特に限定されず広範囲に適宜選択されるが、通常全組成物中１７０重量％、好ましくは１〜３０重量％含まれる量とするのが適当である。
【００７１】
上記医薬製剤の投与方法は特に限定は無く、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度等に応じて決定される。例えば錠剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤およびカプセル剤の場合には経口投与される。また、注射剤の場合には単独であるいはグルコース、アミノ酸等の通常の補液と混合して静脈内投与され、さらに必要に応じて単独で筋肉内、皮内、皮下もしくは腹腔内投与される。坐剤の場合には直腸投与される。
【００７２】
その使用量は症状、年齢、体重、投与方法および剤形等によって異なるが、通常は成人に対して１日あたり、上限として２０００ｍｇ（好ましくは１００ｍｇ）であり、下限として０．１ｍｇ（好ましくは１ｍｇ、さらに好ましくは１０ｍｇ）を症状に応じて１回または数回に分けて投与することができる。
【００７３】
本発明のＡ−５００３５９Ｅ化合物及びＡ−５００３５９Ｆ化合物は、分子内に水酸基、カルバモイル残基、エステル基またはカルボキシル基を有するので、それらの官能基において、各種のエーテル、エステル、チオエステル、アミド等の誘導体に変換することができる。これらのうちエステル基またはカルボキシル基を各種のアミドに修飾した誘導体及び水酸基を各種のエーテル若しくはエステルに修飾した誘導体が好適である。
【００７４】
【実施例】
以下に実施例、試験例及び製剤例をあげて、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００７５】
実施例１． ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）ＳＡＮＫ６０１９６（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４２０）株の培養
以下に記載する前培養培地５００ｍｌを入れた２Ｌの三角フラスコ（種フラスコ）に、ＳＡＮＫ６０１９６株を無菌的に４白金耳接種し、次いで該フラスコ４本分をロータリー振とう機中で２３℃、２１０回転／分（ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎｓ ｐｅｒ ｍｉｎｕｔｅ：以下、「ｒｐｍ」と記す。）にて振とうして、３日間の前培養を行った。
【００７６】
前培養培地：下記の成分を水道水１０００ｍｌ中に含む。
【００７７】
マルトース ３０ｇ
肉エキス ５ｇ
ポリペプトン ５ｇ
塩化ナトリウム ５ｇ
炭酸カルシウム ３ｇ
消泡剤ＣＢ４４２ ５０ｍｇ
（日本油脂社製）
――――――――――――――――――――――――――――――――――
ｐＨを７．４に調整した後１２１℃にて３０分間滅菌した。
【００７８】
本培養は以下に記載するようにして行った。すなわち、下記本培養培地１５Ｌの入った３０Ｌ容ジャーファーメンター２基に、前培養液を３％（容量／容量：以下、「ｖ/ｖ」と記す。）植菌した。２３℃で培養開始後６時間目にフィルター除菌したＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン塩酸塩を終濃度１０ｍＭとなるように添加した後、6日間通気攪拌培養を行った。
【００７９】
本培養培地：下記の成分を水道水１０００ｍｌ中に含む。
【００８０】
マルトース ３０ｇ
イーストエキス ５ｇ
（Ｄｉｆｃｏ社製）
肉エキス ５ｇ
ポリペプトン ５ｇ
塩化ナトリウム ５ｇ
炭酸カルシウム ３ｇ
消泡剤ＣＢ４４２ ５０ｍｇ
（日本油脂社製）
――――――――――――――――――――――――――――――――――
ｐＨを７．４に調整した後１２５℃にて３０分間滅菌した。
【００８１】
実施例２． Ａ−５００３５９Ｅ化合物の精製
実施例1にて得られた培養終了液（３０Ｌ）を、セライト５４５（Ｃｅｌｉｔｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）をろ過助剤としてろ過した。
【００８２】
以降の精製においては、活性画分を下記のカラム及び分析条件のＨＰＬＣでモニターした。
【００８３】
カラム：Ｓｅｎｓｈｕ Ｐａｋ ＯＤＳ−Ｈ−２１５１
６φ×１５０ｍｍ（センシュー科学社製）
溶媒：４％アセトニトリルを含有する０．０４％トリフルオロ酢酸水
流速：１．０ｍｌ/分
検出：ＵＶ２１０ｎｍ
保持時間：２１．２分
得られたろ液３０Ｌを、ダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化学社製）を充填したカラム（６Ｌ）に供与した。その後、カラムを１２Ｌの純水で洗浄した後、素通り画分と洗浄画分を合併した（以下、この合併した画分を「素通り・洗浄画分」と記す。）。吸着物質は１２Ｌの１０％アセトン水で溶出した。この溶出画分を濃縮、アセトンを留去した後、凍結乾燥し、３９ｇの粗粉末が得られた。
【００８４】
この粗粉末を２００ｍｌの純水に溶解し、ダイヤイオンＣＨＰ−２０Ｐ（三菱化学社製）を充填したカラム（２Ｌ）に供与した。その後、カラムを４Ｌの純水および４Ｌの１０％メタノール水で洗浄し、吸着物質を４Ｌの１５％メタノール水、４Ｌの２０％メタノール水で溶出した。１５％メタノール水画分の２〜４Ｌ部分および２０％メタノール水画分を合併し濃縮、メタノールを留去した後、凍結乾燥し、８．９ｇの粉末が得られた。
【００８５】
この粉末を２００ｍｌの純水に溶解し、トヨパールＨＷ４０Ｆ（東ソー社製）を充填したカラム（１Ｌ）に供与し、カラムを純水で展開した。１００ｍｌ毎に溶出液を分画したところ、上記ＨＰＬＣにて保持時間２１．２分の活性物質はフラクション５〜１０に溶出された。この画分を濃縮後、凍結乾燥し、２．７ｇの粉末が得られた。
【００８６】
この粉末を２００ｍｌの水に溶解し４％アセトニトリルを含有する０．０４％のトリフルオロ酢酸水で平衡化したＨＰＬＣカラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−１０５０−２０−ＳＲ：１００φ×５００ｍｍ：ワイエムシィ社製）に供与し、カラムを４％アセトニトリルを含有する０．０４％のトリフルオロ酢酸水にて流速２０８ｍｌ／分で展開した。溶出液を１Ｌ毎に分画したところ、活性物質はフラクション６および７に溶出された。
【００８７】
この画分を合併しエバポール（大川原製作所社製）で２００ｍｌに濃縮した後、凍結乾燥することにより、９９ｍｇの粉末が得られた。この粉末を５ｍｌの蒸留水に懸濁し、不溶物をろ別した。ろ液をロタリーエバポレーターで２ｍｌに濃縮し、凍結乾燥することにより、８７ｍｇのＡ−５００３５９Ｅ化合物が純品として得られた。
【００８８】
Ａ−５００３５９Ｅ化合物は下記の物理化学的性状を有する。
１）物質の性状：白色粉末状物質
２）溶解性：水に可溶、メタノールに難溶、ノルマルヘキサン、クロロホルムに不溶
３）分子式：C₁₈H₂₃N₃O₁₂
４）分子量：473（FAB マススペクトル法により測定）
５）高分解能FABマススペクトル法により測定した精密質量、[M+H]⁺は、次に示す通りである：
実測値：474.1349
計算値：474.1359
６）紫外部吸収スペクトル：水中で測定した紫外部吸収スペクトルは、次に示す極大吸収を示す：
251 nm (ε10,000)
７）旋光度：水中で測定した旋光度は、以下に示す値を示す：
[α]_D ²⁰：+115°(c 0.28)
８）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム（KBr）錠剤法で測定した赤外部吸収スペクトルは、以下に示す極大吸収を示す：
3410, 2955, 1683, 1464, 1441, 1396, 1309, 1267, 1206, 1138, 1115, 1088, 1062, 1023 cm^-1
９）¹H-核磁気共鳴スペクトル：重ジメチルスルホキシド中、内部基準にテトラメチルシランを用いて測定した、¹H-核磁気共鳴スペクトルは、以下に示す通りである： 3.24 (3H, s), 3.52 (1H, dd, J=4.5, 6.1Hz), 3.72 (3H, s), 3.98 (1H, m), 4.10 (1H, m), 4.25 (1H, m), 4.29 (1H, d, J=2.0Hz), 4.33 (1H, dd, J=2.0, 6.1Hz), 5.05 (1H, d, J=3.9 Hz), 5.16 (1H, d, J=6.8Hz), 5.45 (1H, d, J=4.2Hz), 5.54 (1H, d, J=5.9Hz), 5.61 (1H, d, J=3.3Hz), 5.61 (1H, d, J=8.1Hz), 5.93 (1H, dd, J=1.3, 2.9 Hz), 7.56 (1H, br. s), 7.69 (1H, br. s), 7.74 (1H, d, J=8.1 Hz) ppm.
１０）¹³C-核磁気共鳴スペクトル：重ジメチルスルホキシド中、内部基準にテトラメチルシランを用いて測定した、¹³C-核磁気共鳴スペクトルは、以下に示す通りである： 52.0 (q), 57.3 (q), 61.5 (d), 64.9 (d), 72.1 (d), 75.4 (d), 78.2 (d), 81.3 (d), 89.0 (d), 99.2 (d), 101.2 (d), 114.2 (d), 139.2 (s), 139.8 (d), 150.3 (s), 161.8 (s), 163.1 (s), 170.1 (s) ppm.１１）高速液体クロマトグラフィー（ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：以下、「ＨＰＬＣ」と記する。）分析：
カラム： センシューパックODS-H-2151、
6φ×150 mm（センシュー科学社製）
溶媒：4%アセトニトリルを含有する0.04%トリフルオロ酢酸水
流速：1.0 ml/分
検出：UV 210 nm
保持時間：21分。
【００８９】
実施例３． Ａ−５００３５９Ｆ化合物及びＡ−５００３５９Ｈ化合物の精製以降の精製においては、活性画分を下記のカラム及び分析条件のＨＰＬＣでモニターした。
【００９０】
カラム：Ｓｅｎｓｈｕ Ｐａｋ ＯＤＳ−Ｈ−２１５１
６φ×１５０ｍｍ（センシュー科学社製）
溶媒：０．０４％トリフルオロ酢酸水
流速：１．５ｍｌ/分
検出：ＵＶ２１０ｎｍ
保持時間： ８分（Ａ−５００３５９Ｈ化合物）
１８分（Ａ−５００３５９Ｆ化合物）。
【００９１】
実施例２で得られた素通り・洗浄画分４２ＬのｐＨを６Ｎの水酸化ナトリウムを用いて９に調整した後、ダイヤイオンＰＡ３１６（Ｃｌ^-）（三菱化学社製）を充填したカラム（８．５Ｌ）に供与した。カラムを２７Ｌの純水で洗浄した後、吸着物を２７Ｌの０．１Ｎ塩酸で溶出した。
【００９２】
溶出液のｐＨを６Ｎの水酸化ナトリウムで７に調整した後、この溶出液を活性炭カラム（２Ｌ）に供与した。カラムを８Ｌの純水で洗浄した後、活性物質を１０％アセトンを含有する０．５Ｎアンモニア水８Ｌで溶出した。この溶出液を濃縮、凍結乾燥することにより、２８ｇの粉末が得られた。
【００９３】
この粉末を４００ｍｌの蒸留水に溶解し、ｐＨを３．０に調節した後、純水で調製したダイヤイオンＣＨＰ−２０Ｐ（三菱化学社製）を充填したカラム（２Ｌ）に供与した。通過液および水洗液を回収し、濃縮、凍結乾燥することにより１２ｇのアメ状物質が得られた。
【００９４】
得られたアメ状物質を２００ｍｌの蒸留水に溶解し、ｐＨをトリフルオロ酢酸で３．３に調整した後、０．０４％のトリフルオロ酢酸水で平衡化したダイヤイオンＣＨＰ−２０Ｐ（三菱化学社製）を充填したカラム（１Ｌ）に再度供与した。カラムを２Ｌの０．０４％のトリフルオロ酢酸水で展開し、０．８〜１．４Ｌの間に溶出された画分（Ｈ画分）をプールした後、溶出液を２Ｌの蒸留水に切り替え溶出した。蒸留水溶出画分２Ｌ（Ｆ画分）を濃縮、凍結乾燥し、６０５ｍｇの粉末が得られた。
【００９５】
Ｈ画分６００ｍｌを蒸留水で１Ｌに希釈し、ｐＨをトリフルオロ酢酸で２．８に調整した後、０．０４％のトリフルオロ酢酸水で平衡化したダイヤイオンＣＨＰ−２０Ｐ（三菱化学社製）を充填したカラム（１Ｌ）に再度供与した。カラムを２．２Ｌの０．０４％のトリフルオロ酢酸水で溶出した。２００ｍｌ毎に分画したフラクション８〜１１を濃縮、凍結乾燥し、２３３ｍｇの粉末が得られた。
【００９６】
この粉末のうち１００ｍｇを５ｍｌの水に溶解し、各１ｍｌを０．０４％のトリフルオロ酢酸水で平衡化したＨＰＬＣカラム（Ｓｅｎｓｈｕ Ｐａｋ ＯＤＳ−Ｈ−５２５１：２０φ×２５０ｍｍ：センシュー科学社製）に供与し、流速１０ｍｌ／分で展開した。活性画分の紫外部２１０ｎｍの吸収を検出し、保持時間１４分〜１６分に溶出されるピークを５回分取した。得られた画分をロータリーエバポレーターで濃縮後、凍結乾燥し２３ｍｇのＡ−５００３５９Ｈ化合物が純品として得られた。
【００９７】
６０５ｍｇのＦ画分凍結乾燥粉末を１５ｍｌの水に溶解し、各１ｍｌを０．０４％のトリフルオロ酢酸水で平衡化したＨＰＬＣカラム（Ｓｅｎｓｈｕ ＰａｋＯＤＳ−Ｈ−５２５１：２０φ×２５０ｍｍ：センシュー科学社製) に供与し、流速１０ｍｌ／分で展開した。活性画分の紫外部２１０ｎｍの吸収を検出し、保持時間２９分〜３１分に溶出されるピークを１５回分取した。得られた画分をロータリーエバポレーターで濃縮後、凍結乾燥し、１３４ｍｇのＡ−５００３５９Ｆ化合物が純品として得られた。
【００９８】
Ａ−５００３５９Ｆ化合物は、下記の物理化学的性状を有する。
１）物質の性状：白色粉末状物質
２）溶解性：水に可溶、メタノールに難溶、ノルマルヘキサン、クロロホルムに不溶
３）分子式：C₁₇H₂₁N₃O₁₂
４）分子量：459（FAB マススペクトル法により測定）
５）高分解能FABマススペクトル法により測定した精密質量、[M+H]⁺は、次に示す通りである：
実測値：460.1201
計算値：460.1203
６）紫外部吸収スペクトル：水中で測定した紫外部吸収スペクトルは、次に示す極大吸収を示す：
262 nm (ε7,000)
７）旋光度：水中で測定した旋光度は、以下に示す値を示す：
[α]_D ²⁰：+111°(c 0.41)
８）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム（KBr）錠剤法で測定した赤外部吸収スペクトルは、以下に示す極大吸収を示す：
3391, 2941, 1684, 1466, 1400, 1333, 1269, 1205, 1137, 1115, 1062, 1020 cm^-1
９）¹H-核磁気共鳴スペクトル：重水中、水のシグナルを4.75 ppmとして測定した、¹H-核磁気共鳴スペクトルは、以下に示す通りである： 3.37 (3H, s), 3.79 (1H, dd, J=5.1, 6.4Hz), 4.17 (1H, ddd, J=1.6, 3.4, 4.6 Hz), 4.38 (1H, dd, J=3.5, 5.1 Hz), 4.48 (1H, dd, J=2.4, 6.4 Hz), 4.49 (1H, ddd, J=0.6, 2.7, 4.6 Hz), 4.69 (1H, d, J=2.4 Hz), 5.32 (1H, dd, J=0.6, 3.4 Hz), 5.77 (1H, d, J=3.5 Hz), 5.90 (1H, d, J=8.1 Hz), 6.11 (1H, dd, J=1.6, 2.7 Hz), 7.75 (1H, d, J=8.1 Hz) ppm.
１０）¹³C-核磁気共鳴スペクトル：重水中、内部基準に1, 4-ジオキサン (67.4 ppm) を用いて測定した、¹³C-核磁気共鳴スペクトルは、以下に示す通りである： 58.6 (q), 62.7 (d), 65.5 (d), 72.7 (d), 76.3 (d), 78.8 (d), 91.2 (d), 100.0 (d), 102.7 (d), 114.8 (d), 140.7 (s), 141.9 (d), 152.1 (s), 165.4 (s), 167.0 (s), 173.9 (s) ppm.
１１）ＨＰＬＣ分析：
カラム： センシューパックODS-H-2151、
6φ×150 mm（センシュー科学社製）
溶媒：0.04%トリフルオロ酢酸水
流速：1.5 ml/分
検出：UV 210 nm
保持時間18分。
【００９９】
Ａ−５００３５９Ｈ化合物は、下記の物理化学的性状を有する。
１）物質の性状：白色粉末状物質
２）溶解性：水に可溶、メタノールに難溶、ノルマルヘキサン、クロロホルムに不溶
３）分子式：C₁₆H₁₉N₃O₁₂
４）分子量：445
５）高分解能FABマススペクトル法により測定した精密質量、[M+H]⁺は、次に示す通りである：
実測値：446.1025
計算値：446.1047
６）紫外部吸収スペクトル：水中で測定した紫外部吸収スペクトルは、次に示す極大吸収を示す：
262 nm (ε7,400)
７）旋光度：水中で測定した旋光度は、以下に示す値を示す：
[α]_D ²⁰：+115°(c 0.33)
８）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム (KBr)錠剤法で測定した赤外部吸収スペクトルは、以下に示す極大吸収を示す：
3361, 2934, 1683, 1467, 1403, 1336, 1270, 1206, 1114, 1090, 1058, 1021 cm^-1
９）¹H-核磁気共鳴スペクトル：重水中、水を4.75 ppmとして測定した¹H-核磁気共鳴スペクトルは、以下に示す通りである： 4.13 (br. t, J=5.4 Hz), 4.15-4.19 (2H), 4.43 (1H, dd, J=2.5, 5.8Hz), 4.48 (1H, dd, J=2.9, 4.7 Hz), 4.72 (1H, d, J=2.5 Hz), 5.31 (1H, d, J=4.0 Hz), 5.80 (1H, d, J=4.0 Hz), 5.89 (1H, d, J=8.3 Hz), 6.12 (1H, dd, J=1.4, 2.9 Hz), 7.75 (1H, d, J=8.3 Hz) ppm
１０）¹³C-核磁気共鳴スペクトル：重水中、内部基準に1, 4-ジオキサン (67.4 ppm) を用いて測定した¹³C-核磁気共鳴スペクトルは、以下に示す通りである： 62.8 (d), 65.8 (d), 70.3 (d), 74.6 (d), 77.0 (d), 84.2 (d), 90.3 (d), 100.3 (d), 102.9 (d), 113.9 (d), 141.2 (s), 141.9 (d), 152.2 (s), 165.9 (s), 167.0 (s), 174.2 (s) ppm
１１）ＨＰＬＣ分析：
カラム： センシューパックODS-H-2151、
6φ×150 mm（センシュー科学社製）
溶媒：0.04%トリフルオロ酢酸水
流速：1.5 ml/分
検出：UV 210 nm
保持時間：8分。
【０１００】
実施例４． ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）ＳＡＮＫ６０１９６（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４２０）株の培養
以下に記載する前培養培地５００ｍｌを入れた２Ｌの三角フラスコに、ＳＡＮＫ６０１９６株を無菌的に４白金耳接種し、次いで該フラスコ３本分をロータリー振とう機中で２３℃、２１０ｒｐｍにて振とうして、３日間の第一前培養を行った。
【０１０１】
前培養培地：下記の成分を水道水１０００ｍｌ中に含む。
【０１０２】
グルコース ２０ｇ
可溶性澱粉 １０ｇ
生イースト ９ｇ
肉エキス ５ｇ
ポリペプトン ５ｇ
塩化ナトリウム ５ｇ
炭酸カルシウム ３ｇ
消泡剤ＣＢ４４２ ５０ｍｇ
（日本油脂社製）
―――――――――――――――――――――――――――――――――――
ｐＨを７．４に調整したのち１２１℃にて２０分間滅菌した。
【０１０３】
この第一前培養液を、同一の前培養培地３０Ｌを入れた６０Ｌのタンク１基に３％接種し、２３℃で１日通気攪拌培養を行った（第二前培養）。
本培養は以下に記載するようにして行った。すなわち、下記本培養培地４００Ｌの入った６００Ｌ容タンク２基に、第二前培養液を３％（ｖ/ｖ）接種した後、２３℃で６日間通気攪拌培養を行った。
【０１０４】
前培養培地：下記の成分を水道水１０００ｍｌ中に含む。
【０１０５】
グルコース ２０ｇ
可溶性澱粉 １０ｇ
生イースト ９ｇ
肉エキス ５ｇ
ポリペプトン ５ｇ
塩化ナトリウム ５ｇ
炭酸カルシウム ３ｇ
消泡剤ＣＢ４４２ ５０ｍｇ
（日本油脂社製）
――――――――――――――――――――――――――――――――――
ｐＨを７．４に調整した後炭酸カルシウム３ｇを添加し、
１２５℃にて２０分間滅菌した。
【０１０６】
実施例５． Ａ−５００３５９Ｅ化合物の精製
実施例４にて得られた培養終了液（８１０Ｌ）を、セライト５４５（Ｃｅｌｉｔｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）をろ過助剤として、ろ過した。
【０１０７】
以降の精製においては、活性画分を下記のカラム及び分析条件のＨＰＬＣでモニターした。
【０１０８】
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ Ａ−３１２
６φ×１５０ｍｍ（ワイエムシィ社製）
溶媒：４％アセトニトリルを含有する０．０４％トリフルオロ酢酸水
流速：１．０ｍｌ/分
検出：ＵＶ２１０ｎｍ
保持時間：１９．８分。
【０１０９】
得られたろ液８００ＬをダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化学社製）を充填したカラム（１６０Ｌ）に供与した。その後、カラムを６４０Ｌの純水で洗浄した後、素通り画分と洗浄画分を合併した（素通り・洗浄画分）。吸着物質は３４８Ｌの１０％アセトン水で溶出した。
【０１１０】
この溶出画分を１０Ｌに濃縮した後、ダイヤイオンＣＨＰ−２０Ｐ（三菱化学社製）を充填したカラム（４５Ｌ）に供与した。その後、カラムを９０Ｌの純水、１００Ｌの１０％メタノール水および１００Ｌの１５％メタノール水で洗浄し、吸着物質を１００Ｌの２０％メタノール水で溶出した。
【０１１１】
２０％メタノール水画分を５Lに濃縮した後、濃縮液をトヨパールＨＷ４０Ｆ（東ソー社製）を充填したカラム（２２Ｌ）に供与した。カラムを純水で展開し、５Ｌ毎に溶出液を分画したところ、上記ＨＰＬＣにて保持時間１９．８分の活性物質はフラクション３〜６に溶出された。この画分を５．８Ｌに濃縮後、凍結乾燥し、５５．８ｇの粉末が得られた。
【０１１２】
この粉末を１．２Ｌの純水に溶解し、そのうち２００ｍｌを４％アセトニトリルを含有する０．０４％のトリフルオロ酢酸水で平衡化したＨＰＬＣカラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−１０５０−２０−ＳＲ：１００φ×５００ｍｍ：ワイエムシィ社製）に供与し、カラムを４％アセトニトリルを含有する０．０４％のトリフルオロ酢酸水にて流速２００ｍｌ／分で展開した。活性物質は１０５分から１２４分の間に溶出された。この操作を６回くりかえし、得られた画分を合併しエバポールで５Ｌに濃縮した後、凍結乾燥することにより、２４．２ｇのＡ−５００３５９Ｅ化合物が純品として得られた。
【０１１３】
実施例６．Ａ−５００３５９Ｆ化合物及びＡ−５００３５９Ｈ化合物の精製
以降の精製においては、活性画分を下記のカラム及び条件のＨＰＬＣでモニターした。
【０１１４】
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ Ａ−３１２
６φ×１５０ｍｍ（ワイエムシィ社製）
溶媒：０．０４％トリフルオロ酢酸水
流速：１．５ｍｌ／分
検出：ＵＶ２１０ｎｍ
保持時間： ７．７分（Ａ−５００３５９Ｈ化合物）
１６．６分（Ａ−５００３５９Ｆ化合物）。
【０１１５】
実施例５で得られた素通り・洗浄画分１３７０Ｌを、活性炭カラム（６５Ｌ）に供与した。カラムを２６０Ｌの純水で洗浄した後、活性物質を１０％アセトンを含有する０．５Ｎアンモニア水２７０Ｌで溶出した。この溶出液を４０Ｌに濃縮し、ｐＨをトリフルオロ酢酸で２．４に調節した後、０．０４％のトリフルオロ酢酸水で平衡化したダイヤイオンＣＨＰ−２０Ｐ（三菱化学社製）を充填したカラム（４５Ｌ）に供与した。カラムを０．０４％のトリフルオロ酢酸水で展開し、０〜４７Ｌの間に溶出された画分（Ｈ画分）、４７〜９１Ｌの間に溶出された画分（Ｆ画分）が得られた。Ｈ画分は１．５Ｌに濃縮し、Ｆ画分は濃縮の後、凍結乾燥し２８７ｇの粉末とした。
【０１１６】
Ｈ画分の濃縮液を、純水で３．２Ｌに希釈した。このうち１６０ｍｌを０．０４％のトリフルオロ酢酸水で平衡化したＨＰＬＣカラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−１０５０−２０−ＳＲ：１００φ×５００ｍｍ：ワイエムシィ社製）に供与し、流速２００ｍｌ／分で展開した。活性画分の紫外部２１０ｎｍの吸収を検出し、保持時間６７分〜７２分に溶出されるピークを分取した。この操作を２０回繰り返し、得られた画分をエバポール（大川原製作所社製）で濃縮後、凍結乾燥し、５．９ｇのＡ−５００３５９Ｈ化合物が純品として得られた。
【０１１７】
Ｆ画分の粉末のうち、２７７ｇを５０Ｌの純水に溶解し、ｐＨをトリフルオロ酢酸で２．２に調整した。この溶解液を０．０４％のトリフルオロ酢酸水で平衡化したダイヤイオンＣＨＰ−２０Ｐ（三菱化学社製）を充填したカラム（４５Ｌ）に再度供与した。カラムを９７Ｌの０．０４％のトリフルオロ酢酸水で洗浄した後、活性物質を１２０Ｌの純水で溶出した。この純水溶出画分を濃縮、凍結乾燥し、７５．６ｇのＦ画分凍結乾燥粉末が得られた。
【０１１８】
このF画分凍結乾燥粉末を４Ｌの水に溶解し、このうち１５０ｍｌを０．５％アセトニトリル−０．０４％トリフルオロ酢酸水混液で平衡化したＨＰＬＣカラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−１０５０−２０−ＳＲ：１００φ×５００ｍｍ：ワイエムシィ社製）に供与し、同一溶媒系を用いて流速２００ｍｌ／分で展開した。活性画分の紫外部２１０ｎｍの吸収を検出し、保持時間８８分〜９７分に溶出されるピークを分取した。この操作を２７回繰り返し、得られた画分を濃縮後、凍結乾燥し、１９．２ｇのＡ−５００３５９Ｆ化合物が純品として得られた。
【０１１９】
実施例７．Ａ−５００３５９Ｆ化合物及びＡ−５０３５９Ｆアミド化合物の製造方法（Ａ−５００３５９Ｅ化合物のアンモニア水による化学変換）
実施例２で得られたＡ−５００３５９Ｅ化合物７５ｍｇを２ｍｌの０．５Ｎアンモニア水に溶解した。室温で２時間放置した後、反応終了液を凍結乾燥し、７８ｍｇの粉末が得られた。
【０１２０】
この粉末を１ｍｌの０．０４％ＴＦＡ水に溶解し、各１００μｌを０．０４％のトリフルオロ酢酸水で平衡化したＨＰＬＣカラム（Ｃａｐｃｅｌｌｐａｋ ＵＧ １２０Å：２０φ×２５０ｍｍ：資生堂社製）に供与し、０．０４％のトリフルオロ酢酸水を用いて流速１０ｍｌ／分で展開した。活性画分の紫外部２１０ｎｍの吸収を検出し、保持時間２１分〜２２分に溶出されるピークおよび保持時間３１分〜３３分に溶出されるピークを１０回に分けて分取した。
【０１２１】
保持時間２１分〜２２分に溶出された画分をロータリーエバポレーターで濃縮後、凍結乾燥し、１４ｍｇのＡ−５００３５９Ｆアミド化合物が純品として得られた。
【０１２２】
また、保持時間３１分〜３３分に溶出された画分をロータリーエバポレーターで濃縮後、凍結乾燥し、５０ｍｇのＡ−５００３５９Ｆ化合物が純品として得られた。
【０１２３】
Ａ−５００３５９Ｆアミド化合物は、下記の物理化学的性状を有する。
１）物質の性状：白色粉末状物質
２）溶解性：水に可溶、メタノールに難溶、ノルマルヘキサン、クロロホルムに不溶
３）分子式：C₁₇H₂₂N₄O₁₁
４）分子量：458（FAB マススペクトル法により測定）
５）高分解能FABマススペクトル法により測定した精密質量、[M+H]⁺は、次に示す通りである：
実測値：459.1328
計算値：459.1364
６）紫外部吸収スペクトル：水中で測定した紫外部吸収スペクトルは、次に示す極大吸収を示す：
258 nm (ε7,500)
７）旋光度：水中で測定した旋光度は、以下に示す値を示す：
[α]_D ²⁵：+119°(c 0.87)
８）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム（KBr）錠剤法で測定した赤外部吸収スペクトルは、以下に示す極大吸収を示す：
3339, 2943, 1686, 1598, 1495, 1402, 1337, 1272, 1205, 1136, 1115, 1060, 1019 cm^-1
９）¹H-核磁気共鳴スペクトル：重水中、水のシグナルを4.75 ppmとして測定した、¹H-核磁気共鳴スペクトルは、以下に示す通りである： 3.30 (3H, s) 3.67 (1H, dd, J=5.0, 6.8 Hz), 4.17 (1H, ddd, J=1.8, 2.9, 4.4 Hz), 4.35 (1H, dd, J=3.2, 5.0 Hz), 4.43 (1H, dd, J=2.3, 6.8 Hz), 4.45 (1H, dd, J=2.4, 4.4 Hz), 4.66 (1H, d, J=2.3 Hz), 5.35 (1H, d, J=2.9 Hz), 5.71 (1H, d, J=3.2 Hz), 5.85 (1H, d, J=8.1 Hz), 5.97 (1H, dd, J=1.8, 2.4 Hz), 7.71 (1H, d, J=8.1 Hz) ppm.
１０）¹³C-核磁気共鳴スペクトル：重水中、内部基準に1, 4-ジオキサン (67.4 ppm) を用いて測定した、¹³C-核磁気共鳴スペクトルは、以下に示す通りである： 58.6 (q), 62.7 (d), 65.3 (d), 72.6 (d), 75.7 (d), 78.7 (d), 82.3 (d), 91.3 (d), 99.8 (d), 102.7 (d), 110.8 (d), 141.9 (d), 142.3 (s), 152.1 (s), 166.0 (s), 167.0 (s) ppm.
１１）ＨＰＬＣ分析：
カラム： センシューパックODS-H-2151、
6φ×150 mm（センシュー科学社製）
溶媒：0.04%トリフルオロ酢酸水
流速：1.5 ml/分
検出：UV 210 nm
保持時間：11分。
【０１２４】
実施例８． Ａ−５００３５９Ｆ化合物の製造方法（Ａ−５００３５９Ｅ化合物の水酸化ナトリウムによる加水分解）
実施例２で得られたＡ−５００３５９Ｅ化合物４．４ｍｇを０．５ｍｌの蒸留水に溶解した。０．５ｍｌの０．０２Ｎ水酸化ナトリウム水を滴下した後、１ｍｌの０．１Ｎ水酸化ナトリウム水を滴下し、室温にて５０分間放置した。反応液を1Ｎの塩酸で中和した後、２ｍｌの活性炭カラムに供与した。カラムを８ｍｌの蒸留水で洗浄した後、８ｍｌの１０％アセトンを含有する０．５Ｎアンモニア水で反応物質を溶出させた。
【０１２５】
この溶出液を７００μｌに濃縮した後、２３０μｌを０．０４％のトリフルオロ酢酸水で平衡化したＨＰＬＣカラム（Ｓｅｎｓｈｕ Ｐａｋ ＯＤＳ−Ｈ−４２５１：１０φ×２５０ｍｍ：センシュー科学社製）に供与し、流速４ｍｌ／分で展開した。活性物質の紫外部２１０ｎｍの吸収を検出し、保持時間２５分〜３０分に溶出されるピークを分取した。この操作を３回繰り返し、得られた画分をロータリーエバポレーターで濃縮後、凍結乾燥し、２．６ｍｇのＡ−５００３５９Ｆ化合物が純品として得られた。
【０１２６】
実施例９． ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）ＳＡＮＫ６０１９６（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４２０）株の培養
以下に記載する組成の培地１００ｍｌを入れた５００ｍｌの三角フラスコ(種フラスコ)にＳＡＮＫ６０１９６株を無菌的に１白金耳接種し、次いで該フラスコをロータリー振とう機中で２３℃、２１０ｒｐｍにて振とうして、３日間の前培養を行った。
【０１２７】
前培養培地：下記の成分を水道水１０００ｍｌ中に含む。
【０１２８】
マルトース ３０ｇ
肉エキス ５ｇ
ポリペプトン ５ｇ
塩化ナトリウム ５ｇ
炭酸カルシウム ３ｇ
消泡剤ＣＢ４４２ ５０ｍｇ
―――――――――――――――――――――――――――――――――――
ｐＨを７．４に調製した後１２１℃にて３０分間滅菌した。
本培養は以下に記載するようにして行った。すなわち、滅菌済みの下記の組成の培地１００ｍｌの入った５００ｍｌ容三角フラスコに前培養液を３％（Ｖ／Ｖ）植菌し、次いで該フラスコ１０本分をロータリー振とう機中で２３℃、２１０ｒｐｍにて振とうして、１１日間培養を行った。
【０１２９】
本培養培地：下記の成分を水道水１０００ｍｌ中に含む。
【０１３０】
グルコース ５０ｇ
肉エキス ４ｇ
ポリペプトン ３ｇ
スキムミルク １０ｇ
コーンスチープリカー １０ｇ
塩化ナトリウム ５ｇ
消泡剤ＣＢ４４２ ５０ｍｇ
――――――――――――――――――――――――――――――――――
ｐＨを７．４に調製した後１２５℃にて３０分間滅菌した。
【０１３１】
実施例１０．Ａ−５００３５９Ｊ化合物の精製
以降の精製においては、活性画分を下記のカラム及び条件のＨＰＬＣでモニターした。
【０１３２】
カラム：ＰｅｇａｓｉｌＯＤＳ
６φ×１５０ｍｍ（センシュー科学(株)社製）
溶媒：０．０４％トリフルオロ酢酸水
流速：１．０ｍｌ／分
検出：ＵＶ２６０ｎｍ
保持時間：５．５７分。
【０１３３】
実施例９で得られた培養液を、セライト５４５をろ過助剤として５％（Ｗ／Ｖ）添加した後、ろ過した。得られたろ液（１Ｌ）を、ダイアイオンＨＰ−２０（２００ｍｌ）カラムに供与し、その後カラムを蒸留水(５００ｍｌ)で洗浄した。通過画分及び水洗画分の合併液１．５ＬのｐＨを６Ｎの水酸化ナトリウムを用いて９に調製した後、ダウエックスＳＢＲ−Ｐ（ＯＨ^-）カラム（１００ｍｌ）に供与した。カラムを蒸留水(３００ｍｌ)で洗浄した後、吸着物を３００ｍｌの１Ｎ塩酸水で溶出した。
【０１３４】
溶出後のｐＨを６Ｎの水酸化ナトリウムで７に調製した後、この溶出液を活性炭カラム（５０ｍｌ）に供与した。カラムを蒸留水（１００ｍｌ）で洗浄した後、活性物質を６０％アセトン水（２００ｍｌ）で溶出した。この溶出液を濃縮、凍結乾燥することにより、５５８ｍｇの粉末が得られた。
【０１３５】
この粉末を５ｍｌの蒸留水に溶解し、各５００μｌを０．０５％のトリフルオロ酢酸水で平衡化したＨＰＬＣカラム(センシューパックＰｅｇａｓｉｌＯＤＳ:２０φｘ２５０ｍｍ:センシュー科学(株)社製)に供与し、流速１０.０ｍｌ/分で展開した。活性画分の紫外部２６０ｎｍの吸収を検出し、保持時間１１．１分に溶出されるピークを１０回分取した。得られた画分をロータリーエバポレーターで濃縮後、凍結乾燥し１６．２ｍｇのＡ−５００３５９Ｊ物質が純品として得られた。
【０１３６】
Ａ−５００３５９Ｊ化合物は、下記の物理化学的性状を有する。
１）物質の性状：白色粉末状物質
２）溶解性：水に可溶、メタノールに難溶、ノルマルヘキサン、クロロホルムに不溶
３）分子式：C₁₆H₂₁N₃O₁₃
４）分子量：463（FABマススペクトル法により測定）
５）高分解能FABマススペクトル法により測定した精密質量、[M-H]^-は、次に示す通りである：
実測値：462.0996
計算値：462.1006
６）紫外吸収スペクトル：水中で測定した紫外吸収スペクトルは、次に示す極大吸収を示す：
194（ε8800）、262（ε10000）nm
７）旋光度：水中で測定した旋光度は、以下に示す値を示す：
[α]_D ²⁸：+83°（c 0.1、H₂O）
８）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム (KBr)錠剤法で測定した赤外部吸収スペクトルは、以下に示す極大吸収を示す：
3372, 2931, 1684, 1467, 1407, 1273, 1204, 1107, 1058 cm^-1
９）¹H-核磁気共鳴スペクトル：重水中、内部基準に1,4-ジオキサン(3.53ppm)を用いて測定した¹H-核磁気共鳴スペクトルは、以下に示す通りである： 3.75 (１H, t, J=3.4 Hz), 3.83 (1H, ddd, J=1.4, 1.9, 3.4 Hz), 4.02 (1H, ddd, J=1.4, 1.7, 3.4Hz), 4.05 (1H, dd, J=5.3, 5.6 Hz), 4.11 (1H, t, J=5.6 Hz), 4.13 (1H, dd, J=3.1, 5.6 Hz), 4.30 (1H, d, J=5.3 Hz), 4.33 (1H, d, J=1.7 Hz), 4.90 (1H, d, J=1.9 Hz), 5.50 (1H, d, J=3.1 Hz), 5.7 (1H,d, J=8.2 Hz), 7.6 (1H, d, J=8.2 Hz) ppm
１０）¹³C-核磁気共鳴スペクトル：重水中、内部基準に1, 4-ジオキサン (67.4 ppm) を用いて測定した¹³C-核磁気共鳴スペクトルは、以下に示す通りである： 64.4 (d), 68.8 (d), 68.9 (d), 69.7 (d), 71.4 (d), 73.0 (d), 75.4 (d), 82.8 (d), 90.7 (d), 99.2 (d), 101.7 (d), 141.6 (d), 151.0 (s), 165.9 (s), 171.9 (s), 172.6 (s) ppm
１１）ＨＰＬＣ分析：
カラム： センシューパックODS-H-2151、
6φ×150 mm（センシュー科学社製）
溶媒：0.05%トリフルオロ酢酸水
流速：1.0 ml/分
検出：UV 260 nm
保持時間：5.57分。
【０１３７】
実施例１１．ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）ＳＡＮＫ６０１９６（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４２０）株の培養
以下に記載する組成の培地１００ｍｌを入れた５００ｍｌの三角フラスコ(種フラスコ)にＳＡＮＫ６０１９６株を無金的に１白金耳接種し、次いで該フラスコ４本分をロータリー振とう機中で２３℃、２１０ｒｐｍにて振とうして、３日間の前培養を行った。
【０１３８】
前培養培地：下記の成分を水道水１０００ｍｌ中に含む。
【０１３９】
マルトース ３０ｇ
肉エキス ５ｇ
ポリペプトン ５ｇ
塩化ナトリウム ５ｇ
炭酸カルシウム ３ｇ
消泡剤ＣＢ４４２ ５０ｍｇ
―――――――――――――――――――――――――――――――――――
ｐＨを７．４に調製した後１２１℃にて３０分間滅菌した。
【０１４０】
本培養は以下に記載するようにして行った。すなわち、滅菌済みの下記の組成の培地１００ｍｌの入った５００ｍｌ容三角フラスコに前培養液を３％（Ｖ／Ｖ） 植菌し、次いで該フラスコ１０本をロータリー振とう機中で２３℃、２１０ｒｐｍにて振とうし培養をした。培養開始後６時間目にフィルター除菌したＳ-(２-アミノエチル)-Ｌ-システイン塩酸塩およびＬ-アリルグリシンを終濃度１０ｍＭとなるように添加した後、引き続き７日間培養を行った。
【０１４１】
本培養培地：下記の成分を水道水１０００ｍｌ中に含む。
【０１４２】
マルトース ３０ｇ
イーストエキス ５ｇ
（Ｄｉｆｃｏ社製）
肉エキス ５ｇ
ポリペプトン ５ｇ
塩化ナトリウム ５ｇ
炭酸カルシウム ３ｇ
消泡剤ＣＢ４４２ ５０ｍｇ
――――――――――――――――――――――――――――――――――
ｐＨを７．４に調製した後１２５℃にて３０分間滅菌した。
【０１４３】
実施例１２． Ａ-５００３５９Ｍ−３物質の精製
実施例１１にて得られた培養終了液(１Ｌ)を、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、得られた上清より精製した。
【０１４４】
以降の精製においては、活性画分を下記のカラム及び条件のＨＰＬＣでモニターした。
【０１４５】
カラム：ＰｅｇａｓｉｌＯＤＳ
６φ×１５０ｍｍ（センシュー科学(株)社製）
溶媒：７．２％アセトニトリル-０．０５％トリフルオロ酢酸水
流速：１．０ｍｌ／分
検出：ＵＶ２６０ｎｍ
保持時間：１０．１分。
【０１４６】
上清(１Ｌ)のｐＨをトリフルオロ酢酸を用いて３に調整後、０．０５％トリフルオロ酢酸水で平衡化したダイヤイオンＨＰ−２０カラム（２００ｍｌ）に供与した。その後、カラムを０．０５％のトリフルオロ酢酸水（５００ｍｌ）で洗浄し、蒸留水(５００ｍｌ)で溶出した。得られた蒸留水溶出画分(５００ｍｌ)を濃縮、凍結乾燥し２３０ｍｇの粗粉末が得られた。
【０１４７】
この粗粉末を２ｍｌの蒸留水に溶解し、そのうち５００μｌを７％アセトニトリルを含有する０．０５％のトリフルオロ酢酸水で平衡化したＨＰＬＣカラム(ＰｅｇａｓｉｌＯＤＳ:２０φｘ２５０ｍｍ:センシュー科学(株)社製)に供与した。
【０１４８】
カラムを同一溶媒で流速１０．０ｍｌ/分で展開し、２６０ｎｍの紫外部吸収でモニターしたところ、活性物質は２８．０分に溶出された。この操作を４回繰り返し得られた溶出液を合併し濃縮した後凍結乾燥することにより、１１．１ｍｇのＡ−５００３５９Ｍ−３物質が純品として得られた。
【０１４９】
Ａ−５００３５９Ｍ−３化合物は、下記の物理化学的性状を有する。
１）物質の性状：白色粉末状物質
２）溶解性：水、メタノールに可溶、ノルマルヘキサン、クロロホルムに不溶
３）分子式：C₂₂H₂₈N₄O₁₃
４）分子量：556 （FABマススペクトルにより測定）
５）高分解能FABマススペクトル法により測定した精密質量、[M+H]⁺は、次に示す通りである：
実測値：557.1754
計算値：557.1731
６）紫外部吸収スペクトル：水中で測定した紫外部吸収スペクトルは、次に示す極大吸収を示す：
236 nm (ε10,000)
７）旋光度：水中で測定した旋光度は、以下に示す値を示す：
[α]_D ²⁶：+92°(c 0.1, H₂O)
８）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム (KBr)錠剤法で測定した赤外部吸収スペクトルは、以下に示す極大吸収を示す：
3407, 2938, 1684, 1524, 1465, 1399, 1385, 1335, 1268, 1205, 1139, 1118, 1095， 1063, 1021 cm^-1
９）¹H-核磁気共鳴スペクトル：重水中、内部基準に1,4-ジオキサンを用いて測定した¹H-核磁気共鳴スペクトルは、以下に示す通りである： 2.44 (1H, ddd, J=4.3, 7.3, 13.3 Hz), 2.52 (1H, ddd, J=4.3, 7.5, 13.3 Hz), 3.27 (3H, s), 3.66 (1H, t, J=5.5 Hz), 4.17 (1H, ddd, J=1.1, 2.5, 3.1 Hz), 4.32 (1H, dd, J=3.7, 5.5 Hz), 4.33 (1H, t, J=4.3 Hz), 4.45 (1H, m), 4.46 (1H, m), 4.73 (1H overlapped with HDO) , 5.07 (1H, d, J=10.2 Hz) , 5.36 (1H, d, J=3.1 Hz) , 5.51 (1H, d, J=17.1 Hz) , 5.58 (1H, d, J=8.1 Hz) , 5.73 (1H, m) , 5.74 (1H, d, J=3.7 Hz) , 5.95 (1H, dd, J=1.1, 1.9 Hz) , 7.72 (1H, d, J=8.1 Hz) ppm
１０）¹³C-核磁気共鳴スペクトル：重水中、内部基準に1, 4-ジオキサン (67.4 ppm) を用いて測定した¹³C-核磁気共鳴スペクトルは、以下に示す通りである： 37.1 (t), 55.4 (d), 58.6 (q), 62.6 (d), 65.3 (d), 72.6 (d), 75.7 (d), 78.9 (d), 82.4(d), 90.6(d), 99.8(d), 102.6(d), 109.9(d), 119.0(t), 134.0(d), 1414.7(d), 142.2 (s), 152.0 (s), 162.3 (s), 166.8 (s), 173.6 (s), 177.6 (s) ppm
１１）ＨＰＬＣ分析：
カラム： Pegasil ODS
6φ×150 mm（センシュー科学社製）
溶媒：7.2%アセトニトリル-0.05%トリフルオロ酢酸水
流速：1.0 ml/分
検出：UV 260 nm
保持時間：10.1分。
【０１５０】
試験例１． 抗菌活性の測定
直径８ｍｍのペーパーディスクを用い、ディスク１枚当たり被検検体４０μｇを含むいわゆるディスクアッセイ（東京大学農学部農芸化学教室編「実験農芸化学 第３版、下巻」：朝倉書店、１９７８年）を行った。マイコバクテリウム・スメグマティス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ＳＡＮＫ７５０７５に対してＡ−５００３５９Ｅ化合物は直径１２ｍｍ、Ａ−５００３５９Ｆアミド化合物は直径１２ｍｍ、Ａ−５００３５９Ｍ−３化合物も直径１２ｍｍの阻止円を示した。
【０１５１】
製剤例１．
Ａ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｆアミド化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物又はＡ−５００３５９Ｍ−３化合物１００ｍｇ、乳糖１００ｍｇ、トウモロコシ澱粉１４８．８ｍｇ、ステアリン酸マグネシウム１．２ｍｇ（全量３５０ｍｇ）の各粉末を混合し、６０メッシュのふるいに通した後、この粉末をゼラチンカプセルに入れ、カプセル剤とする。
【０１５２】
【発明の効果】
本発明の化合物及びその薬学的に許容される塩は、マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を含む各種細菌に対して優れた抗菌力を示すので、それらの細菌に起因する感染症の予防薬または治療薬として有用である。また、本発明の化合物は、各種細菌感染症の予防薬または治療薬を目指した、有機化学的変換および微生物学的変換を用いた誘導体合成における原料化合物としても有用である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a compound having excellent antibacterial activity, a method for producing the compound, a medicine (particularly an antibacterial agent) containing the compound as an active ingredient, or a novel microorganism producing the compound.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, various beta-lactam antibiotics, macrolides, quinolones, aminoglycosides, isonaziazide, rifampicin, etc. have been used for the prevention and treatment of bacterial infections including tuberculosis, but recently these antibiotics have become resistant. The number of infectious bacteria to be shown has increased, and antibiotics different from the conventional type have been craved.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
The present inventors have found novel compounds that do not have cross-resistance with conventional drugs in the culture medium, and further established a method for producing such novel compounds, a novel microorganism for producing the compounds, and a method for producing the same, and these compounds. As a result of intensive studies on the pharmacological activity of these compounds for many years, they found that these compounds have excellent antibacterial activity and completed the present invention.
[0004]
The compound of the present invention can be used for the prevention and treatment of bacterial infections including resistant bacteria, which are currently becoming a problem, and the compound is a starting material for synthesizing derivatives having superior antibacterial activity. It is also possible.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
The present invention
(1) The following formula (I)
[0006]
[Chemical 7]

A-500359E compound represented by the formula:
(2) The following formula (II)
[0007]
[Chemical 8]

A-500359F compound represented by the formula:
(3) The following formula (III)
[0008]
[Chemical 9]

A-500359F amide compound represented by the formula:
(4) The following formula (IV)
[0009]
[Chemical Formula 10]

A-500359H compound represented by the formula:
(5) The following formula (V)
[0010]
Embedded image

A-50039J compound represented by the formula:
(6) The following formula (VI)
[0011]
Embedded image

A-500359M-3 compound represented by the formula:
(7)Streptomyces griseus SANK60196 (FERM BP-5420) is cultured, and the compound described in (1), (2), (4) or (5) is collected from the culture. , A process for producing the compound,
(8)(1), (2), (4) or (5) Streptomyces griseus SANK60196 (FERM BP-5420),
(9) A medicament comprising the compound according to (1), (2), (3), (4), (5) or (6) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
[0012]
The compounds represented by the formulas (I), (II), (III), (IV), (V) and (VI) of the present invention are Streptomyces isolated from soil collected at Mt. Tsukuba, Ibaraki Prefecture. It is produced in the culture solution of Streptomyces griseius strain SANK60196 belonging to the genus, or produced by microbial conversion in the culture process or chemical conversion in the isolation and purification process.
[0013]
The A-500359E compound represented by the above formula (I), the A-500359F compound represented by the above formula (II), the A-500359F amide compound represented by the above formula (III), and the above formula (IV). The A-500399H compound, the A-50039J compound represented by the formula (V), and the A-50039M-3 compound represented by the formula (VI) each have several asymmetric carbon atoms. Therefore, there are various optical isomers. In the present invention, each of the isomers of these A-500359E compound, A-500359F compound, A-500359F amide compound, A-500359H compound, A-500359J compound and A-500359M-3 compound is all represented by a single formula. Although shown, the present invention also includes all of these isomers, including racemates, and mixtures of these isomers. When a stereospecific synthesis method is used, or when an optically active compound is used as a raw material compound, the individual A-500359E compound, A-500359F compound, A-500359F amide compound, A-500359H compound, A-500359J Each of the isomers of the compound and the A-500359M-3 compound may be produced directly, while individual isomers may be obtained by conventional methods if a mixture of isomers is produced.
[0014]
The compound A-500359F compound, A-500359H compound, A-500359J compound and A-500359M-3 compound of the present invention can be converted into a salt by a method well known to those skilled in the art. The present invention also includes salts of such A-500359F compound, A-500359H compound, A-500359J compound and A-500359M-3 compound. A salt of the A-500359F compound, the A-500359H compound, the A-500359J compound, and the A-500359M-3 compound is not particularly limited as long as it is used medically and is pharmacologically acceptable. In addition, when the salt of A-5003939F compound, A-500039H compound, A-5003939J compound, and A-50000359M-3 compound is used for uses other than a pharmaceutical, for example, when used as an intermediate, there is no limitation. Such salts are preferably alkali metal salts such as sodium salts, potassium salts, lithium salts, alkaline earth metal salts such as calcium salts, magnesium salts, aluminum salts, iron salts, zinc salts, Metal salts such as copper salt, nickel salt, cobalt salt; inorganic salt such as ammonium salt, t-octylamine salt, dibenzylamine salt, morpholine salt, glucosamine salt, phenylglycine alkyl ester salt, ethylenediamine salt, N-methyl Glucamine salt, guanidine salt, diethylamine salt, triethylamine salt, dicyclohexylamine salt, N, N'-dibenzylethylenediamine salt, chloroprocaine salt, procaine salt, diethanolamine salt, N-benzyl-phenethylamine salt, piperazine salt, tetramethylammonia Salt, tris (hydroxy Mention may be made of organic amine salts such as methyl) aminomethane salts; and amino acid salts such as glycine salts, lysine salts, arginine salts, ornithine salts, asparagine salts. More preferable examples include those preferably used as pharmacologically acceptable salts, that is, sodium salts, potassium salts, ammonium salts, and the like.
[0015]
In addition, the compound A-500359E compound, A-500359F compound, A-500359F amide compound, A-500359H compound, A-500359J compound and A-500359M-3 compound of the present invention, or each salt thereof is a solvate. Sometimes. For example, when it is left in the atmosphere or recrystallized, it absorbs moisture and adsorbs water or may become a hydrate. Such a solvate is also included in the present invention. Is done.
[0016]
Furthermore, the present invention relates to a compound that is metabolized in vivo and converted into an A-50039E compound, an A-50039F compound, an A-50039F amide compound, an A-500399H compound, an A-50000359J compound, and an A-50000359M-3 compound, so-called Includes all prodrugs.
[0017]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Compound A-500359E compound, A-500359F compound, A-500359H compound, A-500359J compound and A-500359M represented by the formula (I), (II), (IV), (V) or (VI) of the present invention -3 compound can be obtained by culturing a bacterium producing the compound belonging to the genus Streptomyces in an appropriate medium and collecting it from the culture. Streptomyces griseus SANK60196 strain (hereinafter referred to as “SANK60196 strain”), which is a preferred producing strain of A-50039E compound, A-50039F compound, A-500309H compound, A-500309J compound and A-50000359M-3 compound. ”Is collected and separated from the soil of Mt. Tsukuba in Ibaraki Prefecture according to a conventional method as described above.
[0018]
The mycological properties of SANK60196 strain are as follows.
[0019]
1) Morphological features
The SANK60196 strain is regulated by the International Streptomyces Project (hereinafter referred to as “ISP”) (Shirling, EB and Gottlieb, D., International Journal 13 System 16). The following morphological characteristics were exhibited by culturing on the medium of) at 28 ° C. for 14 days. When observed with an optical microscope, the basic mycelium of SANK60196 stretches and branches well and shows yellowish ash, yellowish brown or light olive color, but no Nocardia strain-like breakage or zigzag elongation is observed. The aerial hyphae are simply branched. The form of the spore chain is straight or curved, and forms a chain of approximately 10-50 or more spores. In observation with a scanning electron microscope, the spores are elliptical and the surface structure is smooth. The size of the spore is 0.6 to 0.8 × 0.7 to 1.2 μm. Spores are formed only on the aerial hyphae. Also, special organs such as spore, aerial hyphae axle branching, aerial hyphae rupture, and mycorrhiza are not recognized.
[0020]
2) Culture characteristics on various culture media
Table 1 shows the culture properties of the SANK60196 strain on an agar medium after culturing at 28 ° C. for 14 days.

In Table 1, the composition of the medium indicated by the ISP number is as defined by the ISP. Item G is growth, AM is aerial hyphae, R is the back surface, and SP is a soluble pigment. The description of the color tone is based on “Color Standard (Japan Color Research Institute version)”, and the color tone display in parentheses is a color number based on the Munsell system. The pale yellow soluble pigment produced in the water agar medium is changed to colorless by 0.05 normality (hereinafter referred to as “N”) hydrochloric acid and does not show any change by 0.05N sodium hydroxide. It was.
[0021]
3) Physiological properties
Physiological properties of this strain observed for 2 to 21 days after culturing at 28 ° C. are as shown in Table 2.

In Table 2, medium 1 refers to yeast extract / malt extract agar (ISP 2). In addition, assimilation of the carbon source of the SANK60196 strain observed after culturing at 28 ° C. for 14 days using a Prideham Gotley agar medium (ISP 9) is as shown in Table 3.
[Table 3]
――――――――――――――――――――――――――――
D-glucose +
L-arabinose-
D-xylose +
Inositol −
D-mannitol +
D-fructose +
L-rhamnose-
Sucrose −
Raffinose −
Control −
――――――――――――――――――――――――――――
In Table 3, “+” indicates assimilation, and “−” indicates not assimilation.
[0022]
4) Chemical taxonomic properties
As a result of examining the cell wall of this strain according to the method of Hasegawa et al. (Hasegawa, T., et al., The Journal of General and Applied Microbiology 29, 319-322, 1983), LL-diaminopimelic acid was detected. Moreover, as a result of examining the main sugar components in all cells of this strain according to the method of MP P. Lechevalier (Lechevalier, MP, Journal of Laboratory and Clinical Medicine 71, 934-944, 1968), No component was detected.
[0023]
From the above mycological properties, it was revealed that this strain belongs to the genus Streptomyces among actinomycetes. Description of ISP strains by Shirring and Gotrib (Shirling, EB and Gottlieb, D., International Journal of Systematic Bacteriology 18, 68-189 and 279-392, 1968: 19, 526, 1969: 22 1972), Waksman, SA, “The Actynomycetes, Vol. 2, 1961”, Buchanan, RE and Gibbons, NE. )) “Bergies' Manual of Detergent Bacterology” iii) 8th edition, 1974 ", Williams et al. (Williams, ST, et al.)" Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 4th edition, 1989 ". It was found to be very closely related to Streptomyces griseus when compared to the bacterial species described in recent literature on Streptomyces genus Streptomyces. However, Streptomyces griseus produces soluble pigments of yellowish gray in glycerin and asparagine agar and light yellowish brown in peptone yeast extract and iron agar, but potato extract, carrot extract agar and In water agar, differences were observed in that no soluble pigment was produced, that the upper limit temperature for growth was 40 ° C., and that it was grown in the presence of 7% sodium chloride.
[0024]
The present strain having such mycological characteristics is clearly considered to be a new strain different from Streptomyces griseus, but it is not possible to distinguish between species only by these differences. Therefore, the present inventors identified this strain as Streptomyces griseius SANK60196. The strain was internationally deposited at the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry on February 22, 1996, and was given FERM BP-5420.
[0025]
As described above, the SANK60196 strain has been described, but it is well known that various properties of actinomycetes are not constant and easily change naturally or artificially. Strains that can be used in the present invention include all such mutants. That is, the present invention encompasses all strains belonging to the genus Streptomyces and producing the A-500359E compound, the A-500359F compound, the A-500359H compound, the A-500359J compound, or the A-500359M-3 compound. is there.
[0026]
The medium used for culturing the producing bacteria of the A-500359E compound, A-500359F compound, A-500359H compound, A-500359J compound or A-500359M-3 compound of the present invention is a carbon source, nitrogen source, inorganic ion. In addition, any synthetic or natural medium can be used as long as it appropriately contains a medium selected from organic nutrient sources and the like.
[0027]
As the nutrient source, known carbon sources, nitrogen sources, and inorganic salts that can be assimilated by microorganisms, which are conventionally used for culturing fungal and actinomycetes strains, can be used.
[0028]
Specifically, carbon sources include glucose, fructose, maltose, sucrose, mannitol, glycerol, dextrin, oats, rye, corn starch, potato, corn flour, soy flour, cottonseed oil, starch syrup, molasses, soybean oil, citrus Acid, tartaric acid, etc. can be used singly or in combination. In general, the amount is varied at 1 to 10% by weight of the medium amount, but is not limited to this range.
[0029]
Moreover, as a nitrogen source, generally, a substance containing a protein or a hydrolyzate thereof can be used. Suitable nitrogen sources include, for example, soy flour, bran, peanut flour, cottonseed flour, skim milk, casein hydrolyzate, pharmamine (manufactured by Shefield Chemical), fish meal, corn steep liquor, peptone, meat extract, fresh yeast, dried Yeast, yeast extract, malto extract, potato, ammonium sulfate, ammonium nitrate, sodium nitrate and the like can be used. The nitrogen source is preferably used alone or in combination in a range of 0.2 to 6% by weight of the medium amount.
[0030]
Further, as the nutrient inorganic salt, ordinary salts capable of obtaining ions such as sodium, ammonium, calcium, phosphate, sulfate, chloride, carbonate and the like can be used. Trace amounts of metals such as potassium, calcium, cobalt, manganese, iron and magnesium can also be used.
[0031]
In particular, the addition of cobalt, skim milk and yeast extract is effective for the production of the A-500359E compound, the A-500359F compound, the A-500359H compound and the A-500359J compound.
[0032]
Furthermore, when the producing bacteria are cultured, an antibiotic biosynthesis inhibitor can be added to produce the A-500359E compound, the A-500359F compound, and the A-500359H compound. The production of the A-500359E compound, the A-500359F compound, and the A-500359H compound can be achieved by, for example, using S- (2-aminoethyl) -L-cysteine or its salt, which is an aspartate kinase inhibitor, as a medium additive alone or cobalt Achieved by using in combination with skim milk and yeast extract. The productivity of the A-500359E compound, the A-500359F compound, and the A-500359H compound is improved by using the additive in combination with skim milk. The additive can be used in a range of 1 to 100 mM as a final concentration. Preferably, a final concentration of 10 mM can be used to produce good A-500359E compound, A-500359F compound and A-500359H compound.
[0033]
Moreover, the useful related compound of the A-500359F compound and the A-500359H compound can also be produced by using the said additive together with various amino acids or its salt. In particular, A-500359M-3 compound (VI) is obtained by using L-allylglycine or a salt thereof together. L-allyl glycine can be used in the range of 1 to 100 mM as a final concentration. It is possible to produce a good A-50039M-3 substance preferably at a final concentration of 10 mM.
[0034]
In liquid culture, silicone oil, vegetable oil, surfactant, etc. can be used as an antifoaming agent.
[0035]
The pH of the medium for culturing the SANK60196 strain to produce the A-500359E compound, the A-500359F compound, the A-500359H compound, and the A-500359J compound is preferably 5.0 to 8.0.
[0036]
The growth temperature of the SANK60196 strain is 12 to 36 ° C. In order to produce the A-500359E compound, the A-500359F compound, the A-500359H compound and the A-500359J compound, the strain is cultured at 18 to 28 ° C. More preferably, the culture is preferably performed at 19 to 23 ° C.
[0037]
The A-500359E compound, the A-500359F compound, the A-500359H compound, the A-500359J compound, and the A-500359M-3 compound can be obtained by aerobically culturing the SANK60196 strain. Ordinarily used aerobic culture methods such as solid culture method, shaking culture method, aeration and stirring culture method and the like can be used.
[0038]
In small-scale culture, it is preferable to perform shaking culture at 19 to 23 ° C. for several days. Cultivation is initiated by a 1-2 stage seed development process in a baffle (water flow control wall) or in a regular Erlenmeyer flask. A carbon source and a nitrogen source can be used in combination in the medium at the seed development stage. The seed flask is shaken in a constant temperature incubator at 19-23 ° C. for 5 days or until it is fully grown. The grown seed is used to inoculate a second seed medium or production medium. If an intermediate growth process is used, it is grown in essentially the same manner and a portion thereof is inoculated into the production medium. The inoculated flask is cultured with shaking at a constant temperature for several days, and after completion of the culture, the culture in the flask is centrifuged or filtered.
[0039]
In the case of mass culture, the culture is preferably carried out in a jar fermenter or tank equipped with a stirrer and an aeration device. To do so, the nutrient medium is first heated to 121-130 ° C., sterilized and cooled, and then the sterilized medium is inoculated with seeds that have been previously grown by the method described above. Subsequent culture is performed with aeration and agitation at 19 to 23 ° C. This method is suitable for obtaining large amounts of compounds.
[0040]
The production of the A-500359E compound, the A-500359F compound and the A-500359H compound was carried out using S- (2-aminoethyl) -L-cysteine, which is an aspartate kinase inhibitor previously filtered and sterilized in the sterilized medium. It is also achieved by adding an aqueous solution of the salt to the medium at the start of culture or during culture.
[0041]
The production of the A-500399M-3 compound was started by culturing an aqueous solution of S- (2-aminoethyl) -L-cysteine or a salt thereof and L-allylglycine or a salt thereof previously sterilized by filtration in the sterilized medium. This is accomplished by adding to the medium at the same time or separately during the time point or culture.
[0042]
The amount of A-500359E compound, A-500359F compound, A-500359H compound, A-5003939J compound and A-50000359M-3 compound produced during the course of the culture was collected by collecting a part of the culture solution and analyzed by HPLC. It can measure by implementing. The production amounts of the A-500359E compound, the A-500359F compound, the A-500359H compound, the A-500359J compound, and the A-500359M-3 compound usually reach the maximum value in 3 to 15 days.
[0043]
After completion of the culture, the bacterial cell components in the culture solution are separated by filtration operation or centrifugation using diatomaceous earth as a filtration operation aid, and the A-500359E compound, A-500359F compound present in the filtrate or supernatant, The A-500359H compound, A-500359J compound and A-500359M-3 compound are purified using their physicochemical properties using HPLC analysis as an indicator. As diatomaceous earth, for example, Celite 545 (manufactured by Celite Corporation) is preferably used. Purification of the A-500359E compound, A-500359F compound, A-500359H compound, A-500359J compound, and A-500359M-3 compound present in the filtrate is performed by using, for example, activated carbon or amberlite as an adsorbing resin as an adsorbent. XAD-2, XAD-4 (Rohm and Haas), Diaion HP-10, HP-20, CHP-20P, HP-50, Sepabeads SP205, SP206, SP207 (Mitsubishi Chemical) Can be used alone or in combination. A solution containing the A-500359E compound, the A-500359F compound, the A-500359H compound, the A-500359J compound and the A-500359M-3 compound is passed through the adsorbent layer as described above to remove the impurities, or After adsorbing the A-500359E compound, the A-500359F compound, the A-500359H compound, the A-500359J compound, and the A-500359M-3 compound, the solution contained methanol water, acetone water, n-butanol water, ammonia water, and ammonia. By eluting with methanol water, acetone water containing ammonia, etc., the A-500359E compound, A-500359F compound, A-500359H compound, A-500359J compound and A-500359M-3 compound are separated. Can. When an ammonia-containing solution is used as the eluent, an A-500359F amide compound may be generated during elution from the column or during concentration.
[0044]
Further, the thus obtained A-500359E compound, A-500359F compound, A-500359F amide compound, A-500359H compound, A-500359J compound and A-500359M-3 compound were further converted to silica gel, florisil, cosmosyl ( Adsorption column chromatography using a carrier such as Nacalai Tesque), Diaion CHP-20P, SP207 (Mitsubishi Chemical); Sephadex G-10 (Pharmacia Biotech), Toyopearl HW40F (Tosoh Corp.) ) Etc .; anion exchange chromatography using Dowex 1, SBR-P (Dow Chemical Co.), Diaion PA316 (Mitsubishi Chemical Co., Ltd.), etc .; and normal layer, reverse layer column HPLC etc. using It is possible to further purification.
[0045]
By using the above separation and purification means singly or in combination as appropriate, and repeatedly in some cases, the compound A-500359E compound, A-500359F compound, A-500359F amide compound, A-500359H compound, A- The 5003039J compound and the A-500359M-3 compound can be separated and purified.
[0046]
The A-500359F compound can also be obtained by hydrolyzing the A-500359E compound. For example, it is hydrolyzed well under basic conditions, preferably in a basic aqueous solution.
[0047]
Examples of basic compounds that can be used include alkali metal hydroxides such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, lithium hydroxide, sodium acetate, sodium carbonate, potassium carbonate, and sodium bicarbonate, or weak acid salts thereof; Alkaline earth metal hydroxides or weak acid salts thereof such as calcium, magnesium hydroxide and magnesium acetate; inorganic basic compounds such as ammonia or salts thereof showing basicity; t-octylamine, dibenzylamine, morpholine, Glucosamine, phenylglycine alkyl ester, ethylenediamine, N-methylglucamine, guanidine, diethylamine, triethylamine, dicyclohexylamine, N, N'-dibenzylethylenediamine, chloroprocaine, procaine, diethanolamine, N-be Jill - phenethylamine, piperazine, tetramethylammonium, tris (hydroxymethyl) their salts of an organic amine or basic, such as amino methane and the like. In addition, basic buffer solutions containing those alkali metal ions, alkaline earth metal ions, inorganic ions such as ammonia, and organic amine ions can also be used. Of these basic compounds, alkali metal hydroxides, particularly sodium hydroxide are preferred. In particular, in the method of hydrolyzing the A-500359E compound using sodium hydroxide, the A-500359F compound can be easily obtained.
[0048]
The concentration of the basic compound used in the above reaction is preferably 0.001-1N, more preferably 0.3-0.1N. The reaction temperature is preferably -20 to 40 ° C, more preferably 0 to 30 ° C. The reaction time is 30 seconds to 15 hours, more preferably 30 minutes to 2 hours.
[0049]
In particular, when sodium hydroxide is used, the concentration is preferably 0.001 to 1N, more preferably 0.01 to 0.1N. The reaction temperature is preferably -20 to 40 ° C, more preferably 0 to 30 ° C. The reaction time is preferably 30 seconds to 2 hours, more preferably 30 minutes to 1 hour.
[0050]
In addition, when using aqueous ammonia as a base, in addition to the A-500359F compound, an A-500359F amide compound is also produced. These can be separated and purified by the method described above.
[0051]
The A-500359F amide compound can be obtained by reacting the A-500359E compound with ammonia in a solvent.
[0052]
The solvent used is water or an alcohol such as ethanol or methanol, preferably water or methanol.
[0053]
The ammonia used may be introduced as a gas into the compound solution, but is usually used by dissolving in water or an alcohol such as methanol or ethanol. Preferably water or methanol solution is used.
[0054]
When ammonia water is used, the concentration is preferably 0.1 to 1N, more preferably 0.3 to 0.7N. The reaction temperature is preferably -20 to 40 ° C, more preferably 0 to 30 ° C. The reaction time is preferably 30 minutes to 15 hours, more preferably 1 to 4 hours.
[0055]
In addition, when ammonia water is used, in addition to the target A-50039F amide compound, the ester is hydrolyzed to produce the A-50039F compound, which can be separated and purified by the method described above.
[0056]
The A-500359F amide compound can also be produced by reacting the A-500359F compound with a methylating reagent in a solvent and converting it to the methyl ester form of the compound, that is, the A-500359E compound, and then reacting with ammonia as described above. be able to.
[0057]
As the methylating reagent, for example, diazomethane, dimethyl sulfate and the like can be used, and diazomethane is preferable. The methylating reagent in the reaction solution for converting the A-500359F compound to the A-500359E compound is preferably 1 to 5 equivalents, more preferably 1.5 to 2 equivalents.
[0058]
Examples of the solvent used include water, alcohols such as methanol and ethanol, and preferably water or methanol.
[0059]
The reaction temperature is preferably -20 to 40 ° C, more preferably 0 to 30 ° C.
The reaction time is preferably 30 minutes to 15 hours, more preferably 1 to 2 hours.
[0060]
The means for isolating the A-500359F compound, the A-500359E compound and the A-500359F amide compound from the reaction end solution is the above-mentioned A-500359E compound, A-500359F compound, A-500359F amide compound, A-500359H compound, A It can be appropriately selected according to the method described in the section of separation / purification means for the -550039J compound and the A-5003539M-3 compound.
[0061]
In the above, the representative methods for producing the A-500359E compound, the A-500359F compound, the A-500359F amide compound, the A-500359H compound, the A-500359J compound and the A-500359M-3 compound have been described. However, the present invention is not limited thereto, and other production methods already known to those skilled in the art can also be used.
[0062]
The compound A-500359E compound, A-500359F compound, A-500359F amide compound, A-500359H compound, A-500359J compound, and A-500359M-3 compound of the present invention obtained as described above are novel documents not yet published. Although it is a compound, its growth inhibitory activity against general gram-positive and gram-negative bacteria is measured by a disc assay method using a normal agar medium (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.) or heart infusion agar medium (manufactured by Difco). . Furthermore, the growth inhibitory activity against Gram-positive bacteria Actinomycete Mycobacteria is measured in the same manner in a medium in which glycerol is added to the above medium.
[0063]
The representative evaluation methods for the biological activities of the compound A-500359E compound, the A-500359F compound, the A-500359F amide compound, the A-500359H compound, the A-500359J compound, and the A-500359M-3 compound have been described above. The method is not limited to these, and other antibacterial activity evaluation methods already known to those skilled in the art can also be used.
[0064]
The A-500359E compound, A-500359F compound, A-500359F amide compound, A-500359H compound, A-500359J compound and A-500359M-3 compound of the present invention or their pharmacologically acceptable salts are various Administered in the form. Examples of the dosage form include oral administration such as tablets, capsules, granules, powders, syrups, etc., or parenteral administration such as injections (intravenous, intramuscular, subcutaneous), drops, suppositories, etc. Can do. These various preparations are usually used in the pharmaceutical preparation technical field such as excipients, binders, disintegrants, lubricants, flavoring agents, solubilizers, suspension agents, coating agents, etc. as main ingredients in accordance with conventional methods. It can be formulated with the known adjuvants obtained.
[0065]
In molding into tablets, conventionally known carriers can be widely used as carriers, such as lactose, sucrose, sodium chloride, glucose, urea, starch, calcium carbonate, kaolin, crystalline cellulose, silicic acid and the like. Forming agent: water, ethanol, propanol, simple syrup, glucose solution, starch solution, gelatin solution, carboxymethylcellulose, shellac, methylcellulose, potassium phosphate, polyvinylpyrrolidone, etc .; dry starch, sodium alginate, agar powder, laminaran powder , Sodium bicarbonate, calcium carbonate, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, sodium lauryl sulfate, stearic acid monoglyceride, starch, lactose, etc .; disintegration inhibitors such as sucrose, stearin, cocoa butter, hydrogenated oil; quaternary Ammonium Absorption promoters such as sodium lauryl sulfate; humectants such as glycerin and starch; adsorbents such as starch, lactose, kaolin, bentonite and colloidal silicic acid; purified talc, stearate, boric acid powder, polyethylene glycol, etc. An example of a lubricant is an example. Further, the tablets can be made into tablets with ordinary coatings as necessary, for example, sugar-coated tablets, gelatin-encapsulated tablets, enteric-coated tablets, film-coated tablets, double tablets, and multilayer tablets.
[0066]
In molding into the form of pills, those conventionally known in the field can be widely used as a carrier. For example, excipients such as glucose, lactose, cocoa butter, starch, hydrogenated vegetable oil, kaolin, talc; Examples include binders such as tragacanth powder, gelatin and ethanol; and disintegrants such as laminaran agar.
[0067]
In the case of forming into a suppository, conventionally known carriers can be widely used as carriers, such as polyethylene glycol, cocoa butter, higher alcohols, esters of higher alcohols, gelatin, semisynthetic glycerides and the like. it can.
[0068]
When prepared as injections, the solutions and suspensions are preferably sterilized and isotonic with blood, and when formed into these solutions, emulsions and suspensions, this is used as a diluent. Any of those commonly used in the field can be used, and examples thereof include water, ethanol, propylene glycol, ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxylated isostearyl alcohol, and polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters. In this case, a sufficient amount of sodium chloride, glucose, or glycerin to prepare an isotonic solution may be contained in the pharmaceutical preparation, and a normal solubilizer, buffer, soothing agent, etc. May be added.
[0069]
Furthermore, you may contain a coloring agent, a preservative, a fragrance | flavor, a flavoring agent, a sweetening agent, and other pharmaceuticals as needed.
[0070]
The amount of the active ingredient compound contained in the above pharmaceutical preparation is not particularly limited and is appropriately selected within a wide range. Usually, it is appropriate that the amount contained in the total composition is 170% by weight, preferably 1 to 30% by weight. is there.
[0071]
The administration method of the pharmaceutical preparation is not particularly limited, and is determined according to various preparation forms, patient age, sex and other conditions, the degree of disease, and the like. For example, in the case of tablets, pills, solutions, suspensions, emulsions, granules and capsules, they are administered orally. In the case of an injection, it is administered alone or mixed with a normal replacement fluid such as glucose or amino acid, and administered intravenously, and if necessary, administered alone intramuscularly, intradermally, subcutaneously or intraperitoneally. In the case of a suppository, it is administered rectally.
[0072]
The amount used varies depending on symptoms, age, body weight, administration method, dosage form and the like, but is usually 2000 mg (preferably 100 mg) as an upper limit per day for an adult and 0.1 mg (preferably 1 mg as a lower limit) More preferably 10 mg) can be administered once or divided into several times according to the symptoms.
[0073]
Since the A-500359E compound and the A-500359F compound of the present invention have a hydroxyl group, a carbamoyl residue, an ester group, or a carboxyl group in the molecule, various functional groups such as ethers, esters, thioesters, amides, etc. Can be converted to Of these, derivatives in which the ester group or carboxyl group is modified with various amides and derivatives in which the hydroxyl group is modified with various ethers or esters are preferred.
[0074]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to Examples, Test Examples and Formulation Examples, but the present invention is not limited thereto.
[0075]
Example 1. Culture of Streptomyces griseus SANK60196 (FERM BP-5420) strain
Into a 2 L Erlenmeyer flask (seed flask) containing 500 ml of the preculture medium described below, 4 platinum ears of SANK60196 are aseptically inoculated, and then the four flasks are placed at 23 ° C., 210 ° C. in a rotary shaker. Pre-culture for 3 days was performed by shaking at rotations per minute (revolutions per minute: hereinafter referred to as “rpm”).
[0076]
Preculture medium: The following components are contained in 1000 ml of tap water.
[0077]
Maltose 30g
5g meat extract
Polypeptone 5g
Sodium chloride 5g
Calcium carbonate 3g
Antifoam CB442 50mg
(Nippon Yushi Co., Ltd.)
――――――――――――――――――――――――――――――――――
After adjusting the pH to 7.4, the mixture was sterilized at 121 ° C. for 30 minutes.
[0078]
The main culture was performed as described below. That is, 3% (volume / volume: hereinafter referred to as “v / v”) of the preculture was inoculated into two 30 L jar fermenters containing 15 L of the main culture medium described below. S- (2-aminoethyl) -L-cysteine hydrochloride sterilized by filter 6 hours after the start of culture at 23 ° C. was added to a final concentration of 10 mM, and then aerated and stirred for 6 days.
[0079]
Main culture medium: The following components are contained in 1000 ml of tap water.
[0080]
Maltose 30g
Yeast extract 5g
(Difco)
5g meat extract
Polypeptone 5g
Sodium chloride 5g
Calcium carbonate 3g
Antifoam CB442 50mg
(Nippon Yushi Co., Ltd.)
――――――――――――――――――――――――――――――――――
The pH was adjusted to 7.4 and then sterilized at 125 ° C. for 30 minutes.
[0081]
Example 2 Purification of A-500359E compound
The culture completion solution (30 L) obtained in Example 1 was filtered using Celite 545 (manufactured by Celite Corporation) as a filter aid.
[0082]
In the subsequent purification, the active fraction was monitored by HPLC under the following column and analytical conditions.
[0083]
Column: Senshu Pak ODS-H-2151
6φ × 150mm (made by Senshu Science Co., Ltd.)
Solvent: 0.04% aqueous trifluoroacetic acid containing 4% acetonitrile
Flow rate: 1.0 ml / min
Detection: UV210nm
Retention time: 21.2 minutes
30 L of the obtained filtrate was donated to a column (6 L) packed with Diaion HP-20 (Mitsubishi Chemical Corporation). Thereafter, the column was washed with 12 L of pure water, and the flow-through fraction and the wash fraction were merged (hereinafter, the merged fraction is referred to as “flow-through / washed fraction”). The adsorbed material was eluted with 12 L of 10% acetone water. This elution fraction was concentrated, acetone was distilled off, and freeze-dried to obtain 39 g of crude powder.
[0084]
This crude powder was dissolved in 200 ml of pure water and applied to a column (2 L) packed with Diaion CHP-20P (Mitsubishi Chemical Corporation). Thereafter, the column was washed with 4 L of pure water and 4 L of 10% methanol water, and the adsorbed material was eluted with 4 L of 15% methanol water and 4 L of 20% methanol water. The 2% to 4L portions of the 15% methanol water fraction and the 20% methanol water fraction were combined and concentrated, and the methanol was distilled off, followed by lyophilization to obtain 8.9 g of powder.
[0085]
This powder was dissolved in 200 ml of pure water and supplied to a column (1 L) packed with Toyopearl HW40F (manufactured by Tosoh Corporation), and the column was developed with pure water. When the eluate was fractionated every 100 ml, the active substance having a retention time of 21.2 minutes was eluted in fractions 5 to 10 by the HPLC. This fraction was concentrated and then lyophilized to obtain 2.7 g of powder.
[0086]
An HPLC column (YMC-Pack ODS-1050-20-SR: 100φ × 500 mm: manufactured by YMC Corporation) in which this powder was dissolved in 200 ml of water and equilibrated with 0.04% trifluoroacetic acid water containing 4% acetonitrile. The column was developed with 0.04% aqueous trifluoroacetic acid containing 4% acetonitrile at a flow rate of 208 ml / min. When the eluate was fractionated every 1 L, the active substance was eluted in fractions 6 and 7.
[0087]
These fractions were combined, concentrated to 200 ml with Evapol (manufactured by Okawara Seisakusho), and freeze-dried to obtain 99 mg of powder. This powder was suspended in 5 ml of distilled water, and insoluble matters were filtered off. The filtrate was concentrated to 2 ml with a rotary evaporator and freeze-dried to obtain 87 mg of A-500359E compound as a pure product.
[0088]
The A-500359E compound has the following physicochemical properties.
1) Substance properties: White powdery substance
2) Solubility: Soluble in water, hardly soluble in methanol, insoluble in normal hexane and chloroform
3) Molecular formula: C₁₈H_{twenty three}N_ThreeO₁₂
4) Molecular weight: 473 (measured by FAB mass spectrum method)
5) Accurate mass measured by high resolution FAB mass spectrometry, [M + H]⁺Is as follows:
Actual value: 474.1349
Calculated value: 474.1359
6) Ultraviolet absorption spectrum: The ultraviolet absorption spectrum measured in water shows the following maximum absorption:
251 nm (ε10,000)
7) Optical rotation: The optical rotation measured in water shows the following values:
[α]_D ²⁰: + 115 ° (c 0.28)
8) Infrared absorption spectrum: The infrared absorption spectrum measured by the potassium bromide (KBr) tablet method shows the following maximum absorption:
3410, 2955, 1683, 1464, 1441, 1396, 1309, 1267, 1206, 1138, 1115, 1088, 1062, 1023 cm^-1
9)¹H-nuclear magnetic resonance spectrum: measured using tetramethylsilane as an internal standard in deuterated dimethyl sulfoxide,¹The H-nuclear magnetic resonance spectra are as follows: 3.24 (3H, s), 3.52 (1H, dd, J = 4.5, 6.1Hz), 3.72 (3H, s), 3.98 (1H, m), 4.10 (1H, m), 4.25 (1H, m), 4.29 (1H, d, J = 2.0Hz), 4.33 (1H, dd, J = 2.0, 6.1Hz), 5.05 (1H, d, J = 3.9 Hz) ), 5.16 (1H, d, J = 6.8Hz), 5.45 (1H, d, J = 4.2Hz), 5.54 (1H, d, J = 5.9Hz), 5.61 (1H, d, J = 3.3Hz), 5.61 (1H, d, J = 8.1Hz), 5.93 (1H, dd, J = 1.3, 2.9 Hz), 7.56 (1H, br.s), 7.69 (1H, br.s), 7.74 (1H, d, J = 8.1 Hz) ppm.
10)¹³C-nuclear magnetic resonance spectrum: Measured using tetramethylsilane as an internal standard in deuterated dimethyl sulfoxide.¹³The C-nuclear magnetic resonance spectra are as follows: 52.0 (q), 57.3 (q), 61.5 (d), 64.9 (d), 72.1 (d), 75.4 (d), 78.2 (d), 81.3 (d), 89.0 (d), 99.2 (d), 101.2 (d), 114.2 (d), 139.2 (s), 139.8 (d), 150.3 (s), 161.8 (s), 163.1 (s), 170.1 (s) ppm.11) High performance liquid chromatography (hereinafter referred to as “HPLC”) Analysis:
Column: Senshu Pack ODS-H-2151,
6φ × 150 mm (Senshu Scientific Co., Ltd.)
Solvent: 0.04% aqueous trifluoroacetic acid containing 4% acetonitrile
Flow rate: 1.0 ml / min
Detection: UV 210 nm
Retention time: 21 minutes.
[0089]
Example 3 In the purification after the purification of the A-500359F compound and the A-500359H compound, the active fraction was monitored by HPLC under the following column and analytical conditions.
[0090]
Column: Senshu Pak ODS-H-2151
6φ × 150mm (made by Senshu Science Co., Ltd.)
Solvent: 0.04% aqueous trifluoroacetic acid
Flow rate: 1.5 ml / min
Detection: UV210nm
Retention time: 8 minutes (A-500359H compound)
18 min (A-500359F compound).
[0091]
After adjusting the pH of the flow-through / washing fraction 42L obtained in Example 2 to 9 using 6N sodium hydroxide, Diaion PA316 (Cl^-) (Mitsubishi Chemical Co., Ltd.) packed column (8.5 L). After the column was washed with 27 L of pure water, the adsorbate was eluted with 27 L of 0.1N hydrochloric acid.
[0092]
After adjusting the pH of the eluate to 7 with 6N sodium hydroxide, the eluate was applied to an activated carbon column (2 L). After the column was washed with 8 L of pure water, the active substance was eluted with 8 L of 0.5 N aqueous ammonia containing 10% acetone. The eluate was concentrated and freeze-dried to obtain 28 g of powder.
[0093]
This powder was dissolved in 400 ml of distilled water, the pH was adjusted to 3.0, and then applied to a column (2 L) packed with Diaion CHP-20P (manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation) prepared with pure water. The passage liquid and the water washing liquid were collected, concentrated and freeze-dried to obtain 12 g of a candy-like substance.
[0094]
The obtained candy-like substance was dissolved in 200 ml of distilled water, the pH was adjusted to 3.3 with trifluoroacetic acid, and then the diamond ion CHP-20P (Mitsubishi Chemical Corporation) equilibrated with 0.04% trifluoroacetic acid water was used. The product was again applied to a column (1 L) packed with the same product. The column was developed with 2 L of 0.04% aqueous trifluoroacetic acid, the fraction eluted between 0.8 and 1.4 L (H fraction) was pooled, and the eluate was then added to 2 L of distilled water. Switching elution was performed. Distilled water elution fraction 2L (F fraction) was concentrated and freeze-dried to obtain 605 mg of powder.
[0095]
After diluting 600 ml of H fraction to 1 L with distilled water and adjusting pH to 2.8 with trifluoroacetic acid, Diaion CHP-20P (manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation) equilibrated with 0.04% aqueous trifluoroacetic acid. ) Was again applied to the column (1 L) packed with. The column was eluted with 2.2 L of 0.04% aqueous trifluoroacetic acid. Fractions 8 to 11 fractionated every 200 ml were concentrated and freeze-dried to obtain 233 mg of powder.
[0096]
100 mg of this powder was dissolved in 5 ml of water and 1 ml of each was equilibrated with 0.04% trifluoroacetic acid water (Senshu Pak ODS-H-5251: 20φ × 250 mm: manufactured by Senshu Kagaku). And developed at a flow rate of 10 ml / min. Absorption in the ultraviolet region of 210 nm of the active fraction was detected, and the peak eluted at a retention time of 14 to 16 minutes was collected five times. The obtained fraction was concentrated by a rotary evaporator and then lyophilized to obtain 23 mg of A-500359H compound as a pure product.
[0097]
605 mg of F fraction freeze-dried powder was dissolved in 15 ml of water, and 1 ml of each was equilibrated with 0.04% trifluoroacetic acid water (Senshu PakODS-H-5251: 20φ × 250 mm: manufactured by Senshu Scientific Co., Ltd.) ) And developed at a flow rate of 10 ml / min. Absorption in the ultraviolet part of 210 nm of the active fraction was detected, and the peak eluted at a retention time of 29 minutes to 31 minutes was collected 15 times. The obtained fraction was concentrated by a rotary evaporator and then freeze-dried to obtain 134 mg of A-500359F compound as a pure product.
[0098]
The A-500359F compound has the following physicochemical properties.
1) Substance properties: White powdery substance
2) Solubility: Soluble in water, hardly soluble in methanol, insoluble in normal hexane and chloroform
3) Molecular formula: C₁₇H_{twenty one}N_ThreeO₁₂
4) Molecular weight: 459 (measured by FAB mass spectrum method)
5) Accurate mass measured by high resolution FAB mass spectrometry, [M + H]⁺Is as follows:
Actual value: 460.1201
Calculated value: 460.1203
6) Ultraviolet absorption spectrum: The ultraviolet absorption spectrum measured in water shows the following maximum absorption:
262 nm (ε7,000)
7) Optical rotation: The optical rotation measured in water shows the following values:
[α]_D ²⁰: + 111 ° (c 0.41)
8) Infrared absorption spectrum: The infrared absorption spectrum measured by the potassium bromide (KBr) tablet method shows the following maximum absorption:
3391, 2941, 1684, 1466, 1400, 1333, 1269, 1205, 1137, 1115, 1062, 1020 cm^-1
9)¹H-nuclear magnetic resonance spectrum: measured in water with a water signal of 4.75 ppm.¹The H-nuclear magnetic resonance spectra are as follows: 3.37 (3H, s), 3.79 (1H, dd, J = 5.1, 6.4Hz), 4.17 (1H, ddd, J = 1.6, 3.4, 4.6 Hz) ), 4.38 (1H, dd, J = 3.5, 5.1 Hz), 4.48 (1H, dd, J = 2.4, 6.4 Hz), 4.49 (1H, ddd, J = 0.6, 2.7, 4.6 Hz), 4.69 (1H, d, J = 2.4 Hz), 5.32 (1H, dd, J = 0.6, 3.4 Hz), 5.77 (1H, d, J = 3.5 Hz), 5.90 (1H, d, J = 8.1 Hz), 6.11 (1H, dd, J = 1.6, 2.7 Hz), 7.75 (1H, d, J = 8.1 Hz) ppm.
10)¹³C-nuclear magnetic resonance spectrum: measured in heavy water using 1,4-dioxane (67.4 ppm) as an internal standard.¹³The C-nuclear magnetic resonance spectra are as follows: 58.6 (q), 62.7 (d), 65.5 (d), 72.7 (d), 76.3 (d), 78.8 (d), 91.2 (d), 100.0 (d), 102.7 (d), 114.8 (d), 140.7 (s), 141.9 (d), 152.1 (s), 165.4 (s), 167.0 (s), 173.9 (s) ppm.
11) HPLC analysis:
Column: Senshu Pack ODS-H-2151,
6φ × 150 mm (Senshu Scientific Co., Ltd.)
Solvent: 0.04% aqueous trifluoroacetic acid
Flow rate: 1.5 ml / min
Detection: UV 210 nm
Retention time 18 minutes.
[0099]
The A-500359H compound has the following physicochemical properties.
1) Substance properties: White powdery substance
2) Solubility: Soluble in water, hardly soluble in methanol, insoluble in normal hexane and chloroform
3) Molecular formula: C₁₆H₁₉N_ThreeO₁₂
4) Molecular weight: 445
5) Accurate mass measured by high resolution FAB mass spectrometry, [M + H]⁺Is as follows:
Actual value: 446.1025
Calculated value: 446.1047
6) Ultraviolet absorption spectrum: The ultraviolet absorption spectrum measured in water shows the following maximum absorption:
262 nm (ε7,400)
7) Optical rotation: The optical rotation measured in water shows the following values:
[α]_D ²⁰: + 115 ° (c 0.33)
8) Infrared absorption spectrum: The infrared absorption spectrum measured by the potassium bromide (KBr) tablet method shows the following maximum absorption:
3361, 2934, 1683, 1467, 1403, 1336, 1270, 1206, 1114, 1090, 1058, 1021 cm^-1
9)¹H-nuclear magnetic resonance spectrum: measured at 4.75 ppm in heavy water¹The H-nuclear magnetic resonance spectrum is as follows: 4.13 (br. T, J = 5.4 Hz), 4.15-4.19 (2H), 4.43 (1H, dd, J = 2.5, 5.8Hz), 4.48 ( 1H, dd, J = 2.9, 4.7 Hz), 4.72 (1H, d, J = 2.5 Hz), 5.31 (1H, d, J = 4.0 Hz), 5.80 (1H, d, J = 4.0 Hz), 5.89 ( 1H, d, J = 8.3 Hz), 6.12 (1H, dd, J = 1.4, 2.9 Hz), 7.75 (1H, d, J = 8.3 Hz) ppm
10)¹³C-nuclear magnetic resonance spectrum: measured in heavy water using 1,4-dioxane (67.4 ppm) as internal standard¹³The C-nuclear magnetic resonance spectra are as follows: 62.8 (d), 65.8 (d), 70.3 (d), 74.6 (d), 77.0 (d), 84.2 (d), 90.3 (d), 100.3 (d), 102.9 (d), 113.9 (d), 141.2 (s), 141.9 (d), 152.2 (s), 165.9 (s), 167.0 (s), 174.2 (s) ppm
11) HPLC analysis:
Column: Senshu Pack ODS-H-2151,
6φ × 150 mm (Senshu Scientific Co., Ltd.)
Solvent: 0.04% aqueous trifluoroacetic acid
Flow rate: 1.5 ml / min
Detection: UV 210 nm
Retention time: 8 minutes.
[0100]
Example 4 Culture of Streptomyces griseus SANK60196 (FERM BP-5420) strain
Aseptically inoculate 4 platinum ears of SANK60196 strain into a 2 L Erlenmeyer flask containing 500 ml of the preculture medium described below, and then shake the three flasks at 23 ° C. and 210 rpm in a rotary shaker. Then, the first preculture for 3 days was performed.
[0101]
Preculture medium: The following components are contained in 1000 ml of tap water.
[0102]
Glucose 20g
10g soluble starch
9g raw yeast
5g meat extract
Polypeptone 5g
Sodium chloride 5g
Calcium carbonate 3g
Antifoam CB442 50mg
(Nippon Yushi Co., Ltd.)
―――――――――――――――――――――――――――――――――――
After adjusting the pH to 7.4, the mixture was sterilized at 121 ° C. for 20 minutes.
[0103]
3% of this first preculture was inoculated into one 60 L tank containing 30 L of the same preculture medium, and aerated and stirred for 1 day at 23 ° C. (second preculture).
The main culture was performed as described below. Specifically, 3% (v / v) of the second preculture was inoculated into two 600 L tanks containing 400 L of the following main culture medium, and then aerated and stirred for 6 days at 23 ° C.
[0104]
Preculture medium: The following components are contained in 1000 ml of tap water.
[0105]
Glucose 20g
10g soluble starch
9g raw yeast
5g meat extract
Polypeptone 5g
Sodium chloride 5g
Calcium carbonate 3g
Antifoam CB442 50mg
(Nippon Yushi Co., Ltd.)
――――――――――――――――――――――――――――――――――
After adjusting the pH to 7.4, add 3 g of calcium carbonate,
Sterilized at 125 ° C. for 20 minutes.
[0106]
Embodiment 5 FIG. Purification of A-500359E compound
The culture completion solution (810 L) obtained in Example 4 was filtered using Celite 545 (manufactured by Celite Corporation) as a filter aid.
[0107]
In the subsequent purification, the active fraction was monitored by HPLC under the following column and analytical conditions.
[0108]
Column: YMC-Pack ODS-A A-312
6φ × 150mm (made by YMC)
Solvent: 0.04% aqueous trifluoroacetic acid containing 4% acetonitrile
Flow rate: 1.0 ml / min
Detection: UV210nm
Retention time: 19.8 minutes.
[0109]
800 L of the obtained filtrate was donated to a column (160 L) packed with Diaion HP-20 (Mitsubishi Chemical Corporation). Thereafter, the column was washed with 640 L of pure water, and the passing-through fraction and the washing fraction were merged (passing-through / washing fraction). The adsorbed material was eluted with 348 L of 10% acetone water.
[0110]
The elution fraction was concentrated to 10 L and then applied to a column (45 L) packed with Diaion CHP-20P (Mitsubishi Chemical Corporation). Thereafter, the column was washed with 90 L of pure water, 100 L of 10% methanol water and 100 L of 15% methanol water, and the adsorbed material was eluted with 100 L of 20% methanol water.
[0111]
After concentrating the 20% methanol aqueous fraction to 5 L, the concentrated solution was applied to a column (22 L) packed with Toyopearl HW40F (manufactured by Tosoh Corporation). When the column was developed with pure water and the eluate was fractionated every 5 L, the active substance having a retention time of 19.8 minutes was eluted in fractions 3 to 6 by the HPLC. This fraction was concentrated to 5.8 L and then lyophilized to obtain 55.8 g of powder.
[0112]
This powder was dissolved in 1.2 L of pure water, 200 ml of which was equilibrated with 0.04% aqueous trifluoroacetic acid containing 4% acetonitrile (YMC-Pack ODS-1050-20-SR: 100φ). × 500 mm (manufactured by YMC Co., Ltd.), and the column was developed with 0.04% aqueous trifluoroacetic acid containing 4% acetonitrile at a flow rate of 200 ml / min. The active substance eluted between 105 and 124 minutes. This operation was repeated 6 times, and the obtained fractions were combined, concentrated to 5 L with Evapor, and freeze-dried to obtain 24.2 g of A-500359E compound as a pure product.
[0113]
Example 6 Purification of A-500359F and A-500359H compounds
In subsequent purifications, the active fraction was monitored by HPLC with the following columns and conditions.
[0114]
Column: YMC-Pack ODS-A A-312
6φ × 150mm (made by YMC)
Solvent: 0.04% aqueous trifluoroacetic acid
Flow rate: 1.5 ml / min
Detection: UV210nm
Retention time: 7.7 minutes (A-500359H compound)
16.6 min (A-500359F compound).
[0115]
The flow-through / washed fraction 1370L obtained in Example 5 was applied to an activated carbon column (65L). After the column was washed with 260 L of pure water, the active substance was eluted with 270 L of 0.5N aqueous ammonia containing 10% acetone. The eluate was concentrated to 40 L, pH was adjusted to 2.4 with trifluoroacetic acid, and then charged with Diaion CHP-20P (Mitsubishi Chemical Corporation) equilibrated with 0.04% trifluoroacetic acid water. Applied to column (45 L). The column was developed with 0.04% aqueous trifluoroacetic acid to obtain a fraction eluted between 0-47 L (H fraction) and a fraction eluted between 47-91 L (F fraction). It was. The H fraction was concentrated to 1.5 L, and the F fraction was concentrated and then lyophilized to give 287 g of powder.
[0116]
The concentrate of the H fraction was diluted to 3.2 L with pure water. Of this, 160 ml was donated to an HPLC column (YMC-Pack ODS-1050-20-SR: 100φ × 500 mm: manufactured by YMC) equilibrated with 0.04% aqueous trifluoroacetic acid, and developed at a flow rate of 200 ml / min. . Absorption in the ultraviolet region of 210 nm was detected in the active fraction, and a peak eluted at a retention time of 67 minutes to 72 minutes was collected. This operation was repeated 20 times, and the obtained fraction was concentrated with Evapol (manufactured by Okawara Seisakusho) and lyophilized to obtain 5.9 g of A-500359H compound as a pure product.
[0117]
Of the powder of the F fraction, 277 g was dissolved in 50 L of pure water, and the pH was adjusted to 2.2 with trifluoroacetic acid. This solution was again applied to a column (45 L) packed with Diaion CHP-20P (manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation) equilibrated with 0.04% aqueous trifluoroacetic acid. After washing the column with 97 L of 0.04% aqueous trifluoroacetic acid, the active substance was eluted with 120 L of pure water. This pure water elution fraction was concentrated and lyophilized to obtain 75.6 g of F fraction lyophilized powder.
[0118]
This F fraction lyophilized powder was dissolved in 4 L of water, 150 ml of which was equilibrated with 0.5% acetonitrile-0.04% trifluoroacetic acid aqueous solution (YMC-Pack ODS-1050-20- SR: 100φ × 500 mm (manufactured by YMC Corporation) and developed at a flow rate of 200 ml / min using the same solvent system. Absorption in the ultraviolet region of 210 nm was detected in the active fraction, and a peak eluted at a retention time of 88 to 97 minutes was collected. This operation was repeated 27 times, and the obtained fraction was concentrated and then freeze-dried to obtain 19.2 g of A-500359F compound as a pure product.
[0119]
Example 7 Method for producing A-5003539F compound and A-50359F amide compound (chemical conversion of A-5003539E compound with aqueous ammonia)
75 mg of the A-500359E compound obtained in Example 2 was dissolved in 2 ml of 0.5N aqueous ammonia. After standing at room temperature for 2 hours, the reaction-terminated liquid was lyophilized to obtain 78 mg of powder.
[0120]
This powder was dissolved in 1 ml of 0.04% TFA water, and each 100 μl was applied to an HPLC column (Capcellpak UG 120Å: 20φ × 250 mm: manufactured by Shiseido Co., Ltd.) equilibrated with 0.04% trifluoroacetic acid water. Development was performed using 0.04% aqueous trifluoroacetic acid at a flow rate of 10 ml / min. Absorption in the ultraviolet region 210 nm of the active fraction was detected, and the peak eluted at a retention time of 21 to 22 minutes and the peak eluted at a retention time of 31 to 33 minutes were divided into 10 fractions.
[0121]
The fraction eluted at a retention time of 21 to 22 minutes was concentrated with a rotary evaporator and then lyophilized to obtain 14 mg of A-50039F amide compound as a pure product.
[0122]
Further, the fraction eluted at a retention time of 31 minutes to 33 minutes was concentrated with a rotary evaporator and then freeze-dried to obtain 50 mg of A-50039F compound as a pure product.
[0123]
The A-50039F amide compound has the following physicochemical properties.
1) Substance properties: White powdery substance
2) Solubility: Soluble in water, hardly soluble in methanol, insoluble in normal hexane and chloroform
3) Molecular formula: C₁₇H_{twenty two}N_FourO₁₁
4) Molecular weight: 458 (measured by FAB mass spectrum method)
5) Accurate mass measured by high resolution FAB mass spectrometry, [M + H]⁺Is as follows:
Actual value: 459.1328
Calculated value: 459.1364
6) Ultraviolet absorption spectrum: The ultraviolet absorption spectrum measured in water shows the following maximum absorption:
258 nm (ε7,500)
7) Optical rotation: The optical rotation measured in water shows the following values:
[α]_D ^{twenty five}: + 119 ° (c 0.87)
8) Infrared absorption spectrum: The infrared absorption spectrum measured by the potassium bromide (KBr) tablet method shows the following maximum absorption:
3339, 2943, 1686, 1598, 1495, 1402, 1337, 1272, 1205, 1136, 1115, 1060, 1019 cm^-1
9)¹H-nuclear magnetic resonance spectrum: measured in water with a water signal of 4.75 ppm.¹The H-nuclear magnetic resonance spectra are as follows: 3.30 (3H, s) 3.67 (1H, dd, J = 5.0, 6.8 Hz), 4.17 (1H, ddd, J = 1.8, 2.9, 4.4 Hz) , 4.35 (1H, dd, J = 3.2, 5.0 Hz), 4.43 (1H, dd, J = 2.3, 6.8 Hz), 4.45 (1H, dd, J = 2.4, 4.4 Hz), 4.66 (1H, d, J = 2.3 Hz), 5.35 (1H, d, J = 2.9 Hz), 5.71 (1H, d, J = 3.2 Hz), 5.85 (1H, d, J = 8.1 Hz), 5.97 (1H, dd, J = 1.8 , 2.4 Hz), 7.71 (1H, d, J = 8.1 Hz) ppm.
10)¹³C-nuclear magnetic resonance spectrum: measured in heavy water using 1,4-dioxane (67.4 ppm) as an internal standard.¹³The C-nuclear magnetic resonance spectra are as follows: 58.6 (q), 62.7 (d), 65.3 (d), 72.6 (d), 75.7 (d), 78.7 (d), 82.3 (d), 91.3 (d), 99.8 (d), 102.7 (d), 110.8 (d), 141.9 (d), 142.3 (s), 152.1 (s), 166.0 (s), 167.0 (s) ppm.
11) HPLC analysis:
Column: Senshu Pack ODS-H-2151,
6φ × 150 mm (Senshu Scientific Co., Ltd.)
Solvent: 0.04% aqueous trifluoroacetic acid
Flow rate: 1.5 ml / min
Detection: UV 210 nm
Retention time: 11 minutes.
[0124]
Example 8 FIG. Method for producing A-500359F compound (hydrolysis of A-500359E compound with sodium hydroxide)
4.4 mg of the A-500359E compound obtained in Example 2 was dissolved in 0.5 ml of distilled water. 0.5 ml of 0.02N aqueous sodium hydroxide was added dropwise, 1 ml of 0.1N aqueous sodium hydroxide was added dropwise, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 50 minutes. The reaction solution was neutralized with 1N hydrochloric acid and then applied to a 2 ml activated carbon column. After the column was washed with 8 ml of distilled water, the reactant was eluted with 0.5 N aqueous ammonia containing 8 ml of 10% acetone.
[0125]
This eluate was concentrated to 700 μl, and then 230 μl was applied to an HPLC column (Senshu Pak ODS-H-4251: 10φ × 250 mm: manufactured by Senshu Kagaku) equilibrated with 0.04% aqueous trifluoroacetic acid. Developed at 4 ml / min. Absorption in the ultraviolet region of 210 nm of the active substance was detected, and a peak eluted at a retention time of 25 to 30 minutes was collected. This operation was repeated three times, and the obtained fraction was concentrated by a rotary evaporator and then freeze-dried to obtain 2.6 mg of A-500359F compound as a pure product.
[0126]
Example 9 Culture of Streptomyces griseus SANK60196 (FERM BP-5420) strain
A 500 ml Erlenmeyer flask (seed flask) containing 100 ml of the medium having the composition described below is aseptically inoculated with one platinum loop of SANK60196, and then the flask is shaken at 23 ° C. and 210 rpm in a rotary shaker. Then, pre-culture for 3 days was performed.
[0127]
Preculture medium: The following components are contained in 1000 ml of tap water.
[0128]
Maltose 30g
5g meat extract
Polypeptone 5g
Sodium chloride 5g
Calcium carbonate 3g
Antifoam CB442 50mg
―――――――――――――――――――――――――――――――――――
The pH was adjusted to 7.4 and then sterilized at 121 ° C. for 30 minutes.
The main culture was performed as described below. That is, 3% (V / V) of the preculture was inoculated into a 500 ml Erlenmeyer flask containing 100 ml of a sterilized medium having the following composition. The culture was carried out for 11 days with shaking at 210 rpm.
[0129]
Main culture medium: The following components are contained in 1000 ml of tap water.
[0130]
Glucose 50g
4g meat extract
Polypeptone 3g
Skim milk 10g
Corn steep liquor 10g
Sodium chloride 5g
Antifoam CB442 50mg
――――――――――――――――――――――――――――――――――
The pH was adjusted to 7.4 and then sterilized at 125 ° C. for 30 minutes.
[0131]
Example 10 Purification of A-50039J compound
In subsequent purifications, the active fraction was monitored by HPLC with the following columns and conditions.
[0132]
Column: Pegasil ODS
6φ × 150mm (Senshu Scientific Co., Ltd.)
Solvent: 0.04% aqueous trifluoroacetic acid
Flow rate: 1.0 ml / min
Detection: UV260nm
Retention time: 5.57 minutes.
[0133]
The culture solution obtained in Example 9 was filtered after adding 5% (W / V) of Celite 545 as a filter aid. The obtained filtrate (1 L) was applied to a Diaion HP-20 (200 ml) column, and then the column was washed with distilled water (500 ml). After adjusting the pH of 1.5 L of the combined solution of the flow-through fraction and the water-washed fraction to 9 using 6N sodium hydroxide, Dowex SBR-P (OH^-) Column (100 ml). After washing the column with distilled water (300 ml), the adsorbate was eluted with 300 ml of 1N aqueous hydrochloric acid.
[0134]
The pH after elution was adjusted to 7 with 6N sodium hydroxide, and this eluate was applied to an activated carbon column (50 ml). After washing the column with distilled water (100 ml), the active substance was eluted with 60% aqueous acetone (200 ml). The eluate was concentrated and freeze-dried to obtain 558 mg of powder.
[0135]
This powder was dissolved in 5 ml of distilled water, and 500 μl of each was supplied to an HPLC column (Senshu Pack Pegasil ODS: 20φ × 250 mm: manufactured by Senshu Science Co., Ltd.) equilibrated with 0.05% aqueous trifluoroacetic acid. Developed at 10.0 ml / min. Absorption in the ultraviolet region of 260 nm was detected in the active fraction, and the peak eluted at a retention time of 11.1 minutes was collected 10 times. The obtained fraction was concentrated with a rotary evaporator and then freeze-dried to obtain 16.2 mg of A-500359J substance as a pure product.
[0136]
The A-50039J compound has the following physicochemical properties.
1) Substance properties: White powdery substance
2) Solubility: Soluble in water, hardly soluble in methanol, insoluble in normal hexane and chloroform
3) Molecular formula: C₁₆H_{twenty one}N_ThreeO₁₃
4) Molecular weight: 463 (measured by FAB mass spectrometry)
5) Accurate mass measured by high-resolution FAB mass spectrometry, [M-H]^-Is as follows:
Actual value: 462.0996
Calculated value: 462.1006
6) Ultraviolet absorption spectrum: The ultraviolet absorption spectrum measured in water shows the following maximum absorption:
194 (ε8800), 262 (ε10000) nm
7) Optical rotation: The optical rotation measured in water shows the following values:
[α]_D ²⁸: + 83 ° (c 0.1, H₂O)
8) Infrared absorption spectrum: The infrared absorption spectrum measured by the potassium bromide (KBr) tablet method shows the following maximum absorption:
3372, 2931, 1684, 1467, 1407, 1273, 1204, 1107, 1058 cm^-1
9)¹H-nuclear magnetic resonance spectrum: measured in heavy water using 1,4-dioxane (3.53ppm) as internal standard¹The H-nuclear magnetic resonance spectra are as follows: 3.75 (1H, t, J = 3.4 Hz), 3.83 (1H, ddd, J = 1.4, 1.9, 3.4 Hz), 4.02 (1H, ddd, J = 1.4, 1.7, 3.4Hz), 4.05 (1H, dd, J = 5.3, 5.6 Hz), 4.11 (1H, t, J = 5.6 Hz), 4.13 (1H, dd, J = 3.1, 5.6 Hz), 4.30 (1H, d, J = 5.3 Hz), 4.33 (1H, d, J = 1.7 Hz), 4.90 (1H, d, J = 1.9 Hz), 5.50 (1H, d, J = 3.1 Hz), 5.7 (1H , d, J = 8.2 Hz), 7.6 (1H, d, J = 8.2 Hz) ppm
10)¹³C-nuclear magnetic resonance spectrum: measured in heavy water using 1,4-dioxane (67.4 ppm) as internal standard¹³The C-nuclear magnetic resonance spectra are as follows: 64.4 (d), 68.8 (d), 68.9 (d), 69.7 (d), 71.4 (d), 73.0 (d), 75.4 (d), 82.8 (d), 90.7 (d), 99.2 (d), 101.7 (d), 141.6 (d), 151.0 (s), 165.9 (s), 171.9 (s), 172.6 (s) ppm
11) HPLC analysis:
Column: Senshu Pack ODS-H-2151,
6φ × 150 mm (Senshu Scientific Co., Ltd.)
Solvent: 0.05% trifluoroacetic acid water
Flow rate: 1.0 ml / min
Detection: UV 260 nm
Retention time: 5.57 minutes.
[0137]
Example 11 Culture of Streptomyces griseus SANK60196 (FERM BP-5420) strain
A 500 ml Erlenmeyer flask (seed flask) containing 100 ml of the medium having the composition described below is inoculated with 1 platinum ear of SANK60196 strain, and then the four flasks are placed at 23 ° C., 210 rpm in a rotary shaker. And pre-cultured for 3 days.
[0138]
Preculture medium: The following components are contained in 1000 ml of tap water.
[0139]
Maltose 30g
5g meat extract
Polypeptone 5g
Sodium chloride 5g
Calcium carbonate 3g
Antifoam CB442 50mg
―――――――――――――――――――――――――――――――――――
The pH was adjusted to 7.4 and then sterilized at 121 ° C. for 30 minutes.
[0140]
The main culture was performed as described below. That is, 3% (V / V) of the preculture was inoculated into a 500 ml Erlenmeyer flask containing 100 ml of a sterilized medium having the following composition, and then 10 of the flasks were placed at 23 ° C. and 210 rpm in a rotary shaker. And cultured with shaking. Six hours after the start of the culture, S- (2-aminoethyl) -L-cysteine hydrochloride and L-allyl glycine sterilized by filter were added to a final concentration of 10 mM, and then cultured for 7 days.
[0141]
Main culture medium: The following components are contained in 1000 ml of tap water.
[0142]
Maltose 30g
Yeast extract 5g
(Difco)
5g meat extract
Polypeptone 5g
Sodium chloride 5g
Calcium carbonate 3g
Antifoam CB442 50mg
――――――――――――――――――――――――――――――――――
The pH was adjusted to 7.4 and then sterilized at 125 ° C. for 30 minutes.
[0143]
Example 12 A-500359M-3 Purification of substance
The culture end solution (1 L) obtained in Example 11 was centrifuged at 3000 rpm for 20 minutes and purified from the resulting supernatant.
[0144]
In subsequent purifications, the active fraction was monitored by HPLC with the following columns and conditions.
[0145]
Column: Pegasil ODS
6φ × 150mm (Senshu Scientific Co., Ltd.)
Solvent: 7.2% acetonitrile-0.05% aqueous trifluoroacetic acid
Flow rate: 1.0 ml / min
Detection: UV260nm
Retention time: 10.1 minutes.
[0146]
The pH of the supernatant (1 L) was adjusted to 3 using trifluoroacetic acid and then applied to a Diaion HP-20 column (200 ml) equilibrated with 0.05% aqueous trifluoroacetic acid. The column was then washed with 0.05% aqueous trifluoroacetic acid (500 ml) and eluted with distilled water (500 ml). The obtained fraction (500 ml) eluted with distilled water was concentrated and freeze-dried to obtain 230 mg of a crude powder.
[0147]
This crude powder was dissolved in 2 ml of distilled water, 500 μl of which was equilibrated with 0.05% aqueous trifluoroacetic acid containing 7% acetonitrile (Pegasil ODS: 20φ × 250 mm: manufactured by Senshu Scientific Co., Ltd.). Provided.
[0148]
The column was developed with the same solvent at a flow rate of 10.0 ml / min and monitored by UV absorption at 260 nm. As a result, the active substance was eluted at 28.0 minutes. The eluate obtained by repeating this operation four times was combined and concentrated, and then lyophilized to obtain 11.1 mg of A-500359M-3 substance as a pure product.
[0149]
The A-5003539M-3 compound has the following physicochemical properties.
1) Substance properties: White powdery substance
2) Solubility: soluble in water and methanol, insoluble in normal hexane and chloroform
3) Molecular formula: C_{twenty two}H₂₈N_FourO₁₃
4) Molecular weight: 556 (measured by FAB mass spectrum)
5) Accurate mass measured by high resolution FAB mass spectrometry, [M + H]⁺Is as follows:
Actual value: 557.1754
Calculated value: 557.1731
6) Ultraviolet absorption spectrum: The ultraviolet absorption spectrum measured in water shows the following maximum absorption:
236 nm (ε10,000)
7) Optical rotation: The optical rotation measured in water shows the following values:
[α]_D ²⁶: + 92 ° (c 0.1, H₂O)
8) Infrared absorption spectrum: The infrared absorption spectrum measured by the potassium bromide (KBr) tablet method shows the following maximum absorption:
3407, 2938, 1684, 1524, 1465, 1399, 1385, 1335, 1268, 1205, 1139, 1118, 1095, 1063, 1021 cm^-1
9)¹H-nuclear magnetic resonance spectrum: measured in heavy water using 1,4-dioxane as internal standard¹The H-nuclear magnetic resonance spectra are as follows: 2.44 (1H, ddd, J = 4.3, 7.3, 13.3 Hz), 2.52 (1H, ddd, J = 4.3, 7.5, 13.3 Hz), 3.27 (3H , s), 3.66 (1H, t, J = 5.5 Hz), 4.17 (1H, ddd, J = 1.1, 2.5, 3.1 Hz), 4.32 (1H, dd, J = 3.7, 5.5 Hz), 4.33 (1H, t, J = 4.3 Hz), 4.45 (1H, m), 4.46 (1H, m), 4.73 (1H overlapped with HDO), 5.07 (1H, d, J = 10.2 Hz), 5.36 (1H, d, J = 3.1 Hz), 5.51 (1H, d, J = 17.1 Hz), 5.58 (1H, d, J = 8.1 Hz), 5.73 (1H, m), 5.74 (1H, d, J = 3.7 Hz), 5.95 (1H , dd, J = 1.1, 1.9 Hz), 7.72 (1H, d, J = 8.1 Hz) ppm
10)¹³C-nuclear magnetic resonance spectrum: measured in heavy water using 1,4-dioxane (67.4 ppm) as internal standard¹³The C-nuclear magnetic resonance spectra are as follows: 37.1 (t), 55.4 (d), 58.6 (q), 62.6 (d), 65.3 (d), 72.6 (d), 75.7 (d), 78.9 (d), 82.4 (d), 90.6 (d), 99.8 (d), 102.6 (d), 109.9 (d), 119.0 (t), 134.0 (d), 1414.7 (d), 142.2 (s), 152.0 (s), 162.3 (s), 166.8 (s), 173.6 (s), 177.6 (s) ppm
11) HPLC analysis:
Column: Pegasil ODS
6φ × 150 mm (Senshu Scientific Co., Ltd.)
Solvent: 7.2% acetonitrile-0.05% aqueous trifluoroacetic acid
Flow rate: 1.0 ml / min
Detection: UV 260 nm
Retention time: 10.1 minutes.
[0150]
Test Example 1 Measurement of antibacterial activity
A so-called disk assay was performed using a paper disk having a diameter of 8 mm and containing 40 μg of test sample per disk (edited by the Department of Agricultural Chemistry, Faculty of Agriculture, University of Tokyo “Experimental Agricultural Chemistry 3rd Edition, Volume 2”: Asakura Shoten, 1978). In contrast to Mycobacterium smegmatis SANK75075, the A-500359E compound showed a diameter of 12 mm, the A-500359F amide compound showed a diameter of 12 mm, and the A-500359M-3 compound also showed a blocking circle of 12 mm in diameter.
[0151]
Formulation Example 1
A-500359E compound, A-50039F compound, A-500309F amide compound, A-500309H compound, A-500039J compound or A-500039M-3 compound 100 mg, lactose 100 mg, corn starch 148.8 mg, magnesium stearate 1.2 mg ( Each powder (total amount 350 mg) is mixed and passed through a 60 mesh sieve, and then this powder is put into a gelatin capsule to form a capsule.
[0152]
【The invention's effect】
Since the compounds of the present invention and pharmaceutically acceptable salts thereof have excellent antibacterial activity against various bacteria including mycobacteria, they are used as preventive or therapeutic agents for infectious diseases caused by those bacteria. Useful. The compounds of the present invention are also useful as raw material compounds in derivative synthesis using organic chemical conversion and microbiological conversion aiming at preventive or therapeutic agents for various bacterial infections.

Claims (9)

Formula (I)

A-500359E compound shown by these, or its salt. The following formula (II)

A-500359F compound shown by these, or its salt. Formula (III) below

A-500359F amide compound or a salt thereof represented by: Formula (IV) below

A-500359H compound or a salt thereof represented by: Following formula (V)

A-50039J compound or its salt shown by these. The following formula (VI)

A-500359M-3 compound or a salt thereof represented by: Culturing Streptomyces griseus (Streptomyces griseus) SANK60196 (FERM BP -5420), and characterized in that the culture from claim 1, and collecting the claim 2, claim 4 or claim 5 compounds according And a process for producing the compound.   Streptomyces griseus SANK60196 (FERM BP-5420), characterized in that it produces the compound according to claim 1, claim 2, claim 4 or claim 5.   A medicament comprising the compound according to claim 1, claim 2, claim 3, claim 4, claim 5 or claim 6, or a pharmacologically acceptable salt thereof.