JP2006111594A

JP2006111594A - New antibiotic substance a-94964a

Info

Publication number: JP2006111594A
Application number: JP2004302354A
Authority: JP
Inventors: Masaaki Kitsuka; 正明木塚; Akira Murakami; 亮村上; Yoko Fujita; 陽子藤田
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 2004-10-18
Filing date: 2004-10-18
Publication date: 2006-04-27

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a compound free from cross-tolerance to drugs of conventional type and having excellent antimicrobial activity. <P>SOLUTION: The compound is expressed by formula (I), etc. The invention relates to a new compound usable as a synthetic raw material for a related derivative having antimicrobial activity or induced for improving antimicrobial activity, a drug (especially an antimicrobial agent) containing the compound as an active component, a method for producing the compound, and a new microbial strain producing the compound. <P>COPYRIGHT: (C)2006,JPO&NCIPI

Description

本発明は、抗菌活性を有し、また抗菌活性を増強せしめる目的で導かれる関連誘導体の合成原料として利用可能な新規化合物、該化合物を有効成分として含有する医薬（特に、抗菌剤）、該化合物の製造方法、及び該化合物を生産する新規微生物に関する。 The present invention relates to a novel compound that has antibacterial activity and can be used as a raw material for synthesizing related derivatives derived for the purpose of enhancing antibacterial activity, a medicament (particularly, an antibacterial agent) containing the compound as an active ingredient, and the compound And a novel microorganism producing the compound.

従来、細菌感染症の予防及び治療には各種ベータラクタム抗生物質、アミノ配糖体、マクロライド、グリコペプチド、キノロンなどが使われてきたが、最近これらの抗生物質に耐性を示す感染菌が増加しており、従来のタイプとは異なる抗生物質が渇望されている。 Conventionally, various beta-lactam antibiotics, aminoglycosides, macrolides, glycopeptides, quinolones, etc. have been used for the prevention and treatment of bacterial infections, but recently, the number of infectious bacteria resistant to these antibiotics has increased. And antibiotics different from the conventional type are craved.

細菌細胞壁構成成分である、ペプチドグリカン生合成に関与するトランスロケースＩは、細菌の生育には必須の酵素である。近年、トランスロケースＩ阻害活性に基づき、マイコバクテリウム属の細菌に対して抗菌活性を示す化合物として、リポシドマイシン（ｌｉｐｏｓｉｄｏｍｙｃｉｎ）類及びカプラザマシン（ｃａｐｒａｚａｍｙｃｉｎ）類、ムラミノミシン（Ｍｕｒａｍｉｎｏｍｉｃｉｎ）類等が報告されている（例えば、特許文献１、特許文献２、非特許文献１及び非特許文献２参照）。
国際公開第０１／１２６４３号パンフレット国際公開第２００４／０４６３６８号パンフレットジャーナルオブアンチビオチクス，１９８５年，第３８巻，ｐ．１６１７−１６２１（J．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，１９８５，３８，ｐ．１６１７−１６２１）アグリカルチュラルアンドバイオロジカルケミストリー，１９８９年，第５３巻，ｐ．１８１１−１８１５（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，１９８９，５３，ｐ．１８１１−１８１５） Translocase I involved in peptidoglycan biosynthesis, which is a component of the bacterial cell wall, is an essential enzyme for bacterial growth. In recent years, as compounds showing antibacterial activity against bacteria of the genus Mycobacterium on the basis of translocase I inhibitory activity, liposidemycins, caprazamycins, muraminomycins, etc. Have been reported (for example, see Patent Document 1, Patent Document 2, Non-Patent Document 1, and Non-Patent Document 2).
International Publication No. 01/124633 Pamphlet International Publication No. 2004/046368 Pamphlet Journal of Antibiotics, 1985, 38, p. 1617-1621 (J. Antibiotics, 1985, 38, p. 1617-1621) Agricultural and Biological Chemistry, 1989, Vol. 53, p. 1811-1815 (Agric. Biol. Chem, 1989, 53, p. 1811-1815)

本発明者らは、新規化合物を培養液中に見出し、これら化合物の薬理活性について鋭意研究を行った結果、これらの化合物がトランスロケースＩ阻害活性に基づく抗菌活性を有し、従来のタイプの薬剤とは交差耐性がなく、かつ、従来知られていた化合物と比べて新規骨格を有することを見出すと共に、該化合物を生産する新規微生物及び該化合物の製造方法を確立し、本発明を完成した。
As a result of discovering new compounds in the culture medium and conducting intensive studies on the pharmacological activities of these compounds, the present inventors have antibacterial activity based on translocase I inhibitory activity, The present invention was completed by finding that it has no cross-resistance with drugs and has a novel skeleton compared to conventionally known compounds, and established a novel microorganism that produces the compound and a method for producing the compound. .

本発明は；
（１）式(Ｉ)： The present invention includes:
(1) Formula (I):

で表わされる化合物又はその塩、

（２）下記の物理化学的性状を有する化合物又はその塩；
１）物質の性状：無色粉末状物質
２）溶解性：メタノール、ジメチルスルホキシドに可溶、クロロホルムに不溶
３）分子式：Ｃ_４５Ｈ_７３Ｎ_４Ｏ_２３Ｐ
４）分子量：１０６８（ＦＡＢマススペクトル法により測定)
５）高分解能ＦＡＢマススペクトル法により測定した精密質量、[Ｍ＋Ｎａ]^＋は次に示す通りである：
実測値：１０９１．４３２８
計算値：１０９１．４３０１
６）紫外部吸収スペクトル：メタノール中で測定した紫外部吸収スペクトルは、次に示す極大吸収を示す：
２６７ｎｍ（ε２６４００)
７）旋光度：５０％含水メタノール中で測定した旋光度は、以下に示す値を示す：
[α]_Ｄ ^２５：＋６０．０°（ｃ０．５)
８）赤外吸収スペクトル：臭化カリウム（ＫＢｒ）錠剤法で測定した赤外吸収スペクトルは以下に示す極大吸収を示す：
３３２８，２９２５，１６８６，１６１３，１２５９，１２３３，１０５３，９６３ｃｍ^−１
９）^１Ｈ−核磁気共鳴スペクトル：重ジメチルスルホキシド中、内部標準に重ジメチルスルホキシド（２．４９ｐｐｍ）を用いて測定した、^１Ｈ−核磁気共鳴スペクトルは、以下に示すとおりである：
０．８０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ)，０．８１（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ)，０．９３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ)，１．０−１．４（１７Ｈ，ｍ)，１．６８（１Ｈ，ｍ)，１．７１（３Ｈ，ｓ)，１．８６（１Ｈ，ｍ)，２．４８（１Ｈ，ｍ)，３．１５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．０，９．４Ｈｚ)，３．２３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．４，９．４Ｈｚ)，３．０（１Ｈ，ｍ)，３．４５（１Ｈ，ｍ)，３．５（２Ｈ，ｍ)，３．５１（１Ｈ，ｍ)，３．５６（１Ｈ，ｍ)，３．５７（１Ｈ，ｍ)，３．６７（２Ｈ，ｍ)，３．６９（１Ｈ，ｍ)，３．７７（１Ｈ，ｍ)，３．８（１Ｈ，ｍ)，３．８１（１Ｈ，ｍ)，３．９（１Ｈ，ｍ)，３．９９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．０，６．０Ｈｚ)，４．１３（１Ｈ，ｍ)，４．７２（１Ｈ，ｂｒ，ｓ)，４．９４（１Ｈ，ｍ)，５．３６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．７，６．４Ｈｚ)，５．５９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ)，５．６２（１Ｈ，ｄ，J＝８．０Ｈｚ)，５．７０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ)，６．０４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．４Ｈｚ)，７．０１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．４），７．５４（１Ｈ，ｄ，J＝８．０Ｈｚ)ｐｐｍ
１０）^１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル：重ジメチルスルホキシド中、内部標準に重ジメチルスルホキシド（３９．５ｐｐｍ）を用いて測定した、^１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトルは、以下に示すとおりである：
１１．３（ｑ），１２．４（ｑ），１９．１（ｑ），２０．６（ｑ），２６．５（ｔ），２７．０（ｔ），２７．０（ｔ），２８．９（ｔ），２９．０（ｔ），２９．１（ｔ），２９．４（ｔ），３２．４（ｄ），３３．８（ｄ），３４．５（ｔ），３６．７（ｔ），４１．５（ｔ)，５４．０（ｄｄ)，６０．２(ｔ)，６２．３（ｄ)，６８．０（ｄ)，６９．９（ｄ），７０．５（ｄ)，７０．６（ｄ)，７０．８（ｄ)，７２．６（ｄ)，７２．８（ｄ)，７３．３（ｄ)，７３．５（ｄ)，７７．０（ｄ)，７８．９（ｄ)，８１．８（ｄ)，８７．７（ｄ)，９４．４（ｄｄ)，１０２．１（ｄ)，１０２．４（ｄ)，１１９．６（ｄ)，１３１．０（ｓ)，１４０．６（ｄ)，１４４．０（ｄ)，１４５．４（ｄ)，１５０．７（ｓ)，１６３．０（ｓ)，１６５．６（ｓ)，１６９．１（ｓ)，１７２．３（ｓ)ｐｐｍ、

（３）ストレプトマイセス属に属する、（１）又は（２）記載の化合物の生産菌を培養し、その培養物より（１）又は（２）記載の化合物を採取することを特徴とする、請求項（１）又は（２）記載の化合物の製造方法、

（４）
ストレプトマイセス属に属する、（１）又は（２）記載の化合物の生産菌が、ストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ．）ＳＡＮＫ６０４０４株（ＦＥＲＭＢＰ−１０１１２）である、（３）記載の製造方法、

（５）ストレプトマイセス属に属し、（１）又は（２）記載の化合物を生産することを特徴とする微生物、

（６）ストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ．）ＳＡＮＫ６０４０４株（ＦＥＲＭＢＰ−１０１１２）、

（７）（１）又は（２）記載の化合物或いはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物、

（８）トランスロケースI阻害剤である、（７）に記載の医薬組成物、

（９）抗菌剤である、（７）に記載の医薬組成物、

に関する。 Or a salt thereof,

(2) A compound or salt thereof having the following physicochemical properties;
1) Substance properties: colorless powdery substance 2) Solubility: soluble in methanol and dimethyl sulfoxide, insoluble in chloroform 3) Molecular formula: C ₄₅ H ₇₃ N ₄ O ₂₃ P
4) Molecular weight: 1068 (measured by FAB mass spectral method)
5) The exact mass, [M + Na] ⁺ , measured by high resolution FAB mass spectrometry is as follows:
Actual value: 1091.4328
Calculated value: 1091.4301
6) Ultraviolet absorption spectrum: The ultraviolet absorption spectrum measured in methanol shows the following maximum absorption:
267 nm (ε26400)
7) Optical rotation: The optical rotation measured in 50% water-containing methanol shows the following values:
[α] _D ²⁵ : + 60.0 ° (c0.5)
8) Infrared absorption spectrum: The infrared absorption spectrum measured by the potassium bromide (KBr) tablet method shows the following maximum absorption:
3328, 2925, 1686, 1613, 1259, 1233, 1053, 963 cm ⁻¹
⁹⁾ 1 H- nuclear magnetic resonance spectrum: in deuterated dimethyl sulfoxide was determined as an internal standard using a deuterated dimethyl sulfoxide (2.49 ^ppm), 1 H- nuclear magnetic resonance spectrum is as shown below:
0.80 (3H, d, J = 6.4 Hz), 0.81 (3H, t, J = 7.0 Hz), 0.93 (3H, d, J = 6.7 Hz), 1.0-1 .4 (17H, m), 1.68 (1H, m), 1.71 (3H, s), 1.86 (1H, m), 2.48 (1H, m), 3.15 (1H, dd, J = 9.0, 9.4 Hz), 3.23 (1H, dd, J = 9.4, 9.4 Hz), 3.0 (1 H, m), 3.45 (1 H, m), 3.5 (2H, m), 3.51 (1H, m), 3.56 (1H, m), 3.57 (1H, m), 3.67 (2H, m), 3.69 (1H , M), 3.77 (1H, m), 3.8 (1H, m), 3.81 (1H, m), 3.9 (1H, m), 3.99 (1H, dd, J = 5.0, 6.0 Hz), 4.13 (1 H, m), 4.72 (1 H, br, s), 4.94 (1 H, m ), 5.36 (1H, dd, J = 2.7, 6.4 Hz), 5.59 (1H, d, J = 10.0 Hz), 5.62 (1H, d, J = 8.0 Hz) , 5.70 (1H, d, J = 8.0 Hz), 6.04 (1 H, d, J = 15.4 Hz), 7.01 (1 H, d, J = 15.4), 7.54 ( 1H, d, J = 8.0 Hz) ppm
¹⁰⁾ 13 C-Nuclear magnetic resonance spectrum: in deuterated dimethyl sulfoxide was determined as an internal standard using a deuterated dimethyl sulfoxide (39.5 ^ppm), 13 C-nuclear magnetic resonance spectrum is as shown below:
11.3 (q), 12.4 (q), 19.1 (q), 20.6 (q), 26.5 (t), 27.0 (t), 27.0 (t), 28 .9 (t), 29.0 (t), 29.1 (t), 29.4 (t), 32.4 (d), 33.8 (d), 34.5 (t), 36. 7 (t), 41.5 (t), 54.0 (dd), 60.2 (t), 62.3 (d), 68.0 (d), 69.9 (d), 70.5 (D), 70.6 (d), 70.8 (d), 72.6 (d), 72.8 (d), 73.3 (d), 73.5 (d), 77.0 ( d), 78.9 (d), 81.8 (d), 87.7 (d), 94.4 (dd), 102.1 (d), 102.4 (d), 119.6 (d ), 131.0 (s), 140.6 (d), 144.0 (d), 145.4 (d), 150.7 (s), 163.0 (s), 165. (S), 169.1 (s), 172.3 (s) ppm,

(3) It is characterized by culturing a compound-producing fungus of (1) or (2) belonging to the genus Streptomyces, and collecting the compound of (1) or (2) from the culture, A process for producing the compound according to claim (1) or (2),

(4)
The production according to (3), wherein the microorganism producing the compound according to (1) or (2) belonging to the genus Streptomyces is Streptomyces sp. SANK 60404 strain (FERM BP-10112). Method,

(5) A microorganism belonging to the genus Streptomyces and producing the compound according to (1) or (2),

(6) Streptomyces sp. SANK 60404 strain (FERM BP-10112),

(7) A pharmaceutical composition comprising the compound according to (1) or (2) or a pharmacologically acceptable salt thereof as an active ingredient,

(8) The pharmaceutical composition according to (7), which is a translocase I inhibitor,

(9) The pharmaceutical composition according to (7), which is an antibacterial agent,

About.

本発明において、式（Ｉ）により表わされる構造からなる化合物、又は、（２）記載の物理化学的性状を有する化合物を「Ａ−９４９６４Ａ」とよぶ。 In the present invention, a compound having a structure represented by the formula (I) or a compound having the physicochemical properties described in (2) is referred to as “A-94964A”.

本発明の化合物は、いくつかの不斉炭素原子を有するため、種々の光学異性体が存在する。式（Ｉ）において、これらの異性体はすべて単一の式で示されているが、本発明はラセミ化合物を含むこれらの異性体、及びこれらの異性体の混合物をもすべて含む。これらの異性体は、立体特異的合成法により、若しくは光学活性化合物を原料化合物とした合成により、製造することができ、又は、異性体の混合物として製造した後、所望の異性体をクロマトグラフィー等を用いて常法により単離することにより製造することもできる。 Since the compound of the present invention has several asymmetric carbon atoms, various optical isomers exist. In formula (I), these isomers are all represented by a single formula, but the present invention also includes all of these isomers, including racemates, and mixtures of these isomers. These isomers can be produced by a stereospecific synthesis method, or by synthesis using an optically active compound as a raw material compound, or after being produced as a mixture of isomers, the desired isomer is chromatographed, etc. It can also manufacture by isolating by a conventional method using.

本発明の化合物は、カルボキシル基、リン酸基等を有するため、酸又は塩基を用いて当業者に周知の方法により塩にすることができる。本発明はこれらの塩も包含する。本発明の化合物の塩を医薬として使用する場合、医学的に使用され、薬理学的に許容されるものであれば特に限定されない。また、本発明の化合物の塩を医薬以外の用途に用いる場合、例えば中間体として用いる場合には、該用途に用いることのできるものであれば特に限定されない。 Since the compound of the present invention has a carboxyl group, a phosphate group and the like, it can be converted into a salt by a method well known to those skilled in the art using an acid or a base. The present invention also includes these salts. When the salt of the compound of the present invention is used as a medicine, it is not particularly limited as long as it is medically used and pharmacologically acceptable. Moreover, when using the salt of the compound of this invention for uses other than a pharmaceutical, for example, when using as an intermediate body, if it can be used for this use, it will not specifically limit.

そのような塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、のようなアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩、のようなアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩等の金属塩；アンモニウム塩のような無機塩；ｔ−オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ−ベンジル−フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニア塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機アミン塩；グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、アスパラギン塩のようなアミノ酸塩；酢酸塩、臭化物塩、塩化物塩、塩酸塩、臭酸塩、ヨウ化物塩、硫酸塩、リン酸塩、ニリン酸塩のような無機塩；及びクエン酸塩、マレイン酸塩、パモ酸塩、酒石酸塩のような有機酸塩等を挙げることができる。好適には、薬理学的に許容される塩であり、より好適には、ナトリウム塩、カリウム塩、塩酸塩、アンモニウム塩、パモ酸塩である。 Examples of such salts include alkali metal salts such as sodium salt, potassium salt and lithium salt; alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt; aluminum salt, iron salt, zinc salt and copper Metal salts such as salts, nickel salts and cobalt salts; inorganic salts such as ammonium salts; t-octylamine salts, dibenzylamine salts, morpholine salts, glucosamine salts, phenylglycine alkyl ester salts, ethylenediamine salts, N-methylglu Camin salt, guanidine salt, diethylamine salt, triethylamine salt, dicyclohexylamine salt, N, N'-dibenzylethylenediamine salt, chloroprocaine salt, procaine salt, diethanolamine salt, N-benzyl-phenethylamine salt, piperazine salt, tetramethylammonium salt , Tris (hydroxy Organic amine salts such as methyl) aminomethane salt; amino acid salts such as glycine salt, lysine salt, arginine salt, ornithine salt, asparagine salt; acetate salt, bromide salt, chloride salt, hydrochloride salt, odorous salt, iodine salt And inorganic salts such as chloride salts, sulfate salts, phosphate salts, and diphosphate salts; and organic acid salts such as citrate salts, maleate salts, pamoate salts, and tartrate salts. Preferred are pharmacologically acceptable salts, and more preferred are sodium salt, potassium salt, hydrochloride, ammonium salt, and pamoate.

また、本発明の化合物及びその塩は、大気中に放置したり、水又は有機溶媒と混和することによって水又は溶媒と結合し、水和物又は溶媒和物を形成する場合があるが、これらの水和物及び溶媒和物も「薬理上許容される塩」として本発明に含まれる。 In addition, the compound of the present invention and a salt thereof may be left in the air or mixed with water or an organic solvent to combine with water or a solvent to form a hydrate or a solvate. Hydrates and solvates of are also included in the present invention as “pharmacologically acceptable salts”.

本発明のＡ−９４９６４Ａは、ストレプトマイセス属に属する菌株を培養することにより、その培養液中から得ることができる。 A-94964A of the present invention can be obtained from the culture solution by culturing a strain belonging to the genus Streptomyces.

本発明のＡ−９４９６４Ａの製造法において用いられるストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌株としては、例えばストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ．）ＳＡＮＫ６０４０４株（以下、「ＳＡＮＫ６０４０４株」という。）を挙げることができる。ＳＡＮＫ６０４０４株は沖縄県西表島で採集した土壌から土壌希釈法による希釈液から分離できる。ＳＡＮＫ６０４０４株の菌学的特徴は、次のとおりである。 Examples of the strain belonging to the genus Streptomyces used in the method for producing A-94964A of the present invention include Streptomyces sp. SANK 60404 strain (hereinafter referred to as “SANK 60404 strain”). Can be mentioned. SANK 60404 strain can be separated from the soil collected in Iriomote Island, Okinawa Prefecture from the diluted solution by the soil dilution method. The mycological characteristics of the SANK 60404 strain are as follows.

１．形態学的特徴
ＳＡＮＫ６０４０４株は、ＩＳＰ〔インターナショナル・ストレプトマイセス・プロジェクト（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓＰｒｏｊｅｃｔ）〕規定の寒天培地上２８℃、１４日間の培養後、顕微鏡下観察では、ＳＡＮＫ６０４０４株の基生菌糸は良好に伸長、分岐し、薄茶、薄黄味茶、乃至黄味灰色を示すが、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属菌株様の菌糸断裂やジグザグ伸長は観察されない。気菌糸は単純分岐である。気菌糸の先端に１０乃至５０個又はそれ以上の胞子連鎖を形成し、胞子連鎖の形態は直線乃至波状を示す。走査型電子顕微鏡による観察では、胞子の表面構造は平滑(smooth)状を示す。胞子は楕円形で、その大きさは０．４乃至０．７μｍ×０．８乃至１．２μｍである。また、気菌糸の車軸分岐、菌核や胞子のうなどの特殊器官は観察されない。 1. Morphological characteristics The SANK 60404 strain is obtained from the basic mycelium of the SANK 60404 strain after culturing at 28 ° C. for 14 days on an agar medium defined by ISP (International Streptomyces Project). Elongates and branches well, and shows light brown, light yellowish brown, or yellowish gray, but no mycelial breakage or zigzag elongation similar to the Nocardia genus strain is observed. Air hyphae are simply branched. 10 to 50 or more spore chains are formed at the tip of the aerial hyphae, and the form of the spore chain is linear or wavy. When observed with a scanning electron microscope, the surface structure of the spore shows a smooth shape. The spores are elliptical and have a size of 0.4 to 0.7 μm × 0.8 to 1.2 μm. In addition, special organs such as axle branches of the aerial hyphae, mycorrhiza and spores are not observed.

２．各種培養基上の諸性質
各種培養基上で２８℃、１４日培養後の性状は表１に示したとおりである。色調の表示はマンセル方式による日本色彩研究所版「標準色票」のカラーチップ・ナンバーをあらわす。 2. Properties on various culture media Table 1 shows the properties after 14 days of culture on various culture media. The color display indicates the color chip number of the “Standard Color Chart” of the Japan Color Research Institute version using the Munsell method.

［表１］
―――――――――――――――――――――――――――――――――――
培地の種類項目*１ＳＡＮＫ６０４０４株の性状
―――――――――――――――――――――――――――――――――――
シュークロース・Ｇ：良い、平坦、白
硝酸塩寒天ＡＭ：良い、ビロード状、薄橙色（５ＹＲ８／２)＊２
Ｒ：白
ＳＰ：産生せず
グルコース・Ｇ：余り良くない、平坦、黄味灰（７．５Ｙ９／２)
アスパラギン寒天ＡＭ：良くない、白
Ｒ：黄味灰（７．５Ｙ９／２)
ＳＰ：産生せず
グリセリン・Ｇ：良い、隆起状、黄味灰（７．５Ｙ９／１)
アスパラギン寒天ＡＭ：良い、白
（ＩＳＰ５）Ｒ：黄味灰（７．５Ｙ９／１)
ＳＰ：産生せず
澱粉・無機塩寒天Ｇ：非常に良好、隆起状、黄味灰（５Ｙ９／２)
（ＩＳＰ４）ＡＭ：非常に良好、ビロード状、
明るい茶味灰（７．５Ｙ８／２)
Ｒ：黄味灰（５Ｙ９／２)
ＳＰ：産生せず
チロシン寒天Ｇ：非常に良好、隆起状、薄茶（２．５Ｙ８／２)
（ＩＳＰ７）ＡＭ：非常に良好、ビロード状、
茶味灰（７．５ＹＲ９／２)
Ｒ：薄茶（２．５Ｙ８／２)
ＳＰ：黒
栄養寒天Ｇ：あまり良くない、平坦、黄味灰（７．５Ｙ９／２)
（Ｄｉｆｃｏ）ＡＭ：形成せず
Ｒ：黄味灰（７．５Ｙ９／２）
ＳＰ：産生せず
イーストエキス・Ｇ：非常に良好、隆起状、黄味灰（５Ｙ９／２)
麦芽エキス寒天ＡＭ：豊富に形成、ビロード状、
黄味灰（７．５Ｙ９／２）
（ＩＳＰ２）Ｒ：黄味灰（５Ｙ９／２)
ＳＰ：産生せず
オートミール寒天Ｇ：良好、平坦、白、
（ＩＳＰ３）ＡＭ：良好、ビロード状、
明るい茶味灰（２．５Ｙ８／１)
Ｒ：白
ＳＰ：産生せず
水寒天Ｇ：良くない、平坦、白
ＡＭ：良くない、ビロード状、薄茶（２．５Ｙ８／２)
Ｒ：白
ＳＰ：産生せず
ポテトエキス・Ｇ：余り良くない、平坦、白
人参エキス寒天ＡＭ：良好、ビロード状、薄茶（２．５Ｙ８／２)
Ｒ：白
ＳＰ：産生せず
―――――――――――――――――――――――――――――――――――
＊１Ｇ：生育、ＡＭ：気菌糸、Ｒ：裏面、ＳＰ：可溶性色素
＊２性状の欄の（）内はマンセル方式による色調表示である。 [Table 1]
―――――――――――――――――――――――――――――――――――
Type of medium Item * 1 Properties of SANK 60404 strain ―――――――――――――――――――――――――――――――――――
Sucrose G: Good, flat, white nitrate agar AM: Good, velvety, light orange (5YR8 / 2) * 2
R: White
SP: glucose not produced G: not so good, flat, yellowish ash (7.5Y9 / 2)
Asparagine Agar AM: Not good, white
R: Yellowish ash (7.5Y9 / 2)
SP: not produced glycerin G: good, raised, yellowish ash (7.5Y9 / 1)
Asparagine agar AM: good, white (ISP5) R: yellowish ash (7.5Y9 / 1)
SP: Starch not produced, inorganic salt agar G: Very good, raised, yellowish ash (5Y9 / 2)
(ISP4) AM: very good, velvety,
Bright tea taste ash (7.5Y8 / 2)
R: Yellowish ash (5Y9 / 2)
SP: Tyrosine agar not produced G: Very good, raised, light brown (2.5Y8 / 2)
(ISP7) AM: very good, velvety,
Brown ash (7.5YR9 / 2)
R: Light brown (2.5Y8 / 2)
SP: Black nutrition agar G: Not so good, flat, yellowish ash (7.5Y9 / 2)
(Difco) AM: Not formed
R: Yellowish ash (7.5Y9 / 2)
SP: Yeast extract not produced G: Very good, raised, yellowish ash (5Y9 / 2)
Malt extract agar AM: abundantly formed, velvety,
Yellowish ash (7.5Y9 / 2)
(ISP2) R: Yellowish ash (5Y9 / 2)
SP: not produced oatmeal agar G: good, flat, white,
(ISP3) AM: good, velvety,
Bright brown ash (2.5Y8 / 1)
R: White
SP: not produced water agar G: bad, flat, white
AM: Bad, velvety, light brown (2.5Y8 / 2)
R: White
SP: not producing potato extract · G: not good, flat, caucasian ginseng extract agar AM: good, velvety, light brown (2.5Y8 / 2)
R: White
SP: Not produced------------------------
* 1 G: growth, AM: aerial hyphae, R: back surface, SP: soluble pigment * 2 The color brackets in the parentheses in the property column are color tone display by the Munsell method.

３．生理学的性質
２８℃で培養後、２乃至２１日間に観察したＳＡＮＫ６０４０４株の生理学的性質は表２に示したとおりである。 3. Physiological properties Physiological properties of the SANK 60404 strain observed from 2 to 21 days after culturing at 28 ° C are as shown in Table 2.

［表２］
―――――――――――――――――――――――――――――――――――
澱粉の水解陽性
ゼラチンの液化陰性
硝酸塩の還元陽性
ミルクのペプトン化陽性
ミルクの凝固陽性
メラニン様色素の生産性（培地１）＊陰性
（培地２）＊陽性
（培地３）＊陽性
基質分解性カゼイン陽性
チロシン陽性
キサンチン陽性
生育温度範囲（培地４）＊８〜４５℃
食塩耐性５％
―――――――――――――――――――――――――――――――――――
＊：培地１；トリプトン・イーストエキス・ブロス（ＩＳＰ１)
２；ペプトン・イーストエキス・鉄寒天（ＩＳＰ６)
３；チロシン寒天（ＩＳＰ７)
４；イーストエキス・麦芽エキス寒天（ＩＳＰ２)
また、プリドハム・ゴトリーブ寒天培地（ＩＳＰ９)を使用して、２８℃、１４日間培養後に観察したＳＡＮＫ６０４０４株の炭素源の資化性は表３に示すとおりである。 [Table 2]
―――――――――――――――――――――――――――――――――――
Starch hydrolysis positive Gelatin liquefaction negative Nitrate reduction positive Milk peptone positive Positive Milk coagulation positive Melanin-like pigment productivity (medium 1) * negative
(Medium 2) * Positive
(Medium 3) * Positive Substrate degradability Casein Positive
Tyrosine positive
Xanthine positive Growth temperature range (medium 4) * 8-45 ° C
Salt tolerance 5%
―――――――――――――――――――――――――――――――――――
*: Medium 1; Tryptone yeast extract broth (ISP1)
2; Peptone, yeast extract, iron agar (ISP6)
3; Tyrosine Agar (ISP7)
4; Yeast extract / malt extract agar (ISP2)
Table 3 shows the assimilation properties of the carbon source of the SANK 60404 strain observed after culturing at 28 ° C. for 14 days using the Prideham Goat-Leave Agar Medium (ISP9).

［表３］
―――――――――――――――――――――――――――――――――――
Ｄ−グルコース＋Ｄ−フルクトース＋
Ｌ−アラビノース＋Ｌ−ラムノース＋
Ｄ−キシロース＋シュークロース −
イノシトール＋ラフィノース −
Ｄ−マンニトール − 対照 −
―――――――――――――――――――――――――――――――――――
＋：利用する、 ±：弱く利用する、−：利用しない。 [Table 3]
―――――――――――――――――――――――――――――――――――
D-glucose + D-fructose +
L-arabinose + L-rhamnose +
D-xylose + sucrose-
Inositol + raffinose-
D-mannitol-control-
―――――――――――――――――――――――――――――――――――
+: Use, ±: Use weakly,-: Do not use.

４．菌体成分について
ＳＡＮＫ６０４０４株の細胞壁はビー・ベッカーらの方法〔Ｂ．Ｂｅｃｋｅｒ．ｅｔ．ａｌ．，ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１２巻、４２１〜４２３頁、（１９８４年）〕に従い検討した結果、ＬＬ−ジアミノピメリン酸が検出されたことから細胞壁タイプＩであることが確認された。また、ＳＡＮＫ６０４０４株の全細胞中の糖成分をエム・ピー・レシェバリエの方法〔Ｍ．Ｐ．Ｌｅｃｈｅｖａｌｉｅｒ，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＬａｂｏｒａｔｏｒｙ＆ＣｌｉｎｉｃａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ７１巻、８３４頁、（１９６８年）〕に従い検討した結果、特徴的なパターンは認められなかった。 4). About the cell component The cell wall of the SANK 60404 strain is the method of B. Becker et al. Becker. et. al. , Applied Microbiology, Vol. 12, 421-423 (1984)]. As a result, LL-diaminopimelic acid was detected and confirmed to be cell wall type I. In addition, the sugar component in the whole cells of SANK 60404 strain was determined by the method of MP Rechevalier [M. P. Lechevalier, Journal of Laboratory & Clinical Medicine 71, 834, (1968)], no characteristic pattern was found.

ＩＳＰ〔インターナショナル・ストレプトマイセス・プロジェクト（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓＰｒｏｊｅｃｔ）〕基準、ワックスマン著，「ジ・アクチノミセテス」，第２巻（Ｓ．Ａ．Ｗａｋｓｍａｎ、“ＴｈｅＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ”，２）、ブキャナンとギボンズ編，「バージーズ・マニュアル」，第８版，１９７４年（Ｒ．Ｅ．Ｂｕｃｈａｎａｎａｎｄ、Ｎ．Ｅ．Ｇｉｂｂｏｎｓ，“Ｂｅｒｇｅｙ'ｓＭａｎｕａｌｏｆＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ”，８ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，１９７４）、「バージーズ・マニュアル」，第４巻，１９８９年（Ｂｅｒｇｅｙ'ｓＭａｎｕａｌｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，４，１９８９）、及びストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属放線菌に関する最近の文献によって同定を行い、本菌株が放線菌の中でもストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属すると判断した。そこで、本菌株をストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ．）ＳＡＮＫ６０４０４株と命名した。なお、本菌株は２００４年６月２３日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１中央第６）に国内寄託され、国内寄託番号ＦＥＲＭＰ−２００９７が付与された。また、同菌株は、２００４年８月２６日付けで国際寄託へ移管され国際寄託番号ＦＥＲＭＢＰ−１０１１２を付与された。 ISP (International Streptomyces Project) Standard, by Waxman, “The Actinomycetes”, Volume 2 (SA Waksman, “The Actinomycetes”, 2), edited by Buchanan and Gibbons, "Birgie's Manual", 8th edition, 1974 (R.E. Bucchanand, NE Gibbons, "Bergey's Manual of Deterministic Bacteriology", 8th edition, 1974), "Burgies Manual", Vol. , 1989 (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 4, 1989), and Carried out identified by the recent literature on Reputomaisesu (Streptomyces) belonging to the genus Actinomycetes, this strain was determined to belong to Streptomyces (Streptomyces) genus among the actinomycetes. Therefore, this strain was named Streptomyces sp. SANK 60404 strain. This strain was deposited domestically on June 23, 2004 at the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Chuo 6-1-1, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture). 20097 was given. The strain was transferred to the international deposit on August 26, 2004 and was assigned the international deposit number FERM BP-10112.

周知のとおり、放線菌は自然界において、又は人工的な操作（例えば、紫外線照射、放射線照射、化学薬品処理等）により、変異を起こし易く、本発明のＳＡＮＫ６０４０４株もこの点は同じである。本発明にいうＳＡＮＫ６０４０４株はそのすべての変異株を包含する。 As is well known, actinomycetes are susceptible to mutation in nature or by artificial manipulation (for example, ultraviolet irradiation, radiation irradiation, chemical treatment, etc.), and this is the same with the SANK 60404 strain of the present invention. The SANK 60404 strain referred to in the present invention includes all mutants thereof.

また、これらの変異株の中には、遺伝学的方法、例えば組み換え、形質導入、形質転換等により得られたものも包含される。即ち、Ａ−９４９６４Ａを生産する、ＳＡＮＫ６０４０４株及びその変異株並びにそれらと明確に区別されない菌株は、すべてＳＡＮＫ６０４０４株に包含されるものである。 These mutant strains also include those obtained by genetic methods such as recombination, transduction, transformation and the like. That is, the SANK 60404 strain and its mutant strains that produce A-94964A and strains that are not clearly distinguished from them are all included in the SANK 60404 strain.

また、本発明は、ストレプトマイセス属に属し、Ａ−９４９６４Ａを生産する全ての菌株を包含する。 Moreover, this invention includes all the strains which belong to Streptomyces genus and produce A-94964A.

本発明のＡ−９４９６４Ａの生産菌を培養するに際し使用される培地としては、炭素源、窒素源、無機イオン及び有機栄養源等より選択されたものを適宜含有する培地であれば、合成又は天然培地のいずれも使用することができる。 As a medium used for culturing the A-94964A-producing bacterium of the present invention, any medium that is appropriately selected from carbon sources, nitrogen sources, inorganic ions, organic nutrient sources, and the like can be used. Any of the media can be used.

該栄養源としては、従来真菌類や放線菌類の菌株の培養に利用されている公知の、微生物が資化できる炭素源、窒素源及び無機塩が使用できる。 As the nutrient source, known carbon sources, nitrogen sources and inorganic salts that can be assimilated by microorganisms, which have been conventionally used for culturing fungal and actinomycetes strains, can be used.

具体的には、炭素源としてグルコース、フルクトース、マルトース、シュークロース、マンニトール、グリセロール、デキストリン、オート麦、ライ麦、トウモロコシ澱粉、ジャガイモ、トウモロコシ粉、大豆粉、綿実油、水飴、糖蜜、大豆油、クエン酸、酒石酸などを単一に、又は併用して使用できる。一般的には、上記炭素源を培地量の１乃至１０重量％で使用することができるが、この範囲に限定されない。 Specifically, glucose, fructose, maltose, sucrose, mannitol, glycerol, dextrin, oats, rye, corn starch, potato, corn flour, soybean flour, cottonseed oil, starch syrup, molasses, soybean oil, citric acid , Tartaric acid or the like can be used singly or in combination. In general, the carbon source can be used in an amount of 1 to 10% by weight of the medium amount, but is not limited to this range.

また、窒素源としては、蛋白質又はその水解物を含有する物質、或いは含窒素無機塩類を用いることができる。好適な窒素源としては、例えば大豆粉、フスマ、落花生粉、綿実粉、スキムミルク、カゼイン加水分解物、ファーマミン、魚粉、コーンスチープリカー、ペプトン、肉エキス、生イースト、乾燥イースト、イーストエキス、マルトエキス、ジャガイモ、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム等を使用することができる。該窒素源は、単一で又は併用して、好ましくは培地量の０．２乃至６重量％の範囲で使用する。 Further, as the nitrogen source, a substance containing a protein or a hydrolyzate thereof, or a nitrogen-containing inorganic salt can be used. Suitable nitrogen sources include, for example, soy flour, bran, peanut flour, cottonseed flour, skim milk, casein hydrolyzate, pharmamine, fish meal, corn steep liquor, peptone, meat extract, fresh yeast, dry yeast, yeast extract, Malt extract, potato, ammonium sulfate, ammonium nitrate, sodium nitrate and the like can be used. The nitrogen sources are used alone or in combination, and are preferably used in the range of 0.2 to 6% by weight of the medium amount.

さらに栄養無機塩としては、ナトリウム、アンモニウム、カルシウム、フォスフェート、サルフェート、クロライド、カーボネート等のイオンを含む、通常の塩類を使用することができる。また、カリウム、カルシウム、コバルト、マンガン、鉄、マグネシウム等の微量の金属も使用することができる。 Further, as the nutrient inorganic salt, ordinary salts containing ions such as sodium, ammonium, calcium, phosphate, sulfate, chloride, carbonate and the like can be used. Moreover, trace metals, such as potassium, calcium, cobalt, manganese, iron, and magnesium, can also be used.

なお、液体培養に際しては、消泡剤としてシリコン油、植物油、界面活性剤等を使用することができる。 In liquid culture, silicone oil, vegetable oil, surfactant, etc. can be used as an antifoaming agent.

ＳＡＮＫ６０４０４株を培養してＡ−９４９６４Ａを生産するための培地のｐＨは、好適には５．０乃至８．０である。 The pH of the medium for culturing SANK 60404 strain to produce A-94964A is preferably 5.0 to 8.0.

ＳＡＮＫ６０４０４株の生育温度は１２乃至３８℃であるが、Ａ−９４９６４Ａを生産させるためには、該菌株を１８乃至３６℃で培養することが好ましく、より好適には、２０乃至３２℃で培養するのが好ましい。 The growth temperature of the SANK 60404 strain is 12 to 38 ° C. In order to produce A-94964A, the strain is preferably cultured at 18 to 36 ° C, more preferably at 20 to 32 ° C. It is preferable to do this.

Ａ−９４９６４Ａは、ＳＡＮＫ６０４０４株を好気的に培養することにより得られるが、そのような培養法としては、通常用いられる好気的培養法、例えば固体培養法、振とう培養法、通気攪拌培養法等を用いることができる。 A-94964A is obtained by aerobically cultivating SANK 60404 strain. As such a culture method, a conventionally used aerobic culture method such as a solid culture method, a shaking culture method, aeration stirring, A culture method or the like can be used.

小規模の培養においては、２０乃至３２℃で数日間振とう培養を行うのが好適である。培養は、バッフル（水流調節壁）のついた、又は、ついていない三角フラスコ中で、１又は２段階の種の発育工程により開始する。 In small-scale culture, it is preferable to perform shaking culture at 20 to 32 ° C. for several days. Cultivation begins with a one or two stage seed development process in an Erlenmeyer flask with or without a baffle (water flow control wall).

種発育段階の培地には、炭素源及び窒素源を併用することができる。種培養は、２０乃至３２℃の定温インキュベーター中で充分に成長するまで振とうすることにより行う。成長した種は、第二の種培地、又は、生産培地に接種する。 A carbon source and a nitrogen source can be used in combination in the medium at the seed development stage. The seed culture is performed by shaking in a constant temperature incubator at 20 to 32 ° C. until it grows sufficiently. The grown seed is inoculated into a second seed medium or production medium.

中間の発育工程を用いる場合には、種培養と同様の方法で行うことができる。中間の発育工程により得られた種は、その一部を生産培地に接種する。 When an intermediate growth process is used, it can be performed by the same method as seed culture. A part of the seed obtained by the intermediate development process is inoculated into the production medium.

生産のための培養は、種を接種した生産培養用フラスコを一定の温度で数日間振とう培養することにより行うことができる。 Culture for production can be performed by shaking and culturing a production culture flask inoculated with seeds at a certain temperature for several days.

生産のための培養を大量培養で行う場合には、攪拌機、通気装置が付いたジャーファーメンター又はタンクで培養するのが好ましい。そのためには、まず栄養培地を１２１乃至１３０℃まで加熱して滅菌し、その後冷却させておく。次いで、該滅菌済培地に前述の方法によって予め成長させておいた種を接種する。その後の培養は２０乃至３２℃で通気攪拌して行う。この方法は、多量の化合物を得るのに適している。 When culturing for production is carried out in a large-scale culture, it is preferable to culture in a jar fermenter or tank equipped with a stirrer and an aeration device. For this purpose, the nutrient medium is first sterilized by heating to 121 to 130 ° C. and then cooled. The sterilized medium is then inoculated with seeds previously grown by the method described above. Subsequent cultivation is performed at 20 to 32 ° C. with aeration and agitation. This method is suitable for obtaining large amounts of compounds.

培養終了後、フラスコ内の培養物を遠心分離又はろ過するか、或いは培養物全体を用いて抽出、精製することにより、目的の化合物を得ることができる。 After completion of the culture, the target compound can be obtained by centrifuging or filtering the culture in the flask, or extracting and purifying the whole culture.

培養の経過に伴って生産されるＡ−９４９６４Ａの量は、培養液の一部を採取して該化合物を抽出し、トランスロケースＩ阻害活性を測定することにより該化合物を総活性量として確認するか、又は、高速液体クロマトグラフィーを実施し、該化合物を測定することによりモニターすることができる。Ａ−９４９６４Ａの生産量は、通常３乃至１５日で最高値に達する。 The amount of A-94964A produced as the culture progresses is determined by collecting a part of the culture solution, extracting the compound, and measuring the translocase I inhibitory activity as the total active amount. Alternatively, it can be monitored by performing high performance liquid chromatography and measuring the compound. The production of A-94964A usually reaches its maximum in 3 to 15 days.

培養終了後、培養液中の液体部分及び菌体内、又はその双方に存在するＡ−９４９６４Ａは、培養終了液の全て、あるいは菌体、その他の固形部分を、珪藻土をろ過助剤とするろ過操作又は遠心分離によって分別し、得られたろ液又は上清及び菌体中から、トランスロケースＩ阻害活性又は高速液体クロマトグラフィーを指標にして、その物理化学的性状を利用し抽出精製することができる。 After completion of the culture, A-99464A present in the liquid part of the culture liquid and the microbial cells, or both, is a filtration operation using diatomaceous earth as a filter aid for all of the culture ending liquid, or the microbial cells and other solid parts. Alternatively, it can be separated by centrifugation, and can be extracted and purified from the obtained filtrate or supernatant and bacterial cells using translocase I inhibitory activity or high-performance liquid chromatography as an index, using its physicochemical properties. .

ろ液又は上清中に存在するＡ−９４９６４Ａは、酸性ｐＨ条件下で、水と混和しない有機溶剤、例えば、酢酸エチル、クロロホルム、塩化エチレン、塩化メチレン、ブタノール等の単独又は、それらの組み合わせにより抽出精製することができる。また、吸着剤として、例えば、活性炭、吸着用樹脂であるアンバーライトＸＡＤ−２、ＸＡＤ−４（登録商標、ローム・アンド・ハース社製）等や、ダイアイオンＨＰ−１０、ＨＰ−２０、ＣＨＰ−２０Ｐ、ＨＰ−５０、セパビーズＳＰ−２０７（登録商標、三菱化学社製）等を使用して抽出精製することもできる。吸着剤を使用して抽出精製する場合、目的化合物を含む液を吸着剤の層を通過させ、不純物を吸着剤に吸着させることにより取り除くか、又は、目的化合物を吸着させて不純物を洗い流した後、メタノール水、アセトン水、ブタノ−ル水等を用いて目的化合物を溶出させることにより、目的化合物を抽出精製することができる。 A-94964A present in the filtrate or supernatant is an organic solvent that is immiscible with water under acidic pH conditions, for example, ethyl acetate, chloroform, ethylene chloride, methylene chloride, butanol alone or in combination. It can be extracted and purified. Further, as the adsorbent, for example, activated carbon, Amberlite XAD-2, XAD-4 (registered trademark, manufactured by Rohm and Haas Co.) which is an adsorbing resin, Diaion HP-10, HP-20, CHP, etc. Extraction and purification can also be performed using -20P, HP-50, Sepabeads SP-207 (registered trademark, manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation) and the like. When extracting and purifying using an adsorbent, remove the liquid containing the target compound by passing it through the adsorbent layer and adsorbing the impurity to the adsorbent, or washing the impurity by adsorbing the target compound The target compound can be extracted and purified by eluting the target compound with methanol water, acetone water, butanol water or the like.

菌体内に存在するＡ−９４９６４Ａは、５０乃至９０％の含水アセトン又は含水メタノールにより抽出し、濃縮操作により有機溶剤を除去した後、上記と同様に抽出精製操作を行うことにより得ることができる。例えば、培養終了後に適当量（好ましくは終濃度５０％）の、アセトン又はメタノールを添加することにより目的の化合物を抽出することができる。抽出終了後、珪藻土をろ過助剤とするろ過操作を行ない、得られた抽出液をろ液と同様な抽出精製操作を行うことにより目的の化合物を抽出精製することができる。 A-94964A present in the cells can be obtained by extraction with 50 to 90% aqueous acetone or aqueous methanol, removing the organic solvent by concentration, and then performing extraction and purification in the same manner as described above. For example, the target compound can be extracted by adding an appropriate amount (preferably a final concentration of 50%) of acetone or methanol after the end of the culture. After completion of the extraction, the target compound can be extracted and purified by performing a filtration operation using diatomaceous earth as a filter aid and performing the same extraction and purification operation as that of the filtrate.

上記の方法により抽出精製されたＡ−９４９６４Ａを含む溶液は、シリカゲル、セファデックスＬＨ−２０（アマシャムバイオサイエンス社製）、フロリジル、コスモシル（ナカライテスク社製）のような担体を用いた分配カラムクロマトグラフィー；ダイヤイオンＣＨＰ−２０Ｐ（三菱化学社製）のような担体を用いた吸着カラムクロマトグラフィー；セファデックスＧ−１０（アマシャムバイオサイエンス社製）、トヨパールＨＷ４０Ｆ（トーソー社製）などを用いたゲルろ過クロマトグラフィー；ダウエックス５０（ダウケミカル社製）ダウエックス１（ダウケミカル社製）、ダイヤイオンＰＫ２１６（三菱化学社製）、ダイヤイオンＰＡ３１６（三菱化学社製）、ＣＭセファデックスＣ−２５（アマシャムバイオサイエンス社製）、ＤＥＡＥセファデックスＡ−２５（アマシャムバイオサイエンス社製）などを用いたイオン交換クロマトグラフィー；及び順層、逆層カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー等により更に精製することができる。 A solution containing A-94964A extracted and purified by the above method was distributed column chromatography using a carrier such as silica gel, Sephadex LH-20 (Amersham Biosciences), Florisil, Cosmosil (Nacalai Tesque). Chromatography: adsorption column chromatography using a carrier such as Diaion CHP-20P (Mitsubishi Chemical); gel using Sephadex G-10 (Amersham Bioscience), Toyopearl HW40F (Tosoh) Filtration chromatography: Dowex 50 (Dow Chemical) Dowex 1 (Dow Chemical), Diaion PK216 (Mitsubishi Chemical), Diaion PA316 (Mitsubishi Chemical), CM Sephadex C-25 ( Amersham Bioscience) It can be further purified by and Junso, high performance liquid chromatography using a reversed phase column; the EAE Sephadex A-25 (Amersham Biosciences) ion exchange chromatography using, for example.

以上の分離、精製の手段を単独又は適宜組み合わせ、場合によっては反復して用いることにより、本発明のＡ−９４９６４Ａを分離精製することができる。 A-94964A of the present invention can be separated and purified by using the above separation and purification means alone or in combination as appropriate, and repeatedly in some cases.

以上のごとくして得られる本発明の化合物の、一般グラム陽性細菌及びグラム陰性細菌に対する最少生育阻止濃度（ＭＩＣ）は、普通寒天培地（栄研化学社製）や、ミュラー−ヒントン寒天（Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎａｇａｒ）培地（ＢＢＬ社製）等を用いた、当業者周知の寒天平板希釈法によって測定することができる。 The minimum inhibitory concentration (MIC) of the compound of the present invention obtained as described above with respect to general gram-positive bacteria and gram-negative bacteria can be determined using a normal agar medium (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.), Muller-Hinton agar (Mueller- It can be measured by an agar plate dilution method well known to those skilled in the art using a Hintonagar medium (BBL) or the like.

また、本発明の化合物のトランスロケースＩに対する酵素阻害活性は、酵素とＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニル−γ−Ｄ−グルタミル−ｍ−ジアミノピメリル−（Ｎ^ε−ダンシル）−Ｄ−アラニル−Ｄ−アラニン（ＵＤＰ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｙｌ−Ｌ−Ａｌａ−γ−Ｄ−Ｇｌｕ−ｍ−ＤＡＰ−（Ｎ^ε−ｄａｎｓｙｌ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ）及びウンデカプレニルリン酸（ｕｎｄｅｃａｐｒｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ）の反応を用いて測定することができる。 The enzyme inhibitory activity against translocates Case I of a compound of the present invention, enzyme and UDP-N-acetyl -L- alanyl-gamma-D-glutamyl -m- Jiaminopimeriru ^- (N ε - dansyl)-D- Alanyl-D-alanine (UDP-N-acetylmuramyl-L-Ala-γ-D-Glu-m-DAP- (N ^ε- dansyl) -D-Ala-D-Ala) and undecaprenyl phosphate It can measure using reaction of these.

また、本発明の化合物のトランスロケースＩに対する酵素阻害活性は、当業者周知の方法により測定することもできる。 The enzyme inhibitory activity against translocase I of the compounds of the present invention can also be measured by methods well known to those skilled in the art.

本発明の化合物はトランスロケースＩ酵素阻害活性を示す。トランスロケースＩは、細菌細胞壁の構成成分であるペプチドグリカンの生合成に関与する酵素であり、該酵素を阻害すると細菌が細胞壁を維持することが出来なくなると考えられている。すなわち、トランスロケースＩ阻害作用を有する本発明の化合物は抗菌活性を有する。また、このようなトランスロケースＩ阻害活性に基づく抗菌活性は、従来の抗菌剤とは異なるメカニズムであり、従来品に対する耐性菌に対しても有効な抗菌活性を発揮する。 The compounds of the present invention exhibit translocase I enzyme inhibitory activity. Translocase I is an enzyme involved in the biosynthesis of peptidoglycan, which is a constituent of bacterial cell walls, and it is believed that inhibition of the enzyme prevents bacteria from maintaining the cell wall. That is, the compound of the present invention having a translocase I inhibitory activity has antibacterial activity. In addition, the antibacterial activity based on such translocase I inhibitory activity is a mechanism different from that of conventional antibacterial agents, and also exhibits effective antibacterial activity against resistant bacteria against conventional products.

本発明は、Ａ−９４９６４Ａ又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物に関する。前記医薬組成物は、好適にはトランスロケースＩ阻害剤であり、より好適には抗菌剤である。このような医薬組成物は、細菌感染症、特に耐性菌を含む細菌感染症の予防剤又は治療剤として有用である。また、このような医薬組成物の製造のためのＡ−９４９６４Ａの使用も本発明に含まれるものである。 The present invention relates to a pharmaceutical composition containing A-94964A or a pharmacologically acceptable salt thereof as an active ingredient. The pharmaceutical composition is preferably a translocase I inhibitor, more preferably an antibacterial agent. Such a pharmaceutical composition is useful as a prophylactic or therapeutic agent for bacterial infections, particularly bacterial infections including resistant bacteria. The use of A-94964A for the production of such a pharmaceutical composition is also included in the present invention.

また、患者にＡ−９４９６４Ａ又はその薬理学的に許容される塩の有効量を投与することを含む細菌感染症、特に耐性菌を含む細菌感染症、の治療方法も本発明に含まれる。 Also included in the present invention is a method for treating bacterial infections, particularly bacterial infections including resistant bacteria, comprising administering to a patient an effective amount of A-94964A or a pharmacologically acceptable salt thereof.

本発明のＡ−９４９６４Ａ又はその薬理学的に許容される塩は、種々の形態で投与することができる。その投与形態としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、乳剤、丸剤、散剤、シロップ剤（液剤）等による経口投与、又は注射剤（静脈内、筋肉内、皮下又は腹腔内投与）、点滴剤、坐剤（直腸投与）等による非経口投与を挙げることができる。これらの各種製剤は、常法に従って主薬に賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤等の医薬の製剤技術分野において通常使用し得る補助剤を用いて製剤化することができる。 The A-94964A of the present invention or a pharmacologically acceptable salt thereof can be administered in various forms. Examples of the administration form include oral administration by tablets, capsules, granules, emulsions, pills, powders, syrups (solutions), etc., or injections (intravenous, intramuscular, subcutaneous or intraperitoneal administration), Examples include parenteral administration such as instillation and suppository (rectal administration). These various preparations are usually used in the pharmaceutical preparation technical field such as excipients, binders, disintegrants, lubricants, flavoring agents, solubilizers, suspension agents, coating agents, etc. as main ingredients in accordance with conventional methods. It can be formulated with the resulting adjuvant.

錠剤として使用する場合、担体として、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、グルコース、尿素、澱粉、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸等の賦形剤；水、エタノール、プロパノール、単シロップ、グルコース液、澱粉液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドン等の結合剤；乾燥澱粉、アルギン酸ナトリウム、寒天末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、澱粉、乳糖等の崩壊剤；白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤；第４級アンモニウム塩類、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤；グリセリン、澱粉等の保湿剤；澱粉、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩、硼酸末、ポリエチレングリコール等の潤沢剤等を使用することができる。また、必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠、二重錠又は多層錠とすることができる。 When used as a tablet, carriers include, for example, lactose, sucrose, sodium chloride, glucose, urea, starch, calcium carbonate, kaolin, crystalline cellulose, silicic acid, etc .; water, ethanol, propanol, simple syrup, glucose Liquid, starch liquid, gelatin solution, binders such as carboxymethylcellulose, shellac, methylcellulose, potassium phosphate, polyvinylpyrrolidone; dry starch, sodium alginate, agar powder, laminaran powder, sodium bicarbonate, calcium carbonate, polyoxyethylene sorbitan fatty acid Disintegrating agents such as ester, sodium lauryl sulfate, monoglyceride stearate, starch, lactose; disintegration inhibitors such as sucrose, stearin, cocoa butter, hydrogenated oil; absorption promoters such as quaternary ammonium salts and sodium lauryl sulfate; Glycerin, humectants, such as starch; starch, lactose, kaolin, bentonite, adsorbent such as colloidal silicic acid; purified talc, stearates, boric acid powder, it is possible to use lubricants such as polyethylene glycol. Moreover, it can be set as the tablet which gave the normal coating as needed, for example, a sugar-coated tablet, a gelatin-encapsulated tablet, an enteric-coated tablet, a film coating tablet, a double tablet, or a multilayer tablet.

丸剤として使用する場合、担体として、例えば、グルコース、乳糖、カカオバター、澱粉、硬化植物油、カオリン、タルク等の賦形剤；アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノール等の結合剤；ラミナラン寒天等の崩壊剤等を使用することができる。 When used as a pill, as a carrier, for example, excipients such as glucose, lactose, cocoa butter, starch, hydrogenated vegetable oil, kaolin, talc; binders such as gum arabic powder, tragacanth powder, gelatin, ethanol; laminaran agar Disintegrants such as can be used.

坐剤として使用する場合、担体としてこの分野で従来公知のものを広く使用でき、例えばポリエチレングリコール、カカオバター、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ゼラチン、半合成グリセリド等を挙げることができる。 When used as a suppository, a carrier conventionally known in this field can be widely used as a carrier, and examples thereof include polyethylene glycol, cocoa butter, higher alcohol, esters of higher alcohol, gelatin, semi-synthetic glyceride and the like.

注射剤として使用する場合、液剤、乳剤又は懸濁剤として使用することができる。これらの液剤、乳剤又は懸濁剤は、殺菌され、血液と等張であることが好ましい。これら液剤、乳剤又は懸濁剤の製造に用いる溶液は、医療用の希釈剤として使用できるものであれば特に限定はなく、例えば、水、エタノール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等を挙げることができる。なお、この場合、等張性の溶液を調製するのに充分な量の食塩、グルコース又はグリセリンを製剤中に含んでいてもよく、また通常の溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤等を含んでいてもよい。 When used as an injection, it can be used as a solution, emulsion or suspension. These solutions, emulsions or suspensions are preferably sterilized and isotonic with blood. The solution used for the production of these solutions, emulsions or suspensions is not particularly limited as long as it can be used as a diluent for medical use. For example, water, ethanol, propylene glycol, ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxylated isoforms are used. Examples include stearyl alcohol and polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters. In this case, the preparation may contain a sufficient amount of sodium chloride, glucose, or glycerin to prepare an isotonic solution, and it also contains ordinary solubilizing agents, buffers, soothing agents, etc. You may go out.

また、上記の製剤には、必要に応じて、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等を含めることもでき、更に、他の医薬品を含めることもできる。 Moreover, a coloring agent, a preservative, a fragrance | flavor, a flavoring agent, a sweetening agent, etc. can also be included in said formulation as needed, and also other pharmaceuticals can be included.

上記製剤に含まれる有効成分化合物の量は、特に限定されず広範囲に適宜選択されるが、通常、全組成物中１７０重量％、好ましくは１乃至３０重量％含む。 The amount of the active ingredient compound contained in the preparation is not particularly limited and is appropriately selected within a wide range, but is usually 170% by weight, preferably 1 to 30% by weight in the total composition.

使用量としては、症状、年齢、体重、投与方法及び剤形等によって異なるが、通常は成人に対して１日あたり、上限として２０００ｍｇ（好ましくは１００ｍｇ）であり、下限として０．１ｍｇ（好ましくは１ｍｇ、さらに好ましくは１０ｍｇ）を症状に応じて、一日１回又は数回に分けて投与することができる。 The amount used varies depending on symptoms, age, body weight, administration method, dosage form, etc., but is usually 2000 mg (preferably 100 mg) as the upper limit per day for adults, and 0.1 mg (preferably as the lower limit) 1 mg, more preferably 10 mg) can be administered once a day or divided into several times according to symptoms.

本発明の化合物であるＡ−９４９６４Ａ若しくはその薬理学上許容される塩はグラム陽性菌を含む各種細菌感染症の予防薬又は治療薬として有用である。更に、各種細菌感染症の予防薬若しくは治療薬を目指した、有機化学的及び／又は微生物変換を用いた誘導体合成原料として有用である。 The compound of the present invention, A-94964A or a pharmacologically acceptable salt thereof, is useful as a prophylactic or therapeutic agent for various bacterial infections including Gram-positive bacteria. Furthermore, it is useful as a raw material for synthesizing derivatives using organic chemistry and / or microbial conversion aimed at preventive or therapeutic agents for various bacterial infections.

以下に実施例をあげて、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.

（実施例１）ストレプトマイセス・エスピー．ＳＡＮＫ６０４０４株の培養
１）前培養
斜面培地上に生育させたＳＡＮＫ６０４０４株を、白金耳を用いて菌糸を寒天ごとかきとり、０．８５％生理食塩水を加えたガラス製ホモジナイザーに移し、ホモジナイズし均一化した。この菌糸懸濁液を、表４に記載の組成の培養培地８０ｍｌを入れた５００ｍｌ容の三角フラスコ（種フラスコ）３本に、無菌的に接種し、次いで該フラスコを回転振とう機中で２８℃、２１０ｒｐｍにて、３日間振とう培養して、前培養を行った。 (Example 1) Streptomyces sp. Cultivation of SANK 60404 strain 1) Preculture SANK 60404 strain grown on a slant medium was scraped with agar using a platinum loop, transferred to a glass homogenizer with 0.85% physiological saline and homogenized. Homogenized. This mycelial suspension is aseptically inoculated into three 500 ml Erlenmeyer flasks (seed flasks) containing 80 ml of the culture medium having the composition described in Table 4, and then the flasks are placed on a rotary shaker in 28 Pre-culture was performed by shaking culture at 210 ° C. and shaking for 3 days.

［表４］培養培地
―――――――――――――――――――――――――――
可溶性デンプン４０ｇ
グルコース１０ｇ
生イースト４．５ｇ
大豆粉１０ｇ
Ｃｏｒｎｓｔｅｅｐｌｉｑｕｏｒ５ｇ
ＣｏＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ０．００１ｇ
ＫＨ_３ＰＯ_４０．５ｇ
ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．０１ｇ
Ｍｇ_３（ＰＯ_４）_２・８Ｈ_２Ｏ０．０５ｇ
ＮｉＳＯ_４・６Ｈ_２Ｏ０．００１ｇ
消泡剤(ＣＢ４４２) ５０ｍｇ
―――――――――――――――――――――――――――
蒸留水１０００ｍｌ
滅菌前のｐＨ７
滅菌：１２１℃にて３０分間滅菌した。 [Table 4] Culture medium ―――――――――――――――――――――――――――
Soluble starch 40 g
Glucose 10 g
Raw yeast 4.5 g
Soy flour 10 g
Corn step liquor 5 g
CoCl ₃ · _6H 2 O 0.001g
KH ₃ PO ₄ 0.5 g
ZnSO ₄ · 7H ₂ O 0.01 g
_{_{_{_{Mg 3 (PO 4) 2 ·}}}} 8H 2 O 0.05 g
NiSO ₄ · _6H 2 O 0.001g
Antifoam (CB442) 50 mg
―――――――――――――――――――――――――――
1000 ml of distilled water
PH 7 before sterilization
Sterilization: Sterilized at 121 ° C. for 30 minutes.

２）本培養
滅菌済みの表４に記載の組成の培養培地、８０ｍｌの入った５００ｍｌ容の三角フラスコ２６本に、前培養液を２．５％（Ｖ／Ｖ）植菌し、次いで該フラスコを回転振とう機中で温度２８℃、回転数２１０ｒｐｍにて、７日間振とう培養して、本培養を行った。 2) Main culture Inoculate 2.5% (V / V) of the preculture into 26 500 ml Erlenmeyer flasks containing 80 ml of the culture medium having the composition described in Table 4 and then the flask. Was cultured for 7 days in a rotary shaker at a temperature of 28 ° C. and at a rotation speed of 210 rpm, followed by main culture.

（実施例２）Ａ−９４９６４Ａの単離
以下の精製においては、活性画分を以下の条件の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）でモニターした。 (Example 2) Isolation of A-94964A In the following purification, the active fraction was monitored by high performance liquid chromatography (HPLC) under the following conditions.

カラム：カプセルパック（ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ）Ｃ１８ＵＧ１２０：４．６φ×１５０ｍｍ ((株)資生堂社製)
溶媒：０．３％トリエチルアミンを含有し、リン酸でｐＨ３．０に調節した５０％アセトニトリル水
流速：１．０ｍｌ／分
検出：紫外部吸収２６０ｎｍ
保持時間：７．６分

実施例１で得られた培養終了液（２Ｌ）にアセトン２Ｌを加え抽出した後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心し、菌体かすを除去した。得られた上清３．９Ｌを減圧濃縮後、ｐＨを３に調節し、水で平衡化したダイヤイオンＨＰ２０カラム（４００ｍＬ三菱化学社製）に付した。カラムを３０％アセトン水（１．４Ｌ）で洗浄の後、５０％アセトン水（１．４Ｌ）で活性物質の溶出を行った。この溶出液を減圧濃縮の後、凍結乾燥して粗粉末（１．３３ｇ）を得た。 Column: Capsule pack (CAPCELL PAK) C18UG120: 4.6φ × 150 mm (manufactured by Shiseido Co., Ltd.)
Solvent: 50% acetonitrile water containing 0.3% triethylamine and adjusted to pH 3.0 with phosphoric acid Flow rate: 1.0 ml / min Detection: UV absorption 260 nm
Retention time: 7.6 minutes

Extraction was carried out by adding 2 L of acetone to the culture end solution (2 L) obtained in Example 1, and then centrifugation was performed at 3000 rpm for 10 minutes to remove cell debris. After 3.9 L of the obtained supernatant was concentrated under reduced pressure, the pH was adjusted to 3 and applied to a Diaion HP20 column (400 mL manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation) equilibrated with water. The column was washed with 30% aqueous acetone (1.4 L), and then the active substance was eluted with 50% aqueous acetone (1.4 L). The eluate was concentrated under reduced pressure and lyophilized to obtain a crude powder (1.33 g).

この粗粉末のうち３００ｍｇを、１０ｍＭ重炭酸アンモニウムを含有する１５％アセトニトリル水（１ｍＬ）に懸濁し、同一溶媒系で平衡化したダイヤイオンＣＨＰ２０Ｐカラム（２０ｍＬ三菱化学社製）に供与し、１５％アセトニトリル水（２００ｍＬ）、２０％アセトニトリル水（２００ｍＬ）で洗浄の後、２５％アセトニトリル水（４００ｍＬ）で展開した。溶出液を３ｍｌ毎に分画し、フラクション１０乃至７０までを集め、減圧濃縮したところ、粗粉末６４．４ｍｇが得られた。 300 mg of this coarse powder was suspended in 15% acetonitrile water (1 mL) containing 10 mM ammonium bicarbonate, and applied to a Diaion CHP20P column (20 mL manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation) equilibrated with the same solvent system. 15% After washing with acetonitrile water (200 mL) and 20% acetonitrile water (200 mL), development with 25% acetonitrile water (400 mL) was performed. The eluate was fractionated every 3 ml, and fractions 10 to 70 were collected and concentrated under reduced pressure to obtain 64.4 mg of crude powder.

この粗粉末のうち５０ｍｇを、１．５％トリエチルアミンを含有し、リン酸でｐＨ３．０に調節した５０％メタノール水（４ｍｌ）に溶解し、このうち１５０μｌを１．０％トリエチルアミンを含有し、リン酸でｐＨ３．０に調節した５０％アセトニトリル水で平衡化したＨＰＬＣカラム（カプセルパック（ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ）Ｃ１８ＵＧ１２０、２０φ×２５０ｍｍ）に供与した。カラムを流速９．０ｍｌ／分で展開し、目的物質の２６０ｎｍでの紫外部吸収を検出して、保持時間２０．６分に溶出される画分を２６回に分けて分取した。 50 mg of this crude powder was dissolved in 50% aqueous methanol (4 ml) containing 1.5% triethylamine and adjusted to pH 3.0 with phosphoric acid, of which 150 μl contained 1.0% triethylamine, It was applied to an HPLC column (Capsule Pack (CAPCELL PAK) C18UG120, 20φ × 250 mm) equilibrated with 50% acetonitrile water adjusted to pH 3.0 with phosphoric acid. The column was developed at a flow rate of 9.0 ml / min, the ultraviolet absorption at 260 nm of the target substance was detected, and the fraction eluted at a retention time of 20.6 minutes was divided into 26 fractions.

得られた同一保持時間の画分をあわせ、減圧濃縮後、水で平衡化したダイヤイオンＨＰ２０カラム（７ｍＬ）に付し、カラムを水（２５ｍＬ）で洗浄の後、７０％アセトン水（２５ｍＬ）で活性物質を溶出することにより脱塩を行った。この溶出液を減圧濃縮の後、凍結乾燥し、Ａ−９４９６４Ａ（１８．９ｍｇ）を無色粉末として得た。 The obtained fractions having the same retention time were combined, concentrated under reduced pressure, applied to a Diaion HP20 column (7 mL) equilibrated with water, the column was washed with water (25 mL), and then 70% aqueous acetone (25 mL). The desalting was carried out by eluting the active substance with The eluate was concentrated under reduced pressure and lyophilized to give A-94964A (18.9 mg) as a colorless powder.

（試験例１）抗菌活性の測定（抗グラム陽性菌活性）
本発明のＡ−９４９６４Ａの黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）ＦＤＡ１２３−１株（以降Ｓ．ａｕｒｅｕｓ１２３−１株と略記)及び腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ）１０７８５株（以降Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ１０７８５株と略記）に対する最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の測定は、以下の方法で行った。検体水溶液を１０００μｇ／ｍｌの濃度より２倍希釈し、１４段階（１０００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、２５０μｇ／ｍｌ、１２５μｇ／ｍｌ、６２．５μｇ／ｍｌ、３１．３μｇ／ｍｌ、１５．６μｇ／ｍｌ、７．８μｇ／ｍｌ、３．９μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．２４μｇ／ｍｌ、０．１２μｇ／ｍｌ）の希釈液を調製した。各希釈液を丸型シャーレ（９０φ×２０ｍｍ、テルモ社製）に１ｍｌずつ分注後、ミュラー−ヒントン寒天（Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎａｇａｒ）培地（ＢＢＬ社製）を９ｍｌ加えて混合し、平板とした。被検菌Ｓ．ａｕｒｅｕｓ１２３−１株及びＥ．ｆａｅｃａｌｉｓ１０７８５株をトリプトソイブイヨン（ＴＳＢ）培地（栄研化学社製）にて３７℃、一夜前培養した。試験当日、得られた菌液を、ＴＳＢを用いて１００倍に希釈し、その１白金耳を平板培地に画線塗沫した。この画線塗沫した平板培地を３７℃、１８時間培養した後、ＭＩＣを判定した。 (Test Example 1) Measurement of antibacterial activity (antigram-positive bacteria activity)
A-94964A of the present invention is minimally grown against Staphylococcus aureus FDA123-1 strain (hereinafter abbreviated as S. aureus 123-1 strain) and Enterococcus faecalis 10785 strain (hereinafter abbreviated as E. faecalis 10785 strain). The inhibition concentration (MIC) was measured by the following method. The sample aqueous solution was diluted 2 times from the concentration of 1000 μg / ml, and 14 levels (1000 μg / ml, 500 μg / ml, 250 μg / ml, 125 μg / ml, 62.5 μg / ml, 31.3 μg / ml, 15.6 μg / ml) 7.8 μg / ml, 3.9 μg / ml, 2 μg / ml, 1 μg / ml, 0.5 μg / ml, 0.24 μg / ml, 0.12 μg / ml). Each dilution was dispensed into a round petri dish (90φ × 20 mm, Terumo) in an amount of 1 ml, and 9 ml of Mueller-Hintongar medium (BBL) was added and mixed to obtain a flat plate. Test bacteria aureus 123-1 strain and E. coli. The faecalis 10785 strain was pre-cultured overnight at 37 ° C. in tryptic soy bouillon (TSB) medium (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.). On the day of the test, the obtained bacterial solution was diluted 100 times with TSB, and one platinum loop was smeared on a flat plate medium. After this streaked plate medium was cultured at 37 ° C. for 18 hours, MIC was determined.

［表５］抗菌活性（抗グラム陽性菌活性）
―――――――――――――――――――――――――――――――
試験化合物ＭＩＣ（μｇ／ｍｌ）
―――――――――――――――――――――――――――――――
被検菌Ｓ．ａｕｒｅｕｓＥ．ｆａｅｃａｌｉｓ
１２３−１１０７８５
―――――――――――――――――――――――――――――――
Ａ−９４９６４Ａ１００２５
―――――――――――――――――――――――――――――――
以上の結果から、Ａ−９４９６４Ａは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ１２３−１株及びＥ．ｆａｅｃａｌｉｓ１０７８５株に対して抗菌活性を有することが示された。 [Table 5] Antibacterial activity (activity of anti-gram-positive bacteria)
―――――――――――――――――――――――――――――――
Test compound MIC (μg / ml)
―――――――――――――――――――――――――――――――
Test bacteria aureus E. et al. faecalis
123-1 10785
―――――――――――――――――――――――――――――――
A-94964A 100 25
―――――――――――――――――――――――――――――――
From the above results, A-94964A aureus 123-1 strain and E. coli. It was shown to have antibacterial activity against faecalis 10785 strain.

（試験例２）トランスロケースＩ酵素阻害活性の測定
本発明の化合物のトランスロケースＩに対する酵素阻害活性は、酵素とＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニル−γ−Ｄ−グルタミル−ｍ−ジアミノピメリル−（Ｎ^ε−ダンシル）−Ｄ−アラニル−Ｄ−アラニン（ＵＤＰ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｙｌ−Ｌ−Ａｌａ−γ−Ｄ−Ｇｌｕ−ｍ−ＤＡＰ−（Ｎ^ε−ｄａｎｓｙｌ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ）及びウンデカプレニルリン酸（ｕｎｄｅｃａｐｒｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ)の反応を用いて測定した。 (Test Example 2) Measurement of translocase I enzyme inhibitory activity The enzyme inhibitory activity of the compound of the present invention against translocase I was determined by the enzyme and UDP-N-acetyl-L-alanyl-γ-D-glutamyl-m-diamino. Pimeryl- (N [ ^epsilon] -dansyl) -D-alanyl-D-alanine (UDP-N-acetylmuramyl-L-Ala- [gamma] -D-Glu-m-DAP- (N [ ^epsilon] -dansyl) -D-Ala-D -Ala) and undecaprenyl phosphate reaction.

すなわち、トランスロケースＩをコードしたプラスミドを有する大腸菌、Ｅ．ｃｏｌｉ／ｐＴＡ５株を培養して得られる菌体を、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中にて超音波破砕した後、粗抽出液を超遠心し、得られた沈殿を界面活性化剤で可溶化した溶液を酵素源として使用した。ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニル−γ−Ｄ−グルタミル−ｍ−ジアミノピメリル−（Ｎ^ε−ダンシル）−Ｄ−アラニル−Ｄ−アラニンとウンデカプレニルリン酸を、様々な濃度の本発明の化合物の存在下又は非存在下で、酵素液とともにインキュベートした後、酵素反応により増加した蛍光度を、励起波長３５５ｎｍ、検出波長５３８ｎｍの条件で定量して酵素活性とし、５０％酵素阻害濃度（ＩＣ_５０）は、添加した本発明の化合物の濃度と各濃度における阻害率から計算して求めた。 That is, E. coli having a plasmid encoding translocase I, E. coli. The cells obtained by culturing the E. coli / pTA5 strain were sonicated in Tris-HCl buffer (pH 8.0), and then the crude extract was ultracentrifuged. The resulting precipitate was treated with a surfactant. The solubilized solution was used as the enzyme source. UDP-N-acetyl-L-alanyl-γ-D-glutamyl-m-diaminopimeryl- (N ^ε -dansyl) -D-alanyl-D-alanine and undecaprenyl phosphate in various concentrations according to the present invention After incubating with the enzyme solution in the presence or absence of the above compound, the fluorescence increased by the enzyme reaction was quantified under the conditions of an excitation wavelength of 355 nm and a detection wavelength of 538 nm to obtain enzyme activity, and a 50% enzyme inhibitory concentration ( IC ₅₀ ) was calculated from the concentration of the compound of the present invention added and the inhibition rate at each concentration.

［表６］トランスロケースＩ阻害活性
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試験化合物ＩＣ_５０値（μｇ／ｍｌ）
―――――――――――――――――――――――――――――――
Ａ−９４９６４Ａ１．１０
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Ａ−９４９６４Ａは、トランスロケースＩに対し阻害活性を示した。 [Table 6] Translocase I inhibitory activity ―――――――――――――――――――――――――――――――
Test compound IC ₅₀ value (μg / ml)
―――――――――――――――――――――――――――――――
A-94964A 1.10.
―――――――――――――――――――――――――――――――
A-94964A showed inhibitory activity against translocase I.

（製剤例）カプセル剤
Ａ−９４９６４Ａ１００ｍｇ
乳糖１００ｍｇ
トウモロコシ澱粉１４８．８ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム１．２ｍｇ
――――――――――――――――――――――――――
全量３５０ｍｇ
上記処方の粉末を混合し、６０メッシュのふるいに通した後、この粉末をゼラチンカプセルに入れ、カプセル剤とする。 (Formulation example) Capsule A-94964A 100 mg
Lactose 100mg
Corn starch 148.8mg
Magnesium stearate 1.2mg
――――――――――――――――――――――――――
Total amount 350mg
After mixing the powder of the said formulation and letting it pass through a 60-mesh sieve, this powder is put into a gelatin capsule to make a capsule.

Claims

Formula (I):

Or a salt thereof.

A compound having the following physicochemical properties or a salt thereof;
1) Substance properties: colorless powdery substance 2) Solubility: soluble in methanol and dimethyl sulfoxide, insoluble in chloroform 3) Molecular formula: C ₄₅ H ₇₃ N ₄ O ₂₃ P
4) Molecular weight: 1068 (measured by FAB mass spectral method)
5) The exact mass, [M + Na] ⁺ , measured by high resolution FAB mass spectrometry is as follows:
Actual value: 1091.4328
Calculated value: 1091.4301
6) Ultraviolet absorption spectrum: The ultraviolet absorption spectrum measured in methanol shows the following maximum absorption:
267 nm (ε26400)
7) Optical rotation: The optical rotation measured in 50% water-containing methanol shows the following values:
[α] _D ²⁵ : + 60.0 ° (c0.5)
8) Infrared absorption spectrum: The infrared absorption spectrum measured by the potassium bromide (KBr) tablet method shows the following maximum absorption:
3328,2925,1686,1613,1259,1233,1053,963cm ^-1
⁹⁾ 1 H- nuclear magnetic resonance spectrum: in deuterated dimethyl sulfoxide was determined as an internal standard using a deuterated dimethyl sulfoxide (2.49 ^ppm), 1 H- nuclear magnetic resonance spectrum is as shown below:
0.80 (3H, d, J = 6.4 Hz), 0.81 (3H, t, J = 7.0 Hz), 0.93 (3H, d, J = 6.7 Hz), 1.0-1 .4 (17H, m), 1.68 (1H, m), 1.71 (3H, s), 1.86 (1H, m), 2.48 (1H, m), 3.15 (1H, dd, J = 9.0, 9.4 Hz), 3.23 (1H, dd, J = 9.4, 9.4 Hz), 3.0 (1 H, m), 3.45 (1 H, m), 3.5 (2H, m), 3.51 (1H, m), 3.56 (1H, m), 3.57 (1H, m), 3.67 (2H, m), 3.69 (1H , M), 3.77 (1H, m), 3.8 (1H, m), 3.81 (1H, m), 3.9 (1H, m), 3.99 (1H, dd, J = 5.0, 6.0 Hz), 4.13 (1 H, m), 4.72 (1 H, br, s), 4.94 (1 H, m ), 5.36 (1H, dd, J = 2.7, 6.4 Hz), 5.59 (1H, d, J = 10.0 Hz), 5.62 (1H, d, J = 8.0 Hz) , 5.70 (1H, d, J = 8.0 Hz), 6.04 (1 H, d, J = 15.4 Hz), 7.01 (1 H, d, J = 15.4), 7.54 ( 1H, d, J = 8.0 Hz) ppm
¹⁰⁾ 13 C-Nuclear magnetic resonance spectrum: in deuterated dimethyl sulfoxide was determined as an internal standard using a deuterated dimethyl sulfoxide (39.5 ^ppm), 13 C-nuclear magnetic resonance spectrum is as shown below:
11.3 (q), 12.4 (q), 19.1 (q), 20.6 (q), 26.5 (t), 27.0 (t), 27.0 (t), 28 .9 (t), 29.0 (t), 29.1 (t), 29.4 (t), 32.4 (d), 33.8 (d), 34.5 (t), 36. 7 (t), 41.5 (t), 54.0 (dd), 60.2 (t), 62.3 (d), 68.0 (d), 69.9 (d), 70.5 (D), 70.6 (d), 70.8 (d), 72.6 (d), 72.8 (d), 73.3 (d), 73.5 (d), 77.0 ( d), 78.9 (d), 81.8 (d), 87.7 (d), 94.4 (dd), 102.1 (d), 102.4 (d), 119.6 (d ), 131.0 (s), 140.6 (d), 144.0 (d), 145.4 (d), 150.7 (s), 163.0 (s), 165. (S), 169.1 (s), 172.3 (s) ppm.

The bacterium according to claim 1 or 2 belonging to the genus Streptomyces is cultured, and the compound according to claim 1 or 2 is collected from the culture. Compound production method.

The production method according to claim 3, wherein the bacterium producing the compound according to claim 1 or 2 belonging to the genus Streptomyces is Streptomyces sp. SANK 60404 (FERM BP-10112).

A microorganism belonging to the genus Streptomyces and producing the compound according to claim 1 or 2.

Streptomyces sp. SANK 60404 (FERM BP-10112).

A pharmaceutical composition comprising the compound according to claim 1 or 2 or a pharmacologically acceptable salt thereof as an active ingredient.

The pharmaceutical composition according to claim 7, which is a translocase I inhibitor.

The pharmaceutical composition according to claim 7, which is an antibacterial agent.